Methodenartikel

Mitochondriale overdracht via tunnelende nanobuisjes tussen mesenchymale stamcellen en retinaal pigmentepitheel in vitro

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66917

⸱

4 oktober 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol met mitochondriale tracering, directe co-cultuurprocedures van mesenchymale stamcellen (MSC's) en retinale pigmentepitheelcellen (ARPE19), evenals de methoden voor het observeren en statistisch analyseren van de vorming van tunnelende nanobuisjes (TNT) en mitochondriale overdracht om mitochondriale uitwisseling via TNT's tussen MSC's en ARPE19-cellen te karakteriseren.

Samenvatting

Mitochondriale overdracht is een normaal fysiologisch fenomeen dat veel voorkomt bij verschillende soorten cellen. In de studie tot nu toe is de belangrijkste route voor mitochondriaal transport via tunnelende nanobuisjes (TNT's). Er zijn veel onderzoeken geweest die melden dat mesenchymale stamcellen (MSC's) mitochondriën kunnen overbrengen naar andere cellen door TNT's. Er zijn echter maar weinig studies die het fenomeen van bidirectionele mitochondriale overdracht hebben aangetoond. Hier beschrijft ons protocol een experimentele benadering om het fenomeen van mitochondriale overdracht tussen MSC's en retinale pigmentepitheelcellen in vitro te bestuderen door middel van twee mitochondriale traceringsmethoden.

We hebben mito-GFP-getransfecteerde MSC's gecoëxcultureerd met mito-RFP-getransfecteerde ARPE19-cellen (een retinale pigmentepitheelcellijn) gedurende 24 uur. Vervolgens werden alle cellen gekleurd met falloïdine en in beeld gebracht door confocale microscopie. We hebben mitochondriën met groene fluorescentie waargenomen in ARPE19-cellen en mitochondriën met rode fluorescentie in MSC's, wat aangeeft dat bidirectionele mitochondriale overdracht plaatsvindt tussen MSC's en ARPE19-cellen. Dit fenomeen suggereert dat mitochondriaal transport een normaal fysiologisch fenomeen is dat ook optreedt tussen MSC's en ARPE19-cellen, en dat mitochondriale overdracht van MSC's naar ARPE19-cellen veel vaker voorkomt dan vice versa. Onze resultaten geven aan dat MSC's mitochondriën kunnen overbrengen naar retinaal pigmentepitheel, en voorspellen op dezelfde manier dat MSC's in de toekomst hun therapeutisch potentieel kunnen vervullen door mitochondriaal transport in het retinale pigmentepitheel. Bovendien moet de mitochondriale overdracht van ARPE19-cellen naar MSC's nog verder worden onderzocht.

Inleiding

Mitochondriën dienen als de primaire energiebron voor de meeste celtypen, waarbij mitochondriale disfunctie vooral van invloed is op weefsels die veel energie vragen, zoals het netvlies. Metabole veranderingen in het netvlies kunnen een bio-energetische crisis veroorzaken, wat uiteindelijk resulteert in de dood van fotoreceptoren en/of RPE-cellen2. Op mesenchymale stamcellen (MSC) gebaseerde therapieën hebben werkzaamheid aangetoond bij de behandeling van oculaire degeneratie, en een van de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de gunstige effecten van MSC's op netvliesweefsels kan worden toegeschreven aan functionele mitochondriale overdracht 3,4,5,6. In 2004 rapporteerden Rustom et al. voor het eerst het fenomeen van mitochondriale overdracht door een nieuwe cel-tot-cel-interactie die wordt vergemakkelijkt door tunnelende nanobuisjes (TNT's)7.

In 2D-cultuur worden tunnelende nanobuisjes (TNT's) geïdentificeerd door hun dunne (20-700 nm) membraanuitsteeksels van tientallen tot honderden nanometers lang, die over het substraat hangen en direct verbindingen kunnen leggen tussen twee of meer homotypische en heterotypische cellen. Deze structuren zijn met name verrijkt met F-actine en vergemakkelijken het transport van vracht, zoals mitochondriën, tussen cellen. Bovendien hebben TNT's openingen aan beide uiteinden, waardoor de continuïteit van de cytoplasmatische inhoud tussen onderling verbonden cellen mogelijkis 8.

