Methodenartikel

In vivo functionele beoordeling van de kauwspier van ratten na chirurgische creatie van een volumetrisch spierverlies (VML) letsel

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66902

⸱

15 november 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 2Myologica LLC, 3Department of Orthopedic Surgery, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

Verwondingen door volumetrisch spierverlies (VML) overschrijden het endogene regeneratieve vermogen, wat resulteert in permanente functionele tekorten. Het huidige VML-onderzoek richt zich vooral op ledemaat- en rompspieren. Om mechanistische studies van VML uit te breiden naar craniofaciale spieren, beschrijft dit artikel een in vivo methode voor longitudinale beoordeling van de kauwspierfunctie voor en na VML-letsel.

Samenvatting

Volumetrisch spierverlies (VML) komt veel voor bij burgers en militairen en vertegenwoordigt een slopende skeletspierbeschadiging die het natuurlijke regeneratieve vermogen van het lichaam overtreft. Deze verwondingen verstoren niet alleen spiervezels, maar ook zenuwen, bloedvaten en de extracellulaire matrix, waardoor het regeneratieve vermogen van skeletspieren wordt overweldigd en leidt tot ernstige fibrose en permanente tekortkomingen in de spierstructuur en -functie. De huidige klinische behandeling heeft veel beperkingen en daarom wordt er onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van effectievere therapeutische benaderingen. Met name is echter een groot deel van de preklinische nadruk op VML-letsels gericht op ledemaat- en rompspieren, met beperkt onderzoek naar craniofaciale spieren. Verschillen in ontwikkelingsbiologie en regeneratief vermogen tussen craniofaciale en ledemaat-/rompspieren kunnen cruciale inzichten opleveren die leiden tot meer blessurespecifieke VML-behandelingsopties. Bovendien is evaluatie van functioneel herstel van cruciaal belang voor het vaststellen van de therapeutische werkzaamheid. In dit opzicht is in vivo testen van spiercontractie met percutane zenuwstimulatie een minimaal invasieve methode die herhaalde functionele beoordeling in de loop van een onderzoek mogelijk maakt - bij hetzelfde dier. In het licht van deze overwegingen beschrijft dit artikel een methode voor de in vivo beoordeling van de spierfunctie in de kauwspier van de rat voor en na een VML-letsel. Dit protocol is het eerste gepubliceerde exemplaar dat de creatie en functionele evaluatie van een biologisch relevant craniofaciale VML-verwonding bij de rat in detail beschrijft.

Inleiding

Traumatische en chirurgische verwondingen van zacht weefsel waarbij de onderliggende skeletspier betrokken is, blijven een van de grootste uitdagingen voor weefselreconstructie voor zowel burgers als gewonde krijgers1. In feite komt bijna 20% van de verwondingen op het slagveld ook voor in de craniofaciale gebieden van gewonde krijgers (hoofd en gezicht)2. Inclusief extremiteitstrauma's en hoofd- en nekletsel zijn verantwoordelijk voor >80% van de gevechtsverwondingen in recente conflicten2. Ondanks het vrij bekende vermogen van skeletspieren om te herstellen, te regenereren en te hermodelleren na een blessure, zijn deze ernstigere verwondingen, waarbij een aanzienlijk deel van het spierweefsel verloren gaat, niet in staat om op zichzelf te genezen en worden ze Volumetric Muscle Loss (VML) -verwondingen genoemd. Per definitie resulteert VML in permanente esthetische en functionele tekorten van de geblesseerde spier of de spiereenheid3.

Interessant is dat, ondanks de prevalentie van craniofaciale VML-verwonding 2,4, veel van het onderzoek tot nu toe gericht is op ledematen 5,6,7,8 en romp 9,10,11 spieren, met slechts een handvol rapporten over VML-verwondingen in craniofaciale spieren 12,13,14. Dit vormt een potentieel belangrijke translationele onderzoekslacune, aangezien de bestaande literatuur suggereert dat er significante verschillen zijn in zowel ontwikkelingsbiologie als regeneratief vermogen tussen craniofaciale en ledemaat- en rompspieren15,16. In feite zijn er meer dan 20 spieren aan elke kant van het gezicht - een weerspiegeling van het feit dat het craniofaciale gebied betrokken is bij het uitvoeren van veel essentiële taken die zo divers zijn als knipperen, slikken en kauwen15. Bovendien ontstaan er zelfs tussen craniofaciale spieren verschillen met betrekking tot het regeneratief vermogen. Extraoculaire spieren lijken bijvoorbeeld sneller te regenereren dan ledemaatspieren17. Daarentegen vertoont de kauwspier een langzamere regeneratieve respons dan de tibialis anterior (TA)18. Deze verschillen kunnen, althans gedeeltelijk, te wijten zijn aan de vraag of de oorsprong van de spieren branchiomeer of somiet-afgeleid is - wat resulteert in zowel verschillende hoeveelheden satellietcellen als verschillende genexpressieprofielen van de residente satellietcelpopulaties19. Beschouwing van de unieke kenmerken van craniofaciale spieren, evenals ten opzichte van ledemaat- en rompspieren, kan belangrijke mechanistische inzichten opleveren voor een betere therapeutische ontwikkeling van op maat gemaakte behandelingsopties die spierspecifieke VML-letsels aanpakken. Deze spierspecifieke verschillen kunnen ook de bekende beperkingen van lakenachtige spieren, zoals de latissimus dorsi, verklaren als opties voor het overbrengen van donorspierweefsel voor reconstructieve hoofd- en nekoperaties 20,21,22.

