Methodenartikel

Een geïsoleerd werkend rattenhartmodel gebruiken om strategieën voor het behoud van donorharten te testen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66910

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een ex vivo geïsoleerd werkend rattenhartprotocol om strategieën voor het behoud van donorharten te testen. Dit artikel beschrijft het protocol voor gebruik bij statische koude opslag van knaagdierdonorharten; Het protocol kan echter ook worden gebruikt voor donorharten die zijn verkregen na donatie na dood van de bloedsomloop en hersendood.

Samenvatting

Optimalisatie van oplossingen voor het behoud van donorharten heeft een sleutelrol gespeeld bij het verminderen van ischemie-reperfusieschade in donorharten tijdens het ophalen, transporteren en transplanteren van organen. Eerder werk van ons laboratorium toonde aan dat de toevoeging van glyceryltrinitraat en erytropoëtine aan oplossingen voor het behoud van donorharten het herstel van de hartfunctie aanzienlijk zou kunnen verbeteren na langdurige koude opslag en bij donatie na dood van de bloedsomloop. Dit suppletieprotocol is in klinisch gebruik geïmplementeerd in transplantatie-eenheden in Australië, België en het Verenigd Koninkrijk. Hier schetsen we een protocol voor het testen van suppletiestrategieën met behulp van een ex vivo geïsoleerd werkend rattenhart (IWRH) perfusiecircuit. Met behulp van deze methodologie kunnen suppletiestrategieën worden getest in de context van langdurige koude statische opslag, donatie na hersendood en donatie na overlijden van de bloedsomloop met behoud van het donorhart. Cardiale functionele herstel, gemeten aan de hand van aortastroom, coronaire stroom, hartminuutvolume, polsdruk en hartslag, kan worden gebruikt om te bepalen of een bepaalde conserveringsstrategie ischemie-reperfusieschade van het donorhart kan minimaliseren.

Inleiding

Het succes van een harttransplantatie kan sterk worden beïnvloed door de conserveringsmethode die voor het donorhart wordt gebruikt. Donorharten worden tijdens het ophalen, transporteren en transplanteren van organen onderworpen aan ischemische beledigingen. De mate van ischemische schade aan het donororgaan kan worden beperkt door een geschikte strategie voor het behoud van het donorhart te selecteren. Koude statische opslag (CSS) blijft de meest haalbare en gebruikelijke methode voor het behoud van donorharten; CSS is echter niet noodzakelijkerwijs de beste optie voor alle hartdonatieroutes. Harten die zijn verkregen via de route voor donatie na dood van de bloedsomloop (DCD) worden bijvoorbeeld onderhouden en beoordeeld op levensvatbaarheid met behulp van normotherme machineperfusie, terwijl harten die zijn verkregen via de route voor donatie na hersendood (DBD) kunnen worden bewaard met behulp van CSS of onderkoelde machineperfusie. Een andere belangrijke bepalende factor voor de gebruikte conserveringsstrategie is de hoeveelheid warme ischemie (voor DCD) of koude ischemie (voor DBD) waaraan het hart wordt blootgesteld tijdens de verkrijging en het transport van organen.

Veel centra gebruiken aanvullende farmacologische suppletie van de oplossing voor het behoud van het hart om de ischemische tolerantie te verhogen en de hartfunctie na transplantatie te verbeteren. Knaagdierstudies uit ons laboratorium toonden aan dat suppletie van cardioplegie met erytropoëtine en glyceryltrinitraat het herstel van de hartfunctie aanzienlijk kon verbeteren na langdurige koude opslag van het donorhart 1,2. Deze onderzoeken gingen vervolgens over op varkensstudies naar het behoud van donorharten en vormden de preklinische basis die leidde tot de opname van erytropoëtine en glyceryltrinitraat in de cardioplegie-oplossing van harten die werd verkregen via een DCD-route met behulp van normotherme machineperfusie 3,4,5. Momenteel wordt suppletie met erytropoëtine en glyceryltrinitraat ook gebruikt in Australische transplantatie-eenheden voor klinische DBD-hartophalen met CSS. Het algemene doel van het hieronder beschreven perfusieprotocol voor geïsoleerd werkend rattenhart (IWRH) is om strategieën voor het behoud van donorharten in een laboratoriumomgeving te testen en hun werkzaamheid te testen voor het behoud van de donorhartfunctie na reperfusie. Het beschreven geïsoleerde werkende rattenhartprotocol wordt al meer dan twee decennia in ons laboratorium gebruikt en is uiterst nuttig gebleken bij het screenen op mogelijke supplementen en/of strategieën die het behoud van het donorhart kunnen verbeteren 2,7,8,9.

