Methodenartikel

Opheldering #946;-1,3-glucanase en peroxidase fysisch-chemische eigenschappen van het verdedigingsmechanisme van de tarwecelwand tegen de besmetting met diuraphis noxia

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66903

⸱

26 juli 2024

 ,  ,  , 
1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft procedures die worden gebruikt om celwandgerelateerde enzymen, voornamelijk β-1,3-glucanase en peroxidase, in tarweplanten te bestuderen en te karakteriseren. Hun activiteitsniveaus nemen toe tijdens de interactie tussen tarwe en RWA en zijn betrokken bij de afweerreactie van de plant door middel van celwandversterking, wat de voeding van bladluizen afschrikt.

Samenvatting

Tarweplanten die zijn aangetast door Russische tarwebladluizen (RWA) induceren een cascade van afweerreacties, waaronder de overgevoelige reacties (HR) en inductie van pathogenese-gerelateerde (PR) eiwitten, zoals β-1,3-glucanase en peroxidase (POD). Deze studie heeft tot doel de fysisch-chemische eigenschappen van celwand-geassocieerde POD en β-1,3-glucanase te karakteriseren en hun synergisme op de celwandmodificatie tijdens RWASA2-tarwe-interactie te bepalen. De vatbare Tugela, matig resistente Tugela-Dn1 en resistente Tugela-Dn5 cultivars werden voorgekiemd en geplant onder kasomstandigheden, 14 dagen na het planten bemest en elke 3 dagen geïrrigeerd. De planten werden besmet met 20 parthenogenetische individuen van dezelfde RWASA2-kloon in het 3-bladstadium en de bladeren werden 1 tot 14 dagen na de besmetting geoogst. De intercellulaire wasvloeistof (IWF) werd geëxtraheerd met behulp van vacuümfiltratie en opgeslagen bij -20 °C. Bladresten werden tot poeder vermalen en gebruikt voor celwandcomponenten. POD-activiteit en karakterisering werden bepaald met behulp van 5 mM guaicol-substraat en H2O2, waarbij de verandering in absorptie bij 470 nm werd gevolgd. β-1,3-glucanase-activiteit, pH en optimale temperatuuromstandigheden werden aangetoond door de totale reducerende suikers in het hydrolysaat te meten met DNS-reagens met behulp van β-1,3-glucaan- en β-1,3-1,4-glucaansubstraten, de absorptie bij 540 nm te meten en de glucosestandaardcurve te gebruiken. Het pH-optimum werd bepaald tussen pH 4 en 9, het temperatuuroptimum tussen 25 en 50 °C en de thermische stabiliteit tussen 30 °C en 70 °C. De specificiteit van het β-1,3-glucanasesubstraat werd bepaald bij 25 °C en 40 °C met behulp van wrongel- en gerst-β-1,3-1,4-glucaansubstraten. Bovendien werd het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase bepaald met behulp van laminaribiose tot laminaripentaose. De productpatronen van de oligosaccharidehydrolyse werden kwalitatief geanalyseerd met dunnelaagchromatografie (TLC) en kwantitatief geanalyseerd met HPLC. De methode die in deze studie wordt gepresenteerd, demonstreert een robuuste aanpak voor het besmetten van tarwe met RWA, waarbij peroxidase en β-1,3-glucanase uit het celwandgebied worden geëxtraheerd en hun uitgebreide biochemische karakterisering.

Inleiding

Russische tarwebladluizen (RWA) besmetten tarwe en gerst, wat leidt tot aanzienlijk opbrengstverlies of vermindering van de graankwaliteit. Tarwe reageert op besmetting door verschillende afweerreacties op te wekken, waaronder het verhogen van de activiteitsniveaus β-1,3-glucanase en peroxidase in de resistente cultivars, terwijl gevoelige cultivars de activiteit van deze enzymen verminderen in de vroege plaagperiode 1,2,3,4. De belangrijkste functies van β-1,3-glucanase en POD in de tarweplant waren onder meer het reguleren van de callose-accumulatie in de resistente cultivar en het blussen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) aan de celwand en apoplastische gebieden tijdens RWA-besmetting 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 toonden aan dat er een sterke correlatie was tussen de verhoogde POD-activiteit en het verhoogde ligninegehalte in de resistente tarwecultivar op RWASA2-plagen. Bovendien gaf een verhoogd ligninegehalte aan dat de celwand van de besmette resistente tarwecultivar was versterkt, wat leidde tot verminderde RWA-voeding.

De meeste onderzoeksgroepen extraheerden en bestudeerden apoplastische β-1,3-glucanase en POD tijdens de tarwe/gerst-RWA-interactie; Bovendien beweerden de meeste van deze onderzoeken dat deze enzymen de celwand van de met RWA besmette tarweplant beïnvloeden zonder de aanwezigheid van enzymen in het celwandgebied te meten. Slechts enkele studies hebben microscopische technieken gebruikt om aan te tonen dat β-1,3-glucanase-activiteitsniveaus verband hielden met calloseregulatie 7,8,9 of geëxtraheerde belangrijke celwandcomponenten om de correlatie tussen POD-activiteiten en celwandmodificatie in de resistente 6,10 aan te tonen. Het ontbreken van het onderzoeken van de β-1,3-glucanase en POD-associatie met de celwand wijst op de noodzaak om methoden te ontwikkelen waarmee onderzoekers de celwandgebonden enzymen rechtstreeks kunnen meten.

De huidige methode stelt voor dat het noodzakelijk is om de apoplastische vloeistof uit het bladweefsel te verwijderen voordat de celwandgebonden enzymen worden geëxtraheerd. De extractieprocedure van apoplastische vloeistof moet twee keer worden uitgevoerd uit het bladweefsel, dat wordt gebruikt voor het extraheren van de celwandgebonden enzymen. Dit proces vermindert contaminatie en verwarring van de apoplastische enzymen met die in de celwandregio's. Daarom hebben we in deze studie celwandgebonden POD, β-1,3-glucanase en MLG-specifieke β-glucanase geëxtraheerd en hun biochemische karakterisering uitgevoerd.

