Methodenartikel

Hellgrammiet als niet-conventionele biomonitor voor de beoordeling van de gezondheid van oppervlaktewater en het milieu

718 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66911

⸱

26 juli 2024

 ,  ,  , 
1Posgrado en Hidrociencias, Colegio de Postgraduados, 2Instituto Politécnico Nacional, Laboratorio de Evaluación de la Salud de los Ecosistemas Acuáticos, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, 3Instituto Politécnico Nacional, Coordinación Politécnica para la Sustentabilidad

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van biomarkers voor de vroege detectie van schadelijke effecten in aquatische ecosystemen. De biomarkers zijn nauw verwant aan sentinel-eigenschappen en hun veranderingen helpen bij het detecteren van vroegtijdige waarschuwingsschade.

Samenvatting

De larven van dobsonvliegen uit het geslacht Corydalus, algemeen bekend als Hellgrammites, worden gekenmerkt door hun opmerkelijke grootte, uitgebreide voorkomen en langere periode van onvolwassenheid, die tot een jaar kan duren. Het is duidelijk bekend dat hellgrammieten gevoelig zijn voor vervuiling en de effecten van de habitatstructuur. Gezien deze unieke eigenschappen is het gebruik van Corydalus texanus-larven zeer geschikt als betrouwbare biomonitoringsmiddelen om de ecologische integriteit van aquatische ecosystemen te beoordelen. Dit protocol is bedoeld om de nodige hulpmiddelen te bieden voor de beoordeling van C. texanus en hun werkzaamheid aan te tonen door middel van een casestudy. Onderzoeksresultaten hebben praktische implicaties, wat aangeeft dat C. texanus-larven vroegtijdig waarschuwen voor mijnbouwvervuiling, waarbij grote hoeveelheden zware metalen zoals Zn, Fe en Al worden gebioaccumuleerd. De aan- of afwezigheid van C. texanus-populaties kan dienen als een nuttige indicator voor het identificeren van mogelijke problemen met betrekking tot de gezondheid van ecosystemen. De onconventionele aanpak heeft geleid tot vroegtijdige waarschuwingen voor vervuiling op door mijnbouw getroffen locaties, wat de noodzaak benadrukt van tijdige actie om het milieu te beschermen. Gezien hun unieke eigenschappen wordt het gebruik van C. texanus-larven sterk aanbevolen als een betrouwbare niet-conventionele bio-indicator.

Inleiding

Hellgramites zijn insectenlarven uit de orde Megaloptera (Latreille, 1802), dobsonvliegen of visvliegen in hun volwassen stadium genoemd. Een lage diversiteit maar wijdverbreid kenmerkt deze groep van toppredator-insectenlarven uit aquatische ecosystemen1. Hellgrarietsoorten komen voor in goed afgebakende biogeografische regio's; Daarom is het relatief eenvoudig om soorten te identificeren zonder een hoge taxonomische kennis. Met name de larven van de Corydalidae bezitten de meest prominente soorten uit de Megaloptera-orde (lichaamslengte 20-90 mm)2, waardoor hellgrariet met het blote oog zichtbaar is.

Hellgrammieten spelen een cruciale rol in aquatische ecosystemen als roofdieren, met een krachtige aanwezigheid dankzij grote kauwsnacks die hun indrukwekkende roofzuchtige vorm aangeven. Een dorsoventraal afgeplat lichaam sluit zich ook aan bij 7-8 paar filamentkieuwen langs het lichaam, en een kopcapsule met zes stemmata per kant maakt hellgrammieten fascinerende organismen voor entomologen en fans3. Volwassenen van Corydalidae verrassen en creëren een indruk bij mensen vanwege hun prominente formaat; Ze zijn echter volkomen onschadelijk. Het is opmerkelijk dat hellgrammieten het vermogen hebben om gedurende een aanzienlijke tijd in hun larvale stadium in het aquatisch milieu te blijven bestaan.

De fenotypische kenmerken van hellgrammieten bieden een bijzondere kans om hun rol in aquatische ecosystemen te benadrukken; Desalniettemin is hun indicatorpotentieel de meest gewilde eigenschap voor aquatisch ecologen. In aquatische ecosystemen wordt de nadruk gelegd op uitgebreide kennis van hun potentieel voor bio-indicatoren, omdat hun voorkomen verband houdt met goede gezondheidsomstandigheden in hun habitats vanwege hun intolerantie voor organische vervuiling in oppervlaktewateren 4,5,6,7,8.

De meeste Corydalidae megaloptera leven in snel stromend water als riffles en substraten die worden gedomineerd door keien en kiezels, maar hellgrammieten komen ook voor in beken met een lage gradiënt met haken en ogen en zandsubstraten, evenals in lentische habitats zoals meren 3,9,10. Hun brede scala aan voorkomen weerspiegelt de kritieke eigenschappen van een toproofdier en hun vermogen om verschillende habitats te koloniseren die worden gericht op hun effectieve levensgeschiedenisstrategieën11. Hellgramites koppelden hun eigenschappen aan de dynamiek van aquatische ecosystemen; dus strategieën zoals aanpassing aan luchtademhaling door spiracles (naast hun ventrale plukjes van tracheale kieuwen) zijn eigen aan de Corydalidae-strategieën10.