Protocol

Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de richtlijnen van de National Health and Medical Research Council (Australië). Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australië).

1. Bereiding van de Krebs-Henseleit (KH) buffer

  1. Bereid 2 L van een 20x voorraadoplossing van KH-buffer met 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Doe in buisjes van 50 ml en bewaar bij -20 °C.
  2. Bereid voorafgaand aan het experiment twee Erlenmyer-kolven van 2 l met 1x KH-buffer met 1900 ml gedeïoniseerd water, 100 ml 20x voorraad KH-buffer, 4,20 g NaHCO3 (25 mM) en 3,96 g glucose (11 mM).
    1. Plaats de bufferkolven in een waterbad van 37 °C en begas de oplossing met carbogeen (95% zuurstof, 5% kooldioxide, debiet ingesteld op 2 l/min) via luchtstenen (opsteekbaar inlaatfilter) gedurende 5 minuten en voeg vervolgens 2,8 ml 1 M CaCl2 (1,4 mM) toe. Blijf de oplossing minstens 1 uur voor de start van het experiment borrelen. Het gebruik van een luchtsteen helpt bij een gelijkmatige beluchting van de buffer.
    2. Plaats een klein volume (~50 ml) buffer in een ronde metalen schaal bij -20 °C om af te koelen en vorm een laag ijsbuffer.

2. Voorbereiding van het perfusiecircuit

  1. Zorg ervoor dat alle slangen en glaswerk schoon zijn zonder zichtbare groei/vervuiling.
  2. Stel de hoogte van de glazen kamers zo in dat deze overeenkomt met de vereiste perfusiedrukken op basis van 1 cm H2Ø, wat overeenkomt met 1,36 mmHg: Langendorff-tot-hart 100 cm (ongeveer 75 mmHg), voorbelasting zij-tot-hart werken 15 cm (ongeveer 11 mmHg), hart-tot-nalaadkamer 100 cm (ongeveer 75 mmHg).
  3. Begin ten minste 10 minuten voor de hartperfusie met het circuleren van heet water rond het circuit.
  4. Plaats microvezelfilters (1.2 μm) in filterhouders en zet ze stevig vast.
  5. Vul het circuit met KH-buffer, zorg ervoor dat alle lucht wordt verwijderd, en gebruik een stroomregelslang clamp om de stroom aan de Langendorff-zijde (Figuur 1A, B) aan te passen tot ~50 ml/min. De langzamere doorstroming zorgt voor een gemakkelijke aortacanulatie en voorkomt dat het hart losraakt voordat het wordt vastgebonden. Plaats een thermometer in het circuit via een T-vormige slangconnector om de temperatuur van de buffer op ~37 °C te controleren.

3. Opzetten van Lab Chart (data-analyse) software

  1. Zorg ervoor dat Powerlab (data-acquisitiesysteem) en flowmeter zijn ingeschakeld en aangesloten op de computer voordat u de data-analysesoftware opent.
  2. Open een nieuw bestand.
  3. Stel gegevensverzameling in door het vervolgkeuzemenu Instellingen te selecteren en Kanaalinstellingen te selecteren. Selecteer voor aortadruk, aortastroom en hartslag (Figuur 2A).
  4. Stel elk kanaal in met de instellingen die worden weergegeven in afbeelding 2B.

4. Voorbereiding van het dier op isolatie van het hart van ratten

OPMERKING: De methodologie voor isolatie en perfusie van rattenharten voor niet-DBD- en niet-DCD-harten voor koude statische opslag wordt hieronder beschreven. De methoden voor hartinstrumentatie op het perfusiecircuit zijn relatief vergelijkbaar, ongeacht welke donatiemethode wordt gebruikt. De verschillen in het protocol voor DBD- en DCD-hartdonatie bij ratten treden voornamelijk op vanaf het moment dat de dierverdoving in werking is getreden tot het moment dat het hart uit het dier wordt weggesneden.

  1. Weeg het dier en zorg ervoor dat het gewicht >330 g is. Het ideale gewichtsbereik voor mannelijke ratten is 330-420 g.
  2. Dien een intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) toe. Zorg voor een adequaat chirurgisch anesthesievlak op basis van de afwezigheid van een pedaalreflex (teenknijpreflex) en oogknipperreflex.
  3. Leg het dier in rugligging en zet de ledematen vast met tape. Dien zuurstof toe aan het dier via een neuskegel.
  4. Zorg voor de KH-buffer ijsbrij metalen container en een kleine metalen container met ijs bij het snijstation. Week een gaasje van 7,5 cm x 7,5 cm in KH-buffer en leg het op de container met ijs.
  5. Zodra een adequaat chirurgisch anesthesievlak is bevestigd, scheert u de huid op de plaats van de chirurgische incisie en reinigt u de huid met aseptisch middel zoals betadine of 70% alcohol. Maak een laterale incisie over de buik (laparotomie) en beweeg de maag en darmen opzij om toegang te krijgen tot de linker nierader. Injecteer 1500 IE heparine en oefen druk uit op de injectieplaats totdat het bloeden stopt. Wacht 1-2 minuten om de heparine te laten circuleren voordat u doorgaat met het ophalen van het hart.
  6. Open de borstholte door aan weerszijden door de ribbenkast door te snijden en over het middenrif te snijden. Houd het hart-longblok voorzichtig vast en til het op terwijl u langs de dalende aorta snijdt, en zorg ervoor dat de aortaboog intact blijft. Hierdoor blijft er voldoende aortalengte over voor canulatie.
  7. De rat wordt geëuthanaseerd door het hart en de longen te verwijderen terwijl hij onder narcose is. Dompel het hart-longblok onder in de KH-bufferijsbrij om het hart te laten stoppen.

5. Het hart canuleren op het geïsoleerde werkende hartperfusiecircuit

  1. Breng het hart-longblok over in een gaas op ijs. Ontleed overtollig vet rond de aorta, snijd de aorta bij zodat er 3-5 mm lengte overblijft voor canulatie en maak een kleine incisie ~1-2 mm in de longslagader. Dit zal een pad mogelijk maken voor het coronaire effluent.
  2. Plaats het bijgesneden hart-longblok (terwijl het nog op ijs ligt) direct onder de canules. Pas de stroom vanaf de Langendorff-zijde aan met behulp van een stroomregelslangklem om de aortacanulatie te vergemakkelijken. Kantel de aorta voorzichtig op de linkercanule, houd deze vast met een zwarte klem en bind deze vast met een 2-0 zijden hechtdraad.
  3. Verhoog de stroom van de Langendorff-perfusie door de klem van de stroomregelslang volledig te openen. Open de nalaadklem. Zorg ervoor dat er een continue stroom uit de Langendorff-kamer is. Begin met het monitoren van de hartactiviteit met software.
    OPMERKING: als de aortastroomwaarde op het display van de flowmeter <10 ml/min is, zorg er dan voor dat de pulmonale arteriotomie voldoende groot is. Een laag spoor/waarde van de aortastroom kan er ook op wijzen dat de aortacanule te ver is ingebracht.
  4. Stel het hart-longblok zo af dat het voorste oppervlak van de longen naar de bediener is gericht. Bind de linker longkwab vast met een 2-0 zijden hechting en snijd overtollig linker longweefsel af. Bind de resterende longlobben in één keer vast met een 2-0 zijden hechtdraad en snijd het weefsel door. Draai het hart zodat de vastgebonden longen naar achteren wijzen.
  5. Knip met een kleine Vannas-schaar een rand van 2-3 mm van het linker hartoor af en zorg ervoor dat er een kleine opening in de boezems wordt bereikt. Kanunnik het linker hartoor voorzichtig aan de linkercanule, houd het vast met een zwarte klem en bind het vast met een 2-0 zijden hechtdraad. Figuur 3A toont de plaatsing van beide canules.
  6. Stel de watermantel van de hartkamer zo af dat het hart zich in het midden van de kamer bevindt.
  7. Open de druktransducer naar lucht en zet de druktransducer op nul in de software door het vervolgkeuzemenu Aortadruk te selecteren > Bridge Amp > Zero. Klik op OK.
  8. Perfuseer het hart gedurende 10 minuten in de Langendorff-modus. Zorg ervoor dat de Langendoff aortastroom tussen 10-20 ml/min meet (ideaal 20 ml/min).
  9. Voordat u van werkmodus wisselt, moet u ervoor zorgen dat de luchtsteen (opsteekbaar inlaatfilter) van het Langendorff KH-bufferreservoir in het werkende KH-bufferreservoir is geplaatst.
  10. Zet het hart in de werkmodus door de grote klem naar de aortacanule te sluiten en de stroom naar het linker hartoor te openen. Open de driewegkraan die leidt van het werken perfusaat. Breng de gemeenschappelijke retourslang (waarbij de KH-buffer terug naar het reservoir wordt gebracht) over van het Langendorff-reservoir naar het werkreservoir.
  11. Laat het hart gedurende 15 minuten in de werkmodus doordringen. De waarden van de aortastroom moeten idealiter >30 ml/min zijn aan het einde van een perfusie van 15 minuten. Zodra het hart is gestabiliseerd, begint u met het opnemen van gegevens in software voor gegevensanalyse.
  12. Meet coronair effluent (coronaire stroom) na 1 min, 5 min, 10 min en 15 min.
    OPMERKING: Coronaire flowwaarden moeten tussen 10-20 ml/min liggen. Coronaire stroom van meer dan 22 ml/min duidt over het algemeen op een lek dat afkomstig is van een losgemaakt longvat. De hartslag moet tussen de 200-300 slagen per minuut liggen. Coronair effluent kan worden verzameld voor stroomafwaartse analyse van markers voor weefselbeschadiging (bijv. troponine-I, afgifte van lactaatdehydrogenase).

6. Toediening van cardioplegie voor koude statische opslag van het hart

  1. Vul de cardioplegiekamer (geplaatst op een hoogte van 60 cm om een perfusiedruk van ongeveer 40 mmHg te verkrijgen) met 50 ml aangewezen hartconserveringsoplossing (met of zonder suppletie).
  2. Laat de watermantel zakken en draai de driewegkraan aan de kant van de werkmodus dicht.
  3. Stop de stroom naar de linker boezemcanule door de klem te sluiten.
  4. Open de stroom naar de aortacanule.
  5. Sluit de klem vanaf de Langendoff-zijde en op de nabelasting.
  6. Open de klem van de cardioplegielijn en spoel 15 ml cardioplegie uit de drukleiding. Draai de kraan dicht bij de drukleiding.
  7. Laat het hart via de aortacanule worden gespoeld met cardioplegie en vang het coronaire effluent op. Voer cardioplegie uit gedurende 3 minuten en noteer het volume van de toegediende cardioplegie.
  8. Stop met het opnemen van gegevens in de software en sla het bestand op.
  9. Sluit na 3 minuten de cardioplegieklem en de kleine blauwe klem die naar de aortacanule leidt.
  10. Plaats een bulldogklem op de aortacanule en een tweede bulldogklem op de linkercanule. Koppel het hartcanuleblok los van het circuit en plaats het in een bekerglas met cardioplegie in een ijsbox (Figuur 3B, C).
  11. Bewaar het hart 6 uur in de koelkast (of de gewenste koude bewaartijd).

7. Hartreperfusie na koude statische opslag

  1. Bereid de KH-buffer voor volgens sectie 1.
  2. Bereid het perfusiecircuit voor volgens sectie 2.
  3. Open het opgeslagen bestand vanaf de basislijnperfusie.
  4. Verwijder het hartcanuleblok voorzichtig uit de ijsbox en bevestig het op het perfusiecircuit. Voordat u de aortacanule weer aansluit, gebruikt u een stompe spuit van 18 G gevuld met KH-buffer om eventuele lucht uit de canule te verwijderen. Sluit eerst de aortacanule aan, open de slangklem aan de Langendorff-zijde en zorg ervoor dat de nabelastingsslangklem open is.
  5. Sluit de linker boezemcanule weer aan en zorg ervoor dat er lucht uit de canule is verwijderd voordat u deze op het perfusiecircuit aansluit. Houd de werkzijde clamp gesloten totdat het tijd is om over te schakelen van Langendorff naar de werkmodus.
  6. Perfuseer het hart in de Langendorff-modus gedurende 15 minuten. Zorg ervoor dat u begint met het registreren van gegevens aan het begin van de Langendorff-reperfusie.
  7. Voordat u overschakelt naar de werkmodus, plaatst u beide borrelstenen in de KH-buffer, opent u de 3-wegkraan aan de werkzijde en brengt u de gemeenschappelijke retourslang over naar het werkreservoir.
  8. Sluit de witte Langendorff-klem, open de witte klem aan de werkzijde en laat het hart 30 minuten perfuseren. Meet en verzamel coronair effluent op aangewezen tijdstippen voor stroomafwaartse analyse (bijv. markers voor hartletsel). Zorg ervoor dat u de software-opname stopt en opnieuw start om een nieuw segment te starten (of voeg een opmerking toe).
  9. Sluit na ongeveer 15 minuten reperfusie in de werkmodus de driewegkraan.
  10. Sla aan het einde van de reperfusie het gegevensbestand op, stop de stroom door het circuit en koppel het hartblok los. Verzamel monsters van de linkerventrikel voor histologische verwerking en/of klik ze in voor toekomstige onderzoeken (bijv. eiwitextractie voor western blot-onderzoeken).
  11. Verwijder de filters uit de filterhouders, laat de buffer uit het circuit lopen en spoel twee keer met 5 L gedestilleerd water.
    OPMERKING: Hoewel het niet noodzakelijk is, helpt het wel om het gedestilleerde water voor te verwarmen in een grote bak in het waterbad.

8. Analyse van functioneel herstel

  1. Open het LabChart-bestand.
  2. Markeer een gebied van ten minste 30 seconden opname en klik vervolgens op Command > Gegevensselectie toevoegen OF Meerdere toevoegen aan gegevens. Hiermee worden de gewenste parameters toegevoegd aan een DataPad-bestand in de software.
  3. Selecteer het vervolgkeuzemenu Venster > DataPad.
  4. Markeer en kopieer de herstelwaarden van DataPad naar een spreadsheet voor functionele herstelanalyse. Bereken functioneel herstel als een percentage van de respectieve basiswaarde 1,6,7.

Resultaten

De resultaten van de baseline-perfusie zullen bepalen of het eerste experiment (pre-opslag) succesvol was. De aortastroom die tijdens de Langendorff-modus wordt weergegeven, moet tussen 14 - 22 ml/min liggen. De Langendorff-stroom wordt weergegeven als een negatieve waarde op de debietmeter als gevolg van de retrograde perfusie van de aorta. Een voorbeeld van een acceptabel Langendorff-spoor is weergegeven in figuur 4A.

Eenmaal overgeschakeld naar de werkmodus, moet de aortastroom ten minste 30 ml/min zijn zodra het hart tot rust is gekomen. Het is normaal dat de stroom aanvankelijk stijgt tot ongeveer 50 ml/min, vervolgens afneemt tot ongeveer 25 ml/min voordat deze weer toeneemt tot een stabiele aortastroom bij basislijn. Zodra de basisparameters bevredigend zijn (AF > 30 ml/min, CF 10-20 ml/min, HR 200-300 bpm), kan het hart worden opgeslagen. Een voorbeeld van een goede basislijn is weergegeven in figuur 4B.

Afhankelijk van de geteste conserveringsoplossing zullen sommige harten geen goed herstel opleveren na langdurige koude statische opslag, ondanks dat ze een uitstekende basislijn hebben. Een voorbeeld van een spoor dat wijst op slecht herstel in de werkmodus wordt weergegeven in figuur 4C.

Het uiteindelijke functionele herstel voor de aortastroom kan worden berekend op basis van de uiteindelijke aflezing van de aortastroom als een percentage van de basiswaarde. Als de AF bij aanvang van het hart bijvoorbeeld 40 ml/min was en de AF aan het einde van de reperfusie na koude statische opslag 20 ml/min was, was het AF-herstel voor dit hart 50%. Een voorbeeld van deze gegevensweergave is weergegeven in figuur 5.

figure-results-1
Figuur 1: Werkend hartperfusiecircuit. (A) Foto van het geïsoleerde werkende hartperfusiecircuit van ratten. Het rode vak geeft aan waar het geïsoleerde hart zich bevindt. (B) Schema van het geïsoleerde perfusiecircuit van het werkende hart, met vermelding van de stroomrichting van de KH-buffer door het circuit voor Langendorff (stippellijn) en werkmodus (ononderbroken lijn) perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 2: Installatie van de LabChart-software. (a) Instellen van kanaalinstellingen voor aortadruk, aortastroom en hartslag. (B) Voorbeeld van een LabChart-sjabloon die is opgezet met drie kanalen. Vensters aan de rechterkant tonen elk afzonderlijk kanaal dat is ingesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Canulatie en cardioplegie. (A) Hartcanulatie voorafgaand aan plaatsing in de kamer van de watermantel. De linkercanule wordt in de aorta ingebracht en de rechtercanule wordt via het linker hartoor in de linker hartkamer ingebracht. De longvaten zijn vastgebonden en het longweefsel is ontleed. (B) Nadat cardioplegie is toegediend, wordt het hart in een bekerglas met de cardioplegie-oplossing geplaatst. De canules zijn vastgeklemd met bulldog-clips voordat ze worden losgekoppeld van de rig. (C) Voorbeeld van harten die in een ijsdoos worden geplaatst voor langdurige koude opslag. Hier zijn twee harten bewaard voor reperfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Voorbeelden van LabChart-sporen. Sporen voor druk (rode grafiek), aortastroom (blauwe grafiek) en hartslag (groene grafiek) voor een hart met (A) Goed Langendorff-spoor, (B) Goed herstel tijdens reperfusie in de werkmodus, (C) Slecht herstel tijdens reperfusie in de werkmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve grafieken voor functioneel herstel. (A) aortastroom, (B) coronaire stroom, (C) hartminuutvolume en (D) hartslag. Dit cijfer is hergebruikt met toestemming van Gao et al.8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Gezien de gevoelige aard van de basisfunctie van het hart, moet ervoor worden gezorgd dat de perfusie-installatie schoon en met compatibele componenten wordt onderhouden. Zo moet bijvoorbeeld de juiste PVC-slang worden gebruikt. Sommige slangmaterialen, zoals siliconen, kunnen bijdragen aan een lagere aortastroom en contractiliteit, wat te wijten kan zijn aan zuurstofverlies via de slang. Hoewel er geïsoleerde werkende hartperfusiecircuits voor ratten in de handel verkrijgbaar zijn, worden de meeste hiervan voornamelijk alleen voor Langendorff-perfusie gebruikt. Over het algemeen kunnen functionele metingen worden verkregen in een Langendoff-perfusiemodel via het inbrengen van een ballonkatheter in de linkerventrikel om metingen van de linkerventrikeldiastolische druk (LVDP) te verkrijgen. Het is echter niet mogelijk om ruwe aortastroommetingen en hartminuutvolume te meten in een Langendoff-perfusiesysteem. Een belangrijk voordeel van het IWRH-protocol is de mogelijkheid om functionele metingen van de aortastroom en het hartminuutvolume te verkrijgen zonder dat er aanvullende ingrepen van het hart nodig zijn (d.w.z. ballonkatheter). Er zijn commerciële opties voor een werkend hartperfusiesysteem voor ratten en hoewel deze kunnen worden aangepast aan individuele studievereisten, kunnen deze systemen kostbaar zijn.

Er zijn cruciale stappen in het protocol om een optimale basisfunctie van het knaagdierhart tijdens de perfusie te garanderen. De bereiding van KHB-buffervoorraadoplossingen mag niet ouder zijn dan 4 weken. Het perfusiecircuit moet bij het aanzuigen vrij zijn van luchtbellen. Voorzichtigheid is geboden bij het canuleren van het linker hartoor. Overmatige behandeling van het weefsel kan het risico op scheuren vergroten en kan ook bijdragen aan functionele prikkelbaarheid van het hart.

De prestatiekwaliteit van het IWRH-perfusiecircuit kan over het algemeen worden bepaald aan de hand van de basislijnmetingen die in harten worden verkregen (AF > 30 ml/min, CF ~20 ml/min). Verdere kwaliteitscontroletests in een CSS-model kunnen worden uitgevoerd door het hart te stoppen en te bewaren in Celsior-conserveringsoplossing aangevuld met 1 μmol/L zoniporide plus 0,1 mg/ml glyceryltrinitraat. Harten gearresteerd met Celsior aangevuld met glyceryltrinitraat plus zoniporide garanderen onmiddellijk herstel van de Langendorff-reperfusie en een uiteindelijk functioneel herstel tussen 40-60% na 6 uur koude opslag. Als u twijfelt of de rig goed presteert, is deze aanvulling op de kwaliteitscontrole nuttig om te testen.

De methoden voor het gebruik van knaagdierharten die via donatie zijn verkregen na dood van de bloedsomloop zijn eerder beschreven10,11. In het kort worden ratten verdoofd, de halsslagader gecanuleerd en drukmetingen verkregen. Heparine (500 IE) wordt geïnjecteerd via de canule van de halsslagader. De luchtpijp wordt afgebonden om de stopzetting van de levensondersteuning te initiëren. Zodra de vereiste warme ischemische tijd is bereikt, kan het hart worden weggesneden en op het perfusiecircuit worden gecanuleerd. Voor toediening van conserveringsoplossing in het DCD-hart wordt 60 ml conserveringsoplossing door de aorta gespoeld (~20 ml/min) via de drukleiding op het circuit. De longvaten worden vastgebonden, de longen worden ontleed, de linkercanule wordt ingebracht en vervolgens wordt 40 ml conserveringsoplossing via de drukleiding gespoeld. Het hart wordt vervolgens geperfundeerd volgens het bovenstaande protocol. Functioneel herstel wordt beschouwd als een ruwe waarde van functionele hemodynamica, en statistische analyse wordt uitgevoerd door de waarden te vergelijken met die harten die schijnoperaties hebben ondergaan (geen DCD, maar gespoeld op de rig).

De methoden voor het gebruik van knaagdierharten die na hersendood worden verkregen, zijn eerder beschreven12. Kortom, dieren worden verdoofd, geïntubeerd en beademd, met hemodynamische monitoring volgens het DCD-knaagdierprotocol. Er wordt een braamgat gemaakt in de temporopariëtale schedel en een 3F-embolectomiekatheter wordt subduraal geplaatst. Schijncontroles hebben braamgaten, maar geen katheterinbreng. De ballon wordt gedurende 2 minuten opgeblazen met 0,3 ml water en 1 uur opgeblazen. Na 1 uur hemodynamische observatie worden harten geëxplanteerd en op het geïsoleerde werkende hartperfusiecircuit geplaatst, worden basislijnmetingen geregistreerd, cardioplegie wordt toegediend en worden harten koud opgeslagen zoals hierboven beschreven.

De belangrijkste beperking van het gebruik van het IWRH-perfusiecircuit is het onvermogen om een op bloed gebaseerde perfusiebuffer te gebruiken om door het systeem te circuleren. Het zou onmogelijk zijn om genoeg knaagdierbloed te verkrijgen om aan het perfusaat toe te voegen; Daarom is perfusie op basis van bloed niet haalbaar. Alternatieve modellen, zoals heterotope harttransplantatie bij knaagdieren of orthotope harttransplantatiestudies bij grote dieren, zouden waarschijnlijk moeten worden uitgevoerd om de impact van perfusie op basis van bloed te testen. Deze alternatieve methoden vereisen echter expertise in microchirurgische vaardigheden en/of chirurgische faciliteiten voor grote dieren en ervaren anesthesisten, perfusionisten en cardiothoracale chirurgen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

De hier beschreven studies zijn gefinancierd door subsidies die zijn toegekend aan PS Macdonald van de National Health and Medical Research Council Australia, de St Vincent's Clinic Foundation en de NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL kleurloze Eppendorff buis, 1000 per doosBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL cent/buizen (S) Sleeve/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Transducer/Kabel kitADInstrumentsMLT1199Data Acquisition
Bridge AmpADInstrumentsFE221Data Acquisition
Carbogen 555G2BOCBOC002
Checktemp1 thermometerHanna InstrumentsHI98509Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.Thomas Scientific8847T08Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.Thomas Scientific8847T02Rig Construction
Clips, Vaat, 60 g DrukCoherent Scientific14121Chirurgische apparatuur
Closed ConnectorThomas Scientific8847E25Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 zwart voorgesneden 45 cm doos van 24Specialist Medical SuppliesS195Chirurgische verbruiksartikelen
Custom Made 250 mL Jacketed DegasserCustom Blown Glassware Pty LtdN/ARig Construction
Custom Made 750 mL ReservoirCustom Blown Glassware Pty LtdN/ARig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgOm Krebs Buffer te maken
Dual Channel ConsoleADInstrumentsTS402Data Acquisition
Erlenmyer kolven 2 L 
Filter Microfibre type GF/C glasvezel 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Chirurgische apparatuur
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm lange arm voor het houden van objecten met een diameter van 2-70 mm. Vinyl gecoatMet-App Australia Pty Ltd1352Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)Thermoline ScientificTU3Rig Construction
Heparine 5000 U/5 mL doos 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Geneesmiddelen
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anesthesie
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Anesthesie
Magnesium Sulfaat heptahydraat AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gOm Krebs Buffer te maken
Male/Female Scharnierende AdapterThomas Scientific8847V08Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head voor Precision Tubing, PPS, CRS RotorJohn Morris1015164Rig Construction
Metzenbaum schaar, 11.5 cm gebogenCoherent ScientificWPI-501748Chirurgische apparatuur
Metzenbaum schaar, 14.5 cm rechtCoherent ScientificWPI-501252Chirurgische apparatuur
Mounting Hardware F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Montageschroeven voor pompkoppen
Open-sided connectorThomas Scientific8847E05Rig Construction
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500GSample processing
Kaliumchloride (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemicals 26764.26Om Krebs Buffer te maken
Kaliumfosfaat monobasisch Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gOm Krebs Buffer te maken
Powerlab 2/26, 2 kanaals recorder + Labchart softwareADInstrumentsML826Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNRig Construction
Scalpel met handvat wegwerpbaar #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Siliconen pakking voor Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig Construction
Siliconen O-Ring 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig Construction
Single Buret ClampThomas Scientific8847T32Rig Construction
Slip-on inlaat Filter poriegrootte 10 µm (bubbeler)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Rotatie ConnectorThomas Scientific8847E35Rig Construction
NatriumbicarbonaatSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gOm Krebs Buffer te maken
Swinnex Filter Holder, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Rig Construction
Spuiten 1 mL doos/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm lange arm en dubbele schroef voor het houden van 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410ADInstrumentsTS410Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Rol 15.24m, helder, DEHP ftalaatvrij, voedingskwaliteit voldoet aan REACThermo FisherNAL 8701-0600Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Rol 15.24 m, helder, DEHP ftalaatvrij, voedingskwaliteit voldoet aan REACThermo FisherNAL 8701-0900Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft RolThermo Fisher

Referenties

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
  2. Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
  4. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  5. Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
  6. Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850(2018).
  7. Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
  8. Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
  9. Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
  10. Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
  11. Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).
  12. Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ischemie reperfusieschadecardiale functionele herstelkoude statische bewaringLangendorff perfusiecardioplegische oplossingaortastroommetinghartperfusiecircuit

Gerelateerde artikelen