Method Article

Isolatie van de retinale capillairen en subendotheliale matrix van muizen voor stijfheidsmeting met behulp van atoomkrachtmicroscopie

DOI:

10.3791/66922

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben onlangs retinale capillaire verstijving geïdentificeerd als een nieuw paradigma voor retinale disfunctie geassocieerd met diabetes. Dit protocol werkt de stappen uit voor de isolatie van de retinale capillairen van muizen en de subendotheelmatrix uit retinale endotheelculturen, gevolgd door een beschrijving van de stijfheidsmeettechniek met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale capillaire degeneratie is een klinisch kenmerk van de vroege stadia van diabetische retinopathie (DR). Onze recente studies hebben aangetoond dat diabetes-geïnduceerde retinale capillaire verstijving een cruciale en voorheen niet-erkende causale rol speelt bij ontstekingsgemedieerde degeneratie van retinale capillairen. De toename van de capillaire stijfheid van het netvlies is het gevolg van de overexpressie van lysyloxidase, een enzym dat de subendotheelmatrix verknoopt en verstijft. Aangezien het aanpakken van DR in een vroeg stadium naar verwachting DR-progressie en daarmee gepaard gaand verlies van gezichtsvermogen zal voorkomen of vertragen, vertegenwoordigen subendotheliale matrix en capillaire stijfheid relevante en nieuwe therapeutische doelen voor vroege DR-behandeling. Verder kan directe meting van retinale capillaire stijfheid dienen als een cruciale preklinische validatiestap voor de ontwikkeling van nieuwe beeldvormingstechnieken voor niet-invasieve beoordeling van retinale capillaire stijfheid bij dieren en mensen. Met deze visie in gedachten bieden we hier een gedetailleerd protocol voor de isolatie en stijfheidsmeting van retinale haarvaten en subendotheelmatrix van muizen met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale haarvaten zijn essentieel voor het behoud van de homeostase van het netvlies en de visuele functie. Hun degeneratie bij vroege diabetes is inderdaad sterk betrokken bij de ontwikkeling van gezichtsbedreigende complicaties van diabetische retinopathie (DR), een microvasculaire aandoening die bijna 40% van alle personenmet diabetes treft. Vasculaire ontsteking draagt aanzienlijk bij aan retinale capillaire degeneratie bij DR. Eerdere studies hebben een belangrijke rol aangetoond voor afwijkende moleculaire en biochemische signalen bij door diabetes geïnduceerde retinale vasculaire ontsteking 2,3. Recent werk heeft echter een nieuw paradigma voor DR-pathogenese geïntroduceerd dat retinale capillaire verstijving identificeert als een cruciale maar voorheen niet-herkende determinant van retinale vasculaire ontsteking en degeneratie 4,5,6.

In het bijzonder wordt de door diabetes veroorzaakte toename van de capillaire stijfheid van het netvlies veroorzaakt door de opregulatie van het collageenverknopingsenzym lysyloxidase (LOX) in retinale endotheelcellen (EC's), waardoor de subendotheelmatrix (basaalmembraan) verstijft4,5,6. Matrixverstijving verstijft op zijn beurt de bovenliggende retinale EC's (als gevolg van mechanische reciprociteit), wat leidt tot de algehele toename van de capillaire stijfheid van het netvlies4. Cruciaal is dat deze door diabetes geïnduceerde capillaire verstijving van het netvlies alleen al de activering van de retinale EC en de door ontsteking gemedieerde EC-dood kan bevorderen. Deze mechanische regulatie van retinale EC-defecten kan worden toegeschreven aan veranderde endotheliale mechanotransductie, het proces waarbij mechanische signalen worden omgezet in biochemische signalen om een biologische respons te produceren 7,8,9. Belangrijk is dat veranderde mechanische EC-signalen en subendotheliale matrixstructuur ook betrokken zijn bij choroïdale vasculaire degeneratie geassocieerd met vroege leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)10,11,12, wat getuigt van de bredere implicaties van vasculaire mechanobiologie bij degeneratieve netvliesaandoeningen.

Met name retinale capillaire verstijving treedt vroeg op bij diabetes, wat samenvalt met het begin van netvliesontsteking. De toename van de capillaire stijfheid van het netvlies kan dus zowel als een therapeutisch doelwit als een vroege diagnostische marker voor DR dienen. Daartoe is het belangrijk om betrouwbare en directe stijfheidsmetingen van retinale haarvaten en subendotheelmatrix te verkrijgen. Dit kan worden bereikt met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM), die een unieke, gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare techniek biedt om de stijfheid van cellen, extracellulaire matrix enweefsels direct te meten. Een AFM past minieme (nanoNewton-niveau) indrukkracht toe op de steekproef waarvan de stijfheid de mate bepaalt waarin de inspringende AFM-cantilever buigt - hoe stijver de steekproef, hoe meer de cantilever buigt, en vice versa. We hebben AFM uitgebreid gebruikt om de stijfheid van gekweekte endotheelcellen, subendotheelmatrices en geïsoleerde retinale haarvaten van muizen te meten 4,5,6,11,12. Deze AFM-stijfheidsmetingen hebben geholpen bij het identificeren van endotheliale mechanobiologie als een zeer belangrijke determinant van DR- en AMD-pathogenese. Om de reikwijdte van mechanobiologie in visieonderzoek te helpen verbreden, bieden we hier een stapsgewijze handleiding over het gebruik van AFM voor stijfheidsmetingen van geïsoleerde retinale haarvaten van muizen en subendotheliale matrix.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research en goedgekeurd door de Institutional Animal and Care Use Committees (IACUC; protocolnummer ARC-2020-030) van de University of California, Los Angeles (OLAW-instelling dierenwelzijnsgarantienummer A3196-01). Het volgende protocol is uitgevoerd met behulp van retinale haarvaten geïsoleerd van volwassen (20 weken oude) mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van ~25 g (diabetische muizen) en ~32 g (niet-diabetische muizen; Jackson Laboratorium).

1. Isolatie van retinale haarvaten van muizen voor AFM-stijfheidsmeting (dagen 1-4)

OPMERKING: Dit protocol, gerapporteerd in een recente studie4, beschrijft de enucleatie en milde fixatie van het muizenoog, retinale isolatie en trypsinevertering, en daaropvolgende montage van het resulterende retinale vasculatuur op microscopieglaasjes voor AFM-stijfheidsmeting.