Het is moeilijk om TNT-gemedieerde mitochondriale overdracht in vivo te detecteren vanwege de dichte cellulaire rangschikking en uitdagingen bij het volgen van mitochondriën. In vitro experimenten, waarbij gebruik wordt gemaakt van celcocultuur en mitochondriale traceringstechnieken, maken de observatie van TNT-vorming en mitochondriale overdracht mogelijk 8,9. We hebben ook het fenomeen van TNT-gemedieerde mitochondriale overdracht waargenomen door MSC's en retinale pigmentepitheelcellen in vitro te co-cultureren 10.

Veel eerdere studies hebben alleen unidirectionele mitochondriale overdracht van MSC's naar andere cellen waargenomen 3,4,5,6. Eerder probeerden we ook de bidirectionele mitochondriale overdracht te analyseren met behulp van twee soorten cellen die respectievelijk waren gelabeld met mito-tracker groen en mito-tracker rood, maar de overspraak van de kleurstoffen interfereerde met de experimentele resultaten. Om mitochondriale bidirectionele overdracht nauwkeuriger te bestuderen, hebben we hier twee cellijnen met verschillende mitochondriale fluorescentie geconstrueerd met behulp van de lentivirale transfectietechniek, en vervolgens de verschijnselen van TNT-vorming en mitochondriale bidirectionele overdracht door directe co-cultuur in vitro geobserveerd en geanalyseerd.

In het kort wordt hier een stapsgewijs en uitvoerbaar protocol beschreven voor het traceren van mitochondriën, co-cultuur MSC's met ARPE19-cellen en het analyseren van TNT-vorming en mitochondriale overdracht. De resultaten van dit experiment toonden TNT-gemedieerde bidirectionele mitochondriale overdracht aan, wat niet alleen bewees dat mitochondriaal transport een veel voorkomend fysiologisch fenomeen is, maar ook het potentiële therapeutische vermogen van MSC's op netvliescellen aantoonde.

Protocol

1. Genereren van MSC-mito-GFP en ARPE19-mito-RFP cellijnen

  1. Celcultuur
    OPMERKING: Alleen MSC's worden hier als voorbeeld gebruikt.
    1. Kweek menselijke MSC's in een plaat met 6 putjes in hMSC-medium met 1% penicilline en streptomycine (zie Materiaaltabel) totdat de celdichtheid 80%-90% bereikt. Afhankelijk van de dichtheid van de celgroei, vervang het medium eens in de 2-3 dagen.
      1. Verwijder het originele medium en was de cellen eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) (zie Materiaaltabel). Voeg 1 ml van het trypsine-EDTA-DPBS-mengsel toe (0,05% trypsine-EDTA: 0,25% trypsine-EDTA verdund met DPBS in een verhouding van 1:5; zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 3-4 minuten (afhankelijk van de cellen) in een incubator van 37 °C.
        OPMERKING: Observeer de celvertering onder een microscoop en stop de vertering als de meeste cellen afgerond en losgelaten zijn.
      2. Tik zachtjes op de plaat met 6 putjes om de cellen los te maken die aan het oppervlak vastzitten en voeg vervolgens 1 ml vers compleet medium toe om de spijsvertering te beëindigen.
      3. Resuspendeer alle cellen voorzichtig met een pipetpistool en breng vervolgens alle verzamelde cellen over in een centrifugebuisje van 15 ml.
      4. Centrifugeer de cellen bij 200 × g gedurende 5 minuten.
      5. Aspireer het supernatans op en resuspendeer de cellen door 1 ml vers medium toe te voegen. Neem 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen.
      6. Achttien tot 24 uur vóór lentivirale transfectie, MSC-cellen zaaien met een dichtheid van 1 × 105 cellen per putje in platen met 6 putjes, ervoor zorgen dat de celdichtheid op het moment van transfectie ongeveer 50% is.
  2. Transfectie van lentivirus
    OPMERKING: Alle handelingen met betrekking tot lentivirale transfectie moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
    1. Vervang het oorspronkelijke medium de volgende dag door 2 ml vers medium en voeg 25 μl lentivirussuspensie (5.00E+08 TU/ml) met adjuvantia toe, gevolgd door incubatie bij 37 °C.
      OPMERKING: Lentivirus-verpakking is uitgevoerd met behulp van het Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) plasmide (zie Materiaaltabel en Aanvullende Figuur S1) door een bedrijf.
    2. Vervang na 6 uur incubatie het virusbevattende medium door 2 ml vers medium. Ga door met incuberen en vervang het medium eenmaal per dag.
      OPMERKING: Significante mitochondriale fluorescentie-expressie wordt waargenomen in MSC's 48 uur na transfectie, met verdere verbetering zichtbaar op het 72-uurs tijdstip.
    3. Screen succesvol getransfecteerde cellen door het kweekmedium 2 dagen na transfectie aan te vullen met puromycine (1 μg/ml). Voeg tegelijkertijd een equivalente concentratie puromycine toe aan mesenchymale stamcellen zonder virale transfectie als controle.
      OPMERKING: De mito-GFP-virale vector is ontworpen om het puromycine-resistentiegen op te nemen.
    4. Vervang het medium dagelijks met de introductie van puromycine (1 μg/ml). Stop met puromycine bij bijna volledige celdood in de controlegroep.
      OPMERKING: Het medium bevat deze concentratie puromycine niet. De toevoeging van puromycine is alleen vereist wanneer het medium wordt toegevoegd aan een plaat met 6 putjes.
    5. Ga door met kweken zonder puromycine totdat de cellen zijn gepasseerd en ingevroren. Noem dit type cel MSC-mito-GFP.
      OPMERKING: ARPE19-cellen zijn afgeleid van ATCC-celbank en gekweekt in DMEM/F12 die 10% FBS en 1% penicilline en streptomycine bevatten (zie materiaaltabel), en de methoden van hun vertering en doorgang zijn dezelfde als die van MSC's. Plasmide Mito-RFP is door een bedrijf gemodificeerd van Mito-GFP. Ten slotte noemden we de succesvol getransfecteerde cellen ARPE19-mito-RFP.