Ongeacht de locatie van het VML-letsel, er zijn momenteel geen behandelingen die de volledige vorm en functie kunnen herstellen. Klinische behandeling volgens de gouden standaard omvat zowel autologe weefseloverdracht als revalidatie; De eerste verbetert echter meestal de kracht niet en kan resulteren in morbiditeit op de donorplaats 3,23, terwijl de laatste het bewegingsbereik verbetert, met minimale impact op functioneel herstel of de terugkeer van contractiele kracht, in de spier 1,6. Om al deze redenen wordt er onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van effectievere therapeutische benaderingen voor de regeneratie van functioneel spierweefsel na VML-letsel. Een recente analyse benadrukte het cruciale belang van preklinische studies in rattenmodellen van VML-letsel voor het bevorderen van regeneratieve technologieoplossingen voor VML-reparatie1.

Zoals opgemerkt in eerder werk 5,8,9,10,24,25, is het beoordelen van functioneel herstel na VML van cruciaal belang voor het evalueren van de effectiviteit van therapeutische interventies. Hoewel wondgenezing en volumeherstel de belangrijkste kenmerken zijn van VML-herstel, helpt het meten van krachtherstel na letsel en behandeling om licht te werpen op de multiscale biomechanische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor VML-tekorten, evenals op de mechanismen die functioneel herstel stimuleren. Als zodanig is het leggen van een verband tussen weefselherstel, volumeherstel en verbeterde spierkracht een absolute vereiste voor het identificeren van de meest effectieve regeneratieve oplossingen voor VML-herstel9.

In dit opzicht zijn er drie hoofdmethoden voor het uitvoeren van deze functionele metingen: (1) in vitro, (2) in situ en (3) in vivo testen - elk met zijn eigen voor- en nadelen8. In-vitrotesten omvatten bijvoorbeeld het onderzoek van de geïsoleerde spierfunctie buiten het levende organisme en bieden de mogelijkheid om spierstimulatie directer/specifieker te manipuleren met een verscheidenheid aan medicijnen en chemicaliën die de prikkelbaarheid en samentrekking van de spieren beïnvloeden26. Hoewel deze methode gedetailleerd onderzoek mogelijk maakt naar cellulaire en moleculaire aspecten van spierfunctie en herstel27, verwijdert het de bloedtoevoer en innervatie, wat beperkt hoe goed het de ware spierfunctie recapituleert 8,26. In situ testen beoordeelt de spierfunctie terwijl de spier zich nog op zijn natuurlijke anatomische locatie bevindt, maar geïsoleerd is van de omliggende weefsels25,28. Hoewel deze methode de innervatie en bloedtoevoer in stand houdt, kan de scheiding van de spier nog steeds de toepasbaarheid van bevindingen op de in vivo omgeving beperken. Bovendien, en misschien wel het belangrijkste, zijn zowel in-situ als in-vitrotesten terminale procedures die longitudinale tests uitsluiten - die nodig zijn om functioneel herstel in de loop van de tijd op hetzelfde dier te kunnen volgen. In vivo testen daarentegen, waarbij de spierfunctie in de oorspronkelijke omgeving wordt geëvalueerd, maakt een vollediger begrip van spierprestaties in een fysiologische context mogelijk29. In vivo onderzoeken zijn ook de minst invasieve techniek en kunnen in de loop van een onderzoek herhaaldelijk worden uitgevoerd29. Met behulp van percutane elektrische zenuwstimulatie kan men functionele metingen in specifieke spieren verzamelen terwijl pezen, vasculatuur en innervatie intact blijven30. Deze longitudinale beoordelingen kunnen inzicht geven in subtiele, maar belangrijke veranderingen die optreden tijdens verschillende stadia van genezing in hetzelfde dier. Deze methode wordt vaak gebruikt in modellen van kleine knaagdieren 8,31,32,33; Het is echter ook gebruikt in grotere diermodellen van Varken30 en Hond34.

Er zijn momenteel drie gepubliceerde studies over de beoordeling van functioneel herstel na craniofaciale VML-verwondingen. Rodriguez et al. rapporteren over een methode voor het repareren van een craniofaciale VML-letselmodel in de jukbeenderen van de schaap. Hun methode beschrijft een in situ testprotocol dat alleen kan worden geïmplementeerd op het terminale studietijdstip, en staat dus geen longitudinale beoordeling binnen een enkel dier toe13. Kim et al. beschrijven een methode voor het gebruik van nanomembraanelektronica om continue elektromyogramgegevens van muizenkauwen na een VML-letsel te volgen. Ze rapporteerden een significant lager signaal van gewonde muizen in vergelijking met controle, maar ze merkten ook op dat bewegingsartefacten de signaalanalyse beïnvloedden en dat de muizen af en toe probeerden het circuit te krassen. Bovendien werden athymische, naakte muizen gebruikt om een veilige bevestiging van het nanomembraan aan de huid mogelijk te maken, wat momenteel een breder gebruik van deze methode in meer algemeen gebruikte (en kosteneffectieve) diermodellen verhindert12. Ten slotte beschrijven Zhao et al. een kritisch VML-defect in de muiskauwspier, dat de voeding van de dieren schaadt, zoals weerspiegeld in een significant verminderde gewichtstoename, als een functionele uitkomst14. Met deze studies in het achterhoofd beschrijft dit artikel een veelzijdige en minimaal invasieve methode voor de in vivo longitudinale beoordeling van de contractiele functie in de kaak van de rat voor en na een VML-letsel via stimulatie van de nervus trigeminus met subcutane elektroden. Terwijl de test een reeks toenemende simulatiefrequenties (20-200 Hz) doorloopt, meet een transducer de gegenereerde kracht van de spier. Met deze metingen kunnen onder andere de spierstijfheid en maximale tetanus worden bepaald. Het onderstaande protocol is bedoeld om functioneel herstel van ipsilaterale bijtkracht na een traumatisch VML-letsel te beoordelen en bevat als zodanig ook een protocol voor het chirurgisch creëren van een gevalideerd VML-letsel. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op een breed scala aan ratten en muizen - en is, met de juiste aanpassingen aan de apparatuur, ook van toepassing op grotere diermodellen en VML-verwondingen30.