Protocol

De studie werd uitgevoerd met de goedkeuring en toestemming van de Environmental and Biosafety Research Ethics Committee van de University of the Free State (UFS-ESD2022/0131/22). De details van de reagentia en de apparatuur hier staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Omstandigheden voor plantengroei

  1. Ontkiem 250 zaden van elke tarwecultivar, d.w.z. gevoelige Tugela, matig resistente Tugela-Dn1 en resistente Tugela-Dn5, in aparte petrischaaltjes.
  2. Voeg 5 ml gedestilleerd water toe aan elk petrischaaltje, sluit af met een paraffinefilm en incubeer gedurende 2 dagen in de kiemkamer op 25 °C.
  3. Verplant de ontkiemde zaden van elke cultivar in potten van 15 cm met 1:1 aarde en veenmos (15 planten per pot) onder gecontroleerde kasomstandigheden.
  4. Stel de temperatuurregimes in op respectievelijk 18 °C en 24 °C gedurende dag en nacht.
  5. Besproei de planten elke 3 dagen met kraanwater en geef ze 14 dagen na ontkieming 2 g/L meststof.
  6. Plaats de planten in kooien die zijn omhuld door netten en laat ze groeien tot het derde bladstadium 2,6 (met vier biologische replicaten van elke cultivar).

2. Besmetting van tarwecultivars met RWASA2

  1. Besmet Tugela-, Tugela-Dn1- en Tugela-Dn5-tarwecultivars met RWASA2 volgens Jimoh et al.11 en Mohase en Taiwe12.
  2. Houd de planten in twee aparte sets in kooien; Steek een set met 20 parthenogenetische individuen van dezelfde RWASA2-kloon per plant in elke pot in de met netten bedekte groeikamers. Houd nog een set tarweplanten in een aparte ruimte onder de groeikamer met schone netten en behandel ze als controles.
    OPMERKING: Bewaar de twee behandelingen in aparte ruimtes en dek de planten af in kooien die zijn omhuld met netten. In het geval dat twee verschillende RWA-biotypen in een onderzoek worden gebruikt, moet u de planten die besmet zijn met één RWA-biotype zo veel mogelijk bewaren ten opzichte van de planten die besmet zijn met het tweede biotype, of in aparte kamers onder groeikamers bedekt met netten om mogelijke kruisbesmetting van de RWASA2 te voorkomen.
  3. Selecteer voor het oogsten de tweede en derde bladeren op twee verschillende tijdstippen, een korte voedingsperiode (1, 2 en 3 dagen) en een langdurige voedingsperiode (7 en 14 dagen) en wikkel ze in vochtig keukenpapier.
  4. Breng de geoogste bladeren onmiddellijk over in een doos met ijs om het bladmetabolisme te verminderen voordat de intercellulaire wasvloeistof (IWF) wordt geëxtraheerd.

3. Extractie van intercellulaire wasvloeistof (IWF) uit de apoplast

  1. Snijd de geoogste bladeren van ongeveer drie tarwecultivars in stukken van 7 cm.
  2. Spoel de bladstukken twee keer af in gedestilleerd water om eventuele cytosolische verontreiniging van de afgeknipte uiteinden te verwijderen 6,13.
  3. Steek de bladstukken in een dikwandige glazen buis en dompel de monsters onder in een extractiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Breng vacuümining aan gedurende 5 minuten met behulp van een waterstraalpomp om bladeren te impregneren met de extractiebuffer.
  5. Verwijder daarna de bladstukken uit de glazen buis en dep ze droog met keukenpapier.
  6. Steek de gedroogde bladstukken verticaal in voorgekoelde centrifugebuizen met geperforeerde schijven en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 500 x g bij 500 x g.
  7. Gebruik een pipet van 100 μl om het supernatans op te vangen in voorgekoelde microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
  8. Herhaal de hele extractieprocedure met hetzelfde bladmateriaal.
  9. Combineer het verzamelde supernatans en bewaar het bij -20° C.
    OPMERKING: De bovendrijvende aliquots worden behandeld als de bron van apoplast inhoud of IWF. De IWF werd niet gebruikt in de huidige studie, maar het was belangrijk om het uit de bladweefsels te verwijderen voordat we de celwandgebonden β-1,3-glucanase en peroxidase (POD) extraheerden.

4. Extractie van de celwand-geassocieerde β-1,3-glucanase en POD

OPMERKING: De bladresten die overbleven na IWF-extractie werden gebruikt om het totale celwandeiwit te extraheren.

  1. Plet de bladresten met behulp van een vijzel en stamper tot een fijn poeder met vloeibare stikstof.
  2. Breng ongeveer 200 mg van het bladweefsel in poedervorm over in een vijzel met 4 ml extractiebuffer (50 mM natriumfosfaat met 1% (w/v) polyvinylpolypyrrolidon (PVPP); pH 5,0), gevolgd door het malen met een stamper tot een gladde pasta, die vervolgens wordt overgebracht naar microcentrifugebuisjes.
  3. Incubeer het mengsel in de microcentrifugebuisjes gedurende 3 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 10.000 x g bij 4 °C.
  4. Verzamel het supernatans (totale eiwitextracten) in microcentrifugebuisjes (aliquots van 2 ml) en gebruik het als een bron van β-1,3-glucanase en POD voor het hele onderzoek.

5. Bepaling van de eiwitstandaard

  1. Bepaal de totale eiwitconcentratie van de extracten volgens de Bradford-methode14.
  2. Bereid de boviene serumalbumine (BSA)-oplossingen in concentraties van 0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml en 1,0 mg/ml opgelost in 50 mM natriumfosfaatbuffer om de eiwitstandaard te genereren.
  3. Bereid de norm voor door 10 μl van elke BSA-oplossing toe te voegen aan de microplaat met 96 putjes met 190 μl (0,25% v/v) Bradford-reagens (zie Materiaaltabel).
  4. Incubeer bij 25 °C gedurende 20 minuten en meet de extinctie bij 595 nm met behulp van de microplaatlezer en gebruik de absorptiewaarden om de standaardcurve voor het kwantificeren van de eiwitconcentratie voor te bereiden.
  5. Kwantificeer de eiwitconcentratie
    1. Voeg 10 μL van het geëxtraheerde enzym (stap 4) toe aan een microplaat met 96 putjes met 190 μL (0,25% v/v) Bradford-reagens in drievouden.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur (25 °C) gedurende 20 min.
    3. Meet de extinctie bij 595 nm met behulp van de spectrofotometer met een microplaatlezer en gebruik de absorptiewaarden om de eiwitconcentratie te bepalen met behulp van BSA als eiwitstandaard (voorbereid in stap 5.4).

