Dit artikel beschrijft de identificatie van pyroptotische cellen met behulp van flowcytometrie na dubbele kleuring met antilichamen tegen het N-terminale fragment van kip GSDME (chGSDME-NT) en propidiumjodide (PI).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pyroptose is een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk wordt aangedreven door de vorming van plasmamembraanporiën door de N-terminus die wordt gegenereerd uit de eiwitten van de familie Cleaved Gasdermin (GSDM). Onderzoek van membraan-gehechte GSDM-NT door Western Blot is de meest gebruikte methode voor het evalueren van pyroptose. Het is echter moeilijk om met deze methode cellen met pyroptose te onderscheiden van andere vormen van celdood. In deze studie werden met Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) geïnfecteerde DF-1-cellen gebruikt als model om het aandeel cellen dat pyroptose onderging te kwantificeren door middel van flowcytometrie, met behulp van specifieke antilichamen tegen het N-terminale fragment van kip GSDME (chGSDME-NT) en propidiumjodide (PI) kleuring. De chGSDME-NT-positieve cellen waren gemakkelijk detecteerbaar door flowcytometrie met behulp van Alexa Fluor 647-gelabelde antilichamen tegen chGSDME-NT. Bovendien was het aandeel chGSDME-NT/PI dubbelpositieve cellen in IBDV-geïnfecteerde cellen (ongeveer 33%) significant groter dan in nep-geïnfecteerde controles (P < 0,001). Deze bevindingen geven aan dat onderzoek van membraangebonden chGSDME-NT door middel van flowcytometrie een effectieve benadering is voor het bepalen van pyroptotische cellen onder cellen die celdood ondergaan.
Inleiding
Pyroptose is een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk afhangt van de vorming van plasmamembraanporiën door Gasdermin (GSDM) D bij zoogdieren 1,2,3. Vanwege de genetische deficiëntie van GSDMD bij kippen 4,5, blijft het mechanisme van pyroptose bij kippen ongrijpbaar. De Gasdermin-familie omvat geconserveerde eiwitten, waaronder GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME en DFNB59 3,6. Studies hebben gemeld dat GSDME van teleostvissen en eenden wordt gesplitst door caspase-1/3/7 of caspase-3/7 om pyroptotische celdood te induceren 7,8. De rol van GSDME-gemedieerde pyroptose in de gastheerrespons op pathogene infecties bij kippen moet echter nog worden opgehelderd.
Infectieuze bursale ziekte (IBD) is een acute, zeer besmettelijke en immunosuppressieve pluimveeziekte die wordt veroorzaakt door IBDV9. IBDV, een niet-omhuld dubbelsegmentig dubbelstrengs (ds) RNA-virus, behoort tot het geslacht Avibirnavirus in de familie Birnaviridae10. Eerdere studies door anderen en ons laboratorium hebben aangetoond dat IBDV-infectie celdood induceert in gastheercellen via verschillende routes 11,12,13,14. Eerdere bevindingen hebben aangetoond dat IBDV-infectie de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH) veroorzaakt, een indicator van lytische celdood 6,15, wat suggereert dat IBDV-infectie lytische celdood in gastheercellen induceert. Bovendien tonen de gegevens aan dat IBDV-geïnfecteerde cellen morfologische kenmerken van pyroptotische celdood vertonen, waaronder celzwelling met grote bellen die uit het plasmamembraan blazen en propidiumjodide (PI)-kleuring positief, wat suggereert dat IBDV-infectie pyroptose in cellen induceert.
Aangezien de vorming van membraanporiën in pyroptotische cellen door het N-terminale fragment van gespleten GSDM (GSDM-NT) een kenmerk is van pyroptose, zouden pyroptotische cellen theoretisch kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie door GSDM-NT op het celmembraan te onderzoeken met behulp van specifieke antilichamen. In pyroptotische cellen van vogels vormt het N-terminale fragment van kippengasdermin E (chGSDME-NT) membraanporiën, waardoor propidiumjodide (PI) erdoorheen kan gaan en DNA kan binden. Het aandeel pyroptotische cellen kan dus worden gedetecteerd met behulp van flowcytometrie, waardoor pyroptose wordt onderscheiden van andere vormen van celdood, zoals apoptose en necrose. De methode voor het onderzoeken van pyroptotische cellen door middel van flowcytometrie is echter niet gerapporteerd. In deze studie werden DF-1-cellen geïnfecteerd met IBDV en werd flowcytometrie uitgevoerd om pyroptotische cellen te onderzoeken met behulp van monoklonale antilichamen (McAb) tegen het chGSDME-NT-fragment (membraangebonden) en PI-kleuring. Verrassend genoeg werden pyroptotische cellen effectief gedetecteerd door flowcytometrie. Bovendien kon het aandeel pyroptotische cellen worden gekwantificeerd. Deze bevindingen bieden een krachtig en effectief middel om pyroptose te bepalen.
Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van pyroptose in IBDV-geïnfecteerde cellen door middel van flowcytometrie met behulp van anti-chGSDME-NT, McAb en PI-kleuring. Deze methode kan ook worden uitgebreid naar andere met ziekteverwekkers geïnfecteerde cellen en worden toegepast om verschillende celtypen met pyroptose te onderzoeken, waarbij ze worden onderscheiden van andere vormen van celdood.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van de monstercellen
- Kweek DF-1 (onsterfelijke kippenembryo fibroblasten) cellen in platen met zes putjes (5 x 10,5 cellen per putje) met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in een 5% CO2 -incubator bij 38 °C.
- Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken, gooit u het serumbevattende celkweekmedium weg, wast u de cellen drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voegt u vervolgens 2 ml serumvrij celcultuurmedium toe aan elk putje.