  1. Enucleatie en milde fixatie (dag 1)
    1. Nadat u de muis hebt geëuthanaseerd met blootstelling aan kooldioxide gevolgd door cervicale dislocatie, plaatst u een micropincet achter de oogbol, houdt u het spieropzetstuk vast en trekt u het oog voorzichtig naar buiten zonder de micropincet te strak te knijpen, waardoor de oogzenuw kan worden doorgesneden.
    2. Plaats het ontkernde oog in 5% (v/v) formaline in PBS gedurende 24 uur bij 4 °C voor milde fixatie.
      OPMERKING: Op basis van ervaring4 leveren niet-gefixeerde of milder gefixeerde ogen fragiele haarvaten op die gefragmenteerd raken tijdens de voorbereiding van het AFM-monster en de stijfheidsmeting.
  2. Retinale isolatie (dag 2)
    1. Plaats het gefixeerde oog op een stuk vetvrij papier onder een ontleedmicroscoop. Houd vervolgens met een micropincet de overblijfselen van de spier en oogzenuw vast die aan de buitenkant van het achterste oog zijn bevestigd en oriënteer het oog zo dat het hoornvlies naar één kant is gericht (Figuur 1).
    2. Maak met een chirurgisch mes een incisie 1-2 mm achter en evenwijdig aan de limbus (cornea-sclera-overgang). Vervolgens, terwijl u het oog op zijn plaats houdt met de micropincet, oefent u een neerwaartse kracht uit met het mes en blijft u drukken totdat het voorste deel van het oog volledig is gescheiden van het achterste uiteinde (Figuur 1). Gooi het voorste segment en de lens weg. Zaag niet heen en weer, want dat kan schade aan het netvlies veroorzaken.
    3. Breng het achterste segment (sclera, vaatvlies en netvlies) over in een schaal van 6 cm gevuld met PBS (pH 7,4).
    4. Gebruik een microspatel en houd tegelijkertijd de oogzenuw voorzichtig vast met een microtang, schep het netvlies eruit. Bewaar het netvlies in een microcentrifugebuisje van 2 ml met PBS bij 4 °C tot capillaire isolatie.
       
  3. Retinale spoelingen
    1. Om één netvlies te spoelen, vult u zes putjes van een plaat met 12 putjes met 1 ml dubbel gedistilleerd H2O (ddH2O). Breng vervolgens met behulp van een omgekeerde pasteurpipet het netvlies van de microcentrifugebuis van 2 ml over naar het eerste putje.
    2. Spoel het netvlies op de orbitale shaker op 120 RPM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Gebruik een P1000-pipet om het water voorzichtig op en neer te pipetten naast het netvlies en blaas water op het netvlies om zachte agitatie te veroorzaken.
    4. Breng het netvlies met behulp van de omgekeerde glazen pipet over naar het tweede putje en herhaal stap 1.3.2 en 1.3.3 4 keer, waarbij elke spoeling in een vers (ddH2O-bevattend) putje wordt gedaan.
    5. Breng ten slotte het netvlies over naar het zesde putje en spoel het 's nachts (O/N) bij RT op de orbitale shaker die is ingesteld op 100 tpm om de scheiding van retinale neuroglia van bloedvaten tijdens de spijsvertering van trypsine te vergemakkelijken.
  4. Vertering van trypsine in het netvlies (dag 3)
    1. Bereid een trypsineoplossing van 10% (w/v) door trypsine 1:250 poeder op te lossen in Tris-buffer (pH 8; 0,1 M). Meng voorzichtig door de conische buis meerdere keren om te keren om de vorming van luchtbellen te minimaliseren, waardoor het moeilijker wordt om de oplosbaarheid van trypsine te bevestigen.
    2. Breng de 10% trypsine-oplossing in evenwicht in een waterbad van 37 °C gedurende 10-15 minuten. Zodra het trypsinepoeder volledig is opgelost, filtert u de oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm.
    3. Voeg in een plaat met 12 putjes 2 ml/putje/netvlies van de gefilterde 10% trypsine-oplossing toe. Voeg wat extra trypsine-oplossing toe in het aangrenzende putje (om de wanden van de glazen pipet in evenwicht te brengen voor de volgende stappen).
    4. Voeg 3 ml ddH2O toe in drie putjes van een plaat met 6 putjes (wijd deze drie putjes aan één netvlies).
    5. Steek in een conische buis van 15 ml een P200-tip voordat u 4 ml van de gefilterde 10% trypsine-oplossing toevoegt. Breng deze conische buis over naar het bad van 37 °C om de punt 2-3 minuten in trypsine te laten weken, omdat dit helpt voorkomen dat het netvlies in de laatste stappen aan de wanden van de punt blijft plakken.
    6. Gebruik na het O/N-spoelen van het netvlies (vanaf stap 1.3.5) een P1000-pipet om het water voorzichtig op en neer te pipetten naast het netvlies, waarbij u water op het netvlies spuit om zachte agitatie te veroorzaken.
    7. Breng het gespoelde netvlies met behulp van een omgekeerde glazen pipet over naar het trypsinehoudende putje van de plaat met 12 putjes (uit stap 1.4.3). Zorg ervoor dat het netvlies wordt overgebracht met een minimale hoeveelheid resterende ddH2O om de trypsine-oplossing niet aanzienlijk te verdunnen. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
    8. Centreer de met trypsine doordrenkte P200-punt (uit stap 1.4.5) op het gebied van de oogzenuw en pipetteer het hele vasculaire netwerk voorzichtig op en neer om het niet-vasculaire weefsel te dissociëren14.
    9. Gebruik een omgekeerde glazen pipet die is voorgespoeld in trypsine (door trypsine 5 keer op en neer te pipetteren) en breng het retinale vaatstelsel over naar het eerste ddH2O-bevattende putje van de plaat met 6 putjes (uit stap 1.4.4).
    10. Draai de plaat en pipetteer het vaatstelsel op en neer met behulp van een omgekeerde met trypsine gespoelde glazen pipet om eventueel achtergebleven niet-vasculair weefsel te verwijderen.
    11. Breng met behulp van de glazen pipet het retinale vaatstelsel over naar het tweede ddH2O-bevattende putje van de plaat met 6 putjes en bewaar het bij 4 °C tot het op het objectglaasje wordt gemonteerd voor AFM-stijfheidsmeting.
      OPMERKING: Gehydrateerd retinaal vaatstelsel (in PBS) is structureel intact bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken. Routinematige stijfheidsmetingen moeten echter worden uitgevoerd met vers geïsoleerde haarvaten.
  5. Montage van het retinale vaatstelsel voor AFM-stijfheidsmeting (dag 4)
    1. Gebruik een omgekeerde, met trypsine gespoelde glazen pipet om het netvliesvasculatuur over te brengen naar het derde ddH2O-bevattende putje van de plaat met 6 putjes om eventuele resterende trypsineoplossing te verwijderen.
    2. Reinig grondig (met behulp van ddH2O en wisserweefsel) een microscopieglaasje met geladen oppervlak dat zal worden gebruikt voor het monteren van het vasculaire netwerk voor AFM-stijfheidsmeting.
      OPMERKING: Het geladen oppervlak van de objectglaasje zorgt voor een sterke binding voor het vasculaire netwerk tijdens AFM-meting.
    3. Label de dia en teken een cirkelvormig gebied van 4-5 cm rond het midden met een hydrofobe pen om te voorkomen dat er water wordt gemorst tijdens de volgende stappen.
    4. Gebruik een omgekeerde met trypsine gespoelde glazen pipet om het netvlies voorzichtig over te brengen naar het midden van het gemarkeerde gebied.
    5. Verwijder met een P200-pipet voorzichtig zoveel mogelijk overtollig water van één rand zonder per ongeluk het vaatstelsel in de punt op te zuigen.
    6. Plaats de schuif in een bioveiligheidskast (BSL-2 kap) dicht bij de voorkant (gefilterd gaas) en laat het restwater verdampen.
    7. Zodra het vaatstelsel bijna droog is, hydrateert u het vaatstelsel onder een fasecontrastmicroscoop (4x vergroting) voorzichtig door ddH2O met een P200-pipet langzaam aan één kant van het gemarkeerde gebied toe te voegen. Door ddH2O direct op het vaatstelsel toe te voegen, komt het los.
    8. Neem fasecontrastbeelden van het gerehydrateerde vaatstelsel bij 4x en 20x vergrotingen om ervoor te zorgen dat het een goede structurele integriteit heeft en goed wordt uitgespreid (niet op zichzelf vouwt) en aan glasdia wordt bevestigd, wat essentiële criteria zijn voor betrouwbare AFM-stijfheidsmeting.