Protocol

Alle omgang met en procedures voor dieren zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de University of Virginia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De ratten die in deze experimenten werden gebruikt, waren 12-14 weken oude mannelijke Lewis-ratten met een gewicht van 324,8 g ± 12,72 g op het moment van de operatie. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. VML-letsel van de kauwspier

  1. Voorbereiding van de apparatuur
    1. Zorg er voorafgaand aan de operatie voor dat alle benodigde instrumenten op de juiste manier zijn gesteriliseerd: chirurgische lakens, scalpel, pincet, microschaar, hemostaten, hechtingen en gaas.
    2. Schakel een verwarmd platform in en stel het in op 37 °C.
    3. Breng steriele oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van de ogen onder narcose te voorkomen. Plaats het dier in de anesthesie-inductiekamer en dien 2%-3% isofluraan toe (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Chirurgische creatie van VML-letsel
    1. Zorg ervoor dat het dier goed verdoofd is voordat u het uit de kamer haalt.
      OPMERKING: Dit kan worden bepaald als het dier niet reageert op een teenbeknelling.
    2. Weeg en plaats het dier op een operatiebord in de zijligging aan de linkerkant, met de neus stevig in de neuskegel om de verdere toediening van isofluraan mogelijk te maken.
    3. Bereid het dier voor op een operatie door de juiste pijnstiller toe te dienen, de rechterkant van het gezicht te scheren en het gebied te steriliseren door drie keer jodium en alcoholdoekjes te vervangen. Voor deze onderzoeken werd buprenorfine met verlengde afgifte gebruikt voor analgesie (0,65 mg/kg lichaamsgewicht).
    4. Begin de operatie door een incisie van ongeveer 2 cm te maken langs het buccale gebied van de rat. De incisie moet in lijn zijn met de neus en het oor van het dier. Gebruik stompe dissectie om de huid en fascia te scheiden.
    5. Maak een soortgelijke incisie langs de fascia en ontleed deze voorzichtig weg van de onderliggende kauwspier.
    6. Lokaliseer de buccale en marginale zenuwen (Figuur 1A). Gebruik een steriele chirurgische marker en liniaal om het te verwijderen gebied te markeren. Het gebied moet een rechthoek van 10 mm x 5 mm zijn in het midden van de blootgestelde kauwspier die tussen de aangezichtszenuwen ligt (Figuur 1B).
    7. Gebruik voorzichtig een microschaar om te beginnen met het verwijderen van weefsel. Zorg ervoor dat de uiteindelijke verwonding een diepte van ongeveer 4 mm bereikt met 150 mg weggesneden weefsel (Figuur 1C). Het verwijderde weefsel zal over de volle dikte van de oppervlakkige kauwspier zijn en gedeeltelijk in de diepe kauwspier gaan.
      OPMERKING: De gemiddelde massa weefsel die in deze experimenten werd verwijderd, was 146,1 mg ±1,16 mg.
    8. Sluit de fascia en de huid met respectievelijk resorbeerbare (6-0) en niet-resorbeerbare (5-0) onderbroken hechtingen.
  3. Opschonen en monitoren
    1. Schakel na het hechten het anesthesiegas uit en houd het dier op het verwarmde oppervlak om te controleren of het weer bij bewustzijn komt. Zodra de rat weer bij bewustzijn begint te komen, plaatst u het dier terug in de kooi en blijft u toezicht houden totdat het wakker en ambulant is.
    2. Controleer het dier gedurende 3 dagen na de operatie en beoordeel op tekenen van pijn of ongemak.
    3. Geef het dier gedurende 7 dagen na de operatie zacht voer om de kaak minder te belasten en de dieren goed gehydrateerd/gevoed te houden.
    4. Verwijder de onderbroken hechtingen 7-10 dagen na de operatie en zorg ervoor dat de wond volledig gesloten is voordat u ze verwijdert.
    5. Na het eindtijdstip van het onderzoek, euthanasie dieren volgens de IACUC-richtlijnen. Explanteer kauwspieren en bevries ze snel door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof of met vloeibare stikstof gekoeld isopentaan.
      OPMERKING: Ingevroren weefselmonsters kunnen langdurig bij -80 °C worden bewaard voor toekomstige histologische beoordeling.