Hellgrammieten bewonen bepaalde ecosystemen en reageren snel op afwijkingen van gevestigde patronen, waardoor ze dienen als een systeem voor vroegtijdige waarschuwing7. De reacties van deze in het wild levende organismen kunnen worden gebruikt als een waardevol instrument om de impact van vervuiling op aquatische ecosystemen te beoordelen, met name in het geval van mengsels van niet-doelverontreinigende stoffen. Sommige schadelijke effecten op levende organismen zijn in ecosystemen erkend vanwege de individuele toxiciteit van chemische stoffen, maar het effect van mengsels van verontreinigende stoffen moet worden geïdentificeerd. De vroegtijdige waarschuwingsreacties van hellgrammieten kunnen het mogelijk maken om schadelijke effecten te identificeren door een verwijzing te geven naar de effecten van een mengsel van verontreinigende stoffen of zelfs wanneer individuele effecten van verontreinigende stoffen geen waarneembare effectconcentratie (NOEC) erkennen12.

Verschillende modelorganismen zijn gebruikt voor experimentele acute en chronische tests; Ze worden echter gekweekt en onderhouden onder gecontroleerde omstandigheden13. Gecontroleerde omstandigheden zorgen ervoor dat ze niet in staat zijn om de niet-doeleffecten van verschillende verontreinigende stoffen waaraan ze worden blootgesteld te identificeren. NOEC wordt ook vaak erkend vanwege de complexiteit van het mengsel van de verontreinigende stof. Om die reden werden in de afgelopen decennia niet-modelmatige inheemse soorten met niet-doeleffecten herkend om systemen te screenen, die essentieel zijn voor het uitvoeren van ecotoxicologisch onderzoek14. Bijgevolg lijken hellgrammieten in staat om de schadelijke effecten van vervuiling in aquatische ecosystemen te beoordelen. Eigenschappen zoals hun biologie, genetica en fysiologie maken niet-modelorganismen geschikt voor effectbeoordeling in ecosystemen14.

Dit protocol heeft tot doel een nieuw biomonitoringinstrument op te zetten met behulp van een niet-modelorganisme dat vroegtijdige waarschuwingssignalen kan detecteren als reactie op niet-doelwitvervuilingsmengsels. Om de beste resultaten te bereiken, zijn de eigenschappen van de larven van de modelsoort, C. texanus, uitgebreid overwogen en geïntegreerd in de analyse15.

Protocol

figure-protocol-1
Figuur 1: Korte stap-voor-stap handleiding voor het gebruik van de niet-conventionele biomonitor Corydalus texanus voor implementatie in aquatische ecosystemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Veldwerk

  1. Identificeer studielocaties die zich stroomopwaarts en stroomafwaarts van de vervuilingsbron bevinden waar vermoedelijke of duidelijke effecten worden herkend (dwz punctuele of diffuse emissies).
    OPMERKING: Het huidige protocol omvatte 15 studielocaties in vier hoofdrivieren: 1) Extoraz-rivier (locaties PB, EZ, RQ, BC); 2) Escanela-Jalpan-rivier (ES, EN, AH, JL, PI, PA); 3) Ayutla-rivier (AY); en 4) Santa María-rivier (SM, AT).
  2. Zoek en lokaliseer ten minste één referentielocatie (een plaats met geringe of geen effecten) en definieer deze als een studielocatie.
    OPMERKING: Voor de huidige studielocaties werden BC, ES, SM, AY en AT beschouwd als referentielocaties.
  3. Herken bepaalde kenmerken van habitats die de kans op het vinden van individuen van C. texanus vergroten. Deze omvatten grindsubstraat, rotsachtige habitats met steilere hellingen, snelle stromingen, goed zuurstofrijk water, hoge bladerdakdichtheid en habitats in hooglanden en laaglanden.
  4. Omsluit een deel van de beek van 100 m om geschikte habitats voor biomonitoring te identificeren16.
  5. Ga de stream in om monsters te verzamelen.
  6. Bemonster ten minste zes individuen van C. texanus in habitats zoals riffles, kiezels, helder water en puin met behulp van een schop met een maaswijdte van 500 μm.
  7. Verwijder rotsen in de richting van de waterstroom en breng de larven over in het net.
  8. Hanteer het kicknet met bemonsterde larven en breng ze over naar aangewezen flessen voor tijdelijke huisvesting. Ga voorzichtig om met het net en vouw de randen naar binnen om verlies van larven te voorkomen.
  9. Meet de kopbreedte van de bemonsterde larven met behulp van een schuifmaat om de sterren IX tot XI te identificeren (binnen het bereik van 6 mm tot 10 mm).
  10. Spoel de larven door ze 30 minuten onder te dompelen in een fles met beekwater.
  11. Plaats monsters in plastic flessen met duidelijke etikettering en euthanaseer ze vervolgens door onderdompeling in vloeibare stikstof (-75 °C) in een cryogene tank.
  12. Transporteer en bewaar de monsters veilig bij -45 °C in de ultravriezer in het laboratorium.
  13. Neem met behulp van een fles polyethyleen een stroomwatermonster van 200 ml, voeg 1 ml salpeterzuur toe en bewaar het monster bij 4 °C voor latere kwantificering van zware metalen in het laboratorium.