- Voeg de IBDV-virusoplossing (met berekende MOI) toe aan elk putje en stel een nep-geïnfecteerde controle in door het volume DMEM toe te voegen dat gelijk is aan dat van de virusoplossing.
- Gooi na 1 uur virusadsorptie het kweekmedium weg, was de cellen drie keer met PBS, voeg 2 ml DMEM aangevuld met 2% FBS toe aan elk putje en ga door met celculturen gedurende 24 uur.
- 24 uur na IBDV-infectie een trypsinebehandeling uitvoeren (500 μL per putje) gedurende 1 minuut en vervolgens neutraliseren door DMEM aangevuld met 10% FBS (2 ml per putje). Daarna moeten de cellen worden geoogst om eencellige suspensies voor te bereiden voor flowcytometrie.
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C. Gooi het supernatans weg met een pipet.
- Resuspendeer de celpellet in PBS en draai de buizen voorzichtig gedurende 3 s.
- Centrifugeer de cellen zoals beschreven in stap 1.6 (400 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C).
- Herhaal het wassen van de cellen zoals beschreven in stap 1.7 en stap 1.8.
- Voer celtellingen uit met behulp van een hemocytometer onder een microscoop. Resuspendeer de cellen vervolgens in een geschikt volume flowcytometriekleuringsbuffer (zodat de uiteindelijke celconcentratie 1 x 107 cellen/ml is). Draai de suspensies voorzichtig in een draaikolk.
2. Celkleuring voor flowcytometrie
- Voeg 100 μl van de eencellige suspensies uit stap 1.10 toe aan 5 ml polystyreenbuisjes met ronde bodem (12 mm × 75 mm). Bereid nep- en IBDV-geïnfecteerde cellen voor op anti-chGSDME-NT/ CT-antilichaamkleuring en gebruik normaal muizen-IgG als isotypecontrole. Bereid ondertussen blanco controle en enkelvoudig gekleurde buisjes voor met IBDV-geïnfecteerde cellen.
- Voeg 1 μg Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb of normale muis IgG (als isotypecontrole) toe aan respectievelijk IBDV-geïnfecteerde en mock-controlebuisjes. Draai vervolgens de buizen voorzichtig gedurende 3 s.
- Incubeer de gekleurde cellen bij 2-8 °C of 30 minuten in het donker op ijs. Draai de buizen elke 10 minuten voorzichtig in een wervel.
- Was de cellen met 1 ml flowcytometriekleuringsbuffer door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C. Gooi het supernatans weg met een pipet.
- Herhaal het wassen van de cellen zoals beschreven in stap 2.4.
- Resuspendeer de pellet in 100 μL flowcytometrie kleuringsbuffer.
- Kleuring de cellen van de IBDV-geïnfecteerde groep en de nep-geïnfecteerde groep, evenals de PI-enkelvoudig gekleurde buisjes, met 10 μg/ml PI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door het toevoegen van 400 μL flowcytometriekleuringsbuffer voor de flowcytometrietest.
3. Uitvoeren van de flowcytometrietest
- Schakel de flowcytometer in om het instrument te initialiseren en start de software.
- Begin met het laten lopen van de lege regelbuis, gevolgd door de enkele gekleurde buizen om de spannings- en compensatieparameters van de flowcytometer aan te passen. Gebruik FL3- en FL4-fluorescentiekanalen, die uitzenden met 635 nm, voor het detecteren van respectievelijk PI- en Alexa Fluor 647-fluoroforen.
- Nadat u alle parameters hebt geconfigureerd, voert u alle voorbeelden achtereenvolgens uit.
4. Analyse van flowcytometriegegevens
- Analyseer de Alexa Fluor 647-kleuring van elk monster in het FL4-kanaalhistogram.
- Om het aandeel dubbelpositieve cellen in elk monster te beoordelen, gebruikt u de vierkwadrantdiagram van FL3/FL4.
- Stel positieve drempels in op basis van isotypecontrole IgG/PI dubbelgekleurde monsters, en zorg ervoor dat het aandeel dubbelpositieve cellen onder de 1% blijft. Deze aanpak vergemakkelijkt het meten van het aandeel dubbelpositieve cellen in alle monsters.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
chGSDME-NT op het membraan van DF-1-cellen met IBDV-infectie kan gemakkelijk worden gedetecteerd door flowcytometrie
Een van de belangrijkste kenmerken van pyroptotische cellen is de vorming van membraanporiën door GSDM-NT-fragmenten die worden gegenereerd uit Gasdermine-splitsing. Daarom zouden pyroptotische cellen theoretisch kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie door GSDM-NT op celmembranen te onderzoeken met behulp van specifieke antilichamen. DF-...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft een effectieve methode voor het onderzoeken van pyroptose met behulp van flowcytometrie, bereikt door dubbele kleuring van geïnfecteerde cellen met Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb en PI. Deze benadering kan ook worden toegepast op verschillende celtypen om pyroptose te onderscheiden van andere soorten celdood, zoals apoptose en necrose.
Pyroptose, een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk afhankelijk is van Gasdermin (GSDM) ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen Dr. Jue Liu bedanken voor zijn vriendelijke hulp. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (nr. 2022YFD1800300), de National Natural Science Foundation of China (nr. 32130105) en het Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (nr. AUTO'S-40), China.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5 mL ronde bodem polystyreen buis (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cel Cultuur Plaat | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antilichaam labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogene Bevroren Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetaal Rund Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemische Reagens & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx stam | IBDV Lx stam werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Omgekeerde Microscoop | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normale Muis IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Fosfaat Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Jodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsine-EDTA, 0,25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
Referenties
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9(2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526(2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724(2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