6. Bereid de glucosestandaard voor op β-1,3-glucanase-activiteit

  1. Bereid de standaardoplossingen met concentraties tussen 0,00 mg/ml en 1,0 mg/ml (0,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml) met glucose opgelost in gedestilleerd water.
  2. Voeg 300 μl van elke glucoseoplossing en 600 μl 3,5-dinitrosalicylzuur (DNS)-reagens in een verhouding van 1:2 toe aan microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en incubeer de reacties bij 100 °C gedurende 5 minuten (zie Tabel met materialen voor DNS-reagentia) (Miller et al.15).
  3. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de extinctie bij 540 nm meet met behulp van de spectrofotometer.
  4. Gebruik de gemiddelde extinctiewaarden om de standaardcurve te ontwikkelen voor het bepalen van de enzymactiviteit van β-1,3-glucanase.

7. Bepaling van de β-1,3-glucanase-activiteitstest

OPMERKING: De enzymactiviteit van het celwandgebonden β-1,3-glucanase geëxtraheerd uit Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5 werd bepaald door de hoeveelheid vrijgekomen totale reducerende suikers die vrijkwamen bij hydrolyse van 0,5% (w/v) gemengd gekoppeld β-1,3-1,4-glucaan (MLG) en 0,4% (w/v) β-1,3-glucaansubstraten met behulp van een gewijzigde methode zoals beschreven door Miller et al.15. Bewaar de buisjes met eiwitaliquots altijd op het ijs. Als de monsters bevroren waren, ontdooi ze dan op ijs en ga onmiddellijk na het ontdooien verder.

  1. Voeg 200 μl van het enzymextract (houd de eiwitconcentratie tussen 20 μg/ml en 90 μg/ml in alle reacties, tenzij anders vermeld) en 300 μl van het substraat opgelost in 50 mM natriumcitraatbuffer (pH 5,0) toe aan de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
    OPMERKING: Voer een parallelle blanco-reactie uit zonder het enzymextract voor alle substraten (eerste blanco), en de enzymblanco bestaat uit enzymextract zonder substraat (tweede blanco). Zowel het substraat als het enzymextract werden vervangen door de buffer in respectievelijk de eerste en tweede zwarte.
  2. Incubeer de reacties bij 37 °C gedurende 24 uur en beëindig de reactie door verhitting bij 100 °C gedurende 5 min, centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 10.000 x g bij 4 °C.
  3. Meng 300 μl van het supernatans met 600 μl DNS-reagens (verhouding 1:2) in nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en kook gedurende 5 minuten op 100 °C.
  4. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en meet de extinctie bij 540 nm met behulp van de spectrofotometer.
    OPMERKING: Als de concentratie van totale reducerende suikers in het mengsel hoog is, zal dit resulteren in een donkerbruine oplossing, die moeilijk af te lezen is met de spectrofotometer. Daarom is verdere verdunning van de monsters nodig voordat de absorptie wordt afgelezen.
  5. Gebruik de glucosestandaardcurve die in stap 6.4 hierboven is ontwikkeld om de enzymactiviteit in de SI-eenheden van de standaardcurve te bepalen.
  6. Gebruik de onderstaande vergelijking om de activiteit om te zetten in een specifieke activiteit die wordt uitgedrukt in μmol glucose/h/mg eiwit:
    Specifieke activiteit = [(enzymactiviteit/180.16)*1000]/tijd/eiwitconcentratie
    OPMERKING: Zet enzymactiviteit om in mg/ml naar g/ml; 180,16 g/mol is het molecuulgewicht van glucose, 1000 is een factor die M omzet in micromol, tijd is de periode van reactie en de concentratie van eiwitextract wordt weergegeven in mg/ml. Eén eenheid β-1,3-glucanase-activiteit wordt gedefinieerd als 1 μmol glucose die binnen een reactieperiode van 1 uur uit het substraat vrijkomt.

8. Bepaling van de peroxidase (POD) activiteit

OPMERKING: De celwandgebonden peroxidase-activiteit van Tugela-, Tugela-Dn1- en Tugela-Dn5-tarwecultivars werd bepaald door de vorming van de tetra-guaiacol die per tijdseenheid uit guaiacol16 werd geproduceerd, te kwantificeren.

  1. Voeg 30 μl van het enzymextract, 30 μl 1% (v/v) H2O2 en 970 μl 5 mM guaiacol toe aan de cuvetten bij 25 °C.
    OPMERKING: Maak de blanco-reactie zonder het enzymextract (eerste blanco) en een andere blanco voor enzymmonsters zonder substraat (tweede blanco). De enzym- of substraatmonsters werden vervangen door 50 mM natriumfosfaatbuffer in respectievelijk de eerste en tweede blanco.
  2. Gebruik de kinetische modus van de spectrofotometer om de verandering in absorptie bij 470 nm te volgen.
  3. Bepaal de helling waar de grafiek lineair was en gebruik deze als absorptiewaarde.
  4. Bereken de gemiddelde absorptie en gebruik deze bij het berekenen van de POD-activiteit.
  5. Bereken de peroxidase-activiteit met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt van guaiacol (26,6 mM-1 cm-1) en druk de activiteit uit in μmol tetra-guaiacol/min/mg eiwit.
  6. Bereken de POD-activiteit met behulp van de vergelijking die wordt gebruikt door Mafa et al.6:
    POD-ACTIVITEIT = [(ΔABS × DF) ÷ Eiwitconcentratie] × 26.6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    OPMERKING: Waarbij ΔABS = gemiddelde absorptie; DF = Verdunningsfactor; 26,6 mM-1 cm-1 = uitstervingscoëfficiënt van Guaicol.

9. POD-karakterisering

OPMERKING: POD-karakteriseringstests werden uitgevoerd met behulp van 3 dagen na infestation (dpi) enzymextracten van Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5 volgens vergelijkbare methoden beschreven in stap 8, met kleine veranderingen in de reactiebuffers en temperaturen. De enzymmonsters werden altijd op ijs bewaard terwijl de experimenten werden uitgevoerd. Voer de reacties uit in viervouden met een parallelle lege reactie.