2. Directe co-cultuur van MSC- en ARPE19-cellen

OPMERKING: In dit co-cultuursysteem zullen MSC-mito-GFP-cellen dienen als donorcellen, terwijl ARPE19-mito-RFP-cellen zullen functioneren als de ontvangende cellen. Om onderscheid te maken tussen donor- en ontvangercellen, hebben we ontvangercellen opgespoord.

  1. Label ARPE19-mito-RFP-cellen met CellTrace Violet (zie Materiaaltabel) in het cytoplasmatische membraan.
    OPMERKING: De excitatie en emissie van de kleurstof CellTrace-violet zijn respectievelijk 405 nm en 450 nm.
    1. Bereid een CellTrace Violet (zie Materiaaltabel) bouillonoplossing door 20 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan een injectieflacon met CellTrace Violet Reagens en direct voor gebruik goed te mengen.
    2. Laat de ARPE19-mito-RFP-cellen groeien tot de gewenste dichtheid van 80%-90%.
    3. Verdun de CellTrace Violet stockoplossing in voorverwarmd (37 °C) DPBS tot de gewenste werkconcentratie (1:1.000). Dit is de laadoplossing.
      OPMERKING: De verdunning van CellTrace Violet moet worden uitgevoerd met DPBS en kan niet worden vervangen door kweekmedium, omdat dit zal leiden tot zeer slechte kleuringsresultaten.
    4. Verwijder het kweekmedium en vervang het door 1 ml laadoplossing. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Als de omstandigheden het toelaten, kan de kleuring na 5 minuten onder een fluorescentiemicroscoop worden waargenomen. De kleuring kan worden beëindigd zodra de gewenste resultaten zijn bereikt, omdat sommige cellen langdurige blootstelling aan DPBS mogelijk niet kunnen verdragen.
    5. Verwijder de laadoplossing, was de cellen 2x met DPBS en vervang ze door 2 ml vers compleet medium. Incubeer de cellen gedurende ten minste 10 minuten na het kleuren zodat de CellTrace Violet acetaathydrolyse kan ondergaan.
      OPMERKING: Deze stap is nodig om de cellen terug te laten keren naar hun optimale staat en om te voorkomen dat latere experimenten worden verstoord.
  2. Bereid een bord met 24 putjes voor door in elk putje 50 μl DPBS toe te voegen. Plaats vervolgens het afdekglas (met een gespecificeerde diameter van 15 mm) (zie Materiaaltabel) in de plaat en laat het 1 minuut bezinken. Verwijder de DPBS uit de putjes en gebruik negatieve druk om ervoor te zorgen dat de schuif van het deksel zich dicht bij de bodem van de schaal bevindt.
  3. Trypsiniseer donor-MSC's en ontvangende ARPE19-cellen zoals beschreven in stap 1.1.1.
  4. Cellen tellen
    1. Plaats 10 μL celsuspensie op een telplateau voor telling.
      OPMERKING: Als de dichtheid van cellen te hoog is, kunnen ze 10-voudig worden verdund met medium en vervolgens verder gaan zoals hierboven.
    2. Zaad 10.000 MSC's en 10.000 ARPE19-cellen in 500 μL medium per putje van een plaat met 24 putjes. Meng de cellen goed door elkaar voordat je ze op het bord met 24 putjes legt. Zie de onderstaande berekeningen, gegeven een MSC-telling van A/ml en een ARPE19-celtelling van B/ml.
      OPMERKING: Voor 4 putjes zijn 40.000 MSC's en 40.000 ARPE19-cellen nodig in 2 ml medium.
      Volume MSC-suspensie (C) met 40.000 MSC's = 40.000/A μL
      Volume ARPE19-suspensie (D) met 40.000 MSC's = 40.000/B μL
      Vul het volume aan tot 2 ml met 2 - (C + D) ml medium.
  5. Bekijk de cellen onder een microscoop, schud de plaat totdat de cellen gelijkmatig zijn verdeeld en broed ze vervolgens 24 uur in de kweek.