2. Het verkrijgen van een subendotheelmatrix uit retinale microvasculaire endotheelcellen (REC)-culturen (dag 1-17)

OPMERKING: Dit protocol, aangepast van Beacham et al.15 en gerapporteerd in recente studies 4,5,6, beschrijft REC-cultuur op gemodificeerde glasdekglaasjes, gevolgd door decellularisatie om subendotheliale matrix te verkrijgen voor daaropvolgende AFM-stijfheidsmeting.

  1. Bereiding van met gelatine beklede glazen dekglaasjes en celbeplating (dag 1)
    OPMERKING: Voer de gelatinecoating en de daaropvolgende PBS++-spoelstappen uit in een weefselkweekkap voordat u naar een chemische zuurkast gaat voor de daaropvolgende behandelingsstappen met glutaaraldehyde en ethanolamine.
    1. Plaats een geautoclaveerd rond glazen dekglaasje met een diameter van 12 mm per putje van een steriele plaat met 24 putjes en voeg 500 μL voorverwarmde steriele 0,2% (w/v) gelatine toe (verdund in PBS dat calcium en magnesium bevat; PBS++) aan elk putje met dekglaasje. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Zuig de gelatineoplossing op, spoel de dekglaasjes eenmaal af met steriel PBS++ en verknoop de gecoate gelatine door 500 μL 1% (v/v) glutaaraldehyde toe te voegen gedurende 30 minuten bij RT.
    3. Verzamel en gooi de glutaaraldehydeoplossing op de juiste manier weg (volgens de institutionele richtlijnen) voordat u de dekglaasjes gedurende 5 minuten met PBS++ spoelt op een orbitale shaker bij 100 RPM in RT. Herhaal deze spoelstap 5 keer. Til tijdens de eerste drie spoelbeurten de dekglaasjes op met een steriel pincet om de glutaaraldehyde grondig te kunnen spoelen. Elke resterende hoeveelheid kan de levensvatbaarheid van de cel verminderen.
    4. Voeg 800 μl 1 M ethanolamine toe aan het met gelatine verknoopte dekglaasje gedurende 30 minuten bij RT om eventuele resterende sporen van glutaaraldehyde in het putje te doven.
    5. Verzamel en gooi de ethanolamine-oplossing op de juiste manier weg (volgens de institutionele richtlijnen) en spoel de dekglaasjes 5 keer met PBS++ gedurende 5 minuten op een orbitale shaker bij 100 tpm in RT. Til tijdens de eerste drie spoelbeurten de dekglaasjes op met een steriel pincet om de ethanolamine grondig te kunnen spoelen. Elke resterende hoeveelheid kan de levensvatbaarheid van de cel verminderen.
    6. De vernette dekglaasjes zijn nu klaar voor celplating.
      OPMERKING: Hoewel we routinematig cellen onmiddellijk na de bereiding van het dekglaasje plaaten, kan het de moeite waard zijn om de celbeplating te vergelijken op verknoopte gelatinedekglaasjes die gedurende 1-2 dagen in PBS++ bij 4 °C worden bewaard.
    7. Onder steriele omstandigheden in een weefselkweekkap, plaat retinale microvasculaire endotheelcellen (REC's) in 500 μL medium/put met een dichtheid die binnen 24 uur 100% samenvloeiing bereikt, zoals bevestigd door fasecontrastmicroscopie.
      OPMERKING: Het bereiken van samenvloeiing binnen 24 uur is belangrijk omdat de resulterende REC-rust het vermogen van cellen om matrix af te scheiden zal vergroten (zie de volgende stap). In onze ervaring met menselijke REC's is een platingdichtheid van 4 x 104 cellen/cm2 voldoende om binnen 24 uur confluentie te bereiken. Aangezien de REC-grootte echter varieert per soort (bijv. METC's van muizen zijn aanzienlijk kleiner), moet de initiële platingdichtheid mogelijk worden geoptimaliseerd.
  2. Productie van subendotheliale matrix door REC-cultuur (dag 2-16)
    1. Nadat de cellen samenvloeiing hebben bereikt (~24 uur), vervangt u het kweekmedium door vers medium aangevuld met steriel gefilterd ascorbinezuur (eindconcentratie van 200 μg/ml).
      OPMERKING: Elke REC-behandeling met ziekterisicofactoren (bijv. hoge glucose, geavanceerde glycatie-eindproducten, enz.) of farmacologische middelen kan nu beginnen, samen met de behandeling met ascorbinezuur.
    2. Vervang het met ascorbinezuur verrijkte kweekmedium om de dag gedurende 15 dagen.
      OPMERKING: Ascorbinezuur is onstabiel in oplossing. Bereid om de dag een verse 100X bouillonoplossing voor een gemiddelde suppletie.
  3. Decellularisatie van REC-culturen om de subendotheliale matrix te verkrijgen (dag 16)
    1. Verwijder na 15 dagen behandeling met ascorbinezuur het medium en spoel de cellen af met calcium-/magnesiumvrij PBS.
    2. Decellulariseer de REC-culturen door 250 μL/per putje warme decellularisatiebuffer toe te voegen (20 mM ammoniumhydroxide en 0,5% Triton X-100 in PBS) gedurende ~2-3 minuten. Bevestig de verwijdering van cellen onder een fasecontrastmicroscoop (10x vergroting).
    3. Verwijder voorzichtig de decellularisatiebuffer zonder de REC-uitgescheiden subendotheelmatrix te verstoren en voeg 0,5 ml PBS toe aan elk putje.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de subendotheelmatrix tijdens deze en de volgende spoelstappen niet losraakt, mag u alleen voorzichtig spoelen met een P1000-pipet. Voer geen vacuümaspiratie uit.
    4. Bewaar de platen een nacht bij 4 °C om de REC-secreted matrix te stabiliseren.
  4. DNase-behandeling van de subendotheelmatrix om cellulair afval te verwijderen (dag 17)
    1. Spoel de subendotheliale matrix uit stap 2.3.4 af met 800 μL PBS/putje.
    2. Verwijder de PBS voorzichtig en incubeer de matrix met 200 μL RNase-vrij DNase I (30 K-eenheden) bij 37 °C gedurende 30 minuten om alle sporen van cellulair vuil te verwijderen. Controleer de efficiëntie van de DNase-behandeling door zorgvuldig te zoeken naar celresten onder een fasecontrastmicroscoop.
    3. Verwijder voorzichtig de DNase I-oplossing en spoel de subendotheelmatrix twee keer met 800 μL PBS/putje.
    4. Controleer of de fibreuze subendotheelmatrix op macroschaal zichtbaar is onder een fasecontrastmicroscoop (10x vergroting). De visualisatie van de fijnere nanoscale matrixvezels vereist AFM topografisch aftasten of confocale beeldvorming met hoge resolutie van immunogelabelde matrixproteïnen bij 100x vergroting.
    5. Gebruik onmiddellijk de verse (niet-gefixeerde) subendotheliale matrix voor AFM-stijfheidsmeting.
    6. Na AFM-meting, fixeer matrixmonsters met 1% (v/v) paraformaldehyde (15 min bij kamertemperatuur) en bewaar bij 4 °C voor immunolabeling met antilichamen tegen subendotheliale matrixeiwitten en/of crosslinking-enzymen.