  1. Voer de volgende stappen uit voor een optimale pH-test.
    1. Los guaicolsubstraat op in buffers van 50 mM (natriumcitraat, pH 4 en 5), natriumfosfaat (pH 6 en 7) en Tris-HCl (pH 8 en 9) (zie Materiaaltabel).
    2. Voer de reacties uit bij 25 °C zoals beschreven in stap 8.
  2. Voer de volgende stappen uit voor optimale temperatuurtests.
    1. Voer de reacties uit bij respectievelijk 25 °C, 30 °C, 40 °C en 50 °C.
    2. Gebruik guaicol-substraat opgelost in de buffer pH 5 (pH optimum) en voer de reacties uit zoals beschreven in stap 8.
  3. Voer de volgende stappen uit voor thermostabiliteitstests.
    1. Voordat u de reacties start, incubeert u het enzym bij 37 °C, 50 °C en 70 °C gedurende 30 minuten.
    2. Voer de reacties uit volgens de methoden beschreven in stap 8 met behulp van 50 mM natriumcitraatbuffer (pH 5) en bij 40 °C (optimale temperatuur).

10. Karakterisering van β-1,3-glucanase

OPMERKING: Voer de karakteriseringstests uit volgens de methode beschreven in stap 7 met behulp van 3 dpi-enzymextracten, met enkele wijzigingen in de reactiebuffers en temperaturen. Voer de reacties uit in viervouden, met een parallelle blanco reactie voor elk substraat.

  1. Ga als volgt te werk voor optimale pH-tests:
    1. Los MLG- en β-1,3-glucaansubstraten op in buffers van 50 mM (natriumcitraat, pH 4 en 5), natriumfosfaat (pH 6 en 7) en Tris-HCl (pH 8 en 9).
    2. Voer de reactie uit zoals beschreven in stap 7.
  2. Ga als volgt te werk voor optimale temperatuurtests:
    1. Voer de reacties uit bij respectievelijk 25 °C, 30 °C, 40 °C en 50 °C.
    2. Gebruik MLG- en β-1,3-glucaansubstraten opgelost in de 50 mM natriumcitraatbuffer (pH 5) met een optimale pH (verkregen in stap 10.1) en voer de reacties uit zoals beschreven in stap 7.
  3. Ga voor thermostabiliteitstests als volgt te werk:
    1. Voordat u de reacties start, incubeert u het enzym bij 37 °C, 50 °C en 70 °C gedurende 30 minuten.
    2. Voer de reacties uit met substraten opgelost in 50 mM natriumcitraatbuffer (pH 5) en incubeer bij 25 °C en 40 °C gedurende 24 uur.

11. Beoordeling van het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase op verschillende glucaansubstraten

OPMERKING: Glucaansubstraten bevatten hetzelfde glucoseresidu in hun ruggengraat, maar de glycosidische bindingen tussen glucopyranose-eenheden zijn divers en kunnen de α of β oriëntatieaannemen 17. De glycosidische bindingen kunnen zich vormen tussen verschillende koolstofatomen van glucosemoleculen, waardoor hun chemische structuur wordt bepaald, bijv. β-1,3-glucaan, β-1,4-glucaan en gemengd gekoppeld β-1,3-1,4-glucaan (MLG)18,19,20. Het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase werd bepaald met behulp van met RWASA2 besmette Tugela-, Tugela-Dn1- en Tugela-Dn 5-monsters (enzymbronnen) en de volgende substraten β-1,3-glucaan (CM-curdlan), MLG (uit gerst) en β-1,4-glucaan (AZO-CM-Cellulose). Het werkingsmechanisme wordt bepaald onder optimale analyseomstandigheden (25 °C en 40 °C, pH 5,0), met behulp van 0,1% (w/v) β-1,4-glucaan, 0,4% (w/v) β-1,3-glucaan of 0,5% (w/v) MLG-substraten.

  1. Los de substraten op in 50 mM natriumcitraatbuffer (pH 5).
  2. Voeg 200 μl van het enzymextract en 300 μl van het substraat toe aan de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
  3. Incubeer de reacties bij twee afzonderlijke temperaturen, 25 °C en 40 °C gedurende 8 uur.
  4. Beëindiging van de reacties door verhitting bij 100 °C.
  5. Centrifugeer het reactiemengsel van β-1,3-glucaan en MLG bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en ga te werk zoals beschreven in stap 7.3.
  6. Voor β-1,4-glucaan verdunt u het mengsel na beëindiging van de reactie bij 100 °C met 800 μl absolute ethanol en centrifugeert u het mengsel bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 10.000 x g.
  7. Breng het supernatans over in de curves, meet de extinctie bij 590 nm met de spectrofotometer en bereken de activiteit van β-1,3-glucanase op β-1,4-glucaan volgens de procedure van de fabrikant (zie Materiaaltabel) en druk de activiteit uit in eenheden/mg eiwit.

12. Bepaling van het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase

OPMERKING: Het met RWASA2 besmette Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5 geïnduceerde β-1,3-glucanase-werkingsmechanisme werden getest met laminarine-oligosacchariden (LAM's) met een polymerisatiegraad (DP) tussen 5 en 2. Gebruik een kit voor dunnelaagchromatografie (TLC), vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) en glucose-oxidaseperoxidase (GOPOD) om de DP te bepalen die nodig is voor β-1,3-glucanase om het substraat te hydrolyseren. De TLC werd gebruikt voor kwalitatieve analyse en de LC-MS werd gebruikt voor kwantitatieve analyse, die de concentratie van de oligosacchariden in het hydrolysaat na de reactie bepaalde21.