3. Indirecte co-cultuur van MSC- en ARPE19-cellen in een transwell-systeem

  1. Voer celkweek, etikettering, vertering en telling uit zoals beschreven in de stappen 2.1 tot en met 2.4.1.
  2. Zaad 20.000 ARPE19-cellen in 1 ml medium per putje van een plaat met 24 putjes.
    OPMERKING: In dit experiment gebruikten we ARPE19-cellen zonder gelabelde mitochondriën.
  3. Plaats het inzetstuk in het kuiltje waar de cel is gezaaid.
  4. Zaai 10.000 MSC's in 100 μL medium in de bovenste celkamer per putje.
  5. Herhaal stap 2.5.

4. Kleuring van het cytoskelet

OPMERKING: Bescherm tegen licht tijdens het experiment.

  1. Verwijder het medium van de platen met 24 putjes. Was alle cellen eenmaal met 500 μL/putje 4% polyformaldehyde (PFA), voeg 500 μL verse 4% PFA toe en fixeer de monsters gedurende 20 minuten.
    OPMERKING: De inzetstukken van het transwell-systeem worden weggegooid.
    OPMERKING: Omdat nanobuisjes erg kwetsbaar zijn, hebben we de cellen direct gewassen met 4% PFA in plaats van DPBS om de retentie van intacte nanobuisjes te maximaliseren.
  2. Verwijder het fixeermiddel en was de monsters gedurende 3 x 10 minuten met DPBS.
  3. Voeg 500 μl/putje blokkeringsoplossing toe bestaande uit 0,5% Triton X-100 (zie materiaaltabel) en 4% runderserumalbumine (BSA) (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de blokkeringsoplossing en was de monsters gedurende 3 x 10 minuten met DPBS.
  5. Bereiding van falloidinekleuringsoplossing (zie Materiaaltabel)
    OPMERKING: De excitatie en emissie van falloidine zijn respectievelijk 650 nm en 668 nm.
    1. Bereid bouillonoplossingen voor door de inhoud van de injectieflacon op te lossen in 150 μl watervrij DMSO om een 400x voorraadoplossing te verkrijgen.
    2. Bereid de kleuroplossing voor door de 400x bewaaroplossing te verdunnen tot 1x met DPBS. Dit is de falloidine-kleuringsoplossing.
  6. Voeg 200 μL falloidinekleuringsoplossing toe aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Recupereer de kleuroplossing en was het monster 3 x 10 minuten met DPBS.
    OPMERKING: Bij het wassen van de cellen met DPBS is het beter om de plaat op een shaker te laten liggen.
  8. Pak het afdekglas eruit met een injectiespuitnaald en laat het aan de lucht drogen.
    OPMERKING: De optimale toestand is er een waarin er geen zichtbare vloeistof op het afdekglas te zien is, maar het is ook niet droog.
  9. Breng een kleine hoeveelheid montagemedium (zie Materiaaltabel) aan op de objectglaasje en draai het afdekglas voorzichtig om om ervoor te zorgen dat het medium het hele oppervlak gelijkmatig bedekt. Verzegel de randen met nagellak.
    OPMERKING: Wacht een paar minuten om de nagellak te laten drogen.
  10. Leg onmiddellijk een confocaal beeld vast of breng het over naar een plakdoos en bewaar het voor een korte tijd bij 4 °C.
    OPMERKING: Ideale bewaartijd is 2 weken. Als deze tijd wordt overschreden, kan het beeldvormingseffect verslechteren.