3. AFM stijfheid meting

OPMERKING: Dit protocol, aangepast van een standaard AFM-gebruikershandleiding en gerapporteerd in recente studies 4.5, beschrijft de verwerving en analyse van stijfheidsgegevens van retinale haarvaten en subendotheliale matrix met behulp van een AFM en gegevensanalysesoftware. Hoewel de hieronder beschreven stappen zijn gebaseerd op een specifiek model van AFM (zie Materiaaltabel), zijn de onderliggende principes algemeen toepasbaar op alle AFM-modellen.

  1. Selectie van vrijdragende sondes
    OPMERKING: Zachte biologische monsters vereisen zachte uitkragingen die kunnen buigen bij het inspringen van het monster, terwijl de afmetingen van de sonde zijn geselecteerd om overeen te komen met de afmetingen van het monster.
    1. Gebruik voor het meten van de stijfheid van retinale vaten van muizen met een diameter van 5-8 μm een vrijdragende sonde met een straal van 1 μm en een veerconstante (k) van 0,2-0,3 N/m. Voor stijfheidsmeting van een subendotheelmatrix die is samengesteld uit vezels op nanoschaal, gebruikt u een vrijdragende sonde met een straal van 70 nm met een veerconstante (k) van 0,06-0,1 N/m.
  2. Uitkragende montage
    1. Open op de AFM-computer de software die de AFM-eenheid bestuurt en de camera die aan een microscoop van het fasecontrast is bevestigd die wordt gebruikt om de cantilever en de steekproef te visualiseren.
    2. Bevestig de vrijdragende houder op de vrijdragende wisselstandaard en monteer de geselecteerde uitkraging op de houder met behulp van een horlogemakertang onder een stereoscoop zonder de uitkraging fysiek te beschadigen. Draai de schroef op de houder vast om de uitkraging vast te zetten.
    3. Plaats en vergrendel de cantileverhouder op de AFM-kop die op de standaard rust.
    4. Met behulp van de stappenmotorfunctie in de AFM-software trekt u de AFM-kop terug naar het hoogste punt en stelt u die positie in als punt nul in de software. Deze stap voorkomt dat de AFM-cantilever per ongeluk de monstertafel raakt tijdens het monteren van de AFM-kop (volgende stap).
    5. Til de AFM-kop voorzichtig op van zijn standaard en monteer deze op de AFM-monstertafel door de poten in hun respectievelijke sleuven te plaatsen.
  3. Laser uitlijning
    OPMERKING: De initiële laseruitlijning wordt uitgevoerd zonder enig monster (d.w.z. in luchtmodus), omdat dit zorgt voor een nauwkeurigere uitlijning van de laserstraal op de uitkragende punt (door laserbreking in vloeistof te voorkomen). Omdat biologische monsters echter worden ondergedompeld in een medium dat een andere brekingsindex heeft dan lucht, is het belangrijk om de laser opnieuw uit te lijnen in het medium voordat de stijfheid wordt gemeten.
    1. Voor laseruitlijning in lucht, plaatst u het AFM-hoofd op de steekproeffase en gebruikt u het 10x-objectief en de bijgevoegde camera om de cantilever op de monitor in live-modus te visualiseren. De infraroodlaser is verborgen voor de gebruiker, maar is zichtbaar met een CCD-camera.
    2. Selecteer de functie Contactmodus Krachtspectroscopie in de software en open het venster met de titel Laseruitlijning.
    3. Met behulp van de twee schroeven gemarkeerd laser lateraal op de AFM-kop, richt de laserstraal op de cantilever zodanig dat de SOM-waarde in het laseruitlijningsvenster het hoogst is. Om dit te bereiken, richt u de laser op of rond het midden van de uitkraging.
    4. Gebruik de stelschroeven van de detector om de fotodetector zo af te stellen dat de laserspot zich in het midden van het laseruitlijnvenster bevindt.
    5. Stel de spiegel met behulp van de spiegelstelschroef af om ervoor te zorgen dat de SOM-waarde de hoogst mogelijke waarde heeft.
      OPMERKING: Een hoge SOM-waarde zorgt voor een gevoelige en nauwkeurige beoordeling van de stijfheid van het monster. Daarom moeten zowel de stappen voor laseruitlijning als voor spiegelafstelling worden uitgevoerd om de hoogste SOM-waarde te verkrijgen.
    6. Voeg vervolgens, voor laseruitlijning in vloeistof, het gewenste kweekmedium toe in een schaal en monteer het stevig op de tafel om trillingen of drift te voorkomen, waardoor meetartefacten ontstaan tijdens het inspringen van het monster.
    7. Terwijl u naar de live camerafeed kijkt die op de uitkraging is gericht, laat u deze met behulp van de stappenmotorfunctie in de vloeistof zakken.
    8. Herhaal stap 3.3.4 en 3.3.5 om ervoor te zorgen dat de SOM-waarde de hoogste blijft en dat het laserpunt zich in het midden van het laseruitlijningsvenster bevindt.
  4. Kalibratie van de uitkragende veerconstante
    OPMERKING: Hoewel vrijdragende sondes worden geleverd met een door de fabrikant gekalibreerde veerconstante (k), is het een goede gewoonte om de waarde ervan (in vloeistof) onafhankelijk te verifiëren voordat u met een meting begint. Gebruik een schoon glasoppervlak dat interacties tussen de vrijdragende sonde en het glasoppervlak minimaliseert.
    1. De gewenste kracht die door de uitkraging wordt uitgeoefend, stelt de maximale laserafbuiging van de uitkraging in die is toegestaan voor een krachtindrukking. Stel deze in eerste instantie in op 1,5 V. Als de cantilever er niet in slaagt om deze gegeven instelpuntkracht te benaderen, verhoog deze dan stapsgewijs totdat deze het monster inspringt en een krachtinspringingscurve genereert.
    2. Z-lengte geeft de maximale afstand aan waarmee de z-piëzo zich terugtrekt nadat de uitkraging het instelpunt heeft bereikt tijdens het indrukken van het monster. De Z-lengte moet ten minste voldoende zijn om ervoor te zorgen dat de vrijdragende sonde netjes loskomt van het monster. Voor kalibratie van de veerconstante op een glasoppervlak stelt u de Z-lengte in op 1 μm.
    3. Z-snelheid verwijst naar de snelheid waarmee de z-piëzo de cantilever verticaal naar beneden beweegt in de richting van het monster tijdens krachtindrukking. Het moet worden geoptimaliseerd omdat een zeer lage snelheid voornamelijk het stroperige gedrag van het monster zal vastleggen, terwijl een zeer hoge snelheid voornamelijk het elastische gedrag zal vastleggen. De optimale snelheid wordt verwacht om de ware visco-elastische aard van biologische monsters vast te leggen. Stel de Z-snelheid in op 2 μm/s voor de visco-elastische biologische monsters.