  1. Bereid de reacties van β-1,3-glucanase werkingsmechanisme voor
    OPMERKING: Bereid het geconcentreerde eiwitextract voor met een centrifugeconcentrerend membraanfilter van 10 kDa en zorg zo voor geconcentreerde en niet-geconcentreerde RWASA2-geïnfecteerde eiwitextracten voor het experiment.
    1. Voor het concentreren van de enzymen die uit elke cultivar worden geëxtraheerd, brengt u 5 ml van de extracten over in de 10 kDa centrifuge concentrerende membraanfilters.
    2. Centrifugeer de membraanfilterbuisjes met extract bij 15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    3. Los laminaripentaose (LAM5), laminaritetraose (LAM4), laminaritriose (LAM3) en laminaribiose (LAM2) (zie materiaaltabel) op in 50 mM natriumcitraat (pH 5) om 10 mg/ml te maken.
    4. Om de reactie op gang te brengen, voegt u 20 μL van het eiwitextract en 40 μL Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) en Laminaribiose (LAM2) toe.
    5. Incubeer de reactie bij 40 °C gedurende 16 uur en eindig met koken bij 100 °C gedurende 5 min.
  2. Dunnelaagchromatografie (TLC) uitvoeren
    1. Snijd 4 silicaplaten instukken van 10 cm en trek een lijn over het oppervlak van de plaat, laat 1 cm ruimte vanaf de onderkant van een rand.
    2. Markeer de stippen over de lijn en markeer ze volgens verschillende cultivars en DP van de Laminarin-oligosachariden, 1 cm uit elkaar en. Neem 2 silicaplaten voor geconcentreerd eiwitextract en de andere 2 voor niet-geconcentreerde extracten.
    3. Voeg 3 tot 5 keer 3 μl van de reactiemengsels toe aan de overeenkomstige gemarkeerde vlekken op de silicaplaat en laat de vlekken op de plaat volledig drogen voordat u het proces herhaalt.
    4. Plaats de silicaplaten voorzichtig in de TLC-tank met de mobiele fase van n-butanol: azijnzuur: water (2:1:1 v/v/v) met de kant met de vlekken van de monsters op de bodem.
    5. Laat de mobiele fase van de onderkant naar de bovenkant van de plaat bewegen.
      OPMERKING: Deze stap kan ongeveer 2 uur duren. Verplaats of verstoor de tank niet terwijl de monsters zich scheiden.
    6. Haal de platen uit de mobiele fase en laat ze bij kamertemperatuur drogen.
    7. Voeg de kleuroplossing toe aan de kleine container, dompel de silicaplaat voorzichtig onder in de kleuroplossing van 0,3% (w/v) naftol in 95% (v/v) ethanol met 5% (v/v) zwavelzuur gedurende 5 s, verwijder deze en laat deze vervolgens drogen bij kamertemperatuur.
      NOTITIE: Schakel bij deze stap het verwarmingsblok/de oven in en stel de temperatuur in op 100 °C.
    8. Leg de gedroogde silicaplaten op het verwarmingsblok en verwarm op 100 °C gedurende 7-10 minuten of tot de blauwviolette vlekken verschijnen. Maak foto's van de silicaplaten met de blauwviolette vlekken en documenteer ze.
  3. Kwantificeer de concentratie van laminarine-oligosacchariden hydrolysaten
    OPMERKING: De concentratie van de LAM-hydrolysaten wordt gekwantificeerd voor zowel geconcentreerde als niet-geconcentreerde eiwitextracten21.
    1. Voeg 20 μl van elk monster toe aan een C18-kolom (koolhydraten 4,6 × 250 mm) en laat het scheiden met een stroomsnelheid van 500 μl/min met behulp van een water- (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B) gradiënt van 100% B naar 60% B gedurende 10 minuten, gevolgd door stappen voor het opnieuw in evenwicht brengen van de kolom met een totale looptijd van 20 minuten om de kolom opnieuw in evenwicht te brengen.
    2. Ioniseer de eluerende analyten in negatieve elektrospraymodus in de massaspectrometrie-ionenbron met een verwarmingstemperatuur van 400 °C om het overtollige oplosmiddel, 30 psi vernevelingsgas, 30 psi verwarmingsgas en 20 psi gordijngas te verdampen.
    3. Stel het ontclusteringspotentieel in op 350 V.
    4. Analyseer de eluerende analyten op de massaspectrometer in een Q1-scanmodus van 150 Da tot 1000 Da met een verblijftijd van 3 s.
    5. Noteer de concentraties van de analyten op de spreadsheet.
  4. Kwantificeer de glucoseconcentratie
    1. Analyseer de glucoseconcentratie geproduceerd door laminarinehydrolyse met behulp van GOPOD-reagens volgens de instructies van de fabrikant22,23.
    2. Meet de extinctie bij 510 nm in een vaste modus van de spectrofotometer.

13. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Randomiseer alle experimenten om vertekening tijdens de plaag of monsterverzameling te voorkomen en voer de analyse uit in viervouden.
  2. Tenzij anders vermeld, gebruikt u de gemiddelden ± standaarddeviatie om de waarden weer te geven in de grafieken en tabellen die zijn gegenereerd op basis van de verzamelde experimentele gegevens.
  3. Gebruik Microsoft Excel om alle gegevens te analyseren en grafieken te genereren.
  4. Voer statistische analyses uit met compatibele software.
    OPMERKING: Voer een multifactoriële variantieanalyse (ANOVA) uit om te testen op significantie tussen behandelingen en Fisher's LSD om te testen op homogene groepen met een alfawaarde van 0,05.

Resultaten

Vier biologische replicaten van tarwecultivars (Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5) werden besmet met RWASA2 in de groeifase van 3 bladeren. Na aantasting werden de bladeren geoogst met 1-, 2-, 3-, 7- en 14 dpi. De controlebehandelingen waren niet besmet met RWASA2 om de resultaten van het experiment vergelijkbaar te maken met tarweplanten die niet aan stress werden blootgesteld. De experimenten werden uitgevoerd in viervouden en de resultaten werden gepresenteerd als de gemiddelde waarden.

De eiwitconcentraties van zowel RWASA2-besmette als controle-extracten werden gekwantificeerd met behulp van BSA als eiwitstandaard. Dit was nuttig bij het bepalen van de enzymactiviteit voor β-1,3-glucanase en POD en om ervoor te zorgen dat de eiwitconcentraties die bij elke reactie werden gebruikt, voor elk monster bekend waren; De verschillen waren verwaarloosbaar. De gegevens kunnen worden gepresenteerd in een grafiek of tabel. Het eerste grafiekformaat werd gebruikt om de enzymspecifieke activiteiten (y-as) uit te drukken die waren uitgezet tegen dagen na de besmetting (x-as) voor zowel enzymactiviteit als karakteriseringstestresultaten. De verhoogde specifieke activiteit van β-1,3-glucanase, MLG-specifieke β-glucanase en POD in RWASA2-besmette resistente Tugela-Dn5-monsters toonde aan dat de enzymen een rol speelden in de afweerrespons (Figuur 1 en Figuur 2). Bovendien verloren beide enzymen in de loop van de tijd aanzienlijk hun activiteit in de gevoelige Tugela die besmet was met RWASA2.