5. Confocale beeldvorming

NOTITIE: Confocale beeldvorming wordt uitgevoerd volgens de gebruiksaanwijzing en kan variëren tussen microscopen. Hier geven we slechts enkele van de belangrijkste stappen.

  1. Start de confocale microscoop en open vier laserkanalen (405, 488, 561, 640) volgens de gebruiksaanwijzing.
  2. Open de software op de computer en voer voorlopige parametrisaties van de software uit.
    1. Voeg de fluorescerende kanalen CF-405, CF-488, CF-561 en CF-640 toe aan het deelvenster Procesbeheer .
    2. Stel de belichtingstijd van elk fluorescentiekanaal in op 200 ms en stel de versterkingsintensiteit in op 2 in het bedieningspaneel van de camera .
    3. Stel de laser/LED-combiner in op een waarde van 80.
  3. Manipuleer het externe bedieningspaneel van de microscoop om de objectieflens in te stellen op een vergroting van 20x en zorg ervoor dat de lens op de laagste stand staat.
  4. Plaats de slede in omgekeerde richting op de draagtafel.
  5. Activeer de 405 nm laser en manipuleer de scherpstelling met behulp van de grove en fijne scherpstelspiralen. Observeer het monster onder het oculair totdat blauwe fluorescerende cellen zichtbaar zijn.
  6. Selecteer Live Imaging in de software-interface op de computer, schakel over naar het CF-405-kanaal en stel de fijne focushelix opnieuw af totdat een duidelijk beeld van de cellen met blauwe fluorescentie zichtbaar is op het computerscherm.
  7. Stel de objectieflens in op een vergroting van 40x en ga over naar het CF-640-kanaal, en pas vervolgens de scherpstelling voorzichtig aan totdat een duidelijke cellulaire microfilamentstructuur zichtbaar is.
  8. Houd een constante brandpuntsafstand aan, schakel achtereenvolgens over naar de CF-405-, CF-488- en CF-561-kanalen en wijzig de parameters van de optimale belichtingstijd, de versterkingsintensiteit en de laser/LED-combiner voor beeldvorming binnen elk kanaal, indien nodig.
  9. Activeer de Z Image Stack-functie en definieer het begin- en eindpunt van de Z-as door de brandpuntsafstand te manipuleren om een beeld met diepte vast te leggen met behulp van de Z-as.
  10. Klik op de knop Start in het deelvenster Procesbeheer om een foto te maken.
  11. Selecteer willekeurig 10 weergavevelden voor elk segment.
    OPMERKING: Er mag geen overlapping zijn tussen twee gezichtsvelden.
  12. Activeer de time-lapse-functie, die een totale beeldvormingsduur van 24 uur en een foto-interval van 5 minuten opgeeft na identificatie van het gewenste gezichtsveld.
    OPMERKING: Om een time-lapse-sequentie vast te leggen, is het noodzakelijk om cellen in een schaal met glazen bodem te inoculeren en ze in een geventileerde doos met 5% CO2 -gas te plaatsen.
  13. Sla alle afbeeldingen op en exporteer ze.
    OPMERKING: Om de controle van TNT en mitochondriale overdracht te verbeteren, werd beeldvorming met superresolutie gebruikt. Beeldvorming met superresolutie werd uitgevoerd met behulp van gecommercialiseerde HIS-SIM, HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) genaamd, geleverd door een bedrijf. Beelden werden verkregen met behulp van een 100x/1.5 NA olie-onderdompelingsobjectief.

6. Analyse van de gegevens

  1. Kwantificeer voor de statistische analyse van elk beeld het totale aantal cellen, het aantal nanobuisjes, het aantal violet-positieve ARPE19-mito-RFE-cellen, het aantal violet-positieve cellen met groene fluorescentie (wat het aantal ARPE19-cellen vertegenwoordigt met mitochondriale overdracht van MSC's) en het aantal violetnegatieve cellen dat rode fluorescentie vertoont (wat het aantal MSC-cellen vertegenwoordigt met mitochondriale overdracht van ARPE19-cellen).
    1. Om de vorming van TNT te kwantificeren, berekent u de verhouding tussen het aantal intercellulaire nanobuisjes en het totale aantal cellen.
    2. Bereken de mitochondriale overdrachtssnelheid als de verhouding tussen het aantal violetpositieve cellen met groene fluorescentie en het totale aantal violetpositieve cellen (dat de mitochondriale overdracht van MSC's naar ARPE19-cellen vertegenwoordigt) of de verhouding van het aantal violetnegatieve cellen met rode fluorescentie tot het totale aantal violetnegatieve cellen (dat de mitochondriale overdracht van ARPE19-cellen naar MSC's vertegenwoordigt).