2. Dissectie van de bemonsterde larven en weefselscheiding

  1. Zet de plastic snijbak op ijs en wacht tot het 4 °C bereikt, gebruik een thermometer om te controleren.
  2. Neem monsters uit de ultravriezer en leg ze op de snijbak om te beginnen met ontleden.
  3. Selecteer doelweefsels: spieren, takken, neurale buis en exoskelet.
  4. Gebruik een keramisch mes om de kop te verwijderen en scheid de tissues voorzichtig. Open het lichaam in de lengterichting en verwijder de kieuwen aan weerszijden.
  5. Scheid de exoskeletten met een kleiner keramisch mes en verwijder het overtollige weefsel. Plaats de exoskeletten in een oven en droog ze 48 uur bij 80 °C.
  6. Nadat de tijd is verstreken, bewaart u droge exoskeletten voor verdere analyse.
  7. Blijf zachte weefsels reinigen onder koude omstandigheden voor verdere analyse door middel van microassays.
  8. Gebruik een klein keramisch mes om zachte weefsels uit vet te extraheren. Scheid en poolen elk doelweefsel van individuen van hetzelfde bemonsteringspunt.
  9. Bewaar elk weefseltype in een microbuisje van 2 ml en houd tijdens het hele proces koude omstandigheden aan.
  10. Weeg voor elk doelweefsel 100 mg van het weefsel af en voeg 1 ml PBS-oplossing met een pH van 7,4 toe. Gebruik een weefselscheuraar met één hand om elk weefsel te homogeniseren. Doorgaans hebben zachte weefsels drie cycli van elk 10 s nodig.
  11. Centrifugeer het monster bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng het bovenstaande over in een microbuisje van 1 ml.
  12. Voer biomarkermicroassays uit.

3. Kwantificering van zware metalen

  1. Weeg 250 mg gedroogde exoskeletten af van ten minste zes exemplaren in de gespecificeerde ontwikkelingsfase met behulp van een analytische balans.
  2. Maal exoskeletten in een glazen vijzel tot ze fijn gepoederd zijn. Voeg 250 ml ultrapuur salpeterzuur toe aan de poederreactievaten.
  3. Om de monsters te verteren, brengt u ze gedurende 30-45 minuten over naar een vergistingsmagnetron bij 180 °C.
    NOTITIE: Gebruik de juiste magnetronbestendige container voor het magnetronmerk om monsters veilig en effectief te verwarmen. De verteringstijd voor weefselmonsters verschilt per magnetronmerk en duurt 30-45 minuten. Sommige merken bieden gestandaardiseerde methoden aan.
  4. Voer een microgolfvergistingsmethode uit voor watermonsters volgens de EPA3015A-methode, waarbij 45 ml van het watermonster wordt gebruikt en 5 ml salpeterzuur wordt toegevoegd.
  5. Meet zware metalen en metalloïden in verteerde monsters (water en weefsels) met behulp van inductief gekoppelde plasma optische emissiespectroscopie (ICP-OES), inclusief Hg, Cu, Pb, Zn, Fe, Cr, Cd, Mn, Ba en As.
    OPMERKING: Gebruik argonklasse 5 en standaardoplossingen van elk metaal en metalloïde om een kalibratiecurve te construeren.