2. In vivo functionele beoordeling van de kaak

  1. Voorbereiding van de apparatuur
    1. Controleer en zorg voor de juiste aansluiting van alle apparatuur.
    2. Schakel om (1) de computer, (2) de tweefasenstimulator, (3) het dual-mode hendelsysteem en ten slotte (4) een verwarmd platform in om het op te warmen tot 37 °C.
      NOTITIE: In de gebruikershandleiding staat een opwarmtijd van 1 minuut voor de stimulator en het hendelsysteem om nauwkeurige metingen te produceren. Wacht bovendien 10-15 minuten voordat het platform volledig is opgewarmd voordat u dieren test.
    3. Breng steriele oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van de ogen onder narcose te voorkomen. Plaats het te testen dier in de anesthesie-inductiekamer en geef 2%-3% isofluraan.
    4. Steriliseer de met polytetrafluorethyleen beklede elektrodetips door ze in 70% ethanol te plaatsen.
    5. Zoek en open de Dynamic Muscle Control (DMC)-software. Dit is nodig om de functionele beoordeling uit te voeren.
  2. Software instellen
    1. Zoek in de DMC-software Instant Stim in het setup-menu en wijzig de parameters in de gewenste waarden. In dit onderzoek worden geen parameters gewijzigd ten opzichte van hun voorinstellingen (Figuur 2A).
    2. Maak en selecteer in het menu Instellingen een map voor automatisch opslaan om de gegevens op te slaan.
    3. Zoek onderaan het softwarescherm een vak met de naam Autosave Base. Verander dit in een titel die specifiek is voor het dier dat wordt getest, bijvoorbeeld "rat#-timepoint" (Figuur 2B).
    4. Selecteer Sequencer bovenaan het softwarescherm. Selecteer in het nieuwe venster dat wordt geopend de optie Reeks openen onder aan het scherm. Selecteer de vooraf gemaakte reeks in de bestandsverkenner die wordt geopend. Hiermee wordt het sequentievenster gevuld met een lijst met parameters zoals frequentie, duur van stimuli en rusttijd (Figuur 2C).
      1. Klik op Laadvolgorde gevolgd door Venster sluiten.
        OPMERKING: De volgorde die in dit protocol wordt gebruikt, bestaat uit 9 stappen (twitch, 20 Hz, 40 Hz, 50 Hz, 60 Hz, 80 Hz, 100 Hz, 150 Hz, 200 Hz) met 20 s rust tussen elk. Afgezien van de spiertrekkingsstimulatie duren alle stappen 500 ms. Het sequentieprotocol moet worden aangepast aan de specifieke testdoelen van elk laboratorium.
    5. Als u een nieuw venster wilt openen en de weergave van realtime gegevensverzameling wilt inschakelen, selecteert u Bestand > Live Data Monitor.
    6. Stel in het venster Live Data Monitor de tijdschaal, het minimum y-waarde en het maximum y-waarde handmatig in of door het vakje aan te vinken om automatisch schalen in te schakelen.
  3. Voorbereiding van dieren
    1. Zorg ervoor dat het dier zich in het juiste anesthesievlak bevindt voordat u het uit de anesthesiekamer haalt.
    2. Plaats het dier in rugligging met de neus stevig in de neuskegel om de verdere toediening van isofluraan mogelijk te maken. Plaats een bevestigingslus over de bovenste helft van de kaak van de rat om zijn neus stevig op het platform te houden.
    3. Scheer de nek en het gezicht van het dier aan de experimentele kant van de kaak.
    4. Zet de bovenste helft van het dier vast door een riem over zijn armen en borst te plaatsen en vast te maken.
    5. Pas de positie van de beethendel aan met behulp van de drie draaiknoppen in de buurt van het platform van de rig om de X-, Y- en Z-vlakken te bedienen (Figuur 3A). Gebruik de bovenste knop om de bijthendel naar beneden te brengen in de richting van het dier en gebruik de andere twee knoppen om het uiteinde van de hendel net boven de kin van het dier te stellen.
    6. Gebruik een pincet om de ophanglus om de ondertanden van het dier te haken om de kop vast te zetten en te voorkomen dat deze beweegt (Figuur 3B).
      NOTITIE: De lus bevindt zich door een gat dat in de bijthendel is geboord op 3 cm afstand van de krachtopnemer. Het systeem moet voor het eerste gebruik worden gekalibreerd.
    7. Pas de hoogte van de hendel aan om de spanning op de kaak te verhogen. De reproduceerbare basisspanning die in deze experimenten werd gebruikt, was ~ 0,5 N.
  4. Plaatsing van de elektrode
    1. Palpeer de kaak van het dier en lokaliseer de achterste hoek van de onderkaak. Plaats de elektroden subcutaan aan weerszijden van de hoek op ongeveer 2-3 mm afstand van elkaar. Elektroden moeten op een diepte van 3-5 mm worden ingebracht. Gebruik een krokodillenklem en standaard om de elektroden op hun plaats te houden.
    2. Klik in het Live Data Monitor-venster op de grote oranje knop met het label Instant Stim om deze te activeren.
    3. De monitor zou tijdens elke stimulatie opwaartse pieken moeten gaan vertonen. Pas de plaatsing van de elektrode en de positie van de hefboomarm indien nodig aan met behulp van de knoppen. Alleen activering van de ipsilaterale zijde van de kaak moet worden waargenomen (Figuur 4).
    4. Op de krachtige tweefasenstimulator bevinden zich twee knoppen in het midden, met het label "Bereik" en "Aanpassen". Begin met het draaien van de Range-knop om de stroomsterkte te moduleren. Naarmate de stroomsterkte toeneemt, zullen de onmiddellijke stim-pieken in omvang beginnen toe te nemen totdat ze plateau bereiken - bepaald als het niveau waarop drie opeenvolgende stimulaties resulteren in identieke contractiele reacties.
      1. Vermijd het te hoog zetten van de stroomsterkte, dat wil zeggen niet meer dan 20% boven de stroomsterkte waar maximale pieken werden waargenomen - omdat dit kan leiden tot de rekrutering van naburige spieren en onnauwkeurige krachtmetingen.
    5. Draai aan de regelknop om het percentage van het huidige "bereik" te moduleren dat wordt gebruikt om de kaak te stimuleren. Een verhoging of afname van de stroom kan nodig zijn om de twitch-respons te optimaliseren.
    6. Controleer of de elektroden nog goed op hun plaats zitten en stop de instant stim.
    7. Zoek onder de oranje knop "Instant Stim" in de live datamonitor de grijze knop Start Sequence en klik erop.
    8. Blijf de rondingen volgen tijdens de duur van het stimulatieprotocol. Naarmate de stimulatiefrequentie toeneemt, neemt ook de maximale geproduceerde kracht toe. Zodra tetanus is bereikt, zullen de krachtcurven plateau bereiken (Figuur 5A).
  5. Opruimen
    1. Na voltooiing van de functionele stimulatiesequentie, verwijdert u de elektroden en veegt u ze schoon met 70% ethanol. Als dit het laatste dier is dat getest moet worden, kunnen de elektroden terug in hun hoezen worden geplaatst.
    2. Schakel het anesthesiegas uit, maar houd het dier op het verwarmde oppervlak om te controleren of het weer bij bewustzijn komt. Zodra de rat weer bij bewustzijn begint te komen, plaatst u hem terug in de kooi en blijft u toezicht houden totdat het dier wakker en ambulant is.
    3. Schakel de apparatuur uit die wordt gebruikt voor gegevensverzameling en veeg alle oppervlakken schoon.