    4. De doelhoogte op het Z-bereik geeft de geschatte afstand aan van het monster waarop de z-piëzo rust na het meten van een krachtcurve en voordat het naar een andere locatie op het monster wordt verplaatst. De doelhoogte van de Z-reeks moet groter zijn dan de hoogte van de voorbeeldfuncties. Stel de doelhoogte op het Z-bereik in op 7.5 μm.
    5. Gebruik de stappenmotorfunctie om de uitkraging vrij dicht bij het monsteroppervlak te brengen (te oordelen naar de scherpstelling in fasecontrastbeeld bij 10x vergroting) voordat u de naderingsfunctie in het contactmodus-krachtspectroscopievenster selecteert om de uitkraging in kleinere stappen van 15 μm naar beneden te brengen.
    6. Klik op Verkrijgen om een krachtcurve vast te leggen.
    7. Selecteer de krachtcurve, open deze in het venster van de kalibratiemanager en selecteer op contact gebaseerde modus in de sectie methode.
    8. Selecteer met behulp van de Select-fit Range-functie de Cantilever Retraction Curve voor een lineaire curve-fit. Vink vervolgens het selectievakje Gevoeligheid aan om de krachteenheid van V naar N te converteren.
    9. Til de cantilever 100-200 μm op in de vloeistof en selecteer de functie Thermal Noise . Nogmaals, met behulp van Select Fit Range, past u de thermische ruisbelcurve aan met een Lorentz-curve. Selecteer na het aanpassen van de bocht het vakje Veerconstante (k). Controleer of de veerconstante (k) dicht bij de waarde van de fabrikant ligt en noteer deze voor toekomstig gebruik. Na kalibratie verandert de eenheid voor setpoint van mV naar nN.
      NOTITIE: Thermische ruis is de natuurlijke frequentie van de uitkraging bij een bepaalde temperatuur. Correctie voor thermische ruis is vereist voor een nauwkeurige meting van de veerconstante.
  5. Verwerving van kracht-afstandscurven
    1. Plaats de op objectglaasjes gemonteerde steekproef (netvliesvaten of subendotheliale matrix) op het AFM-stadium en selecteer de Spectroscopie van de de Kracht van de contactmodus in de experimentsectie van de software.
    2. Stel de gewenste waarde in op 0,5 nN en klik op Approach, wat aanzienlijk hoger is dan de thermische afbuiging van zowel SAA-SPH 1 μm als PFQNM-LC-A 70 nm cantilever-sondes, wat zorgt voor een soepele cantileverbenadering naar het monster.
    3. Nadat de uitkraging het oppervlak heeft gedetecteerd en is teruggekeerd naar de rustdoelhoogte, stelt u het instelpunt in op 0,2 nN voor de stijvere SAA-SPH 1 μm vrijdragende sonde of 0,1 nN voor de zachtere PFQNM-LC-A 70 nm vrijdragende sonde. Deze aanpassing van het instelpunt zorgt ervoor dat zowel stijve als zachte uitkragingen gemakkelijk buigen tijdens het indrukken van het monster (zie paragraaf 3.1).
    4. Stel de Z-lengte in op ~2.5 μm om te zorgen voor een zuivere scheiding van de uitkragende sonde van biologische monsters tijdens het terugtrekken (zie stap 3.4.2) en de Z-snelheid op 2 μm/s (zie stap 3.4.3).
    5. Met behulp van de faseschroeven op de AFM-stage, plaatst u de cantilever-sonde voorzichtig op een gewenste locatie op het monster.
      OPMERKING: Aangezien de capillairen niet altijd plat op de objectglaasje liggen, is het veilig om de uitkraging nog eens 10-20 μm van de rustdoelhoogte terug te trekken voordat de tafel wordt verplaatst.
    6. Klik op Naderen om de uitkraging eerst dichter bij het monster te brengen en klik vervolgens op Verkrijgen om de krachtcurven voor de gewenste locaties vast te leggen. Sla alle krachtcurven op voor analyse.
  6. Gegevensanalyse
    1. Open de krachtcurve in de gegevensverwerkingssoftware.
    2. Selecteer de intrekkrachtcurve voor gegevensanalyse (vergelijkbaar met stap 3.4.8).
    3. Gebruik de functie voor het afvlakken van gegevens om de krachtcurve glad te strijken met een Gaussiaans filter om de ongewenste ruis in de verkregen gegevens te verwijderen.
    4. Met behulp van de functie voor het aftrekken van de basislijn stelt u de waarde van de helling en de grootte van het (contactloze) basislijngedeelte van de krachtcurve in op nul.
    5. Klik op de functie Contactpunt om het contactpunt van de krachtcurve automatisch naar de (0,0) coördinaten op de X- en Y-as te brengen.
    6. Bereken met behulp van de functie Verticale tippositie de werkelijke verticale positie van de uitkraging op de Y-as door te corrigeren voor een eventuele inkeping van het monster.
    7. Pas op de verwerkte krachtcurve de Elasticity Fit-functie toe door eerst de vorm en straal van de punt te selecteren (op basis van de geselecteerde uitkragende sonde), gevolgd door de krachtcurve-aanpassing met behulp van het Hertz/Sneddon-model.
      1. Als de inkeping van de matrix door de sonde met een straal van 70 nm groter is dan 70 nm, wat meestal het geval is, selecteert u de vorm van de paraboloïde punt. Voor het meten van de capillaire stijfheid is de monsterindrukking door de sonde met een straal van 1 μm nooit groter dan 1 μm, dus selecteer de vorm van de bolpunt . Als het contactpunt van de gemonteerde curve niet samenvalt met het contactpunt van de werkelijke intrekcurve, schakelt u het selectievakje Verschuivingscurve in.
    8. Noteer en bewaar de waarde van Young's modulus (stijfheid).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muis retinale haarvaten
AFM-stijfheidsmeting van geïsoleerde retinale haarvaten omvat stappen voor monsterbehandeling die mogelijk hun mechanostructurele integriteit zouden kunnen schaden. Om dit te voorkomen en daarmee de haalbaarheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van AFM-metingen te garanderen, worden de ontkernde ogen 's nachts bij 4 °C in 5% formaline gefixeerd voordat ze worden geïsoleerd van het vat. Dit milde fixatieprotocol met verminderde formalineconcentratie, lage fixatietemperatuur, beperkte fixatietijd en afwezigheid van hoornvliespunctie is ontwikkeld om mogelijke crosslinking/verstijvingsartefacten veroorzaakt door chemische fixatie te minimaliseren. Zoals te zien is in figuur 2B,C, zorgt deze relatief milde fixatie ervoor dat het geïsoleerde retinale vaatstelsel structureel robuust en voldoende duurzaam is voor de AFM-meting. Daarentegen worden retinale vaten geïsoleerd uit niet-gefixeerde ogen (met behulp van de hypotone methode)4 of kort gefixeerde ogen (gedurende 8 uur) gefragmenteerd of klappen in, waardoor ze ongeschikt worden voor AFM-meting (Figuur 2B).