4. Microassays voor de beoordeling van oxidatieve stress en biomarkers

  1. Reagentia voorbereiden
    1. Meng 6 g NaH2PO4 met 1000 ml ultrapuur water om een monobasisch fosfaatbuffer van 50 mM te maken. Onbeperkt bewaren in een kolf bij 2-8 °C.
    2. Om 8,1% SDS te maken, lost u 450 mg natriumdodecylsulfaat (SDS) op in ultrapuur water van 5 ml. Bereid het voor op een rijtje.
    3. Verdun 2 ml trichloorethaanzuur (TCA) in 8 ml ultrapuur water (bereid indien nodig vers reagens).
    4. Los 100 mg tetrabutylammonium (TBA) op in 10 ml ultrapuur water (bereid indien nodig vers reagens).
    5. Om 50 mM PBS pH 7,8 te maken, lost u 97 mg Na2HPO4 en 59 mg NaH2PO4 op in 10 ml ultrapuur water. Pas vervolgens de pH aan op 7,8 met NaOH om te verhogen of HCl om te verlagen.
    6. Maak een oplossing van 200 μg/ml rundercatalase door 8 mg ervan op te lossen in 40 μl ultrapuur water (bereid indien nodig vers reagens).
    7. Om een oplossing van 50 mM TRIS/5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) te maken, voegt u 6,05 g tris (hydroxymethyl)aminomethaan (TRIS) en 0,073 g EDTA toe aan 45 ml ultrapuur water. Stel de pH in op 7,6 met HCl en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
    8. Weeg voor 0,1 M glutathion gereduceerd (GSH) (voor 45 gedupliceerde monsters) 0,0184 g GSH af en los het op in 600 μL 10 mM HCl.
    9. Om 10 mM HCl te bereiden, voegt u 0,5 μL geconcentreerd HCl toe aan 599,5 μL ultrapuur water.
    10. Voeg 28,5 μL glutathionreductase toe aan 1,4 ml 0,1 M TRIS/HCl 0,5 mM EDTA pH 8,0.
    11. Meng 1,211 g TRIS en 0,0146 g EDTA met 90 ml ultrapuur water om een 0,1 M TRIS/HCl en 0,5 mM EDTA-oplossing bij pH 8,0 te bereiden. Voeg indien nodig HCl toe om de pH aan te passen. De oplossing kan voor onbepaalde tijd worden bewaard bij 2-8 °C.
    12. Weeg 0,075 g NADPH en voeg dit toe aan 2,25 ml 1% NaHCO3 1 mM EDTA.
    13. Meng 1 g NaHCO3 en 0,0282 g EDTA in 100 ml ultrapuur water om een 1% NaHCO3 en 1 mM EDTA-oplossing te bereiden. Bewaar de oplossing voor onbepaalde tijd bij 4-8 °C.
    14. Meng 2 μL t-butylhydroperoxide met 2 ml ultrapuur water om een oplossing van 7 mM te maken. Meng direct voor gebruik.
    15. Meng 1 g runderserumalbumine (BSA) met 1 ml ultrapuur water tot een stockoplossing van 1 μg/μl.
  2. Thiobarbituurzuur reactieve stoffen (TBARS) (lipideperoxidatie, LPO)17
    1. Voeg 5 μL weefselsupernatans toe aan een microbuisje van 1 ml. Voeg 45 μL 50 mM PBS toe (verse en bouillonoplossing).
    2. Voeg 12,5 μL 8,1% SDS toe (vers bereid). Voeg 93,5 μL 20% TCA pH 3,5 toe (vers bereid).
    3. Voeg 93,5 μL 1% TBA toe (vers bereid). Vul het volume aan door 50,5 μL ultrapuur water toe te voegen. Sluit het deksel van de buis en draai het gedurende 30 s.
    4. Prik met een naald in het deksel van de microbuisjes en incubeer gedurende 10 minuten in kokend water.
    5. Koel de buis af tot kamertemperatuur (RT) en centrifugeer deze vervolgens gedurende 10 minuten op 1000 x g .
    6. Voeg 150 μl supernatans toe aan een putje in een microtiterplaat met 96 putjes en meet de extinctie bij 530 nm met behulp van een microplaatspectrofotometer.
    7. Om lipideperoxiden te kwantificeren, maakt u een 8-punts TBARS-kalibratiecurve (0-160 μM) met behulp van malondialdehyde bis (dimethylacetaal) zoals beschreven in tabel 1. Pas de malondialdehyde (MDA)-curve aan op basis van het weefseltype of het vermoedelijke schadeniveau.
    8. Druk de resultaten uit als nmol MDA eq·mg−1 eiwit.
  3. Superoxide dismutase antioxidant enzym microassay (SOD)18
    1. Gebruik een plaat met 96 putjes. Voeg 147 μL 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 toe aan twee putjes als blanco's. Voeg 144 μL 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 duplicaat toe aan andere putjes.
    2. Neem 3 μl van het bovenstaande en voeg dit toe aan de monsterputjes. Meng de inhoud op het bord meerdere keren voorzichtig.
    3. Voeg binnen 30 s 3 μL 10 mM pyrogallisch zuur toe aan elk putje. Meng onmiddellijk voorzichtig.
    4. Meet de extinctie bij T0 (tijd = 0 s) en T10 (tijd = 10 s), bij 420 nm en 25 °C.
    5. Bepaal SOD door het percentage pyrogallol-remming in het monster te berekenen met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-2
      Waar
      x% = percentage oxidatie van pyrogallol door SOD in het monster; Daarom is de oxidatie van pyrogallol gelijk aan 100 - x%
      OPMERKING: Berekening van de SOD-activiteit rekening houdend met 1 IE is het volume dat 50% van de pyrogalloloxidatie remt, zoals hieronder beschreven:
      figure-protocol-3
      Waar
      y = monstervolume op milliliter (remt 50% van het pyrogallon)
      50% = percentage van remming van pyrogallol is gelijk aan 1U SOD
      0,003 = volume in milliliter van het monster
      100 - x% = remming van pyrogallol in percentage door het monster
    6. Bepaal ten slotte de SOD-activiteit met de vergelijking:
      figure-protocol-4
      SOD = activiteit van SOD in internationale eenheden per microgram eiwit
      Y = monstervolume in die zin dat 50% van de pyrogallol remt
      100 = omrekeningsfactor van deciliter naar milliliter.
      eiwit = eiwitconcentratie verkregen uit de kwantificering van Bradford wordt uitgedrukt in microgram per milliliter; Het is noodzakelijk om te delen door 10 om te rekenen naar gram per deciliter
  4. Catalase antioxidant enzym microassay (CAT)19,20
    1. Gebruik een microplaat met 96 putjes. Voeg 20 μl monstersupernatans toe aan de putjes (per duplicaat).
    2. Voeg standaard 20 μL verse catalase (200 μg/ml) toe aan putjes (per duplicaat). Voeg 100 μL 50 mM PBS pH 7,8 toe aan het monster en maak de putjes leeg.
    3. Voeg 100 μL 90 mM (30%) H2O2 toe aan putjes om de reactie te starten. Na toevoeging van H2O2 wordt de absorptie elke 15 s gedurende 2,5 min bij 240 nm afgelezen.
    4. Bereken de activiteit met behulp van de vergelijking:
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      figure-protocol-8
      figure-protocol-9
  5. Glutathion peroxidase enzym microassay (GPx)21
    1. Gebruik een microplaat met 96 putjes.
    2. Meng 240 μl 0,1 M GSH-oplossing, 1 200 μl 10 E/ml GSH-Rd-oplossing en 1 200 μl 4 mM NADPH. Bewaar de oplossing op ijs.
    3. Voeg aan de putjes 100 μL 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7,6 toe. Voeg 1 μl bovenleidingsmonster in tweevoud toe. Tik op de microplaat en meng voorzichtig.
    4. Voeg 50 μl van de mengseloplossing toe (stap 4.5.2) en meng voorzichtig.
    5. Voeg 20 μL van de 7 mM t-butylhydroperoxideoplossing toe aan putjes om de reactie op gang te brengen (het duurt ongeveer 15 s om de reactie te starten in 16 gedupliceerde monsters). Meng de microplaat snel.
    6. Bewaak de absorptie met elk interval van 1 minuut gedurende 5 minuten bij 25 °C bij 340 nm.
    7. Bereken GPx-activiteit met de vergelijking:
      figure-protocol-10
      Waar
      GPx = activiteit in millimolair per minuut per microgram eiwit
      ΔAbs340/min= Gemiddelde extinctie in delta
      103 = Conversie van kies naar millimolair
  6. mg prot = eiwitconcentratie volgens de bepaling van Bradford, uitgedrukt in microgram per microliter
    1. Kwantificering van eiwitten door de analyse van Bradford22
    2. Voer een standaardcurve uit met runderserumalbumine (BSA)-oplossingen, ingesteld op 1 μg/μl uit de standaardoplossing, zoals aangegeven in tabel 2.
    3. Gebruik een microplaat met 96 putjes. Voeg 190 μl Bradford-reagens toe aan het monster en de standaardputjes.
    4. Voeg 10 μL BSA toe in standaardputjes door middel van een duplicaat. Voeg 10 μl bovenmiddel toe aan de monsterputjes door middel van een duplicaat.
    5. Meng voorzichtig met de pipetpunt.
    6. Afgelezen extinctie bij 595 nm. Kwantificeer de eiwitconcentratie met de standaardcurve.