Resultaten

Het schematische diagram dat de directe co-cultuur van mesenchymale stamcellen (MSC) en ARPE19-cellen illustreert, is weergegeven in figuur 1. MSC's, ontworpen om mito-GFP tot expressie te brengen, zoals de donorcellen en ARPE19-mito-RFP-cellen met violet gelabelde cytoplasmatische membranen als ontvangende cellen, werden samen gekweekt in een verhouding van 1:1. Na een co-cultuurperiode van 24 uur werden de cellen gekleurd op falloïdine en onderzocht met behulp van confocale microscopie. De resulterende celpopulaties omvatten MSC-mito-GFP-cellen, ARPE19-mito-RFP-cellen, ARPE19-mito-RFP-cellen die mito-GFP bevatten en MSC-mito-GFP-cellen die mito-RFP bevatten. Met name de aanwezigheid van mito-GFP in ARPE19-cellen en mito-RFP in MSC's suggereerde mitochondriale bidirectionele overdracht.

Specifieke details van TNT-vorming worden weergegeven in figuur 2. Deze structuren kunnen intercellulaire verbindingen tot stand brengen tussen cellen van hetzelfde type (Figuur 2A-C), maar ook tussen cellen van verschillende typen (Figuur 2D). Tunnelende nanobuisjes (TNT's) dienen als kanalen die aangrenzende cellen verbinden en vertonen een kenmerkende F-actinerijke membraanstructuur met open uiteinden die de cytoplasmatische continuïteit en het transport van mitochondriën vergemakkelijken. Met behulp van beeldvorming op de Z-as is het duidelijk dat TNT's niet stevig verankerd zijn in de extracellulaire matrix, maar eerder zweven in het kweekmedium, waardoor ze zich onderscheiden van conventionele cellulaire uitsteeksels. Mitochondriale overdracht is duidelijk zichtbaar in figuur 3, waar violet-positieve ARPE19-cellen een verspreide, groen gestippelde fluorescentie vertonen die wijst op mitochondriën afkomstig van MSC's (figuur 3A). Violetnegatieve MSC's die roodgestippelde fluorescentie bevatten, vertegenwoordigen de mitochondriale overdracht van ARPE19-cellen (Figuur 3B). Figuur 4 toont TNT-vorming en mitochondriale overdracht onder superresolutiebeeldvorming, waaruit we meer details van mitochondriale overdracht via TNT kunnen zien. Video 1 toont de dynamiek van mitochondriaal transport door TNT.

Om verder aan te tonen dat de voorwaarde voor mitochondriale overdracht fysiek contact is, zoals TNT, in plaats van mitochondriale secretie en opname, gebruikten we een eerder gerapporteerde co-cultuurmethode10. Zoals te zien is in figuur 5A, werden MSC's en ARPE19-cellen gezaaid in respectievelijk de bovenste en onderste kamers van een transwellplaat. Ze werden gescheiden door een filter met poriën van 0,4 μm, die het directe contact tussen MSC's en ARPE19-cellen blokkeerden, maar de doorgang van mitochondriën mogelijk maakten. Na 24 uur co-cultuur werden ARPE19-cellen in de onderste kamer getest en werd er weinig mito-GFP waargenomen van MSC's in de bovenste kamer (Figuur 5B). Deze resultaten suggereren dat mitochondriale overdracht direct contact vereist tussen MSC's en ARPE19-cellen.