3. Gegevensanalyse

OPMERKING: Deze methode is eerder beschreven als het documenteren van een methode voor het in vivo functioneel testen van de TA8-rat. Gegevensanalyse is bedoeld om de bedoelingen van dit onderzoek te bepalen, en protocollen kunnen veranderen afhankelijk van de doelen van de gebruiker.

  1. Zoek en open de Dynamic Muscle Analysis-software .
  2. Klik op het menu Hoge doorvoer en selecteer Krachtfrequentieanalyse om meerdere monsters tegelijk te analyseren.
  3. Selecteer Bestanden kiezen en markeer zoveel gegevensbestanden als gewenst voor analyse. De knop "Map kiezen" kan ook worden gebruikt als voorbeelden een duidelijke naam hebben in het bestandssysteem.
  4. Vink het vakje aan om Basislijn te verwijderen. Hierdoor wordt de basiskracht automatisch verwijderd van de maximale kracht die voor elke proef is geregistreerd, waardoor de absolute maximumwaarden worden verkregen.
  5. Klik op de knop Analyseren en klik vervolgens op Tabel exporteren naar Excel , waar de gegevens als spreadsheet kunnen worden opgeslagen. Zorg ervoor dat de waarden "Start Cursor" en "End Cursor" de tijdstempel van de stimulatie nauwkeurig weergeven. Deze waarden kunnen indien nodig handmatig worden ingesteld.
  6. Open de opgeslagen spreadsheet.
    OPMERKING: Met behulp van de kolom "Maximum" kan de gebruiker de maximale kracht berekenen die over alle frequenties wordt geproduceerd. De kracht-frequentiecurve kan ook worden gegenereerd (Figuur 5).

Resultaten

Zoals beschreven in een eerdere publicatie, kunnen de tetanische curven worden gebruikt om optimale resultaten te onderscheiden van suboptimale resultaten8. Een ideaal resultaat wordt verkregen wanneer de spier wordt gestimuleerd tot zijn maximale kracht en dat maximum behoudt gedurende de duur van de tetanische contractie. De som van de individuele spiertrekkingen in tetanische curven begint meestal te verschijnen bij of na 100 Hz. Figuur 5A laat dit punt zien, aangezien de ideale curve bij 150 Hz een scherpe opwaartse beweging heeft aan het begin van de stimulatie, een vlakke plateaufase bij de maximale krachtwaarde met minimale oscillatie, en een scherpe, verticale neerwaartse beweging wanneer de stimulatie stopt. Niet-ideale tetanische curven kunnen oscillaties vertonen tijdens de plateaufase en kunnen een negatieve of positieve helling vertonen (Figuur 5C,D).

De resultaten van dit functionele testprotocol kunnen anders worden weergegeven, afhankelijk van de doelen van de onderzoekers en de experimentele opzet voor het onderzoek. In het geval van dit protocol wordt de absolute maximale kracht empirisch bepaald op basis van alle stimulatiefrequenties en op elk testtijdstip in een grafiek weergegeven. Dit maakt het mogelijk om de maximale krachtproductie bij aanvang te vergelijken met de maximale krachtproductie elke 4 weken na het ontstaan van het beschreven VML-letsel in de kauwspier (Figuur 1D). Ter vergelijking werd ook op elk tijdstip een cohort van niet-gewonde dieren (n = 4) getest (Figuur 1E). De diergewichten op elk tijdstip werden ook vergeleken (Figuur 1F). Respectievelijk 4, 8 en 12 weken na VML produceerden de ratten een gemiddelde maximale kracht van 7.958 N ±1.797 N, 7.183 N ±1.450 N en 7.823 N ± 0.626 N. One-way Repeated Measures Analysis of Variance (ANOVA) met Fisher's Least Significant Difference (LSD) post hoc paarsgewijze vergelijkingen bepaalden dat er geen statistisch significante verschillen waren tussen deze waarden op enig tijdstip na VML-letsel, ze verschilden echter allemaal significant van de gemiddelde basislijnkracht van 10.031 N ±0.564 N.

figure-results-1
Figuur 1: Chirurgisch schematisch en functioneel Geëxplanteerde kauwspier met anatomische oriëntatie en zenuworiëntatie voor het ontstaan van blessures (A). Dier tijdens de operatie voor (B) en na (C) het ontstaan van VML-letsel. Afbeeldingen worden allemaal gepresenteerd met spieren in dezelfde richting als (A). De gele stippellijn geeft het gebied aan waar de spier moet worden weggesneden. Maximale krachtproductie bij baseline en in de loop van de tijd bij ratten die een VML-verwonding (n = 9) aan de kauwspier (D) hebben opgelopen, evenals bij controleratten van dezelfde leeftijd die ongedeerd zijn gebleven (n = 4) (E). Een grafiek van het lichaamsgewicht van ratten in de loop van de tijd (F). (D) vertegenwoordigt een eenrichtings-ANOVA met herhaalde metingen met Fisher's LSD post hoc paarsgewijze vergelijkingen, waarbij **= p < 0,01, ***= p < 0,001, ****= p < 0,0001. Linialen in (A) en (C) zijn in centimeters, met schaalverdelingen in millimeters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Software-initialisatie voor functioneel testen. Parameter ingesteld voor de DMC-software. Instant Stim instellen op de gewenste waarden (A). Software Grafische gebruikersinterface en locatie van het AutoSave Base-instellingenvak (B). Selectie van de 9-stappen protocolsequentie die wordt gebruikt voor het testen (C). De waarden die hier worden weergegeven, zijn voorbeeldwaarden die voor dit onderzoek zijn gebruikt, maar ze moeten mogelijk worden geoptimaliseerd en aangepast, afhankelijk van de specifieke gebruiksscenario's van anderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Functionele bewegingsassen van de rig en de juiste positionering van de dieren. Het schema illustreert de relatie tussen elk van de drie stelwielen op de functionele testbank en de bijbehorende bewegingsassen voor de hefboomarm (A). Voorbeeldafbeelding van een rat die functionele tests ondergaat, waarop de juiste rugligging van het dier op het platform en andere belangrijke rig-componenten te zien is (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Voorbeeld van unilaterale en bilaterale kaakactivering tijdens het testen. (A) toont de kaak van de rat in rust voorafgaand aan enige stimulatie. Verkeerd geplaatste elektroden kunnen leiden tot een bilaterale kaakcontractie, zoals aangegeven door de gele pijlen (B), terwijl correct geplaatste elektroden resulteren in de gewenste ipsilaterale contractie (C). Gele pijlen geven punten van samentrekking in de kaak aan. Ook worden voorbeelden van kracht-tijdcurves bij 150 Hz getoond voor bilaterale (D) en unilaterale (E) spieractivering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve stimulatie-responscurves voor aanvaardbare en onaanvaardbare proeven. Voorbeeld stimulatiecurves bij 40, 80 en 150 Hz (A) om te laten zien waar u op moet letten in de aanloop naar en tijdens een tetanische contractie. Naarmate de stimulatiefrequentie toeneemt, is de geregistreerde piekspanning ook hoger, wat kan worden waargenomen in de kracht-frequentiecurves (B) die het gemiddelde van de gewonde dieren (n = 9) weergeven bij aanvang en 8 weken na het aanmaken van VML. (C,D) demonstreren representatieve voorbeelden van de vorm van een krachtrespons die zou wijzen op de noodzaak van elektrode-aanpassing als gevolg van onjuiste tetanus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor het in vivo functioneel testen van de ipsilaterale bijtkracht die in de kaak van de rat wordt geproduceerd. Ook wordt een methode beschreven voor het chirurgisch creëren van een VML-letsel in de kauwspier van de rat. In combinatie bieden deze methoden een biologisch relevant diermodel om een longitudinale evaluatie uit te voeren van functioneel herstel voor en na een traumatisch craniofaciale verwonding. Hoewel andere testmethoden, zoals in vitro en in situ, ook waardevolle informatie kunnen opleveren, vereisen ze de isolatie van de pees en de verwijdering van het weefsel uit zijn oorspronkelijke omgeving, waardoor hun toepasbaarheid wordt beperkt tot een beter begrip van in vivo functionele resultaten 8,25,26,27,28 . Met de juiste training en oefening kan een onderzoeker een dier snel positioneren voor testen en de nodige aanpassingen maken om maximale spierkrachtproductie te bereiken.

Er zijn technische details die voor elk dier moeten worden geverifieerd om een goede plaatsing en stimulatie van de elektroden te garanderen. Eerst moeten de bovenste snijtanden zo worden vastgezet dat de kop van de rat volledig in contact is met het verwarmde platform. Hierdoor blijft ook de neus van de rat in de neuskegel zitten voor continue toediening van inhalatieverdovingsmiddel. Als het hoofd niet in de juiste positie wordt gehouden, zullen er inconsistenties zijn in de krachtmetingen omdat de basisspanning afwijkt. Bovendien moet het lichaam van het dier in rugligging liggen en moet de ruggengraat recht zijn. Door het dier in de juiste positie te houden, kunt u de elektrode op de juiste plaats plaatsen en onderhouden. Ten slotte kan de plaatsing van de elektroden moeilijk zijn, omdat ze op de juiste diepte en afstand moeten worden geplaatst om alleen de experimentele kant van de kaak te stimuleren. Waakzaamheid en oefening zijn relevant om bedreven te worden in het plaatsen van elektroden voor reproduceerbare en betrouwbare resultaten. De elektroden worden vrij snel dof, dus het is noodzakelijk om ze vaak te vervangen. De kenmerken van een slechte plaatsing van de elektroden zijn activering van accessoire spieren, positief/negatief hellende krachtmetingen (beweging van elektroden tijdens stimulatie) of een niet-gefuseerde/oscillerende tetanische golfvorm8 (Figuur 5C,D).