Resultaten

Uit de resultaten van het onderzoek blijkt dat zware metalen, met name aluminium (Al), ijzer (Fe) en zink (Zn), een nadelige invloed hebben op het milieu, zoals blijkt uit figuur 2. De detectie van hoge niveaus van zware metalen in zowel weefsel- als watermonsters die op alle locaties zijn verzameld, heeft tot een ongunstig resultaat geleid. Er werden uitschieters gedetecteerd, met een bioaccumulatiefactor (BAF) van 600, met name in mijnbouwintensieve gebieden zoals de Extoraz-rivier (locaties PB, EP, RQ en BC weergegeven in figuur 3). Opmerkelijk is dat op sommige studielocaties waar de zinkconcentraties in het water abnormaal hoog waren (PB), het niet mogelijk was om exemplaren van C. texanus te vinden. Dit geeft aan dat de bioaccumulatiedrempel waarschijnlijk is overschreden.

figure-results-1
Figuur 2: Boxplot van bioaccumulatiefactor (BAF) beoordeeld in Corydalus texanus-individuen bemonsterd langs 15 onderzoekslocaties. Bioaccumulatiefactor (BAF) werd berekend voor Al-, Fe- en Zn-metalen op basis van analyse van watermonsters en exoskeletten van C. texanus-individuen . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aangezien SGBR een beschermd natuurgebied is, is het van essentieel belang ervoor te zorgen dat er geen veranderingen in het milieu optreden die gevolgen kunnen hebben voor het schildwachtorganisme. Er werden echter gradiënten waargenomen in de respons van biomarkers voor oxidatieve stress (Figuur 3). Volgens de beoordeling waren de locaties met de laagste niveaus van celmembraanschade, zoals blijkt uit LPO-niveaus, EN, SM en CN. Deze zelfde plaatsen vertoonden een laag niveau van SOD-activiteit, die dient als het primaire enzym in de verdediging van het lichaam tegen oxidatieve stress. Dit suggereert dat er op deze locaties minimale oxidatieve stress optreedt en dat daarom interventies die geen invloed hebben op schildwachtorganismen kunnen worden overwogen. Daarentegen werd waargenomen dat de activiteit van GPx significant lager was op verschillende locaties, namelijk EP, RQ, BC en ES, waar hoge niveaus van LPO werden geregistreerd. Deze observatie suggereert dat het organisme reageert op de stressvolle omstandigheden die voornamelijk worden veroorzaakt door mijnbouw. Bij het evalueren van de vroegtijdige waarschuwingsmarkers in dit specifieke organisme, is ontdekt dat bepaalde locaties een lage en hoge impactgraad hebben. Deze bevindingen tonen effectief het nut aan van het gebruik van deze soort als een onconventionele schildwacht.

figure-results-2
Figuur 3: Boxplot van de beoordeelde biomarkerresponsen in exemplaren van Corydalus texanus op 15 bemonsteringslocaties in drie grote rivieren die uitmonden in een bekken in Mexico (Sierra Gorda Biosphere Reserve) tijdens het droge en natte seizoen. De responsen werden gemeten met behulp van drie biomarkers: (A) lipideperoxidatieniveau (LPO) dat cellulaire vroege schade weerspiegelt, (B) antioxidantrespons van eerstelijns cellulaire afweersuperoxide-dismutase (SOD), en (C) antioxidantrespons van cellulaire afweer door glutathionperoxidase (GPx). Rode pijlen geven de afwezigheid van biomonitor-individuen of een zeer beperkt aantal exemplaren aan, wat slechts één keer voorkwam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Buis200 μM MDA bis (μL)Ultrapuur water (μL)MDA bis-concentratie (μM)
1010000
212.5987.52.5
3259755
45095010
510090020
620080040
740060080
8800200160

Tabel 1: MDA-concentratie die nodig is om de MDA-concentratiecurve te construeren.

Concentratie (μg/μL)Voorraad oplossing (μL)Ultrapuur water (μL)
0050
0.1545
0.21040
0.42030
0.84010
1500

Tabel 2: BSA-concentratie voor eiwitkwantificeringscurve.