De biochemische karakterisering van de celwand-geassocieerde β-1,3-glucanase en POD werd bepaald door de activiteit uit te drukken in percentages relatieve activiteit of specifieke enzymactiviteit, die werden weergegeven door respectievelijk lijn- en staafdiagrammen (Figuur 3). Het resultaat toonde aan dat zowel β-1,3-glucanase als POD pH-vergelijkbare optimale omstandigheden (pH 5) hadden die overeenkwamen met de zure celwandomstandigheden (Figuur 3). Het is belangrijk op te merken dat het MLG-specifieke β-glucanase ook een specifieke activiteit vertoonde bij pH 5. Het was echter stabieler onder basisomstandigheden dan het β-1,3-glucanase, dat in dezelfde toestand tot 80% relatieve activiteit verloor. De resultaten bevestigden dat twee enzymen die de MLG- en β-1,3-glucaansubstraten katalyseerden, met succes uit het celwandgebied werden geëxtraheerd op basis van het pH-optimum. Deze bewering werd bevestigd door de resultaten van de thermostabiliteitstest (figuur 4), die bevestigden dat β-1,3-glucanase slechts temperaturen tot 50 °C kon verdragen en meer dan 80% relatieve activiteit verloor bij 70 °C (POD had dezelfde profielen). Daarentegen vertoonde het MLG-specifieke β-glucanase-enzym de hoogste activiteit bij 25 °C, gevolgd door een geleidelijk verminderde activiteit, maar dit enzym behield meer dan 50% relatieve activiteit bij 50 °C en 70 °C. De waarnemingen bevestigden dat het MLG-specifieke β-glucanase unieke biochemische eigenschappen vertoonde in vergelijking met β-1,3-glucanase en POD geëxtraheerd uit Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5.

Het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase werd aangetoond met laminarine-oligosacchariden met een DP tussen 5 en 2 (aangeduid als LAM5 tot LAM2). De TLC-resultaten toonden aan dat besmette Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5 een β-1,3-glucanase-enzym hadden dat meestal langere oligosacchariden (LAM5 en LAM4) hydrolyseerde in vergelijking met kortere (LAM3). De intensiteit van de blauwviolette vlekken die op de TLC-plaat werden gevisualiseerd, toonde aan dat LAM5 en LAM4 minder intense banden hadden, gevolgd door LAM3 in de resistente en matig resistente cultivars (Figuur 5). De vatbare Tugela-cultivar toonde aan dat β-1,3-glucanase de LAM5 beter hydrolyseerde dan andere oligosacchariden (LAM4-LAM2), die hogere intense banden vertoonden. Het werkingsmechanisme wordt ook uitgedrukt als de concentraties van de hydrolysaten, weergegeven in een tabel met een heatmap die de efficiënte hydrolyse van laminarin-oligosacchariden met een hogere DP en matige activiteit tijdens de hydrolyse van kortere oligosacchariden (LAM3 en LAM2) weergeeft (tabel 1).

figure-results-1
Figuur 1: De specifieke activiteit van peroxidase geëxtraheerd uit RWASA2-besmette Tugela (A), Tugela-Dn1 (B) en Tugela-Dn5 (C) 14 dagen na besmetting. De experimenten werden uitgevoerd in viervouden; de waarden en foutbalken vertegenwoordigen respectievelijk gemiddelden ± SD. U in U/mg eiwit vertegenwoordigt μmol tetra-guaiacol/min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De specifieke activiteit van β-1,3-glucanase gemeten in met RWASA2 besmette Tugela-, Tugela-Dn1- en Tugela-Dn5-cultivars. De enzymactiviteit werd uitgevoerd met behulp van twee chemisch verschillende glucaansubstraten, d.w.z. gemengd gekoppeld β-1,3-1,4-glucaan (AC) en curdlan (DF). De experimenten werden uitgevoerd in viervouden; de waarden en foutbalken vertegenwoordigen respectievelijk gemiddelden ± SD. U in U/mg eiwit staat voor μmol/h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De pH-optimale assays van β-1,3-glucanase-enzym geëxtraheerd uit met RWASA2 besmette Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5 3 dagen na de besmetting. De experimenten werden uitgevoerd met behulp van β-1,3-1,4-glucaan (AC) en curdlan (DF) substraten. De experimenten werden uitgevoerd in viervouden; de waarden en foutbalken vertegenwoordigen respectievelijk gemiddelden ± SD. U in U/mg eiwit staat voor μmol/h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Thermostabiliteitsanalyse. De thermostabiliteitstesten van β-1,3-glucanase afkomstig van met RWASA2 besmette Tugela, Tugela-Dn1 en Tugela-Dn5 3 dagen na besmetting, onderzocht op β-1,3-1,4-glucaan (AC) en β-1,3-glucaan (DF). De experimenten werden uitgevoerd in viervouden; de waarden en foutbalken vertegenwoordigen respectievelijk gemiddelden ± SD. U in U/mg eiwit staat voor μmol/h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Analyse van het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase op laminarine-oligosachariden. Laminarin-oligosacchariden werden vertegenwoordigd door L5, L4, L3 en L2, die equivalent waren aan respectievelijk laminaripentaose (LAM5), laminaritetraose (LAM4), laminaritriose (LAM3) en laminaribiose (LAM2). De rode pijl toont de glucose (GLU) en de blauwe pijl toont de profielen van het enzym zonder de oligosachariden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Laminarin-oligosacchariden geproduceerd met geconcentreerd β-1,3-glucanase geëxtraheerd uit tarwecultivars die gedurende 3 dagen besmet zijn met RWASA2. De concentraties van de oligosacchariden in het hydrolysaat werden bepaald met LC-MS. LAM5, LAM4, LAM3, LAM2 en GLU vertegenwoordigen respectievelijk laminaripentaose, laminaritetraose, laminaritriose, laminaribiose en glucose. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Tarwe en gerst zijn graangewassen die vaak worden aangetast door bladluissoorten, waaronder Russische tarweluizen (Diuraphis noxia)7,24. Resistente tarweplanten induceren de opregulatie van POD- en β-1,3-glucanase-activiteiten als afweerreacties gedurende de plaagperiode om de celwand te wijzigen door de accumulatie van callose en lignine te reguleren 6,25,26,27. Het is belangrijk op te merken dat de meeste onderzoeken de enzymen POD en β-1,3-glucanase uit de apoplasthebben geëxtraheerd 3,12,28, waardoor hun celwandfuncties zeer speculatief zijn. De huidige studie ontwikkelde een methode die het celwandgebonden β-1,3-glucanase, MLG-specifieke β-glucanase en POD extraheerde als onderdeel van het totale eiwit. Deze enzymen waren zeer actief in de resistente tarwecultivars in vergelijking met de controlegroep, terwijl hun activiteit vertraagd was in de vatbare cultivars. Het gebruik van de controles in de experimenten hielp bij het begrijpen van de effecten van de plaag op de activiteitsniveaus van de wandgebonden enzymen. Het bemonsteren van de weefsels van het derde en tweede blad voor besmette of controlemonsters is belangrijk omdat het consistentie geeft. Bemonster ook de besmette en de controlegroep met dezelfde periode, omdat de POD-, β-1,3-glucanase- en MLG-specifieke β-glucanase-activiteit de groei van de tarwezaailingen verhogen.