Retinale subendotheliale matrix
Vasculaire stijfheid weerspiegelt de gecombineerde stijfheid van vasculaire cellen en het basale membraan (subendotheliale matrix)4. Aangezien cellen zich aanpassen aan matrixstijfheid door een vergelijkbare verandering in hun eigen stijfheid te ondergaan, wordt een proces dat mechanische reciprociteit9 wordt genoemd, subendotheliale matrixstijfheid, een belangrijke bepalende factor voor de algehele vasculaire stijfheid. Voor het meten van de matrixstijfheid is het belangrijk om een homogeen dichte subendotheliale matrix te verkrijgen. Voor menselijke retinale EC's gekweekt in met ascorbinezuur aangevuld kweekmedium, duurt dit meestal 10-15 dagen (Figuur 3A)4,5,6. Dit verschil in kweekperiode kan het gevolg zijn van lot-to-lot verschillen in in de handel verkrijgbare primaire retinale EC's. Verder vinden we over het algemeen dat in de handel verkrijgbare retinale EC's van C57BL/6-muizen een dichtere matrix afzetten in vergelijking met de primaire menselijke retinale EC-cultuur, wat wijst op soortspecifieke verschillen. Zoals te zien is in figuur 3A, geven fasecontrastafbeeldingen alleen een globaal beeld van de matrix op macroschaal. De fijnere fibrillaire structuur op nano- tot microschaal wordt echter duidelijk in confocale fluorescentiebeelden met hoge resolutie van de matrix die immuungelabeld zijn met antilichamen tegen matrixstructuureiwitten collageen IV en fibronectine (Figuur 3B). Opgemerkt moet worden dat deze matrixeiwitten ook leerzame aanwijzingen geven aan endotheelcellen door zich te binden aan specifieke integrinereceptoren9.

AFM stijfheid meting
De keuze van de juiste cantileverstijfheid (veerconstante, k) en sondemaat is essentieel voor betrouwbare en gevoelige metingen. Deze parameters moeten worden gekozen om overeen te komen met de stijfheid en afmetingen van het biologische monster. Nadat de geselecteerde cantilever op de AFM is gemonteerd, moet de infraroodlaserstraal worden gericht op de punt van de cantilever en moet de gereflecteerde laserspot worden gecentreerd op de fotodetector. Deze laseruitlijning zorgt voor een nauwkeurige en gevoelige detectie van de uitkragende doorbuiging en dus voor de stijfheidsmeting. Een AFM-stijfheidsmeting begint met de z-piëzo die de cantilever verticaal naar beneden beweegt in de richting van het monster. Er is op dit moment geen uitkragende doorbuiging, wat een vlakke basislijn van de naderingscurve oplevert (Figuur 4A). Wanneer de uitkragende sonde contact maakt met het monster en het indrukt, buigt de uitkraging, waardoor laserafbuiging op de fotodetector ontstaat, die wordt weergegeven door de verticale afbuiging van de naderingscurve. Na het uitoefenen van een vooraf ingestelde indrukkracht (instelpuntkracht) op het monster, trekt de uitkraging zich terug naar de startpositie (Z-doelhoogte) weg van het monster. De afgebogen terugtrekcurve wordt vervolgens aangepast aan het Hertz/Sneddon-model om de Young's modulus (stijfheid) van het monster te berekenen.