Uiteindelijk werd de kwantificering van TNT-vorming en mitochondriale overdracht uitgevoerd, met de bijbehorende resultaten weergegeven in figuur 6. MSC's waren significant beter in staat om mitochondriën te doneren dan ARPE19-cellen (p = 0,0286). Deze bevindingen geven aan dat MSC's het vermogen bezitten om mitochondriën over te brengen naar retinale pigmentepitheelcellen.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van de co-cultuur van MSC's en ARPE19-cellen. MSC's die mito-GFP- en ARPE19-mito-RFP-cellen tot expressie brengen die zijn gelabeld met CellTrace Violet, worden gedurende 24 uur samen gekweekt in een verhouding van 1:1. Mito-GFP in violet+- cellen markeert de overdracht van mitochondriën van MSC's naar ARPE19-cellen, terwijl Mito-RFP in violette cellen de overdracht van mitochondriën van ARPE19-cellen naar MSC's markeert. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; MSC's = mesenchymale stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: TNT-vorming tussen MSC's en ARPE19-cellen. Witte pijlpunten geven TNT-vorming aan, groene pijlpunten geven mitochondriën aan met mito-GFP en rode pijlpunten geven mitochondriën aan met mito-RFP. (A,B) TNT-vorming tussen ARPE19-cellen. (C) TNT-vorming tussen MSC's. (D) TNT-vorming tussen MSC's en ARPE19-cellen. Beeldvorming op de Z-as met TNT's gesuspendeerd in kweekmedium. Schaal balken = 25 μm. Afkortingen: MSC's = mesenchymale stamcellen; TNT's = tunnelende nanobuisjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Mitochondriale overdracht van MSC's naar ARPE19-cellen. (A) De witte gestippelde cirkel geeft mitochondriale (mito-GFP) overdracht van MSC's naar ARPE19-cellen aan, en (B) de gele gestippelde cirkel geeft mitochondriale (mito-RFP) overdracht van ARPE19-cellen naar MSC's aan. Schaalbalken = 20 μm. Afkorting: GFP = groen fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; MSC's = mesenchymale stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: TNT-vorming en mitochondriale overdracht tussen MSC's en ARPE19-cellen door superresolutiemicroscopie. (A en B) Mitochondriaal transport van MSC's naar ARPE19-cellen. (C) Detail van TNT's onder superresolutiebeeldvorming. (D) Groene mitochondriën van MSC's aanwezig in ARPE19-cellen onder superresolutiebeeldvorming. Schaal balk = 5 μm. Afkortingen: MSC's = mesenchymale stamcellen; TNT's = tunnelende nanobuisjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Bijna niet-detecteerbare mitochondriale overdracht in indirecte co-cultuur in het transwell-systeem van MSC's en ARPE19-cellen. (A) Schematische weergave van de co-cultuur van MSC's en ARPE19-cellen in het transwell-systeem. (B) Representatieve beelden van ARPE19-cellen in de bodem van de transwellplaat na indirecte co-cultuur met MSC's gedurende 24 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Kwantificering van TNT-vorming en mitochondriale overdracht. (A) TNT-vorming, (B) mitochondriale overdracht. Afkortingen: M = MSC's = mesenchymale stamcellen; A = ARPE19 cellen; TNT's = tunnelende nanobuisjes; M-A = TNT-vorming tussen MSC's en ARPE19-cellen; M-M = TNT-vorming tussen MSC's; A-A = TNT-vorming tussen ARPE19-cellen. n = 4, gemiddelde ± SD, Mann-Whitney U-test, *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: In kaart brengen van plasmide pCT-Mito-copGFP. Mito-GFP (CYTO102-PA-1) werd aangekocht. De mitochondriën Cyto-Tracer, pCT-Mito-GFP (CMV), versmelt met copGFP via een Cox8-tag, wat resulteert in de labeling van mitochondriën met copGFP. Deze copGFP-fusie wordt aangedreven door de CMV-promotor, waardoor robuuste expressie mogelijk is in cellijnen zoals HeLa, HEK293 en HT1080. Mito-RFP is gewijzigd van mito-GFP door GFP te vervangen door RFP; het draagt een Puromycine-resistentiegen. Lentivirale verpakking van dit plasmide wordt gedaan door gespecialiseerde bedrijven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Video 1: TNT-gemedieerd mitochondriaal transport tussen MSC's en ARPE19-cellen. TNT wordt gegenereerd door de bidirectionele beweging van MSC- en ARPE19-cellen, waardoor de overdracht van mitochondriën van MSC-cellen naar ARPE19-cellen wordt vergemakkelijkt. Afkortingen: MSC's = mesenchymale stamcellen; TNT's = tunnelende nanobuisjes. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Talrijke studies hebben aangetoond dat het fenomeen van TNT-gemedieerde mitochondriale overdracht een veel voorkomend fysiologisch proces is in verschillende soorten weefselcellen 10,11,12,13. Functionele mitochondriale donatie van MSC's aan cellen met mitochondriale disfunctie vertoont een sterk therapeutisch potentieel 3,14,15,16,17,18.