Bovendien zijn er enkele beperkingen aan deze methode die het waard zijn om in toekomstige toepassingen van dit systeem te vermelden en te overwegen. Ten eerste, hoewel voldoende voor de metingen die in dit onderzoek zijn gedaan, is de lus die wordt gebruikt om de bovenkaak vast te zetten misschien niet het meest stijve systeem. In plaats daarvan zou een stereotactische benadering met behulp van oorstangen een betere grip op de bovenkaak van de rat kunnen creëren. Bovendien werd een passieve spanningswaarde gebruikt als de ingestelde positie voor het testen met deze methode, wat mogelijk niet resulteert in de maximale krachtgeneratie die zou worden verkregen als de spier op zijn optimale lengte (Lo) zou worden gepositioneerd. In feite kan de Lo worden bepaald door het dier te positioneren zoals hierin beschreven en vervolgens de kaakocclusie in kleine stappen (0,5-1 mm) te manipuleren tijdens het uitvoeren van spiertrekkingsstimulaties - waarbij Lo wordt bepaald als de optimale testpositie waar de maximale spiertrekkingskracht werd gegenereerd. De kauwspier heeft echter een vrij unieke geometrie en voortbeweging35,36, en werkt daarom over een veel breder lengtebereik dan kenmerkend voor bijvoorbeeld ledemaatspieren (die meestal rond Lo opereren). Kauwen gebeurt echter in een beperkt bereik in vergelijking met bijten. Als zodanig is er geen perfecte aanpak voor dit probleem. Dus hoewel het instellen van een basisspanning niet de enige manier is om dit probleem aan te pakken, is er een logische wetenschappelijke reden om dit te doen, aangezien de optimale lengte van de kaakspieren verder gaat dan de natuurlijke opening van de kaak. Hoe dan ook, maximale kracht bij een gegeven passieve spanning geeft nog steeds belangrijk inzicht in aspecten van functie - zelfs als ze verschillen van maximale kracht bij Lo. Het is duidelijk dat verder onderzoek naar de kracht-lengterelatie van de kauwspier gerechtvaardigd is. Ten slotte wordt bij deze methode gekeken naar de stimulatie van de nervus trigeminus bij de rat, die is verdeeld in drie takken: V1-V3. Hoewel V3, of de mandibulaire zenuw, de enige tak is met een motorische component, innervert het wel meerdere spieren, waaronder de kauwspier, temporalis, pterygoïden en mylohyoïde37. Dit is belangrijk om te overwegen, omdat het betekent dat deze methode niet uitsluitend de kracht van de kauwspier rapporteert, wat relevant kan zijn voor andere onderzoeken.

Ondanks deze technische aspecten en beperkingen blijkt deze methode robuust en consistent te zijn. Hoewel hierin alleen ipsilateraal testen worden beschreven, kan het protocol eenvoudig worden aangepast om aanvullend testen van de andere kant van de kaak op te nemen. Bilateraal testen van de contractie/functie van de kauwspier zou het mogelijk maken om gezonde/gewonde vergelijkingen te maken binnen een enkel dier, wat misschien belangrijke compenserende veranderingen aan de gewonde en/of controlezijde (niet-gewonde zijde) zou kunnen ophelderen. Over het algemeen biedt dit model een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van de longitudinale spierfunctie, evenals functioneel herstel, op een minimaal invasieve manier. Als zodanig zal dit systeem van toepassing zijn op het evalueren van biomechanische mechanismen die gepaard gaan met VML-gemedieerde functionele tekorten, evenals op het testen van de werkzaamheid van verschillende therapieën voor het herstel van VML-letsels in het craniofaciale gebied.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Myologica LLC voor het delen van de apparatuur die wordt gebruikt om functionele beoordelingen uit te voeren. Het onderzoek in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of Dental & Craniofacial Research van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer U24 DE029463. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
200 proof ethanolDecon LabsVerdund tot 70% met gedeïoniseerd water
25 mm x 27 G monopolar naaldelektrodenChalgren Enterprises111-725-24TPWordt gebruikt om functionele metingen uit te voeren
Alcohol doekjesBD326895Voor sterilisatie/reiniging
Alligator Clip en Stand/ Helping Hand SoldeerhulpEclipse Enterprise115584Houdt elektroden op hun plaats
Kralensterilisator18000-45Voor chirurgie (hersteriliseert gereedschap tussen dieren in)
Bi-fasische elektrische stimulatorAurora Scientific701CGeeft elektrische impulsen af aan dieren tijdens functionele tests
Bijdrage-hendelAangepast Aangepast 3D geprint (neem contact op met de auteurs voor details)
Gecomprimeerd zuurstofgasPraxairUN1072
Wattenstaafjes met katoenFisher22363157Voor chirurgie
Dual Mode SpierhendelsysteemAurora Scientific309CWordt gebruikt om functionele metingen uit te voeren
Dynamisch Spier Data Acquisitie en Analyse SysteemAurora Scientific615AWordt gebruikt om functionele metingen te verzamelen en analyseren
GezichtsmaskerHigh FiveAM101Voor chirurgie
PincetIntegra Miltex6-100 Voor chirurgie
GaasMedlinePRM21408CVoor chirurgie
HaarschaarPhillipsMG3750Haarverwijdering
VleesnetVWR75829-204Voor chirurgie
IsofluraanCovetrud29405
Isofluraanevaporisator trechter vullingVet Equip911103
Isofluraan verdamperKent ScientificVetFlo-1231Toediening van anesthesie
Grote knaagdier/kleine dieren apparaatAurora Sceintific807BWordt gebruikt met 309C motor voor functionele metingen
MicroschaarFST91500-09Voor chirurgie
NaalddriverFST1200-13Voor chirurgie
Povidon-jodiumMedlineMDS093943Voor sterilisatie/reiniging
Prolene Hechtdraad 5-0Ethicon8698GHechten van huid
SchelpPersonna Medical73-8030Voor chirurgie
SchelpbladGlass Van1834Voor chirurgie
Chirurgische doeken - ACT materiaalN/AN/ASnijden tot 8 x 11 in en autoclaven voorafgaand aan de chirurgie
Chirurgische handschoenenEncore5711103PFVoor chirurgie
Chirurgische jasVWR414004-467Voor chirurgie
T/Pump Verwarming/Koeling PompBraintree Scientific, IncTP-700Verwarmen van dierplatforms voor chirurgie en functietesten - ingesteld op continue therapietijd bij 38/100 temperatuur
VaporGuard Geactiveerde koolstoffilterVet Equip931401
Vicryl Hechtdraad 6-0EthiconJ492GHechten van fascia