Uit de representatieve meting van de krachtindrukking in figuur 4 blijkt duidelijk dat de naderings- en retractiecurven die worden verkregen uit een retinaal capillair geïsoleerd uit een diabetische muis (figuur 4B) aanzienlijk steiler zijn dan die verkregen uit een niet-diabetische muis (figuur 4A). De steilere helling van de krachtindrukkingscurven duidt op een grotere uitkragende doorbuiging veroorzaakt door een hogere weerstand van het monster tegen krachtindrukking, wat een hogere stijfheid van het monster weerspiegelt13. Inderdaad, daaropvolgende gegevensanalyse van meerdere krachtinspringingscurven onthulde dat de retinale haarvaten van muizen aanzienlijk stijver worden bij diabetes4. Er moet ook worden opgemerkt dat contact tussen de uitkragende sonde en biologische monsters vaak niet-specifieke oppervlakteadhesie veroorzaakt, wat leidt tot een negatieve uitkragende doorbuiging tijdens het intrekken, zoals blijkt uit de uitbreiding van de retractiecurve tot voorbij de basislijn (figuur 4B). Verder zijn biologische monsters zoals cellen, matrix en bloedvaten van nature visco-elastisch en kunnen ze dus enige permanente vervorming en/of verandering in schijnbare stijfheid ondergaan na krachtindrukking. Als dat zo is, zal dit tot uiting komen in de verkeerde uitlijning van naderings- en terugtrekkingscurven (hysterese). Inderdaad, een vergelijking van figuur 4A en figuur 4B bevestigt de verwachte trend waarbij krachtinkeping van zachtere haarvaten bij niet-diabetische muizen een grotere hysterese veroorzaakt dan bij hun stijvere tegenhangers. Zoals eerder gerapporteerd 5,6, wordt stijfheid (Young's modulus) van subendotheliale matrices verkregen uit retinale EC-culturen ook op de bovengenoemde manier berekend.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van de incisiesnede gemaakt in een muizenoog voor netvliesisolatie. Met behulp van een pincet om de oogzenuw vast te houden, wordt een scalpel gebruikt om een volledige incisie achter de limbus te maken om het netvlies van de muis te scheiden van de lens en de voorste kamer. De paarse stippellijn geeft de locatie van de verticale incisie aan. Dit schema is getekend met behulp van wetenschappelijke beeld- en illustratiesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Protocoloptimalisatie voor isolatie van intacte retinale vaten van muizen voor AFM-meting. (A) Het stereoscoopbeeld toont een intact netvlies geïsoleerd uit een mild gefixeerd muizenoog voorafgaand aan de capillaire isolatiestappen. Schaalbalk: 2 mm. (B) Representatieve fasecontrastbeelden bij 4x vergroting tonen de netvliesvaten van muizen die zijn verkregen met behulp van de verschillende isolatiemethoden. Het vergelijken van de structurele integriteit en duurzaamheid van de geïsoleerde vaten, trypsinevertering van netvliezen van ontkernde ogen gefixeerd in 5% formaline gedurende 24 uur bij 4 °C (rode doos) bleek het meest geschikte retinale vasculatuur voor AFM-stijfheidsmeting op te leveren. Retinale vaten die met deze methode werden geïsoleerd, vertoonden een duidelijk vasculair netwerk dat zich gelijkmatig langs het glasoppervlak verspreidde. Schaalbalk: 500 μm. (C) Sterk vergrote (20x) weergave van een intact retinaal capillair netwerk, vergelijkbaar met die getoond in (B), bevestigt de hoge structurele integriteit van haarvaten verkregen uit mild gefixeerde ogen. Schaal balk: 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd van4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Gedecellulariseerde matrices verkregen uit primaire REC-culturen van mens en muis. (A) Representatieve beelden met fasecontrast bij een vergroting van 20x met subendotheelmatrixaggregaten op glazen dekglaasjes na decellularisatie van 10-daagse (10 d) of 15-daagse (15 d) culturen van menselijke of muizen-REC's. Schaalbalk: 100 μm. (B) Representatieve confocale fluorescentiebeelden met hoge vergroting (100x) van gedecellulariseerde matrices verkregen uit 15 d menselijke REC-culturen en gelabeld met anti-collageen IV en anti-fibronectine-antilichamen onthullen een dicht nanofibrillair collageen IV en fibronectinematrix. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Krachtafstandscurven van AFM-stijfheidsmeting van retinale capillairen van muizen. Lijngrafieken geven een representatieve benadering (lichte kleur) en retractiecurve (donkere kleur) aan van een enkele krachtindrukkingsmeting op één locatie van een retinaal capillair van een muis geïsoleerd van een (A) niet-diabetische of (B) diabetische muis. De krachtcurven die worden verkregen met behulp van een SAA-SPH halfronde cantilever-sonde met een straal van 1 μm, geven de relatie weer tussen de cantilever-sample-afstand (gecontroleerd door de z-piëzo) en de uitgeoefende verticale kracht die cantilever-afbuiging veroorzaakt. (A) De gele pijl geeft de z-piëzo-aangedreven cantilever-benadering naar het monster aan, de witte pijl geeft het contactpunt aan waar de cantilever-sonde contact maakt met het monster en de groene pijl geeft de cantilever-doorbuiging aan tot een instelpunt (piek) indrukkracht (*). (B) Zowel naderings- als retractiecurven verkregen uit een retinaal capillair geïsoleerd van diabetische muizen vertonen een duidelijk steilere helling dan die van hun niet-diabetische tegenhangers (weergegeven in A), wat wijst op een hogere capillaire stijfheid bij diabetische muizen. De pijlpunt geeft een dip aan in de retractiecurve onder de basislijn, die de negatieve afbuiging van de cantileversonde weerspiegelt die wordt veroorzaakt door adhesie tussen de sonde en het monster tijdens het inspringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM is op grote schaal gebruikt om ziekte-geassocieerde veranderingen in de stijfheid van grotere bloedvaten, zoals de aorta enslagaders te meten. Deze bevindingen hebben bijgedragen aan het vaststellen van de rol van endotheliale mechanobiologie bij cardiovasculaire complicaties zoals atherosclerose17. Op basis van deze bevindingen zijn we begonnen met het onderzoeken van de voorheen niet-erkende rol van endotheliale mechanobiologie bij de ontwikkeling van retinale microvasculaire laesies in de vroege DR. Succes in dit streven is echter afhankelijk van de nauwkeurige meting van door diabetes geïnduceerde veranderingen in retinale capillaire stijfheid. Recente studies hebben aangetoond dat net als bij grote vaten, stijfheid van retinale haarvaten en retinale EC-uitgescheiden subendotheliale matrix ook direct, nauwkeurig en betrouwbaar kunnen worden gemeten met behulp van AFM 4,5,6.

Deze benadering omvat de isolatie van de netvliescapillairen van muizen uit mild gefixeerde ogen met behulp van trypsinevertering. Op basis van ervaring is deze milde fixatiestap noodzakelijk omdat haarvaten geïsoleerd uit niet-gefixeerde ogen (met behulp van de hypotone methode) kwetsbaar zijn en gefragmenteerd raken, waardoor ze ongeschikt zijn voor AFM-stijfheidsmeting4. Omgekeerd kan een sterkere fixatie en de daaruit voortvloeiende behoefte aan uitgebreide trypsinevergisting, die is gerapporteerd in ander retinale trypsinevergistingsprotocol18, ook de structurele integriteit van de capillairen in gevaar brengen, zoals beoordeeld door de verstoring van tight junctions. Aldus helpen de milde capillaire fixatie en zachte trypsinevertering die hier worden gebruikt om stijfheidsartefacten te verminderen die voortkomen uit overmatige formaline-geïnduceerde crosslinking en de structurele integriteit van de haarvaten voor betrouwbare AFM-stijfheidsmeting te waarborgen.

Als alternatieve benadering rapporteerde een recente studie AFM-stijfheidsmeting van retinale haarvaten van licht gefixeerde retinale platte mounts19. Door AFM-krachtinkepingen uit te voeren op retinale haarvaten in het intacte netvlies, maakt deze benadering in situ stijfheidsmeting mogelijk. Deze capillaire stijfheidsmetingen omvatten echter waarschijnlijk ook de stijfheid van het binnenste begrenzingsmembraan. Verder is deze benadering beperkt tot het meten van alleen oppervlakkige haarvaten die toegankelijk zijn op een retinale platte vatting, terwijl de dieper gelegen capillaire plexus wordt weggelaten die specifiek wordt aangetast in het vroege DR20. Deze problemen kunnen worden aangepakt met behulp van deze aanpak, waarbij bloedvaten schoon (verstoken van resterend netvliesweefsel) uit alle netvlieslagen worden geëxtraheerd. We zijn momenteel bezig met het optimaliseren van dit protocol om choroïdale vaten te isoleren uit diermodellen van vroege AMD. Dat gezegd hebbende, realiseren we ons dat de milde formalinefixatie die in het protocol wordt gebruikt, een crosslinking-geassocieerd verstijvingsartefact in AFM-metingen kan veroorzaken. Daarom zou het verstandig zijn om de vasculaire stijfheidswaarden die met deze benadering worden verkregen, meer te interpreteren in termen van relatieve veranderingen in stijfheid (tussen verschillende experimentele groepen) dan in absolute stijfheid.