Discussie

Hoewel het gebruik van C. texanus optimaal is voor evaluatie, is het noodzakelijk om verschillende aspecten van het gebruik en de verzameling ervan in overweging te nemen. Gekozen studielocaties blijken een uitdaging te zijn vanwege verschillende factoren, zoals ongunstige weersomstandigheden, geografische ontoegankelijkheid, hoge droogteniveaus of onvoldoende beveiligingsprotocollen in geselecteerde regio's. Genoemde beperkingen en beperkingen kunnen vaak uitdagingen opleveren bij het uitvoeren van veldwerk. Bij het evalueren van specifieke regio's, met name die in tropische stromen, kan het verkrijgen van monsters een uitdaging zijn. Hoewel voor dit doel de Barbour23-richtlijnen werden nageleefd, kunnen er vanwege hun specifieke eigenschappen obstakels zijn voor het aanpassen van protocollen in sommige ecosystemen. Zoals eerder vermeld, brengt het verzamelen van monsters in tropische lotische omgevingen een verscheidenheid aan uitdagingen met zich mee als gevolg van regionale en lokale factoren. Deze factoren omvatten de hoge niveaus van heterogeniteit in het milieu, substraten met een hoge variatie, stroomgebied, breedte, diepte, stroming, oevervegetatie en het brede scala aan fysisch-chemische omstandigheden24. Bijgevolg kan het verkrijgen van een uniforme grootte voor exemplaren een uitdaging zijn, omdat ze van nature worden beïnvloed door een bepaald factorbereik, met name als reactie op seizoensveranderingen. Het standaardiseren van hun omvang kan dan ook een complexe onderneming zijn. Na succesvolle afronding van het veldwerk worden de daaropvolgende laboratoriumprocedures gefaciliteerd, waardoor verdere analyse mogelijk is.

De implementatie van een vroegtijdige waarschuwingsbeoordeling in C. texanus heeft de levensvatbaarheid ervan aangetoond bij het spiegelen van effecten in de context van aquatische ecosystemen. In dit opzicht is het identificeren van aquatische macro-invertebraten als betrouwbare indicatoren van menselijke impact een praktische benadering gebleken25,26. Het huidige onderzoek heeft aangetoond dat C. texanus dient als een zeer effectief niet-traditioneel model voor het snel beoordelen van omgevingsomstandigheden. In het geval van de huidige studie toonde het aan dat C. texanus vertoonde variatie in reacties op vervuiling door zware metalen als gevolg van mijnbouw. Toegevoegde effecten van habitatveranderingen maken het mogelijk om een hoge gevoeligheidsgraad in C. texanus te herkennen. Hoewel er bewijs van mijnbouwactiviteit in het gebied aanwezig was, konden traditionele vervuilingsindicatoren, zoals de diversiteitsindex berekend in Rico-Sanchez et al.27, de impact van vervuiling door zware metalen in kernzones of beschermde gebieden niet erkennen. Er werden echter veranderingen waargenomen in gebieden zoals BC of SM, die zich in kernzones bevinden. Hoewel natuurlijke beschermde gebieden effectief zijn voor natuurbehoud, geven de bevindingen met betrekking tot C. texanus aan dat vroege waarschuwingssignalen van schade al onopgemerkt optreden. De opname van niet-conventionele en inheemse fauna moet worden bepleit in onderzoeksprotocollen en toekomstige regelgeving in hun respectieve landen, met name in tropische gebieden waar rivierecosystemen aanzienlijk verschillen van die in gematigde gebieden28. Het gebruik van een niet-conventionele biomonitor zoals C. texanus kan helpen de nauwkeurigheid en relevantie van onderzoeksresultaten te verbeteren en de instandhoudingsinspanningen voor deze belangrijke soorten en hun leefgebied te verbeteren.

Het gebruik van Corydalus sp. toonde ook een hoge gevoeligheid voor diverse effecten van menselijke activiteiten (d.w.z. landbouweffecten zoals verandering in landgebruik en gebruik van landbouwchemicaliën), zoals waargenomen in de Filobobos-rivier (een plaats in de richting van het stroomgebied van de Golf van Mexico)7. De studie in kwestie benadrukt de belangrijke rol van calcium bij het induceren van stress op Corydalus sp. als gevolg van de verhoogde toename van LPO-niveaus onder abnormaal verhard water in de Filobobos-rivier. Deze bevindingen, samen met de huidige, bewezen het nut van het geslacht Corydalus bij het beoordelen van aquatische ecosystemen op intertropische breedtegraden. Alvorens een specifiek aquatisch ecosysteem te beoordelen, is het echter noodzakelijk om voorkennis te hebben van het studiegebied. Door het uitvoeren van een grondige analyse moeten de optimale onderzoekslocaties worden bepaald om de meest uitgebreide en volledige data te verzamelen.

De effectiviteit van laboratoriumwerk is sterk afhankelijk van het gebruik van geschikte verzameltechnieken. Het verzamelen van grotere monsters kan nuttig zijn bij het uitvoeren van dissectie vanwege de grotere hoeveelheid zacht weefsel en exoskelet die beschikbaar zijn voor analyse. Het is echter belangrijk op te merken dat seizoensvariaties de accumulatie van vetweefsel kunnen beïnvloeden, waardoor het een uitdaging is om de zachte weefsels en exoskeletten tijdens temporele studies te scheiden. In dergelijke gevallen kan het raadzaam zijn om te focussen op de kieuwen en beschikbare spieren van elk individu. Het verkrijgen van een aanzienlijk aantal individuen kan een kritieke uitdaging zijn. Vanwege de eerder genoemde variaties kan het een grotere uitdaging zijn om voldoende weefsel te krijgen om het gehalte aan zware metalen en de respons van biomarkers te beoordelen. De huidige studie toonde een voorbeeld van dit geval omdat het niet mogelijk was om catalase te beoordelen in monsters van de SGBR. Voorafgaand aan het huidige protocol vereiste de beoordeling van catalase een grote hoeveelheid weefsel; Desalniettemin biedt het huidige voorstel voor catalasebepaling een minimale hoeveelheid weefsel voor hun beoordeling.