Het curdlan-substraat dat in deze studie wordt gebruikt, heeft een chemische structuur die lijkt op die van callose, een polymeer dat tijdens de tarwe-RWA-interactie in het celwandgebied wordt afgezet 7,24. Het gerst MLG-substraat vertegenwoordigt het deel van de celwand hemicellulose dat in lage mate aanwezig is in vergelijking met xylaan in de meeste eenzaadlobbigen. De substraten werden opgelost in een pH 5-buffer van natriumcitraat om de zure toestand van het celwandgebied van de plant na te bootsen29. Als het β-1,3-glucanase en MLG-specifieke β-glucanase met de IWF zouden worden verwijderd, zou het totale eiwit dat uit het resterende bladweefsel wordt geëxtraheerd, geen activiteit hebben op de MLG- en curdlan-substraten. Als de eiwitextracten afkomstig waren uit het cytoplasmatische gebied, zouden ze ook activiteit vertonen bij het neutrale pH-bereik. Interessant is dat beide enzymen aanwezig waren in het totale eiwitextract omdat ze met succes de MLG- en curdlan-substraten hydrolyseerden. De hydrolyse van het MLG en wrongel door de respectievelijke enzymen produceerde de reducerende suikers, die werden gedetecteerd door het DNS-reagens volgens een gewijzigde methode van Mafa et al.6. Wanneer monsters een hogere totale concentratie reducerende suikers hebben, verandert de kleur van het DNS-reagens van geel naar donkerbruin of verandert de kleur van geel naar lichtbruin (ziet er donkeroranje uit) wanneer de concentratie van reducerende suikers laag is.

Guaicol-substraat werd gebruikt om de POD-activiteit te meten. Vanwege de hoge katalytische efficiëntie van POD hebben we de activiteit ervan gemeten met behulp van de kinetische modus van de spectrofotometer. POD wordt geactiveerd door de lage concentratie van H2O2 in aanwezigheid van het substraat (Guaiacol). De activiteit van dit enzym zet guaiacol om in tetra-guaiacol, een bruinoranje kleurstof. De productie van tetra-guaiacol bevestigt dat POD fenolische verbindingen verknoopt om oligomeren te produceren of fenolische verbindingen in lignine opneemt. POD vertoonde hogere activiteitsniveaus in de RWASA2-besmette resistente Tugela-Dn5, gevolgd door matig resistente Tugela-Dn1 in vergelijking met controles. De activiteitsniveaus van POD's waren echter in de loop van de tijd aanzienlijk verminderd in de besmette gevoelige Tugela. De bevindingen van deze studie werden ondersteund door de bewering dat RWASA2-besmette resistente tarwecultivars POD gebruiken om hun celwand te versterken door de lignine- of lignine-hemicelluloseverbindingen te verknopen6. POD had H2O2 nodig om te functioneren, wat aangeeft dat het oxidatie of bleking van de structurele koolhydraten van de celwand verminderde door de niveaus van H2O2 in het celwandgebied te reguleren.

Verschillende pH- en temperatuuromstandigheden werden gebruikt om de biochemische optimale omstandigheden voor deze celwandgebonden enzymen te bepalen. De optimale omstandigheden toonden aan dat de enzymen optimale activiteiten hebben bij zure pH-bereiken (pH 5), wat suggereert dat ze geassocieerd waren met het celwandgebied. De optimale temperatuur voor β-1,3-glucanase werd bereikt bij 25 °C en 40 °C bij het hydrolyseren van respectievelijk β-1,3-1,4-glucaan- en β-1,3-glucaansubstraten. Deze waarneming bevestigde dat de β-1,3-glucanasen en MLG-specifieke β-glucanase twee verschillende enzymen waren die werden geïnduceerd in het celwandgebied van resistente tarwecultivars tijdens RWASA2-besmetting. Hoewel biochemische karakterisering een veelbelovende methode is voor het ontdekken of identificeren van verschillende enzymen met vergelijkbare substraten, raden we toch aan om andere arbeidsintensieve maar nauwkeurige methoden te gebruiken, waaronder western blotting- en zymogram-assays. Ten slotte konden we de wijze van enzymactiviteit voor MLG-specifieke β-glucanase niet kwantificeren vanwege een gebrek aan MLG-oligosachariden. De β-1,3-glucanasen geëxtraheerd uit de met RWASA2 besmette Tugela-Dn5 en Tugela-Dn1 vertoonden echter een hogere activiteit op LAM5, LAM4 en LAM3, terwijl die afkomstig van gevoelige Tugela een hogere activiteit vertoonden op LAM5 en LAM4. Dit bevestigt dat het bestuderen van de wijze van enzymactiviteit ook subtiele verschillen kan oppikken tussen de β-1,3-glucanasen die worden geïnduceerd in de door RWA aangetaste, resistente en vatbare cultivars.

De huidige studie geeft een gedetailleerde procedure voor het extraheren van de celwandgebonden enzymen uit tarwebladweefsel. Na extractie identificeerden we drie celwandgebonden enzymen, namelijk β-1,3-glucanase, MLG-specifiek β-glucanase en POD. De activiteitsniveaus van deze enzymen waren significant hoger in de met RWASA2 besmette matig resistente Tugela-Dn1- en resistente Tugela-Dn5-cultivars dan in controles. Deze bevestigden dat de celwandgebonden enzymen bijdroegen aan de afweerrespons in de resistente cultivars. De karakteriseringsbevindingen geven inzicht dat celwand POD en β-1,3-glucanase onder dezelfde omstandigheden functioneren, wat suggereert dat ze de celwand synergetisch versterken tijdens de tarwe-RWASA2-interactie.