In tegenstelling tot retinale haarvaten die milde fixatie vereisen, kan de subendotheelmatrix verkregen uit retinale EC-culturen zonder enige wijziging worden beoordeeld. Dit is grotendeels te danken aan de robuustheid van de afgezette matrix, die het resultaat is van een combinatie van verschillende factoren, waaronder de toevoeging van ascorbinezuur in het kweekmedium (dat de collageensynthese verbetert15), chemische modificatie van glazen dekglaasjes die voorkomt dat de matrix loskomt tijdens decellularisatie, en een langere duur van de kweek (10-15 dagen). Belangrijk is dat we hebben aangetoond dat de door hyperglykemie geïnduceerde toename van de stijfheid van de subendotheliale matrix in vitro consistent is met de door diabetes geïnduceerde toename van retinale capillaire stijfheid die in vivo4 wordt gezien. Dit is niet verwonderlijk, aangezien een toename van de matrixstijfheid naar verwachting de stijfheid van bovenliggende retinale EC's zal verhogen (als gevolg van mechanische reciprociteit) die samen de algehele capillaire stijfheid verhogen. Inderdaad, we hebben onlangs aangetoond dat retinale EC's stijver worden wanneer ze worden gekweekt onder diabetische aandoeningen4, waarschijnlijk via een toename van Rho/ROCK-afhankelijke actine-cytoskeletspanning21. Deze bevindingen impliceren ook dat de choroïdale EC-verstijving die te zien is in het resusapenmodel van vroege AMD de verhoogde stijfheid van de choroïdale subendotheliale matrix en intacte vatenweerspiegelt 12, een idee dat wordt getest in lopende studies. Over het algemeen getuigt het feit dat stijfheidsveranderingen in de niet-gefixeerde retinale subendotheliale matrix en EC's de trend weerspiegelen die wordt gezien in mild gefixeerde intacte netvliesvaten, de geldigheid van de milde fixatiebenadering.

Directe stijfheidsmeting van retinale capillairen uit diermodellen van DR helpt niet alleen om endotheliale mechanobiologie te vestigen als een nieuw therapeutisch doelwit voor DR-beheer, maar het biedt ook een sterke reden om in de toekomst nieuwe gevoelige beeldvormingstechnieken te ontwikkelen voor niet-invasieve beoordeling van retinale capillaire stijfheid bij DR-patiënten. Dergelijke niet-invasieve technieken kunnen mogelijk subtiele veranderingen in de bloedstroom detecteren die naar verwachting zullen ontstaan door capillaire verstijving, vergelijkbaar met de veranderingen in de arteriële pulsgolfsnelheid die vaak worden gedetecteerd bij door diabetes veroorzaakte hart- en vaatziekten. AFM-stijfheidsmetingen van retinale haarvaten geïsoleerd uit post-mortem menselijke ogen van diabetische donoren zullen in dit opzicht een belangrijk proof-of-concept opleveren. Gezien het feit dat de capillaire stijfheid van het netvlies vroeg in het (streptozotocine) muismodel van diabetes type 1toeneemt 4, kan het succesvolle gebruik van AFM bij het valideren van stijfheid-metende beeldvormingsmodaliteiten leiden tot de identificatie van retinale capillaire stijfheid als klinische biomarker voor vroege pathogenese van DR.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Eye Institute / NIH-subsidie R01EY028242 (aan K.G.), Research to Prevent Blindness / International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (aan K.G.), The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant van WM Keck Foundation (aan Doheny Eye Institute), en Ursula Mandel Fellowship en UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (aan I.S.T.). Dit werk werd ook ondersteund door een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, Inc. aan de afdeling Oogheelkunde van de UCLA. De inhoud van dit artikel valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Retinal Capillary Isolation
0.22 µm PVDF syringe filterMerck MilliporeSLGVM33RSLow Protein Binding Durapore
10X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without calcium % magnesiumCorning20-031-CVFinal concentration 1X, pH 7.4
12-well plateFalcon Corning353043
15 mL centrifuge tubeCorning430791Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mL Luer-Lok TIP syringeBD302830
5 3/4 inch Disposable Borosilicate Glass/Non-sterile Pasteur pipetteFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Tissue Culture DishFalcon Corning353002
6-well plateFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL PenScientific Device Laboratory9804-02
Blade holderX-ACTO
Carbon Steel Surgical Blade #10Bard-Parker371110
Dental WaxElectron Microscopy Sciences50-949-027
Dissecting microscopeAm-scope
Formalin solution, neutral buffered, 10%Millipore SigmaHT501128-4LFinal concentration 5% (v/v)
Kimwipes - wiper tissueKimtech Science34133
Micro spatulaFine Science Tools10089-11
Orbital ShakerLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm  TweezerTed Pella, Inc.5667
Phase contrast microscopeNikon TS2
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetLabconco302380001
Safe-Lock microcentrifuge tubes 2 mLEppendorf22363352
StereoscopeAmScopeSM-3 Series Zoom Trinocular Stereomicroscope 3.5X-90X
Superfrost Plus microscopy slide - White tab - Pre-cleaned - 25x75x1.0 mmFisherBrand1255015
Tris Buffer, 0.1M solution, pH 7.4 - Biotechnology GradeVWRE553-500MLpH 8 for trypsin solution
Trypsin 1:250 powder Tissue Culture GradeVWRVWRV0458-25G10 % (w/v) trypsin solution
Water Molecular Biology GradeCorning46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS with calcium and magnesiumThermo Fisher Scientific14040-117pH 7.4
Ammonium hydroxideSigma-Aldrich338818
Ascorbic AcidSigma-AldrichA4034
Collagen IV antibodyNovus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
EthanolamineSigma-Aldrich398136
Fibronectin antibodySigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
GelatinSigma-AldrichG1890
Glass coverslips (12mm)Fisher12-541-000
GlutaraldehydeElectron microscopy Sciences16220
Human retinal endothelial cells (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 mediumCorning15-100-CV
Mouse retinal endothelial cells (mREC)Cell BiologicsC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific BP151-100
TrypsinGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Measurement
1 µm ProbeBrukerSAA-SPH-1UMA 19 micron tall hemispherical probe with 1
micron end radius, Spring constant 0.25N/m
70 nm LC probeBrukerPFQNM-LC-V2A 19 micron tall hemispherical probe with 70nm end radius,
 Spring constant 0.1N/m
 cameraXCAM familyToupcam1080P HDMI
Desktop to run the cameraAsusAsus desktopIntel i5-6600 CPU , 8GB RAM
Dish holder for coverslipCellvisD29-14-1.5-N29mm glass bottom dish with
 14 mm micro-well
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Bioscience atomic force microscope mounted on an optical microscope for sensitive measurement of the mechanostructural properties (stiffness and topography) of soft biological samples
Phase contrast micrscopeZeissAxiovert 200Inverted microscope with 10X objective

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).">Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).
  2. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).">Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).
  3. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).">Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  4. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).">Chandrakumar, S., et al. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).
  5. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).">Chandrakumar, S., et al. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).
  6. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).">Yang, X., et al. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).
  7. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).">Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).
  8. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).">Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).
  9. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).">Ghosh, K., Ingber, D. E. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).
  10. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).">Yang, X., et al. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).
  11. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).">Cabrera, A. P., et al. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).
  12. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).">Cabrera, A. P., et al. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).
  13. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).">Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).
  14. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).">Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).
  15. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).">Beacham, D. A., et al. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).
  16. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).">Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).
  17. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).">Huynh, J., et al. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).
  18. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).">Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).
  19. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).">Chaqour, B., et al. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).
  20. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).">Ashraf, M., et al. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).
  21. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).">Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal CapillariesSubendothelial MatrixAtomic Force MicroscopyCapillary StiffnessDiabetic RetinopathyVascular StiffnessRetinal Vessel IsolationPhase Contrast MicroscopyDecellularization BufferCollagen Four Matrix

Related Articles