Referenties

  1. Kulwatno, J., Goldman, S. M., Dearth, C. L. Volumetric muscle loss: A bibliometric analysis of a decade of progress. Tissue Eng Part B: Rev. 29 (3), 299-309 (2023).
  2. Owens, B. D., et al. Combat wounds in Operation Iraqi Freedom and Operation Enduring Freedom. J Trauma. 64 (2), 295-299 (2008).
  3. Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research Consortium. Volumetric Muscle Loss. J Am Acad Orthop Surg. 19, S35-S37 (2011).
  4. Lew, T. A., Walker, J. A., Wenke, J. C., Blackbourne, L. H., Hale, R. G. Characterization of craniomaxillofacial battle injuries sustained by United States service members in the current conflicts of Iraq and Afghanistan. J Oral Maxillofac Surg. 68 (1), 3-7 (2010).
  5. Dienes, J., et al. Semisynthetic hyaluronic acid-based hydrogel promotes recovery of the injured tibialis anterior skeletal muscle form and function. ACS Biomater Sci Eng. 7 (4), 1587-1599 (2021).
  6. Aurora, A., Garg, K., Corona, B. T., Walters, T. J. Physical rehabilitation improves muscle function following volumetric muscle loss injury. BMC Sports Sci Med Rehabil. 6, 41(2014).
  7. Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. BioRes Open Access. 1 (6), 280-290 (2012).
  8. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. J Vis Exp. 116, e54487(2016).
  9. Passipieri, J. A., et al. In silico and in vivo studies detect functional repair mechanisms in a volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 25 (17-18), 1272-1288 (2019).
  10. Corona, B. T., et al. Further development of a tissue-engineered muscle repair construct in vitro for enhanced functional recovery following implantation in vivo in a murine model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 18 (11-12), 1213-1228 (2012).
  11. Chen, X. K., Walters, T. J. Muscle-derived decellularised extracellular matrix improves functional recovery in a rat latissimus dorsi muscle defect model. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 66 (12), 1750-1758 (2013).
  12. Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci (Weinh). 8 (17), 2101037(2021).
  13. Rodriguez, B. L., et al. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152(2020).
  14. Zhao, N., et al. A critical size volumetric muscle loss model in mouse masseter with impaired mastication on nutrition. Cell Prolif. 57 (6), e13610(2024).
  15. Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248(2021).
  16. Noden, D. M., Francis-West, P. The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles. Dev Dyn. 235 (5), 1194-1218 (2006).
  17. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Dev Biol. 397 (1), 31-44 (2015).
  18. Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
  19. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
  20. Aladimi, M. T., et al. Factors to consider when deciding on the type of free-flap reconstruction of head and neck soft tissue defects. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 79 (4), 230-238 (2017).
  21. Maxwell, G. P., Leonard, L. G., Manson, P. N., Hoopes, J. E. Craniofacial coverage using the latissimus dorsi myocutaneous island flap. Ann Plast Surg. 4 (5), 410-421 (1980).
  22. Strübing, F., et al. Scalp reconstruction using the latissimus dorsi free flap: A 12-year experience. J Clin Med. 12 (8), 2953(2023).
  23. Carnes, M. E., Pins, G. D. Skeletal muscle tissue engineering: Biomaterials-based strategies for the treatment of volumetric muscle loss. Bioengineering. 7 (3), 85(2020).
  24. Mintz, E. L., et al. Long-term evaluation of functional outcomes following rat volumetric muscle loss injury and repair. Tissue Eng Part A. 26 (3-4), 140-156 (2020).
  25. Westman, A. M., et al. A coupled framework of in situ and in silico analysis reveals the role of lateral force transmission in force production in volumetric muscle loss injuries. J Biomech. 85, 118-125 (2019).
  26. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. 69, e4198(2012).
  27. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. J Vis Exp. (71), e50036(2013).
  28. MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. (56), e3167(2011).
  29. Iyer, S. R., Valencia, A., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods Mol Biol. 1460, 293-307 (2016).
  30. Corona, B. T., Call, J. A., Borkowski, M., Greising, S. M. In vivo measurement of hindlimb dorsiflexor isometric torque from pig. J Vis Exp. (175), e62905(2021).
  31. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. J Vis Exp. (169), e62211(2021).
  32. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. J Vis Exp. (51), e2782(2011).
  33. Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12 (1), 246(2011).
  34. Childers, M. K., Grange, R. W., Kornegay, J. N. In vivo canine muscle function assay. J Vis Exp. (50), e2623(2011).
  35. Cox, P. G., Jeffery, N. Reviewing the morphology of the jaw-closing musculature in squirrels, rats, and guinea pigs with contrast-enhanced micro CT. Anat Rec. 294, 915-928 (2011).
  36. Nordstrom, S. H., Yemm, R. Sarcomere length in the masseter muscle of the rat. Arch Oral Biol. 12 (5), 895-902 (1972).
  37. Huff, T., Weisbrod, L. J., Daly, D. T. Neuroanatomy, Cranial Nerve 5 (Trigeminal). , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

In vivo-beoordelingspierfunctieletsel aan craniofaciale spierenpercutane zenuwstimulatiespierregeneratiefunctioneel herstelratmodelspiercontractie
In vivo functionele beoordeling van de kauwspier van ratten na chirurgische creatie van een volumetrisch spierverlies (VML) letsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.