Er zijn enkele beperkingen geïdentificeerd die interfereren met de huidige besproken protocollen. Het tekort aan tarweplanten kan het beschikbare bladmateriaal om de enzymmonsters te extraheren beperken. Als de IWF uit de apoplast niet met succes uit de bladmonsters wordt geëxtraheerd voordat de celwandenzymen worden geëxtraheerd, kan dit leiden tot de combinatie van zowel apoplast als celwandenzymen. De combinatie van de IWF en de enzymen in het celwandgebied maakt het moeilijk om de celwandgebonden enzymen te bestuderen die in de celwand zijn gebonden. In het huidige protocol zijn geen andere beperkingen vastgesteld.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling bij dit werk.

Dankbetuigingen

M. Mafa ontving financiering van de NRF-Thuthuka (referentienummer: TTK2204102938). S.N. Zondo ontving de National Research Foundation Postgraduate Scholarship voor zijn MSc-graad. De auteurs zijn het Agricultural Research Council - Small Grain (ARC-SG) Institute dankbaar voor het verstrekken van de zaden die in deze studie zijn gebruikt. Alle meningen, bevindingen en aanbevelingen die in dit materiaal worden geuit, zijn die van de auteur(s) en daarom aanvaarden de financiers geen enkele aansprakelijkheid in verband daarmee.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 kDa Centrifuge concentrating membrane deviceSigma-AldrichR1NB84206Alleen voor onderzoeksdoeleinden. Niet voor gebruik in diagnostische procedures. Voor concentratie en zuivering van biologische oplossingen.
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM2Hoge zuiverheid laminaribiose voor gebruik in onderzoek, biochemische enzymassays en in vitro diagnostische analyse.
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM3Hoge zuiverheid laminaritriose voor gebruik in onderzoek, biochemische enzymassays en in vitro diagnostische analyse.
3,5 Dinitro salicylic acidSigma-AldrichD0550Gebruikt in colorimetrische bepaling van reducerende suikers
4 g Laminaritetraose Megazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM4Hoge zuiverheid laminaritetraose voor gebruik in onderzoek, biochemische enzymassays en in vitro diagnostische analyse.
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM5Hoge zuiverheid laminaripentaose voor gebruik in onderzoek, biochemische enzymassays en in vitro diagnostische analyse.
95% Absolute ethanolSigma-Aldrich107017Ethanol absoluut voor analyse
azijnzuurSigma-AldrichB00063Acetzuurgelatijn 100% voor analyse (bevat azijnzuur)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (Wicklow, Ireland)S-ACMCHet polysacharide is geverfd met Remazolbrilliant Blauw R tot een mate van ongeveer één kleurstofmolecuul per 20 suikerresiduen.
Beta glucan (gerst) Megazyme (Wicklow, Ireland)G6513Een poedervormig substraat, minder oplosbaar in water. Gebruikt bij het bepalen van β-1,3-glucanase-activiteit.
Bio-Rad Protein Assay DyeBio-Rad Laboratories, Zuid-Afrika500-0006Colorimetrische assay kleurstof, concentraat, voor gebruik met Bio-Rad Protein Assay Kits I en II 
Rundserumalbumine (BSA)Gibco Europe810-1018Alleen voor laboratoriumgebruik
Citrate acidSigma-AldrichC0759Alleen voor Life Science-onderzoek. Niet voor gebruik in diagnostische procedures.
CM-curdlan Megazyme (Wicklow, Ireland)P-CMCURPoederachtig substraat voor het bepalen van β-1,3-glucanase-activiteit. Onoplosbaar in water.
D-GlucoseSigma-AldrichG8270Alleen voor Life Science-onderzoek. Niet voor gebruik in diagnostische procedures.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Oxidatie-indicator. Gebruikt voor het bepalen van peroxidase-activiteit.
WaterstofperoxideBDH Laboratory Supplies, Engeland10366Krachtige oxidatiemiddel.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estland)NISubstraat op basis van veenmos voor zaailingen.
Multifeed meststof (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248Een wateroplosbare meststof voor jonge ontwikkelende planten en zaailingen met een hoge fosfor (P) eis om een optimale wortelontwikkeling te garanderen.
NaphtholMerck, DuitslandN2780Ondergaat hydrogenering in aanwezigheid van een katalysator.
FenolSigma-Aldrich33517Lichtgevoelig. Alleen voor R&D gebruik. Niet voor geneesmiddelen, huishoudelijk of ander gebruik. SDS beschikbaar
Kaliumnatriumtartraat tetrahydraat (Rochelle-zout)Sigma-AldrichS2377gebruikt bij de bereiding van 3,5-dinitrosalicylzuuroplossing gebruikt bij de bepaling van de reducerende suiker.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EASilica gel matrix, met fluorescente indicator 254 nm
NatriumhydroxideSigma-AldrichS8045Alleen voor R&D gebruik. Niet voor geneesmiddelen, huishoudelijk of ander gebruik.
NatriummetabisulfietSigma-Aldrich31448Toegevoegd als antioxidant tijdens de bereiding van 3,5-dinitrosalicylzuuroplossingen.
Natriumfosfaat dibasisch heptahydraatSigma-AldrichS9390Gebruikt als bufferoplossing in biologisch onderzoek om de pH constant te houden.
Natriumfosfaat monobasisch heptahydraatSigma-Aldrich71500Een anorganisch compound, die oplosbaar is in water. Gebruikt als reagens bij de ontwikkeling van silicaat-gebaseerde grouts.
Statistische analyse softwareTIBCO Statisticaversie 13.1
ZwavelzuurMerck, Darmstadt, Duitsland30743Zwavelzuur 95-97% voor analyse van Hg, ACS-reagens.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Buffermiddel in incubatiemixtures. Het is ook gebruikt als een component van lysis en TE (Tris-EDTA) buffer. Alleen voor life science-onderzoek. Niet voor gebruik in diagnostische procedures.
UV–Zichtbaar SpectrofotometerGENESYS 120 
 NI = niet geïdentificeerd.

Referenties

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Beta 1peroxidaseactiviteitRussische tarwebladluispathogeniteitsgerelateerde eiwittenenzymkarakteriseringdunlaagchromatografieglucanasubstraatspecificiteitinteractie tussen plant en plaag
Opheldering #946;-1,3-glucanase en peroxidase fysisch-chemische eigenschappen van het verdedigingsmechanisme van de tarwecelwand tegen de besmetting met diuraphis noxia
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.