Om TNT-gemedieerde bidirectionele mitochondriale overdracht tussen MSC's en ARPE19-cellen te presenteren, hebben we hier MSC-mito-GFP- en ARPE19-mito-RFP-cellijnen geconstrueerd. Vervolgens werden de twee soorten cellen gedurende 24 uur samen gekweekt en werd aan het einde van de co-cultuur cytoskeletkleuring uitgevoerd. Door confocale beeldvorming observeerden en telden we TNT-vorming en mitochondriale overdrachtssnelheid. De uitkomsten van deze waarnemingen kunnen worden beïnvloed door factoren zoals het aandeel van co-gekweekte cellen en de celdichtheid. Tijdens co-cultuur is het absoluut noodzakelijk om de twee celtypen grondig te mengen en ze in een eencellige toestand te houden om de vorming van celkolonies door homotypische cellen te minimaliseren, waardoor het optreden van mitochondriale overdracht tussen de twee celtypen wordt verminderd.

Flowcytometrische analyse kan op dezelfde manier worden gebruikt om mitochondriale overdrachtssnelheden te analyseren, en deze methode is eenvoudiger dan statistieken na beeldvorming. De mitochondriale overdrachtssnelheid die met deze methode wordt berekend, zal echter iets lager zijn dan de werkelijke waarde, omdat kleine hoeveelheden mitochondriale overdracht mogelijk niet worden geregistreerd. In dit protocol moet het tellen van de beeldvormingsresultaten zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om weglatingen of onjuiste telling van fluorescerende valse signalen te voorkomen.

De studie van bidirectionele mitochondriale overdracht door het construeren van twee cellijnen met mitochondriale fluorescentie is een innovatie van dit protocol. De methode vermijdt de interferentie van fluorescerende kleurstoffen en maakt de experimentele resultaten geloofwaardiger. De overdracht van mitochondriën van netvliescellen naar MSC's verdient verder onderzoek, bijvoorbeeld om veranderingen in het aandeel mitochondriën dat in beide richtingen wordt overgedragen onder stressvolle omstandigheden te onderzoeken.

Door vast te houden aan de experimentele procedures die in dit protocol worden beschreven, konden we vaststellen dat MSC's mitochondriën kunnen overbrengen naar retinale pigmentepitheelcellen via tunnelende nanobuisjes. Dit fenomeen kan dienen als een plausibel mechanisme dat ten grondslag ligt aan de gunstige effecten van MSC's op netvliesweefsels, en zo helpt bij de opheldering van MSC's-gestuurde regeneratieve therapieën voor oogweefsels.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

We danken Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd voor beeldvorming met hun commerciële superresolutiemicroscoop (HIS-SIM), gegevensverzameling, SR-beeldreconstructie, analyse en discussie. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82125007,92368206) en de Beijing Natural Science Foundation (Z200014).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
4% paraformaldehydeSolarbioP1110
6-well plateNEST703001
15 mL centrifuge tubeBD Falcon352097
24-well plateNEST702001
ARPE19 cellsATCCCRL-2302Cellijnen
Bovine serum albumin (BSA)BeyotimeST025
CellTrace violetInvitrogenC34557
Cover slideNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)VivaCellC04002-500
FluorSave ReagentMillipore345789
MSCsNuwacellRC02003Cellijnen
ncMissionShowninRP02010
Pen StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1Plasmid; Van  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
PipetteAxygenTF-1000-R-S
PhalloidinInvitrogenA22287
Triton X-100SolarbioT8200
Transwell plateCorning3470

Referenties

  1. Caprara, C., Grimm, C. From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease. Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).
  2. Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases. Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).
  3. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  4. Wei, B., et al. Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).
  5. Borcherding, N., Brestoff, J. R. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).
  6. Liu, D., et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).
  7. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  8. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-the path forward. Embo j. 40 (8), e105789(2021).
  9. Qin, Y., et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front Oncol. 11, 672781(2021).
  10. Jiang, D., et al. Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria. Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).
  11. Domhan, S., et al. Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells. PLoS One. 6 (6), e21283(2011).
  12. Zhang, J., Zhang, Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).
  13. Cheng, X. Y., et al. Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria. Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).
  14. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  15. Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).
  16. Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer. J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).
  17. Lin, T. K., et al. Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts. Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).
  18. Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bidirectionele mitochondriale overdrachtmitochondriale traceringconfocale microscopiecel cocultuurMito GFP labelingMito RFP labeling
Mitochondriale overdracht via tunnelende nanobuisjes tussen mesenchymale stamcellen en retinaal pigmentepitheel in vitro
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.