Het huidige protocolvoorstel biedt een geschikte kans om een haalbare benadering van de ecologische integriteit te maken met behulp van veel voorkomende hellgrammieten in aquatische ecosystemen. Het biedt cruciale informatie voor het identificeren van punctuele vervuiling of indirecte schadelijke effecten van menselijke invloeden, waardoor belanghebbenden, ecologen en aquatische wetenschappers op het juiste moment kunnen worden geïnformeerd. Hoewel de kosten van het huidige protocol aanzienlijk zijn verlaagd, blijft het nog steeds relatief duur vanwege de noodzaak van meerdere reagentia en het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. Bovendien beperkt de vereiste van gespecialiseerde apparatuur het aantal locaties waar de volledige test kan worden uitgevoerd.

Openbaarmakingen

De auteurs maakten geen belangenconflicten bekend die aanwezig waren in hun werk.

Dankbetuigingen

De auteurs willen hun oprechte dank betuigen aan CONAHCyT voor het verstrekken van de FONINS P 1931-beurs, die hun onderzoeksinspanningen enorm heeft vergemakkelijkt. Ze zouden ook de Secretaría de Investigación y Posgrado van het Instituto Politécnico Nacional bedanken voor de onschatbare steun die is verleend via de SIP-projectsubsidie (20200577). Bovendien wil de eerste auteur de genereuze postdoctorale beurs erkennen die door CONAHCyT is toegekend, waardoor het team excursies kon maken en essentiële gegevens kon verzamelen. Tot slot willen de auteurs hun waardering uitspreken voor de onschatbare hulp van María Teresa García Camacho in het laboratorium, zonder wie dit project niet mogelijk zou zijn geweest.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Analytische weegschaal van 220 gOhausPR224/EDeze weegschaal is handig voor het wegen van het geëxtraheerde weefsel uit monsters.
WadersLaCrosse700152MWe raden aan om waders te gebruiken voor het verzamelen van monsters. Als alternatief kunt u ook laarzen met rubberen heuplaarzen gebruiken voor het bemonsteren.
SnijplankTrueTRUE915121Het wordt aanbevolen om witte en plastic borden te gebruiken.
PincetDR Instruments112Het wordt aanbevolen om een pincet van 12 pul gemaakt van roestvrij staal te gebruiken.
Inductief Gekoppeld Plasma-Optische EmissiSpectroscopie SysteemPerkin Elmer7300 DVEen apparaat voor het kwantificeren van zware metalen met behulp van spectroscopie.
KicknetLaMotte0021-PEen alternatieve methode voor het maken van een kicknet is het handmatig vervaardigen van een net met een maaswijdte van 500 micrometer.
Vloeibare Stikstof NANANA
Vloeibare Stikstof Dewar Statische Cryogenische ContainerBestEquipDF0504Het wordt aanbevolen om een aluminium tank met canisters te gebruiken.
Mortel en stamper setCole-ParmerEW-63100-54Dit is een porseleinen mortel en stamper die wordt gebruikt voor het malen van droog weefsel.
Multiwave GO PlusAnton PaarC93IP001EN-EMultiwave is een nuttig hulpmiddel voor het verteren van meerdere monsters.
Oven voor het drogenFisher scientific506GEen incubatoroven, ook wel droog weefseloven genoemd, is essentieel voor het drogen van weefsels bij temperaturen van minimaal 80°C.
PrecisiescalpelXcelite by Weller037103-48768Het wordt aanbevolen om een scalpel van aluminium te gebruiken.
Weefsel Homogenisator (scheurder)KoproK110000Het wordt aanbevolen om een weefselscheurder met een basis te gebruiken. Sommige bedrijven bieden ultrasone scheurleders aan, wat misschien de optimale keuze is.
Ultra-lage temperatuur kistvriezerREVCOCA89200-384Veel bedrijven leveren vriezers, maar het wordt aanbevolen om er een te kiezen met een opslagtemperatuur van minimaal -40°C.
Wide mouth plastic flessenUnited Scientific81900Het wordt sterk aanbevolen om flessen van polypropyleen met brede doppen en monden te gebruiken.

Referenties

  1. Rivera-Gasperín, S. L., Ardila-Camacho, A., Contreras-Ramos, A. Bionomics and ecological services of Megaloptera larvae (Dobsonflies, Fishflies, Alderflies). Insects. 10 (4), 86(2019).
  2. Cover, M. R., Seo, J. H., Resh, V. H. Life history, burrowing behavior, and distribution of Neohermes filicornis (Megaloptera: Corydalidae), a long-lived aquatic insect in intermittent streams. Western North Ame. Nat. 75 (4), 474(2016).
  3. Martins, C. C., Ardila-Camacho, A., Rivera-Gasperín, S. L., Oswald, J. D., Liu, X., Contreras-Ramos, A. A world checklist of extant and extinct species of Megaloptera (Insecta: Neuropterida). Euro J of Tax. 812 (1), 1-93 (2022).
  4. Knight, A. W., Siegfried, C. A. The distribution of Corydalus Cornutus (Linnaeus) and Nigronia Serricornis (Say) (Megaloptera: Corydalidae) in Michigan. The Great Lakes Entomol. 10 (2), 1(2017).
  5. Florida, S., Lindsay, H., Patel, M., Lindsay, P. Water quality of Quebrada Cuecha: effects of the effluent from the Monteverde cheese factory. , Available from: https://digitalcommons.usf.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1662&context=tropical_ecology (2018).
  6. Cao, C. -Q., Liu, Z., Chen, S. -Z., Tong, C. The swimming behavior of the aquatic larva of Neoneuromus ignobilis (Megaloptera: Corydalidae: Corydalinae). Acta Entomol Sin. 55 (1), 133-138 (2012).
  7. Rico-Sánchez, A. E., Rodríguez-Romero, A. J., Sedeño-Díaz, J. E., López-López, E. Assessment of seasonal and spatial variations of biochemical markers in Corydalus sp. (Megaloptera: Corydalidae), a non-conventional biomonitor, in a mountain cloud forest in Mexico. Environ Sci Pollut Res Int. 27 (24), 30755-30766 (2020).
  8. Galindo-Pérez, E. J., et al. Cave macroinvertebrates as bioindicators of water quality. Water Sci Technol. 8 (5), 5-17 (2017).
  9. Dolin, P. S. The life history and ecology of Chauliodes Rastricornis Rambur and C. Pectinicornis. (Linnaeus)(Megaloptera: Corydalidae) in Greenbottom swamp, Cabell County, West Virginia. Marshall University. , Doctoral dissertation (1980).
  10. Cover, M. R., Resh, V. H. Global diversity of dobsonflies, fishflies, and alderflies (Megaloptera; Insecta) and spongillaflies, nevrorthids, and osmylids (Neuroptera; Insecta) in freshwater. Hydrobiologia. 595 (1), 409-417 (2008).
  11. Barba-Álvarez, R., De la Lanza-Espino, G., Contreras-Ramos, A., González-Mora, I. Aquatic insects indicators of water quality in Mexico: case studies, Copalita, Zimatán and Coyula rivers, Oaxaca. Mexican Biodiversity Magazine. 84 (1), 381-383 (2013).
  12. Beyer, J., et al. Environmental risk assessment of combined effects in aquatic ecotoxicology: A discussion paper. Mar Env Res. 96, 81-91 (2014).
  13. Tišler, T., Zagorc-Končan, J. Comparative assessment of toxicity of phenol, formaldehyde, and industrial wastewater to aquatic organisms. Water Air Soil Pollut. 97, 315-322 (1997).
  14. Larramendy, M. Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-traditional Aquatic Models. Royal Society of Chemistry. , Cambridge. (2017).
  15. Contreras-Ramos, A., Rosas, M. V. Biodiversity of Megaloptera and Raphidioptera in Mexico. Biodiversity Supplement of Mexico. 85, 257-263 (2014).
  16. Villamarín, C., Rieradevall, M., Paul, M. J., Barbour, M. T., Prat, N. A tool to assess the ecological condition of tropical high Andean streams in Ecuador and Peru: The IMEERA index. Ecol Indic. 29, 79-92 (2013).
  17. Uchiyama, M., Mihara, M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem. 86 (1), 271-278 (1978).
  18. Marklund, S., Marklund, G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 47 (3), 469-474 (1974).
  19. Aebi, H. Catalase. Methods Enzymol. 105, 121-126 (1984).
  20. Li, Y., Schellhorn, H. E. Rapid kinetic microassay for catalase activity. J Biomol Tech. 18 (4), 185-187 (2007).
  21. Kumar, P., Maurya, P. K. L-Cysteine efflux in erythrocytes as a function of human age: Correlation with reduced glutathione and total anti-oxidant potential. Rejuvenation Res. 16 (3), 179-184 (2013).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Barbour, M. T., Stribling, J. B., Verdonschot, P. F. M. The multihabitat approach of USEPA's rapid bioassessment protocols: benthic macroinvertebrates. Limnetica. 25 (3), 839-850 (2006).
  24. Allan, J. D. Stream Ecology: Structure and Function of Running Waters. , Springer. Dordrecht. (2007).
  25. Barbour, M. T., Gerritsen, J., Snyder, B. D., Stribling, J. B. Rapid Bioassessment Protocols for Use in Streams and Wadeable Rivers: Periphyton, Benthic Macroinvertebrates and Fish. United States Environmental Protection Agency. , Washington, DC. (1999).
  26. Wright, J. F., Armitage, P. D., Furse, M. T., Moss, D. The classification of sites on British rivers using macroinvertebrates. SIL Proceed, 1922-2010. 22 (3), 1939-1943 (1984).
  27. Rico-Sánchez, A. E., Rodríguez-Romero, A. J., Sedeño-Díaz, J. E., López-López, E., Sundermann, A. Aquatic macroinvertebrate assemblages in rivers influenced by mining activities. Sci Rep. 12 (1), 3209(2022).
  28. Ramírez, A., Pringle, C. M., Wantzen, K. M. Tropical Stream Conservation. Tropical Stream Ecology. , Academic Press, Elsevier. (2008).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hellgrammite biomonitorbeoordeling van oppervlaktewaterCorydalus texanusaquatische ecosystemengevoeligheid voor vervuilingbioaccumulatie van zware metalenmijnbouvervuilingniet conventionele bioindicatorindicator voor ecosystemgezondheid
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen