Gehyperpolariseerde 129Xe long-MRI en spectroscopie bij mechanisch beademde muizen

Samenvatting

Gehyperpolariseerde xenon-MRI kan de regionale longmicrostructuur (luchtruimteafmetingen) en fysiologie (ventilatie en gasuitwisseling) kwantificeren in translationeel onderzoek en klinische zorg. Hoewel het een uitdaging is, kan het vergelijkbare pulmonale inzichten opleveren in preklinische studies. Dit protocol beschrijft de infrastructuur en procedures die nodig zijn om routinematige xenonlong-MRI bij muizen uit te voeren.

Samenvatting

Gehyperpolariseerd (HP) xenon-129 (¹²⁹Xe) is een inhalatiemiddel voor magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) met unieke spectrale en fysische eigenschappen die kunnen worden benut om de longfysiologie te kwantificeren, waaronder ventilatie, beperkte diffusie (alveolaire luchtruimgrootte) en gasuitwisseling. Bij mensen is het gebruikt om de ernst en progressie van de ziekte bij een verscheidenheid aan longaandoeningen te evalueren en is het goedgekeurd voor klinisch gebruik in de Verenigde Staten en het Verenigd Koninkrijk. Naast de klinische toepassingen is het vermogen van ¹²⁹Xe MRI om pulmonale pathofysiologie niet-invasief te beoordelen en ruimtelijk opgeloste informatie te verstrekken waardevol voor preklinisch onderzoek. Van de diermodellen worden muizen het meest gebruikt vanwege de toegankelijkheid van genetisch gemodificeerde ziektemodellen. Hier is ¹²⁹Xe MRI veelbelovend als een minimaal invasieve, stralingsvrije en gevoelige techniek om de progressie van longziekte en de therapierespons longitudinaal te volgen (bijv. bij het ontdekken van geneesmiddelen). Deze techniek kan worden uitgebreid tot preklinische toepassingen door een MRI-geactiveerd, vrij ademend apparaat of mechanische ventilator op te nemen om gas af te geven. Hier beschrijven we de stappen en bieden we checklists om robuuste gegevensverzameling en -analyse te garanderen, waaronder het creëren van een thermisch gepolariseerd xenongasfantoom voor kwaliteitscontrole, het optimaliseren van polarisatie, omgang met dieren (sedatie, intubatie, ventilatie en zorg voor muizen) en protocollen voor ventilatie, beperkte diffusie en gasuitwisselingsgegevens. Hoewel preklinische ¹²⁹Xe MRI kan worden toegepast in verschillende diermodellen (bijv. ratten, varkens, schapen), richt dit protocol zich op muizen vanwege de uitdagingen van hun kleine anatomie, die worden gecompenseerd door hun betaalbaarheid en de beschikbaarheid van veel ziektemodellen.

Inleiding

Hoewel longaandoeningen de belangrijkste oorzaken van wereldwijde morbiditeit en mortaliteit blijven¹, zijn de resultaten voor patiënten de afgelopen tien jaar dramatisch verbeterd. Deze verbeteringen worden deels gedreven door twee factoren. Ten eerste geven klinische fase III-onderzoeken nu prioriteit aan veranderingen in de longfunctie als eindpunten in plaats van mortaliteit, waardoor geneesmiddelenonderzoeken worden versneld^met 2,3,4,5. Ten tweede heeft de vooruitgang in verbeterde diermodellen inzicht verschaft in ziektemechanismen en de ontwikkeling van therapieën bevorderd ^6,7. Muismodellen hebben vaak de voorkeur voor translationeel onderzoek omdat ze fysiologische parallellen bieden met mensen, betaalbaarheid en snelle ziekteontwikkeling. Genetische manipulatie heeft het bereik en de kwaliteit van de beschikbare modellen uitgebreid, waarbij de International Mouse Strain Resource nu meer dan 32.000 muizenstammen⁸ telt, vergeleken met slechts 4.218 rattenstammen (Rat Genome Database⁹). Deze modellen hebben nieuwe wegen geopend voor het onderzoeken van mechanistische drijfveren en therapieresponsen voor een reeks longziekten, waaronder chronische obstructieve longziekte (COPD)¹⁰, cystische fibrose (CF)¹¹, longfibrose^12,13, pulmonale hypertensie^14,15 en astma¹⁶.

Helaas wordt longonderzoek met muizen beperkt door de beschikbare technieken om de ziektelast te kwantificeren. Studies zijn vaak gebaseerd op terminale procedures die 1) informatie over de hele long (biochemische testen) of gelokaliseerde informatie (histologie) opleveren en 2) transversale ontwerpen en grote steekproefgroottes vereisen. Ze leggen dus noch de ruimtelijke noch de temporele ziektedynamiek vast. Niet-invasieve, driedimensionale beeldvorming daarentegen kan de structuur, moleculaire processen en functie in de longen in de loop van de tijd beoordelen.

De longstructuur (bijv. luchtwegafwijkingen en interstitiële fibrose) kan worden gevisualiseerd met ultrakorte echotijd (UTE) MRI en microcomputertomografie (μCT) met hoge resolutie. Functionele en mechanistische informatie (bijv. ventilatie, perfusie, tumormetabolisme en ontstekingsprocessen) kan worden verkregen met exogene contrastmiddelen (bijv. xenonversterkte CT en zuurstofversterkte UTE) en ioniserende nucleaire geneeskundebenaderingen (d.w.z. positronemissietomografie [PET] en computertomografie met enkelvoudige fotonemissie [SPECT]). Functionele beeldvorming is echter een uitdaging vanwege het bescheiden contrast-ruisgehalte (met name voor zuurstofversterkte UTE bij de hoge magnetische veldsterktes die worden gebruikt voor preklinische MRI, waarbij T₁ wordt verlengd) die beschikbaar is zonder gebruik te maken van ioniserende modaliteiten met hogere dan normale stralingsniveaus. Hoewel beeldvorming met deze modaliteiten goed wordt verdragen in diermodellen met conventionele doses, kan cumulatieve straling de resultaten in onderzoeken naar immunologie, ontsteking en longkanker verwarren¹⁷. Hypergepolariseerde (HP) xenon-129 (¹²⁹Xe) magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) biedt echter minimaal invasieve, niet-bestralende en zeer gevoelige structurele en functionele informatie. Hoewel deze techniek in preklinisch onderzoek is gebruikt om aandoeningen te karakteriseren, waaronder emfyseem^18,19, fibrose²⁰, longkanker²¹, COPD²² en door straling geïnduceerd longletsel²³ op enkele of meerdere tijdstippen, blijft het onderbenut in de preklinische setting.

Om routinematige, preklinische ¹²⁹Xe MRI mogelijk te maken, zijn verschillende vereisten vereist, waaronder institutionele regelgevende ondersteuning, een hyperpolarisatieapparaat, een ¹²⁹Xe-afgestemde radiofrequentie (RF) spoel en een multi-nucleaire scanner. Hoewel geavanceerde applicaties 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33 leverancierspecifieke pulsprogrammering vereisen die buiten het bereik van dit protocol valt, kunnen basisapplicaties worden bereikt met bescheiden softwareaanpassingen. Daarom richten we ons op kwaliteitscontrole, magnetisatiebehandeling, gegevensverzameling en procedures voor het omgaan met dieren - inclusief mechanische beademing - die uniek zijn voor preklinische ¹²⁹Xe MRI (Figuur 1).

Tot op heden heeft ^{de beeldvorming van 129}Xe bij kleine dieren gebruik gemaakt van drie MR-veilige gasafgiftebenaderingen, elk met voor- en nadelen: vrije ademhaling, zuigeraandrijving en drukval. Vrije ademhaling maakt spontane inademing mogelijk zonder risico op letsel door intubatie of tracheostomie, maar verbruikt aanzienlijk meer HP-gas en kan bewegingsartefacten introduceren^34,35. Commerciële zuigeraangedreven apparaten zijn zelfkalibrerend en gebruiksvriendelijk uit de doos, maar kunnen onbetaalbaar zijn³⁶. De op drukval gebaseerde benadering die hier wordt gebruikt, wordt goed beschreven in de literatuur, modulair, aanpasbaar en uitgevoerd door open-sourcecode 37,38,39,40. Bovendien is het kosteneffectief, meestal in totaal minder dan $ 10k en een paar weken toegewijde bouwtijd. De drukvalventilator levert ¹²⁹Xe af uit een dosiszak in een bus onder druk terwijl de luchtwegdruk van een geïntubeerde muis wordt bewaakt.

Figuur 1: Overzicht van het protocol voor het verzamelen van routinematige xenon-129 (¹²⁹Xe) magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) bij muizen. (A) Stappen voor de eerste installatie. (Opmerking: de programmering van de scanner is uniek voor elke leverancier en wordt niet beschreven in dit protocol). (B) Stappen om dagelijkse kwaliteitsborging (QA) en diergegevens te verzamelen. (C) Stappen voor een succesvolle afronding van het experiment en gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier verzamelen en analyseren we de drie gemeenschappelijke klassen van ¹²⁹Xe MRI-gegevens: ventilatie, diffusiegewogen beeldvorming (alveolaire luchtruimgrootte) en gasuitwisseling. Ventilatiebeelden tonen de verdeling van het ingeademde ¹²⁹Xe-gas. Delen van de longen met een verminderde luchtstroom lijken donker in HP-gasbeelden en pathologie wordt gekwantificeerd door het volume van defecte ventilatie. Bij mensen heeft het percentage ventilatiedefecten (VDP) een sterke herhaalbaarheid laten zien^41,42 en een hoge gevoeligheid voor longobstructie bij ziekten zoals COPD 43,44,45 en astma ^46,47.

De beperkte diffusie van de ¹²⁹Xe-atomen in het luchtruim kan worden gemeten via de schijnbare diffusiecoëfficiënt (ADC) en dient als surrogaat voor de grootte van het luchtruim. De ADC wordt berekend door een basislijnbeeld (b₀) te verkrijgen zonder diffusieweging en een of meer beelden die zijn verkregen in aanwezigheid van bipolaire gradiënt-geïnduceerde diffusieweging (b_N). Een verhoogde ADC weerspiegelt een toename van de luchtruimgrootte als gevolg van veroudering of emfysemateuze verbouwing ^18,48. Verder maakt het gebruik van meerdere afbeeldingen met een b-waarde (≥4) het mogelijk om meer gedetailleerde morfometrische informatie (bijv. gemiddeld lineair snijpunt) te berekenen^49,50.

Gasuitwisseling kan worden gekenmerkt door 1) de oplosbaarheid van ¹²⁹Xe in het capillaire membraanweefsel, plasma en RBC's (rode bloedcellen) en 2) de chemische verschuiving van >200 ppm in het veld van ¹²⁹Xe wanneer opgelost in deze compartimenten. Zowel spectroscopische als beeldvormende gegevens geven inzicht in cardiopulmonale aandoeningen (bijv. pulmonale hypertensie en linkerhartfalen 51,52,53). Hoewel veel soorten (mensen, honden en ratten) unieke spectrale pieken vertonen die afkomstig zijn van elk compartiment, missen muizen een uniek RBC-signaal vanwege verschillen in interacties tussen hemoglobine en xenon-bindingsplaats. In plaats daarvan worden alle opgeloste componenten gecombineerd tot een enkel signaal in muizen⁵⁴. Het is echter mogelijk om een duidelijke RBC-resonantie waar te nemen bij transgene muizen die humaan hemoglobine tot expressie brengen, zoals die worden gebruikt in modellen van sikkelcelziekte⁵⁴. Over het algemeen bieden opgeloste ¹²⁹Xe-spectroscopie en beeldvorming unieke inzichten in cardiopulmonale pathofysiologie bij muizen^55,56.

Voordat u dit protocol probeert, is het noodzakelijk om achtergrondinformatie te begrijpen over de MRI-scanner, mechanische ventilatie en muishanteringstechnieken die nodig zijn voor muisstudies. Voorafgaand aan het starten van dierproeven moeten alle procedures worden goedgekeurd door het lokale Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)⁵⁷. Omdat het totale magnetische moment dat beschikbaar is in de muizenlong intrinsiek laag is (d.w.z. teugvolume ~250 μL), moet de voxelgrootte 1000 keer kleiner zijn dan bij mensen om een anatomisch equivalente resolutie te bereiken. De ademhalingsfrequentie van muizen is ook buitengewoon snel (>100 ademhalingen/minuut). Als zodanig zijn de procedures voor het inhouden van de adem die doorgaans worden gebruikt voor menselijke beeldvorming niet haalbaar. In plaats daarvan kunnen slechts een paar RF-excitaties binnen elke ademhaling worden toegepast, dus ¹²⁹Xe-beelden moeten worden gecodeerd over tientallen tot honderden ademhalingen. Pulsprogrammering kan nodig zijn om externe triggering van acquisities mogelijk te maken en om segmenten, fasecoderingen en/of diffusiegewogen beelden op de juiste manier te lussen, terwijl de signaal-ruisverhouding (SNR), resolutie en scanduur in evenwicht zijn. Hier voert het beademingsapparaat eenmaal per ademhaling een transistor-transistor logische (TTL)-puls uit om gegevensverzameling te activeren (Figuur 2).

Figuur 2: Representatieve timing van mechanische ventilatie en data-acquisitie. (A) Door de gebruiker gecontroleerde ventilatie kan gegevensverzameling activeren bij het einde van de inademing, tijdens het inhouden van de adem of bij het einde van de uitademing. (B) Voor deze 3D radiale ventilatiesequentie definieert de gebruiker het totale aantal verkregen projecties en het aantal projecties per ademhaling. (C) Voor een segmentselectieve, 2D-diffusiegewogen afbeelding definieert de gebruiker de volgorde van segmenten, afbeeldingen met b-waarde en fasecoderingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om betrouwbare beademing en ¹²⁹Xe-toediening mogelijk te maken, zijn robuuste sedatie- en intubatieprocedures vereist. Voor elk onderzoek moeten de stroomafwaartse effecten van elk anestheticum in overweging worden genomen, inclusief veranderingen in minuutventilatie, hartslag (HR) en bloeddruk 58,59,60,61,62,63,64,65,66. Hoewel er een verscheidenheid aan sedativa is gebruikt voor preklinische HP-gas-MRI, gebruiken we een mengsel van ketamine, xylazine en acepromazine vanwege de beschikbaarheid, kosteneffectiviteit, betrouwbaarheid en duur^67,68. Eenmaal verdoofd, moeten dieren worden geïntubeerd voor effectieve mechanische ventilatie. Intubatie van muizen is moeilijk vanwege de kleine omvang van hun anatomie, en daarom is het belangrijk om grondig in deze techniek te trainen. We moedigen onderzoekers aan om gepubliceerde videoprotocollen te bekijken ^69,70. Omdat de meeste commerciële intubatiecanules roestvrij staal bevatten, introduceren we een techniek om metaalvrije (d.w.z. MRI- en HP-gas-compatibele), wigvormige canules te maken die kunnen worden aangepast aan de luchtwegdiameter om een luchtdichte afsluiting te creëren met de tracheale wand van de muis.

Omdat ¹²⁹Xe-beelden worden verzameld over vele ademhalingen, zijn de instellingen van de beademingsapparatuur van cruciaal belang. Beschermende ventilatiestrategieën moeten zorgvuldig worden overwogen om longbeschadiging te voorkomen 71,72,73,74. Met name het gebruik van een laag teugvolume (TV), matige positieve eind-expiratoire druk (PEEP) en alveolaire rekruteringsmanoeuvres (RM's) verminderen het risico op door beademing geïnduceerd longletsel bij menselijke patiënten en diermodellen 75,76,77,78,79,80,81. Hier raden we een eenvoudige techniek aan die compatibel is met ¹²⁹Xe mechanische ventilatie met drukval die beschermend is en voldoende ¹²⁹Xe-beeld-SNR biedt. Concreet passen we PEEP toe door een commercieel PEEP-ventiel toe te voegen aan de uitademleiding van het beademingsapparaat. Om RM's uit te voeren, moet de uitademlijn worden gesloten, zodat het dier meerdere keren wordt ingeademd zonder uit te ademen totdat een doeldruk en -duur zijn bereikt.

Overal bieden we algemene ventilatie-instellingen, maar het wordt geadviseerd om de literatuur door te nemen om specifieke studiedoelen aan te pakken^82,83. Naast het bewaken van de piekinspiratoire druk tijdens mechanische beademing, is het belangrijk om de temperatuur van het dier te controleren, wat kan worden gedaan met behulp van standaard temperatuurbewakingsmethoden bij muizen. Hoewel het niet nodig is voor beeldvorming, kan het monitoren van de hartslag via een elektrocardiogram (ECG) voordelig zijn; ECG kan aangeven of een dier wakker is uit sedatie, een overdosis heeft gekregen of van streek is, zodat de onderzoeker kan ingrijpen.

Het protocol dat we beschrijven is ontworpen om ¹²⁹Xe 3D radiale ventilatiegegevens⁶¹, 2D GRE-diffusiegewogen gegevens⁷⁶ en dynamische pulsverwervende spectroscopiegasuitwisselingsgegevens te verzamelen. Dit protocol heeft tot doel de kloof te overbruggen tussen preklinisch onderzoek in kleine diermodellen en het potentieel van ¹²⁹Xe MRI om ons begrip van longaandoeningen te vergroten.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Eerste voorbereiding van de locatie

1. Maak en test een thermisch gepolariseerd ¹²⁹Xe-gasfantoom (Figuur 3).
   1. Zorg voor een vat van borosilicaatglas (~60 ml), een plunjerklep met een O-ring aan de voorkant en een steel van geslepen borosilicaatglas, allemaal met een vermogen tot 150 psig. Zorg ervoor dat er geen magnetische onderdelen zijn. Bevestig een knelfitting aan de glazen steel. Draai vast om een gasdichte afdichting te krijgen.
   2. Sluit het vat aan op een vacuümpomp en zuurstofreservoir volgens afbeelding 3A. Vacuümvat tot minder dan 100 mTorr absolute druk.
   3. Vul het vat met zuurstof tot een druk van 1,5 atm om de ¹²⁹Xe T₁ te verminderen van > 30 minuten tot ~2 s (bij 7 T magnetische veldsterkte; Gebruik voor een scanner van 9,4 T 1,6 atm zuurstof). Zeehond schip.
      OPMERKING: Voor hogere veldsterktes is een iets hogere partiële zuurstofdruk vereist om T₁≤ 2 s⁸⁴ te bereiken.
   4. Vul een gasondoordringbaar reservoir met 400 ml isotopisch verrijkt xenon (85% ¹²⁹Xe).
      OPMERKING: Xenon met natuurlijke abundantie (26% ¹²⁹Xe) kan ook worden gebruikt, maar de gemiddelde signaalmiddeling moet worden verhoogd om de ~3-voudige vermindering van SNR te verminderen.
   5. Sluit het vat aan op het reservoir van ¹²⁹Xe. Vacuümslang tot minder dan 100 mTorr absolute druk.
   6. Vul een benchtop-vloeistof met open mond N₂ Dewar tot ~90%. Dompel de bodem van het vat (~5 cm) onder in vloeibare stikstof om O₂ te condenseren en een vacuüm te creëren (Figuur 3B). Open onder water de klep zodat ¹²⁹Xe uit het reservoir in het vat kan stromen (Figuur 3C).
   7. Sluit het plunjerventiel af door langzaam aan de steel te trekken totdat het instroomgat in de plunjer voorbij de O-ring is getrokken. Onmiddellijk nadat het gat de O-ring is gepasseerd, draait u deze met de hand vast om het vat af te dichten. Verwijder het vat van vloeibare stikstof en laat het ontdooien.
      OPMERKING: Eenmaal ontdooid, zal het vat onder druk komen te staan tot ~4,5 atm (2 atm O₂ + 2,5 atm ¹²⁹Xe).
   8. Bescherm glaswerk (plaats het vat bijv. in de gewatteerde buiscontainer van polyvinylchloride (PVC), afbeelding 3D).
      OPMERKING: Als het fantoom goed wordt onderhouden, kan het tien jaar of langer druk volhouden.
   9. Meet de T₁ van het fantoom (bijv. met behulp van een spectroscopische inversieherstelsequentie). Bevestig T₁ < 2 s voor 7 T scanners. Spoorsein en T₁ in de tijd voor kwaliteitsborging (QA).

Figuur 3: Creatie van een thermisch gepolariseerd ¹²⁹Xe-gasfantoom op basis van het protocol dat in stap 1.1 wordt beschreven. De O₂ en ¹²⁹Xe partiële drukken kunnen worden gewijzigd om de T₁ aan te passen om de juiste ¹²⁹Xe T₁ keer en signaalsterkte te verkrijgen bij een bepaalde veldsterkte⁸⁴. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voer kwaliteitsborging uit met het thermisch gepolariseerde gasfantoom (Tabel 1 en Figuur 4).
   1. Plaats de ¹²⁹Xe-spoel in het isocentrum van de magneet en centreer het ¹²⁹Xe-gasfantoom in de spoel. Stel in een enkele puls-en-verkrijgingssequentie ("enkele puls") de werkfrequentie in op ongeveer ¹²⁹Xe-gasfrequentie in het fantoom (~83.07 MHz bij 7T).
   2. Centreer de acquisitie- en excitatiefrequenties op de ¹²⁹Xe Larmor-frequentie en gebruik deze frequentie voor alle fantoomkalibratie en kwaliteitscontrole ¹²⁹Xe-scans. Zie Tabel 1 voor experimentele parameters voor alle QA-scans. Controleer of het fantoom is gecentreerd met een fantoomlocalizer (Afbeelding 4A).
   3. Voer een nutatie-experiment uit om de fliphoek te kalibreren: Ervan uitgaande dat SNR voldoende is, gebruikt u enkele RF-pulsen met een afstand tussen de herhalingstijd (TR) > 5 x T₁. Verhoog voor elke acquisitie stapsgewijs het RF-vermogen totdat het signaal null wordt en begint om te keren. De standaard die hier wordt gebruikt is: aantal pulsen = 65; TR = 10 s; pulsduur = 125 μs; RF-vermogen = 1-13,8 W, verhoogd met 0,2 W
   4. Fourier transformeert en faseert het eerste spectrum (d.w.z. het spectrum dat wordt verkregen met het laagste RF-vermogen). Pas dezelfde fasering toe voor alle spectra. Zet de werkelijke spectra uit als functie van het RF-pulsvermogen (Figuur 4B).
   5. Het vermogen dat een nulpiek produceert (d.w.z. minimale piekhoogte) komt overeen met de flip-hoek van 180°. Bereik een flip-hoek van 90° door hetzelfde vermogen te gebruiken op de helft van de pulslengte die nodig is om de flip-hoek van 180° te produceren. Ervan uitgaande dat de scannersoftware dit toelaat, stelt u dit referentievermogen en pulslengte van 90° in voor het vervolgens schalen van de flip-hoek.
   6. Gebruik een enkele puls om te vullen door de volledige breedte te minimaliseren tot maximaal de helft van het ¹²⁹Xe-spectrum (TR ~ 1 s). Centreer indien nodig de frequentie opnieuw na het opvullen. Noteer de volledige breedte van de helft max.
   7. Voer de ¹²⁹Xe QA-scan uit (Tabel 1 en Afbeelding 4C). Registreer QA-gegevens: SNR, gemiddeld fantoomsignaal en standaarddeviatie van de ruis.

Figuur 4: Kwaliteitsborging vóór het scannen. (A) Een 2D GRE coronale fantoomlocalizer met lage resolutie zorgt ervoor dat het fantoom gecentreerd is in de magneet. (B) Een nutatie-experiment om een puls van 90° in te stellen, toont een nulpiek bij de puls van 180°. (C) Verkrijg na het lokaliseren en kalibreren van de fliphoek een 2D GRE QA-beeld met een hogere resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol Afkorting Naam	Beschrijving van de sequentie	TR (mevrouw)	TE (ms)	Gemiddelden / herhalingen	Flip hoek (°)	Matrixgrootte of Nptn	Gezichtsveld (mm2)	RF BW (kHz)	Plak / Plaatdikte (mm)	Duur van de scan
Enkele puls	Puls verwerven	1000		1 / 1	60	2048		10		1 s
Fantoom localizer	2D GRE	200	3.7	20 / 1	48	60 × 32	120 × 48	3	60	2 minuten
Kalibratie van de flip-hoek	Puls verwerven	7000		1 / 65	20	2048		5.12		7,5 minuten
129Xe QA	2D GRE	5000	3.3	8 / 1	90	322	322	3	40	21 minuten

Tabel 1: Parameters voor de kwaliteitsborgingssequentie van fantoomkalibratie. TR = herhalingstijd, TE = echotijd, N_pts = aantal punten, FOV = gezichtsveld, BW = bandbreedte. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Plan polarisatie (Figuur 5A, B).
   1. Selecteer gepolariseerd ¹²⁹Xe-volume en accumulatietijd: 400 ml in 15 minuten is optimaal voor dit protocol (Afbeelding 5), maar kan eenvoudig worden aangepast voor andere toepassingen en apparatuur.
   2. Uitgaande van een bekend dood volume in de hyperpolarisator (bijv. V_{dood vol} = 80 ml), berekent u het debiet (F_Xe in SLM) voor een _gewenst gedoseerd volume V, ¹²⁹Xe gasfractie f, en accumulatietijd t_acc:
      (1)
      OPMERKING: Hoewel langere productietijden doorgaans een hogere polarisatie opleveren, zijn ze misschien niet praktisch voor in vivo beeldvorming. Gebruik een geschikt model voor de hyperpolarisator 85,86,87,88 om een debiet te bepalen dat de productietijd en polarisatie in evenwicht houdt. Hier werd het model van J. W. Plummer et ^al.89 (Figuur 5A) gebruikt. Dit is van toepassing op polarisatoren met continue stroom en is niet van toepassing op hyperpolarisatoren met gestopte stroom⁹⁰.
   3. Polariseer gas volgens deze parameters, meet de polarisatie met een commercieel of zelfgebouwd apparaat en vergelijk deze met de voorspelde polarisatie voor QA.
   4. Meet het polarisatieverlies tijdens transport. Als de polarisatie met een voldoende grote hoeveelheid afneemt (bijv. >10%), bouw dan een magnetische draagtas om polarisatie tijdens transport te beschermen. Zie Aanvullend Dossier 1: Omgaan met polarisatie tijdens transport en Aanvullende Figuur 1.

Figuur 5: Polarisatiebeheer. (A) Polarisatie en geproduceerd volume zijn een functie van de accumulatietijd en het debiet. Een zak gas van 400 ml zorgt voor een hoge initiële polarisatie (~35%) gedurende 20 minuten. Hoewel het gebruik van 1 liter gas aantrekkelijk lijkt, zal het een lagere initiële polarisatie hebben (~20%). (B) Na ~15 minuten ventilatie zou een batch van 1 liter HP ¹²⁹Xe uitgeput raken tot <10% polarisatie, terwijl 600 ml gas¹¹⁶ overbleef. Het gebruik van meerdere zakken van 400 ml ¹²⁹Xe zorgt dus voor een hogere gemiddelde geleverde polarisatie. C) Locaties waar het primaire veld en het actieve afschermingsveld elkaar kruisen (rood vak op positie (N,N,N)) kunnen een snelle ontspanning van HP ¹²⁹Xe veroorzaken. Het karakteriseren van het randveld van de magneet helpt bij het identificeren van veilige zones waar reservoirs van HP ¹²⁹Xe kunnen worden geplaatst zonder snelle ontspanning (groene doos op positie (0,0,n)). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Omgaan met polarisatie tijdens transport. Klik hier om dit bestand te downloaden.

4. Meet de positieafhankelijke T₁ van HP ¹²⁹Xe binnen het randveld (Figuur 5C).
   1. Maak referentiepunten met bekende afstanden en posities ten opzichte van het magneetisocentrum langs de X-, Y- en Z-dimensies. Label isocentrum en label de andere posities n tot en met N. Het aantal te onderzoeken posities is afhankelijk van de beschikbare ruimte.
   2. Hyperpolariseer een klein volume van ¹²⁹Xe (~250 ml) en transporteer het naar de MRI-controlekamer. Vul een grote spuit (50-100 ml) met ¹²⁹Xe en plaats deze in het isocentrum in de magneet (positie 1 in afbeelding 5C). Speel een puls van ~1° flip-hoek af om het signaal te meten.
   3. Laat de spuit ~10 minuten op zijn plaats zitten en neem dan een ander spectrum aan. Meet het signaal elke 10 minuten opnieuw totdat het signaal ten minste 1 T₁ is vervallen (d.w.z. het signaal is vervallen tot ~1/3e van de oorspronkelijke waarde).
   4. Start een nieuw T_1-experiment met een nieuwe spuit van ¹²⁹Xe door stap 1.4.2 te herhalen.
   5. Verplaats de spuit naar een nieuwe positie (bijv. positie n in afbeelding 5C) en laat hem daar 10 minuten staan. Breng de spuit terug naar het isocentrum om een extra ~1° flip-hoekspectrum te verkrijgen.
   6. Herhaal dit proces: verplaats de spuit naar positie n, wacht 10 minuten, plaats hem terug naar het isocentrum en meet het signaal opnieuw totdat het ten minste 1 T₁ is vervallen.
   7. Herhaal stap 1.4.4 - 1.4.6 voor de resterende referentieposities in de X-, Y- en Z-richtingen.
   8. Het initiële signaal (S₀) zal monoexponentieel vervallen over n RF-pulsen met een θ-fliphoek . Plaats het signaal (S) als een functie van de tijd (t) in het randveld om de T₁ in elke positie te berekenen:
      (2)
   9. Identificeer een positie met voldoende T₁ (>20 min) voor plaatsing van ^{het 129}Xe-reservoir.
5. Maak metaalvrije intubatiecanules (Figuur 6).
   1. Zorg voor twee adervormige verblijfskatheters van polytetrafluorethyleen (PTFE) met Luer-connectoren. Gooi de naalden weg in een afvalcontainer voor scherpe voorwerpen.
      OPMERKING: Gebruik voor muizen >25 g katheters van 18 G en 20 G. Gebruik voor kleinere dieren katheters van 20 G en 22 G.
   2. Knip de Luer-connector van de katheters. Voer de kleinere katheter in het bovenste uiteinde van de grotere katheter om een scherper taps toelopende en langere canule te creëren. Snijd de composietcanule af tot ~4,6 cm met een afgeschuind uiteinde, exclusief de Luer-basis (Figuur 6A, B).
   3. Snijd het bredere uiteinde van een pipetpunt van 200 μL af tot een lengte van ~2,6 cm (Figuur 6C).
   4. Smeer de binnenkant van de pipetpunt in met algemeen smeermiddel voor het afgeven van de matrijs. Gebruik een andere pipetpunt die erin is gestoken om het smeermiddel dun te verdelen. Vul de pipetpunt met acetoxy siliconen vulkanisatiepasta epoxy (Figuur 6D, E).
   5. Sluit de canule aan met 22 G-draad die aan beide uiteinden uitsteekt. Voer de canuleslang door de siliconen in de pipetpunt. Verleng de slang ~7 mm voorbij het uiteinde van de pipetpunt (Figuur 6F, G).
   6. Schuif de canuleslang aan de bredere kant van de pipetpunt door een plastic mannelijke slip Luer-connector en lijm de stukken aan elkaar met de epoxy. Trim de slang die voorbij de Luer-connector uitsteekt (Figuur 6H).
   7. Wacht tot de epoxy is opgedroogd (>24 uur) en verwijder vervolgens voorzichtig de siliconen intubatiecanule uit de pipetpuntvorm. Verwijder de draad van de canule en zorg ervoor dat de buis niet is afgesloten (Figuur 6I).
   8. Om een handvat te maken voor eenvoudige intubatie, sluit u de slang (1/16" of 1/8") aan op een vrouwelijke Luer-connector. Als u klaar bent voor intubatie, sluit u deze vrouwelijke Luer-connector aan op de mannelijke Luer-intubatiecanule. Dit stuk kan gemakkelijk worden losgemaakt na intubatie (Figuur 6J).
   9. Ontsmet voor elk gebruik bij dieren: veeg de buitenkant van de canule af met 70% alcohol. Veeg de draad van 20 G af met ontsmettingsmiddel en voer de draad vervolgens door de canule om de binnenkant te ontsmetten en ervoor te zorgen dat er geen verstoppingen ontstaan.

Afbeelding 6: MRI- en HP ¹²⁹Xe-compatibele muisintubatiecanules maken. Deze canules zijn gemaakt van veneuze katheters, pipetpunten en siliconenkit, zoals beschreven in stap 1.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Dagelijkse gegevensverzameling

OPMERKING: Zie aanvullend dossier 2: Preklinische scan QA-checklist.

Aanvullend Dossier 2: Preklinische scan QA checklist. Klik hier om dit bestand te downloaden.

1. Volledige dagelijkse kwaliteitscontrole van de scanner en installatieventilator (Afbeelding 4).
   1. Voer met fantomen QA-protocollen uit op de scanner (zie Tabel 1 voor QA-scanparameters en Stap 1.2 voor dagelijkse kwaliteitscontrolestappen).
   2. Kalibreer de ventilator volgens de methode van J. Nouls et ^al.38. Zie aanvullend dossier 3: kalibratie van de ventilator, aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3.
   3. Stel de beademingsinstellingen in voor beeldvorming bij eindinspiratie (Tabel 2). Plaats het dierenbed op het scannerrek en de levensondersteunende module (d.w.z. mechanische ventilatoronderdelen) op de tafel naast de scanner.
   4. Activeer het locatiespecifieke dierverwarmingssysteem. Zet een kachel op 35.5 - 40 °C, schakel circulatielucht in en plaats de luchtslang binnen ~5" van waar de kop van het dier zal rusten om de boring van de scanner voor te verwarmen.

Ventilatie instelling	Aanbeveling voor HP 129Xe MRI	Notities
Getijdenvolume (TV)	8-10 ml/kg ideaal lichaamsgewicht	Matige tv; lage tv vereist een hogere BR, wat bewegingsartefacten in afbeeldingen kan veroorzaken
Positieve eind-expiratoire druk (PEEP)	2–6 cmH2Ø
Ademfrequentie (BR)	80-120 br/min
Rekrutering manoeuvres (RM's)	~35 cmH2O voor 6 s om de 5 min
Duur van de ventilatie; Positie	< 6 uur; Liggend	Rugligging om de beweging van de borstkas beter te zien
Fractie ingeademde zuurstof (FIO2)	0.3–0.5	Voorkom hypoxie bij verdoofde muizen
Inademings- tot expiratoire verhouding (I:E)	1:2–1:4
Inspiratoire tot totale cyclusduur	0.2–0.4
Minuut ventilatie	≥0,57 ml/g-1,-min-1
Onze normen:
BR = 80 br/min, inspiratieduur = 200 ms, FIO2 = 0,3
Beeldvorming bij eindinademing: adem inhouden = 200 ms, triggervertraging = 200 ms na start van de inademing
Beeldvorming tijdens het inhouden van de adem: adem inhouden = 250 ms, triggervertraging = 250 ms na start van de inademing
Beeldvorming aan het einde van de expiratie: adem inhouden = 200 ms, triggervertraging = 650 ms na het begin van de inademing

Tabel 2: Aanbevolen beademingsinstellingen voor ¹²⁹Xe-beeldvorming. Parameters kunnen worden afgestemd op specifieke studiedoelstellingen en experimentele omstandigheden 117,118,119,120,121,122,123,124. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Kalibratie van ventilatoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

2. Kalm en intuber dier.
   1. Zet de broedstoof aan op 27,7 °C en/of het elektrische verwarmingskussen op 37,7 °C. Meet en registreer de lichaamsgewicht van het dier. Bereken de dosering van het kalmerende middel op basis van massa. Zie Tabel 3 voor een typisch doseringsschema.
   2. Injecteer het kalmerende middel intraperitoneaal. Noteer het tijdstip van injectie en stel de timer in voor de volgende dosis kalmerend middel.
      OPMERKING: Voltooi de resterende stappen in Rubriek 2 (Dagelijkse gegevensverzameling) zo snel mogelijk om de tijd onder sedatie en het risico op overdosering te minimaliseren.
   3. Breng oogglijmiddel aan op de ogen van het dier en plaats het dier in een kooi op het verwarmingskussen of in een couveuse om onderkoeling te voorkomen.
   4. Controleer of het dier volledig verdoofd is door 10-15 minuten na de sedatieve injectie⁶⁸ een teenknijptest uit te voeren. Intuberen volgens de procedures beschreven in Das et ^al.69.
      OPMERKING: Het artikel van Das et ^al.69 gaat vergezeld van een uitgebreide videodemonstratie van de techniek. De stappen zijn als volgt:
   5. Hang het dier in rugligging aan de tanden aan een schuine plank. Gebruik een tongspatel voor knaagdieren om de tong naar buiten te trekken.
   6. Om ervoor te zorgen dat stembanden zichtbaar zijn, levert u wit licht via een glasvezelkabel in de intubatiecanule of een fel licht aan de buitenkant van de keel. Breng de canule minder dan 5 mm voorbij de stembanden in.
   7. Zorg ervoor dat de canule zich in de luchtpijp bevindt, niet in de slokdarm, door deze aan te sluiten op een stuk slang met een klein druppeltje water erin. Als de waterdruppel op tijd beweegt met de ademhaling van het dier, is de positionering waarschijnlijk correct.

Agent	Dosis	Route	Duur	Opmerkingen
Inhalatiemiddelen
Isofluraan	Inductie: 4%-5% Onderhoud: 1%– 3% of tot effect	Ingeademd	Tijdens continue stroom	• Vereist het gebruik van een gekalibreerde verdamper
Injecteerbare middelen
Aanbevolen: Ketamine + xylazine + acepromazine	90 + 9 + 3 mg/kg	Intraperitoneaal	20–60 minuten	• Creëert vatbaarheid voor onderkoeling
				• Voor herhaalde dosering wordt aanbevolen om over te schakelen op een ketamine + xylazine-mengsel om overdosering te voorkomen
				• Veroorzaakt schudden als het verdwijnt. Houd u voor beeldvorming strikt aan het doseringsschema
				• Kan bradycardie veroorzaken
Ketamine + xylazine	90 + 9 mg/kg	Intraperitoneaal	20–40 minuten	• Zie hierboven (Ketamine + xylazine + acepromazine)
Pentobarbital	50 - 70 mg/kg	Intraperitoneaal	20–60 minuten	• Verlaagt de ademhalingsfrequentie en beweging
				• Kosten kunnen onbetaalbaar zijn
				• Farmaceutische kwaliteit is mogelijk niet beschikbaar
Disclaimer: Dit zijn algemene richtlijnen. Raadpleeg een dierenarts voor meer informatie voordat u het implementeert.

Tabel 3: Gemeenschappelijk anesthesieformularium voor muizen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Ventileer het dier (Tabel 2).
   1. Bevestig het dier aan de beademing via de Luer-connector op de intubatiecanule. Bewaak de middenrifbeweging en de maximale inspiratoire druk (~10-12 cm H₂O voor een ademvolume van 10 ml/kg lichaamsgewicht). Als de druk of ademhalingsbeweging abnormaal is, pas dan indien nodig de hoek van de nek en de diepte van de canule zorgvuldig aan.
   2. Zorg ervoor dat de intubatiecanule luchtdicht is door een rekruteringsmanoeuvre uit te voeren: voorkom uitademing (blokkeer bijvoorbeeld met een vinger de uitademingspoort) zodat het dier meerdere keren inademt zonder uit te ademen.
      OPMERKING: Als de luchtwegdruk 35 cmH₂O piek inspiratoire druk bereikt over ~6 s, is de luchtwegafdichting voldoende strak. Als dit niet het geval is, raadpleegt u de discussie voor het oplossen van problemen.
   3. Laat de normale uitademing hervatten. Voer rekruteringsmanoeuvres uit tussen scans en elke ~5 minuten wanneer er niet wordt gescand om de longcompliantie te behouden en atelectase te voorkomen. Sluit het PEEP-ventiel aan op de uitademleiding. Stel PEEP in op 4 cmH₂O. Kijk hoe de piek inspiratoire druk met die hoeveelheid toeneemt.
   4. Plan en initialiseer na succesvolle intubatie de productie van HP ¹²⁹Xe rond het sedatieve herdoseringsschema om te voorkomen dat het dier wakker wordt tijdens een scan. Bewaak de lichaamstemperatuur tijdens het experiment.
4. Gegevensverzameling: Verzamel ventilatiebeelden.
   OPMERKING: Stappen 2.4, 2.5 en 2.6 voor gegevensverzameling kunnen in willekeurige volgorde worden uitgevoerd
   1. Stel de ventilator in volgens tabel 2 voor beeldvorming bij eindinspiratie.
   2. Laad de volgende installatieprotocollen: proton animal localizer, single pulse to centrer on gas frequency in the mouse lungs en ¹²⁹Xe animal localizer. Zie Tabel 4 voor scanparameters.
   3. Plaats het dier in het isocentrum en bevestig dat de borstholte zich in het midden van het gezichtsveld bevindt met protonlokalisatie. Als u spoelen met één frequentie gebruikt, vervangt u de protonspoel door een ¹²⁹Xe-afgestemde RF-spoel.
   4. Registreer ¹²⁹Xe-polarisatie en transporteer deze naar de MRI-scanner. Zie aanvullend bestand 4: QA-checklist voor xenonpolarisatie.
   5. Plaats een zak met ¹²⁹Xe in de beademingsbus en sluit deze af. Sluit de bus aan op lijn met de ventilator en laat de bus op druk komen (3 - 6 psig).
   6. Start ^{de mechanische ventilatie van 129}Xe. Elke keer dat ¹²⁹Xe-ventilatie wordt geactiveerd, laat het dier ~5 ademhalingen voltooien voordat u met een scan begint om de functionele restcapaciteit van de longen om te draaien.
      OPMERKING: Schakel over naar het N₂/O_2-mengsel tussen ¹²⁹Xe-scans om hypergepolariseerd gas te besparen.
   7. Pas met behulp van een enkele puls de werkfrequentie aan zodat deze overeenkomt met de in vivo resonantiefrequentie van gasvormig ¹²⁹Xe (~83.07 MHz bij 7 T). Kopieer de frequentie naar alle volgende gasfase ¹²⁹Xe-scans. Voer ¹²⁹Xe-lokalisatie uit om te bevestigen dat de longen zich in het isocentrum bevinden.
   8. Laad en voer de ¹²⁹Xe radiale ventilatiereeks uit. Bewaak de piek inademingsdruk.
      OPMERKING: Als het ¹²⁹Xe-gas op is voordat het protocol is voltooid, zal de piekinspiratoire druk snel afnemen. Een zak van 400 ml ¹²⁹Xe kan een muis van 30 g gedurende ~24 minuten ventileren bij ventilatie met 70% ¹²⁹Xe bij 80 ademhalingen per minuut met een ademvolume van 10 ml/kg ideaal lichaamsgewicht.
   9. Wanneer de scan is voltooid, schakelt u over op beluchten met het N₂/O_2-mengsel en verwijdert u de lege zak met ¹²⁹Xe.
   10. Voor beeldvorming aan het einde van de expiratie, wijzigt u de duur van het inhouden van de adem en de triggervertraging volgens tabel 2 en herhaalt u de stappen 2.4.2 - 2.4.9.
   11. Exporteer de onbewerkte gegevens van de scanner.

Protocol Afkorting Naam	Beschrijving van de sequentie	Trekker	TR (mevrouw)	TE (ms)	Herhalingen	Flip hoek (°)	Matrixgrootte of Nptn	Gezichtsveld (mm2)	RF BW (kHz)	Dikte plak/plaat (mm)	Duur van de scan
Enkele puls	Puls verwerven (gasfase)	Facultatief	1000		1	60	2048		10		1 s
Dieren localizer	2D GRE	Ja	50	1.7	1	60	642	322	3	25	jaren 60
Radiale ventilatie	3D Multi-echo radiaal	Ja	20	Zie bijschrift	1	30	613	223	32.05	30	16 minuten
Opgeloste fase enkele puls	Puls verwerven (opgeloste fase)	Nee	80		1	90	512		10.35		80 ms
Opgeloste fase dynamische specificatie.	Puls verwerven (opgeloste fase)	Nee	50		1000	90	512		10.5		jaren 50
Diffusie gewogen	2D GRE	Ja	12.2	8.1	4	45	642	322	3	1.5	18 minuten

Tabel 4: In vivo sequentieparameters. De eerder beschreven 3D multi-echo radiale ventilatiesequentie³⁹ verwerft beelden met 6 echo-keren. De resultaten worden getoond voor het eerste echobeeld (TE = 1,12 ms, figuur 7). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 4: QA-checklist voor xenonpolarisatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

5. Gegevensverzameling: voer dynamische spectroscopie in opgeloste fase uit.
   1. Stel de ventilator in volgens tabel 2 voor beeldvorming tijdens het inhouden van de adem. Stel de BR in op 100 ademhalingen/min. Bereid je voor op een nieuwe zak ¹²⁹Xe zoals in de stappen 2.4.2 - 2.4.5.
   2. Start ^{de mechanische ventilatie van 129}Xe. Laad en voer een enkele puls uit om de werkfrequentie aan te passen aan de opgeloste frequentie (~83.084 MHz bij 7 T). Kopieer de werkfrequentie naar de dynamische spectroscopie van de opgeloste fase.
      OPMERKING: Dit zal een enkele piek zijn bij muizen met wild-type hemoglobine⁵⁴.
   3. Laad en voer de dynamische spectroscopiereeks uit, gecentreerd op de opgeloste frequentie in de longen van dieren. Wanneer de scan is voltooid, schakelt u over op beluchten met het N₂/O_2-mengsel en verwijdert u de lege zak met ¹²⁹Xe. Exporteer de onbewerkte gegevens van de scanner.
6. Gegevensverzameling: Verzamel diffusiegewogen afbeeldingen.
   1. Stel de ventilator in volgens tabel 2 voor beeldvorming tijdens het inhouden van de adem. Bereid je voor op een nieuwe zak ¹²⁹Xe zoals in de stappen 2.4.2 - 2.4.7.
   2. Laad en voer de diffusiegewogen reeks uit. Wanneer de scan is voltooid, schakelt u over op beluchten met het N₂/O_2-mengsel en verwijdert u de lege zak met ¹²⁹Xe. Exporteer de onbewerkte gegevens van de scanner.

3. Afsluiting van het experiment

1. Dier herstellen.
   1. Trek de intubatiecanule recht uit de bek van het dier. Als het dier niet onmiddellijk spontaan begint te ademen, dien dan lichte borstcompressies toe. Indien beschikbaar, dien dan een lichte stroom zuurstof van medische kwaliteit toe in de buurt van het gezicht van het dier om het herstel van de sedatie te ondersteunen.
   2. Zodra het dier gestaag zelfstandig ademt en als het dier >2 uur verdoofd was, dien dan subcutaan 0,5 - 1 ml normale zoutoplossing toe om uitdroging te voorkomen.
   3. Zet het dier zelf terug in een kooi. Plaats de kooi in een broedmachine of op een verwarmingskussen.
      OPMERKING: Verdoofde dieren zijn kwetsbaar voor kannibalisme en kunnen niet in een kooi met kooigenoten worden geplaatst totdat ze volledig hersteld zijn (d.w.z. zelfstandig lopen). Verdoofde dieren kunnen hun lichaamstemperatuur niet regelen. Gebruik de rug van de hand om om de paar minuten de temperatuur van het dier te voelen.
   4. Houd het dier nauwlettend in de gaten totdat zijn oprichtreflex is teruggekeerd (d.w.z. het kan zelfstandig van rugligging naar buikligging gaan).
   5. Haal het dier uit de warmtesteun zodra het zelfstandig kan lopen. Breng het dier terug naar een kooi met zijn kooigenoten.
      LET OP: als het dier geen kooigenoten heeft, is het vatbaarder voor door sedatie veroorzaakte onderkoeling. Geef het dier extra strooisel en laat het dier, indien beschikbaar, een nacht in een couveuse staan.
   6. Noteer het gewicht van het dier eenmaal per week gedurende 2 weken om zijn gezondheid te controleren.
      OPMERKING: Als het dier door intubatie een verwonding aan de mond of slokdarm heeft opgelopen, kan het stoppen met eten. Als het dier >20% van zijn oorspronkelijke lichaamsgewicht verliest, raadpleeg dan een dierenarts over euthanasie.
2. Analyseer ventilatiebeelden (Figuur 7).
   1. Laad onbewerkte gegevens in een programmeerplatform. Download het open-source reconstructiekader voor niet-cartesiaanse afbeeldingen⁹¹.
   2. Reconstrueer afbeeldingen volgens de instructies van het open-source framework. Normaliseer het eerste punt op elke radiale projectie³⁹.
   3. Segmenteer het longparenchym in de afbeeldingen, inclusief voxels met een laag of geen ¹²⁹Xe-signaal. Neem geen grote luchtwegen mee. Segmenteer het achtergrondgeluid in de afbeelding, met uitzondering van longen, luchtwegen en beeldvormingsartefacten.
      OPMERKING: Het beeld van de protonlokalisator kan helpen bij het bepalen van parenchymale grenzen.
   4. Bereken de SNR met behulp van de formule:
      (3)
   5. Kwantificeer defecte ventilatie.
      OPMERKING: Er zijn verschillende methoden voorgesteld om verminderde ventilatie in modellen met kleine dieren te kwantificeren. Analysemethoden blijven een open onderzoeksgebied, maar eenvoudig te implementeren benaderingen zijn onder meer: (i) Semi-kwantitatieve handmatige segmentatie⁹², (ii) Histogrambenadering waarbij het signaal van de luchtpijp wordt gebruikt om parenchymaal signaal⁴⁷ te normaliseren, en (iii) Segmentatie van het totale longvolume (TLV) en het definiëren van een signaaldrempel (bijv. <60% van het hele longgemiddelde) om de longen te verdelen in defect volume en geventileerd longvolume (VV). Kwantificeer VDP ^93,94 volgens:
      (4)
3. Analyseer dynamische spectroscopie in opgeloste fase (Figuur 8).
   1. Laad onbewerkte gegevens in een programmeerplatform. Voer een snelle Fouriertransformatie uit en faseer de spectra (gelijktijdige handmatige, nul-orde fasering van spectra is voldoende voor deze toepassing.)
   2. Bereken standaard nucleaire magnetische resonantie (NMR) gegevens^95,96: SNR, volledige breedte half max, geïntegreerd gebied, chemische verschuiving en fase van beide pieken.
   3. Deel uit de magnitudegegevens de signaalamplitude van het opgeloste spectrum door die van het gasspectrum voor elke herhaling om de verhouding tussen opgelost gas en gas in de loop van de tijd te vinden.
4. Analyseer diffusiegewogen afbeeldingen (Figuur 9).
   1. Laad onbewerkte gegevens in een programmeerplatform. Segmenteer het longparenchym van het b_0-beeld zoals in stap 3.2.3. Bereken de SNR voor elk beeld met een b-waarde.
   2. Bereken de signaalwaarde-ruisverhouding, SVNR_0, door het signaal in elke voxel van het b_0-beeld te delen door de standaarddeviatie van de beeldruis. Sluit voxels met SVNR₀ < 2,5 keer de beeldruis⁹⁷ uit.
      OPMERKING: De SVNR₀ is een individuele voxelmetriek, terwijl de parenchymale SNR een metriek voor de hele long is.
   3. Bereken ADC door het signaalverval over de b-waarden (b_i) te passen volgens vergelijking 5^98,99:
      (5)

Resultaten

Ventilatie Afbeeldingen

Als de voorbereidings- en ventilatieprocedures voor dieren op de juiste manier worden geïmplementeerd, kan 3D radiale beeldvorming met succes ventilatiepatronen vastleggen wanneer gegevensverzameling wordt uitgevoerd bij inspiratie of expiratie (Figuur 7). Hoewel deze beelden over vele ademhalingen worden verzameld, is de hier beschreven methode vergelijkbaar met de beeldvormingsmethode met één ademhaling die bij mensen wordt gebruikt. Dit komt omdat alle lijnen van de k-ruimte op een bepaald moment tijdens de ademcyclus worden verzameld (bijvoorbeeld allemaal bij de eindinspiratie), waardoor cumulatief een beeld ontstaat dat representatief is voor een enkele inademing. Op deze beelden zijn de belangrijkste luchtwegen (luchtpijp en bronchiën) duidelijk zichtbaar, zijn er geen duidelijke beeldartefacten aanwezig en lijkt het longparenchym volledig opgeblazen met een hoge SNR (~15 of hoger, afhankelijk van de initiële polarisatie). Hoewel ze contra-intuïtief zijn, vertonen de afbeeldingen die bij inspiratie zijn verkregen (Figuur 7A, SNR = 15) een lagere SNR dan die verkregen bij de vervaldatum (Figuur 7B, SNR = 27). Dit heeft te maken met de bescheiden aandrijfdruk en langzame doorstroming die wordt gebruikt bij het ventileren van deze muis. Ter inspiratie: het HP-gas was nog niet volledig in het parenchym van de longen gespoeld, waardoor de ¹²⁹Xe (en dus het signaal) geconcentreerd was in grotere luchtwegen. Dit effect wordt visueel verergerd door k-ruimteschaling tijdens beeldreconstructie, omdat het hoge luchtwegsignaal het dynamische bereik van de gegevens domineert. Desalniettemin zou de analyse eenvoudig moeten zijn als het parenchym zo is gesegmenteerd dat de grote luchtwegen worden weggelaten.

Figuur 7: Representatieve 3D radiale ventilatiebeelden in een volwassen C57BL/6J-muis verkregen met behulp van eerder gepubliceerde methoden³⁹. Hoewel beide afbeeldingen een relatief hoge SNR hebben, hebben afbeeldingen bij (A) inspiratie een lagere SNR dan afbeeldingen bij (B) vervaldatum, grotendeels omdat het ¹²⁹Xe-gas nog niet de tijd had gehad om in de longen te spoelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is belangrijk om onderscheid te maken tussen pathologisch belemmerde ventilatie en andere oorzaken van een lage SNR. In Figuur 7A wordt geen ventilatieobstructie verwacht (d.w.z. lage VDP) omdat het dier een gezonde, wildtype muis was. Als de ventilatie zou worden belemmerd, zouden defecten meestal verschijnen als gebieden met een laag tot geen ¹²⁹Xe-signaal. Niet-pathologische oorzaken van een laag signaal zijn gewoonlijk:

(i)  Lage ¹²⁹Xe-polarisatie: Dit veroorzaakt een lage SNR in longparenchym en luchtwegen zonder begeleidende artefacten. Lage polarisatie kan doorgaans worden toegeschreven aan het onjuist volgen van polarisatieprocedures, depolarisatie tijdens transport of een te hoog_{O2-gasgehalte} in de HP ¹²⁹Xe-afgifteslang (bijv. van een onjuist gekalibreerd beademingsapparaat).

(ii) Intubatiecanule die te diep wordt ingebracht: Als de canule te diep in de luchtpijp wordt ingebracht, kan deze langs de linker- of rechterbronchiën afbuigen. Als het strak genoeg vastzit, kan het teugvolume van de hele long beperkt blijven tot slechts een paar lobben en luchtwegen, terwijl de rest van de long er geen ontvangt. Mocht dit gebeuren, dan kunnen de hyperopgeblazen lobben gewond raken en kan het nodig zijn om het dier te euthanaseren. Als alternatief kan de punt van de canule in direct contact komen met weefsel. In dit geval zal ¹²⁹Xe voornamelijk beperkt zijn tot het inwendige van de canule, wat resulteert in een helder signaal van een zichtbaar rechte buis en een minimaal signaal in het parenchym. In dit geval moet de positie van de canule onmiddellijk worden gecorrigeerd en moet het dier worden gecontroleerd op tekenen van angst (bijv. abnormale, afwezige of asynchrone borstkas

(iii) Intubatiecanule die te ondiep wordt geplaatst: Wanneer een bolus gas te oppervlakkig in de orofarynx wordt toegediend, kan de weerstand tegen die bolus die in de longen stroomt sterker zijn dan de weerstand tegen die bolus die rond de buitenkant van de canule en uit de mond stroomt. Dit kan resulteren in een slechte longinflatie. Tracheale SNR kan hoog zijn, terwijl parenchymale SNR laag zal zijn. Bewegingsartefacten kunnen aanwezig zijn als gevolg van gas dat door de luchtpijp stroomt tijdens het verzamelen van gegevens. Het karakter van het artefact is afhankelijk van het sequentietype (GRE, radiaal, enz.).

(iv) Onjuiste acquisitietiming: Als RF-pulsatie en data-acquisitie plaatsvonden tijdens perioden van inspiratoire of expiratoire gasstroom, zullen er meestal ernstige bewegingsartefacten aanwezig zijn - vooral bij gebruik van Cartesiaanse sequenties - en zal de parenchymale SNR laag zijn.

(v) Spontane ademhaling: Als het dier onvoldoende verdoofd is tijdens het verzamelen van gegevens, wordt de spontane ademhalingsbeweging asynchroon bovenop het mechanische ventilatiepatroon gelegd. Dit zal resulteren in variabele adem-tot-adem ¹²⁹Xe-afgifte, matige tot ernstige bewegingsartefacten en slechte parenchymale SNR. Het zorgvuldig bijhouden van de dosis en timing van het sedatieve middel is van cruciaal belang.

(vi) Sterfte van dieren: In zeldzame gevallen kunnen muizen overlijden (bijv. als gevolg van een verkeerde positie van de canule, onvoldoende O 2-toediening, een overdosis sedatieve middelen of ernstige experimentele pathologie). Als dit gebeurt, verstijft het longweefsel snel en zal het longparenchym slecht opblazen. De bovenste luchtpijp kan helder blijven, maar het longparenchym zal zeer weinig signaal hebben.

Spectroscopie van gasuitwisseling

Bij menselijke proefpersonen bieden spectroscopie-afgeleide parameters (bijv. signaalintensiteit, spectrale breedte, chemische verschuiving en fase) inzicht in de cardiopulmonale dynamiek en de ziektetoestand^52,53. In tegenstelling tot mensen⁸⁶, honden¹⁰⁰ en ratten^20.101, vertonen de hele longspectra van muizen die worden verkregen wanneer ¹²⁹Xe-magnetisatie beperkt is tot het longparenchym een enkele, brede, opgeloste faseresonantie die overeenkomt met ¹²⁹Xe opgelost in het capillaire membraanweefsel, bloedplasma en RBC's⁵⁴ (Figuur 8A, 197 ppm). Wanneer het door de bloedstroom naar meer distale weefsels wordt getransporteerd, produceert ¹²⁹Xe verschillende resonantiefrequenties van verschillende weefsels, waaronder vetweefsel⁵⁴, spieren, grijze stof en witte stof^102,103. Vanwege de relatief lange transittijden (enkele seconden) en de bescheiden oplosbaarheid¹⁰⁴ (Ostwald-oplosbaarheid = 0,1 - 0,3) zijn deze signalen echter doorgaans zwak en worden ze alleen waargenomen tijdens toegewijde, zorgvuldige experimenten. De uitzondering is ¹²⁹Xe opgelost in vetweefsel (Figuur 8A, 189 ppm). Uit deze weefsels kan binnen enkele seconden een ¹²⁹Xe-signaal verschijnen (bijvoorbeeld tijdens de eerste paar ademhalingen tijdens het opstellen van het dier). Bovendien kan de signaalintensiteit hoog zijn, omdat de oplosbaarheid van ^{Ostwald van 129}Xe bijna 20 keer groter is in vetweefsel dan in bloedplasma (d.w.z. respectievelijk 1,7 versus 0,094 bij 37 °C¹⁰⁴). De longitudinale relaxatietijden zullen naar verwachting ook relatief lang zijn (in vivo is T₁ ~20 s in lipiden¹⁰⁵ vs. 3-8 s in bloed¹⁰⁶). Als gevolg hiervan kan het ¹²⁹Xe-signaal van vetweefsel relatief hoog zijn in vergelijking met andere weefsels.

Vanwege de verschillende signaaldynamiek kunnen ¹²⁹Xe-spectroscopie-experimenten worden aangepast om vetweefsel te ondervragen (bijv. om bruine vetweefselthermometrie¹⁰⁷ te targeten) of gasopname in de longen door de juiste acquisitieparameters te selecteren. Wanneer ¹²⁹Xe-spectra uit de longen worden verkregen met de instellingen beschreven in tabel 4 (d.w.z. TR = 50 ms en een flip-hoek van 90° gecentreerd op de piek van de opgeloste fase), worden zowel gasfase- als opgeloste fasepieken waargenomen (Figuur 8A,B). Met name is het gasvolume in de muizenlong 2-3x hoger dan het weefselvolume, en de oplosbaarheid van ¹²⁹Xe in dit weefsel is slechts ~10%104,108,109,110,111^. Desondanks is de amplitude van het opgeloste signaal ongeveer 2-voudig groter dan die van de gasfase omdat de excitatie van de gasfase ver buiten resonantie is (~15 kHz bij 7 T; Figuur 8B, SNR = 102 vs. 43, respectievelijk). Daarom kan de 20 tot 30 keer grotere magnetisatiepool in de gasfase worden benaderd als een stabiel (d.w.z. niet-uitgeput) reservoir voor het signaal van de oplosfase tijdens statische delen van de ademcyclus.

Met een nieuwe inademing van magnetisatie om de ~600 ms en een TR van 50 ms, oscilleert de signaalintensiteit van zowel de gasfase als de opgeloste fase ¹²⁹Xe. Voor het gassignaal is dit toe te schrijven aan de verandering in het totale gasvolume (d.w.z. hoog bij inademing en laag bij uitademing). De situatie is complexer voor het opgeloste signaal omdat de magnetisatie van het brongas, T₂* en het capillaire bloedvolume kunnen fluctueren met de opblaastoestand. Als gevolg hiervan oscilleert de amplitudeverhouding van het opgeloste naar gassignaal ook ten opzichte van de ademcyclus (Figuur 8C, gemiddelde verhouding opgelost: gas = 1,9 ± 0,39).

Figuur 8: Representatieve dynamische spectroscopie in een volwassen C57BL/6J-muis. (A) Een enkel pulsspectrum toont signaal afkomstig van ¹²⁹Xe in de gasfase, opgelost in vetweefsel (189 ppm) en opgelost in zowel capillair membraan als bloedweefsel (197 ppm). (B) Dynamische spectroscopie die de in de tijd variërende signaalintensiteit van zowel opgelost als gasvormig ¹²⁹Xe aantoont (herhalingstijd = 50 ms). Om de visualisatie te vergemakkelijken, worden slechts vijf spectra weergegeven. Diagonale lijnen op de tijdas geven schaalbreuken aan. (C) De verhouding tussen de amplitude van het opgeloste en gassignaal over een interval van 2 s (overeenkomend met de rode schaalbreuk in paneel B vertoont een duidelijke variatie met de ademhalingscyclus (0,6 s per ademhaling). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hieronder volgt een lijst van factoren die de resultaten van de spectroscopie van ¹²⁹Xe-gasuitwisseling in gevaar kunnen brengen. In elk geval is het waarschijnlijke resultaat een lage SNR, waardoor de spectrale aanpassing en de resulterende metrieken (bijv. amplitudeverhouding opgelost naar gassignaal, chemische verschuiving, spectrale breedte en fase) onnauwkeurig kunnen worden.

(i) Verkeerde werkfrequentie: Vanwege het aanzienlijk hogere gasvolume en de lage oplosbaarheid in weefsel, zullen RF-pulsen die zijn gecentreerd op de gasfasefrequentie geen signaal van de opgeloste fase produceren. RF-pulsen moeten gecentreerd zijn op of in de buurt van de frequentie van de opgeloste fase.

(ii) Een te brede bandbreedte: De excitatiebandbreedte moet breed genoeg zijn om een deel van de gasfase ¹²⁹Xe te laten aanslaan om de verhouding van de signaalamplitude tussen opgelost en gas te meten. Maar als de bandbreedte te breed is, zal de excitatiepuls de magnetisatie in de gasfase vernietigen voordat deze in het weefsel oplost. Dit kan worden gezien als een zeer hoog gassignaal en een signaal van weinig tot geen opgeloste fase, ondanks dat de puls gecentreerd is op de frequentie van de opgeloste fase.

(iii) Niet-geoptimaliseerde TR: Om de signaaldynamiek tijdens een ademhaling te ondervragen, vereist de bemonsteringsstelling van Nyquist-Shannon dat het signaal wordt bemonsterd met een frequentie van minimaal tweemaal de frequentie (hier werden elke 50 ms 100 ademhalingen per minuut bemonsterd, of ~12x per ademhaling). Afhankelijk van de experimentele omstandigheden is verdere ondervraging van de dynamiek van het cardiopulmonale signaal met een snellere bemonsteringsfrequentie mogelijk. De resultaten van deze experimenten zijn afhankelijk van vele factoren, waaronder de excitatiebandbreedte, de ademhalingsfrequentie en de hartslag. De xenonuitwisselingstijd (d.w.z. de tijd voor xenon om op te lossen in weefsel; ~56 ms⁵⁴) en pulmonale transittijd (d.w.z. de tijd die nodig is om het bloed van de rechter- naar de linkerventrikel te laten stromen; ~830 ms voor een hartslag van ~436 slagen/min¹¹²) moeten ook in aanmerking worden genomen. Te vaak bemonsteren zal resulteren in de vroege vernietiging van magnetisatie en een laag signaal, maar het zal ook de invloed van de bloedstroom verminderen. Door minder vaak te bemonsteren, kan de magnetisatie verder oplossen en meer signaal opbouwen, maar het zal afhankelijker worden van de bloedstroom en minder gelokaliseerd worden in de gasuitwisselingsgebieden in de longblaasjes.

Diffusie-gewogen afbeeldingen

De diffusiegewogen beelden, die worden gebruikt om de grootte van het alveolaire luchtruim te kwantificeren, zijn rigoureus gevalideerd in kleine diermodellen door middel van traditionele histomorfometriemethoden ^98,113,114. Hier hebben we de discussie beperkt tot 2D, segmentselectieve beeldvorming om de scantijd en het gasverbruik te minimaliseren en tegelijkertijd overeen te komen met eerder gevalideerde protocollen⁹⁸. Een minimum van 2 beelden met een b-waarde is voldoende voor het berekenen van de ADC, en 4 of meer beelden met een b-waarde zijn nodig voor geavanceerde morfometrieberekeningen (zoals het gemiddelde lineaire snijpunt). De verkrijging van meerdere beelden met een b-waarde biedt een aanzienlijk voordeel door de nauwkeurigheid van de berekeningen te verbeteren. In tegenstelling tot het in beeld brengen van mensen tijdens een enkele ademinhouding, levert preklinische beeldvorming over vele ademhalingen een continu aangevuld signaal. Hierdoor is het mogelijk om veel beelden met een hoge SNR-b-waarde te verkrijgen, alleen beperkt door het beschikbare HP-gas en de duur van de sedatie bij dieren. Hier hebben we 7 beelden met een b-waarde verkregen, elk met SNR >15, met 400 ml ¹²⁹Xe-gas gedurende 18 minuten scantijd (Figuur 9). Het signaal in elk beeld vervalt met een verhoogde diffusiegradiëntsterkte (b-waarde). Dit signaalverval is evenredig met de ADC van de ¹²⁹Xe in de long. Grote luchtwegen kunnen worden onderscheiden van acinair weefsel door b₀- en b_{6-afbeeldingen} te vergelijken. In gebieden die anatomisch waarschijnlijk luchtwegen bevatten, zullen pixels erg helder lijken in de b_0-afbeelding, maar donker lijken in de b_6-afbeelding (rode pijlen, figuur 9). Deze pixels moeten worden uitgesloten van de analyse van longparenchym.

Afbeelding 9: Representatieve diffusiegewogen beelden in een volwassen C57BL/6J-muis. Grote luchtwegen (rode pijlen), waardoor ¹²⁹Xe vrij diffundeert terwijl ze verdund zijn met zuurstof, vertonen een verhoogde signaalverzwakking ten opzichte van het longparenchym. Dit resulteert in heldere luchtwegen in het b_0-beeld en luchtwegen met een laag signaal in het b_6-beeld . Muizen en ratten hebben vergelijkbare kleine ADC-waarden in vergelijking met mensen, maar de waarden zijn afhankelijk van biologische en experimentele factoren zoals leeftijd, ademvolume, druk en diffusieparameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De ADC van deze gezonde, volwassen, wildtype muis volgt het verwachte resultaat op basis van de literatuur, de leeftijd, SNR, acquisitieparameters en meer. Factoren die een nadelige invloed kunnen hebben op de precisie en nauwkeurigheid van de ADC-resultaten zijn onder meer:

(i) Lage SNR: Belangrijk is dat een lage SNR in de afbeeldingen de ADC-berekening vertekent in de richting van lagere waarden^99.115. Om deze reden sluiten we voxels uit met SVNR₀ < 2,5 keer de beeldruis⁹⁷.

(ii) Onjuiste segmentatie: Slechte segmentatie (bijv. het gebruik van signaaldrempels zonder visuele inspectie voor kwaliteitscontrole) kan de resultaten vertekenen. Als de afbeeldingen artefacten bevatten (zoals die veroorzaakt door beweging), kunnen ze de drempel overschrijden en ten onrechte worden gecategoriseerd als parenchym. Verder is het vooral belangrijk om pixels in de buurt van grote luchtwegen uit te sluiten, omdat gedeeltelijke volume-effecten hun ADC naar hogere waarden kunnen vertekenen.

(iii) Verkeerd gekalibreerde ventilator: Over het algemeen kan verdunning van ¹²⁹Xe met lichtere gassen (bijv. O₂ of N₂) de ADC naar hogere waarden verschuiven, dus ventilatie met bekende gasmengsels is noodzakelijk voor kwantitatieve vergelijkingen. Bij ventilatie met een ¹²⁹Xe/O_2-mengsel zal een verhoging van de zuurstofconcentratie vóór de toediening de T_1-relaxatie verhogen en de ¹²⁹Xe-magnetisatie in de gastoevoerslang verminderen, waardoor de SNR wordt verlaagd.

(iv) Derekhantering van de longen: Bij verdoofde en mechanisch geventileerde dieren kan na verloop van tijd alveolaire collaps (atelectase) optreden. Wanneer dit gebeurt tijdens ventilatie met constant volume, wordt hetzelfde ademvolume noodzakelijkerwijs herverdeeld over de longblaasjes die gerekruteerd blijven. Naarmate matige tot ernstige atelectase zich ontwikkelt, kan de rest van de long hyperopgeblazen raken, wat letsel en verhoogde ADC in die regio's veroorzaakt. Regelmatige rekruteringsmanoeuvres en PEEP voorkomen alveolaire collaps, voorkomen verminderde longcompliantie en minimaliseren het risico op longbeschadiging die de ADC-resultaten kan vertekenen.

(v) Slechte aanpassing van de gegevens: Er moet rekening worden gehouden met de methode van ADC-schatting. Log-lineair passen is het meest rekenkundig efficiënt, maar introduceert vertekening in beelden met een lage SNR. Daarom kan het het beste worden toegepast op beelden met een hoge SNR (>20). De gewogen lineaire methode vermindert deze vertekening en is geschikt voor afbeeldingen met SNR > 15. Bayesiaanse schatting kan schattingen van ADC opleveren met lage onzekerheid, zelfs met SNR <10, maar is rekenkundig duur⁹⁹.

(vi) Suboptimale diffusietijd: De optimale diffusietijd wordt beïnvloed door de maximale gradiëntsterkte van de MRI-scanner en de acinaire luchtwegstraal bij muizen (straal ~100 μm⁴⁹), die ongeveer drie keer kleiner is dan die bij mensen. Om optimale omstandigheden te garanderen, is de diffusietijd ingesteld om een diffusielengte te bereiken die groter is dan de gemiddelde alveolaire straal, maar kleiner dan de gemiddelde lengte van de alveolaire kanalen. De optimale diffusietijd voor de locatiespecifieke maximale gradiëntsterkte kan worden bepaald met behulp van de methoden die zijn beschreven door Sukstanskii en Yablonskiy⁴⁹. Het gebruik van een suboptimale diffusietijd kan leiden tot niet-lineaire dalingen in ¹²⁹Xe ADC, wat de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt.

(vii) Suboptimale b-waarden: Er is een afweging tussen het maximaliseren van de SNR en het maximaliseren van de contrast-ruisverhouding (CNR) die wordt gegenereerd over afbeeldingen met een b-waarde. Als CNR wordt opgeofferd door het gebruik van alleen lage b-waarden (d.w.z. diffuus signaalverval alsof alleen de eerste 3 b-waardebeelden in figuur 9 worden verkregen), dan zal de ADC-schatting onnauwkeurig zijn vanwege slechte aanpassing. Als de diffusieweging te sterk is, zal de resulterende SNR onvoldoende zijn en zal de ADC naar lagere waarden neigen.

Discussie

Hypergepolariseerde ¹²⁹Xe MRI is in opkomst als een geavanceerde en krachtige techniek om de microstructuur en functie van de longen te bestuderen in kleine diermodellen. Dit protocol is bedoeld als leidraad voor de eerste voorbereiding van de locatie en om experimentele procedures te beschrijven die nodig zijn om ventilatie, diffusie en gasuitwisseling in muizenlongen met HP ¹²⁹Xe te kwantificeren. Belangrijke voorwaarden voor experimenten zijn onder meer het vaststellen van een ¹²⁹Xe-gasfantoom en ervoor zorgen dat het dier een hoge gaspolarisatie krijgt. Dit laatste vereist een zorgvuldige planning van polarisatieparameters, het beperken van polarisatieverliezen tijdens gastransport (bijv. het bouwen van een magnetische draagtas) en het karakteriseren (en idealiter vermijden) van T_1-relaxatie binnen het randveld van de preklinische MRI-magneet^116,125. Parallel aan de ontwikkeling van de noodzakelijke HP ¹²⁹Xe-infrastructuur, is het absoluut noodzakelijk om robuuste protocollen en procedures voor het omgaan met dieren op te stellen. Deze omvatten effectieve sedatie om robuuste mechanische ventilatie mogelijk te maken, niet-schadelijke intubatie om longitudinale onderzoeken mogelijk te maken en ventilatiestrategieën die een evenwicht vinden tussen de noodzaak om hoge ¹²⁹Xe-magnetisatie te leveren en veilige en fysiologisch relevante ventilatieomstandigheden.

Tot op zekere hoogte zijn de hier beschreven methoden, procedures en resultaten afhankelijk van de specifieke hardware die wordt gebruikt (bijv. ventilator, polarisator en MRI-scannertype). Als er alternatieve apparatuur beschikbaar is, kunnen experimentele technieken relatief eenvoudig worden aangepast. Verder kunnen de dagelijkse kwaliteitsborgingsprocedures worden geoptimaliseerd (stap 1.2, figuur 4 en tabel 1). Nauwgezette registratie tijdens de ~30 minuten van QA is van cruciaal belang tijdens het opzetten van een nieuwe site. Het maakt vroegtijdige detectie van hardwareproblemen mogelijk en de mogelijkheid om ze uit te sluiten tijdens het oplossen van problemen. Zodra de dagelijkse variaties in QA-metrieken goed zijn gekarakteriseerd, kunnen de kalibratie van de fliphoek en de ~21-min QA-scan worden teruggeschroefd voor efficiëntie. Bovendien kan de algemene aanpak worden uitgebreid naar andere veel voorkomende kleine diersoorten (bijv. ratten en konijnen) door de anesthesiedoseringen, ventilatorinstellingen en acquisitieparameters aan te passen. De basisprotocollen kunnen worden gebruikt om ventilatorafhankelijke fysiologie te onderzoeken, zoals de impact van ademhalingsfrequentie, volume en PEEP-niveaus op gasuitwisseling of alveolaire rekrutering. Als longitudinale gegevens niet nodig zijn of als een longitudinaal onderzoek is voltooid, maakt de intubatiecanule bronchoalveolaire lavage of snelle longfixatie en oogst mogelijk voor conventionele analyses (bijv. histologie of morfometrische metingen). Bovendien strekt het potentieel voor wijziging van dit protocol zich uit tot MRI-sequenties en -parameters, die een dynamisch aspect van ¹²⁹Xe MRI-onderzoek vertegenwoordigen.

De plaatsing van een canule is van cruciaal belang voor de veiligheid van dieren en de beeldkwaliteit. Omdat de intubatiecanule niet stijf is aangebracht - bijvoorbeeld door rond de luchtpijp te hechten - kunnen relatief kleine verplaatsingen (bijv. bewegingen bij het aansluiten van fysiologische bewakingsapparatuur) de luchtdichte afsluiting met de luchtpijp verbreken. Deze luchtdichte afdichting is nodig voor rekruteringsmanoeuvres (~35 cm H₂O piek inspiratoire druk), die cruciaal zijn voor het behoud van de longcompliantie en het voorkomen van atelectase. Als de rekruteringsmanoeuvre de doeldruk niet bereikt, moet de onderzoeker de corrigerende strategieën afwegen in de context van de onderzoeksdoelen (bijv. diffusiegewogen beeldvorming versus ventilatiebeeldvorming; enkel tijdstip versus longitudinaal). Mitigatiestrategieën kunnen bestaan uit 1) het verwijderen van de canule en het opnieuw tuberen, 2) het aanpassen van de canulepositie om het contact met de tracheale wanden te vergroten terwijl deze nog steeds is ingebracht, en 3) doorgaan met het experiment zonder een gasdichte afdichting te verkrijgen. Vanuit het oogpunt van gegevensgetrouwheid is reïntubatie de meest robuuste optie, maar het kan tijdrovend zijn en leiden tot ongewenst ¹²⁹Xe-magnetisatieverval. Het aanpassen van de canulepositie gaat sneller, maar moet voorzichtig worden gedaan, omdat dit een groter risico op letsel met zich meebrengt. Het voortzetten van het experiment zonder RM's kan het beste worden gebruikt wanneer de muis gedurende <20 minuten wordt beademd om door atelectase veroorzaakte veranderingen in de longdynamiek te voorkomen¹¹⁷.

Naast de voor de hand liggende behoefte aan veilige omgang met dieren, is de sleutel tot het ontwikkelen van een robuust en betrouwbaar HP ¹²⁹Xe muis-MRI-programma - en tot het oplossen van de uitdagingen - nauwgezette registratie. Voor de productie van de HP ¹²⁹Xe is het raadzaam om het laservermogen, de accumulatietijd, het debiet en de polarisatie bij te houden. Tijdens fantoombeeldvorming en spectroscopie is het het beste om de SNR-beeld, de piekpositie, de spectrale lijnbreedte en het RF-vermogen dat nodig is om een puls van 90° te verkrijgen, vast te leggen. Voor in vivo beeldvorming moeten vergelijkbare QA-gegevens worden geregistreerd, samen met fysiologische monitoringparameters (piekinspiratoire druk, lichaamstemperatuur, enz.) en een gedetailleerde tijdlijn van gebeurtenissen in de omgang met dieren. Een paar belangrijke apparaten kunnen het oplossen van problemen met ventilatoren gemakkelijker maken. Deze omvatten een O_2-sensor , een spirometer voor kleine dieren en een manometer om ventilatie en PEEP-druk te kalibreren. Een oscilloscoop en voltmeter kunnen helpen bij het bevestigen dat de timing van de ventilator nauwkeurig is en is afgestemd op de opening van de MRI-scanner. Ten slotte is een draagbare gaussmeter onmisbaar voor het bevestigen van de integriteit van een magnetische draagtas als deze nodig is voor transport. Met betrekking tot het oplossen van problemen met MRI-sequenties, wordt aanbevolen om zowel het gasfantoom te gebruiken dat in dit protocol wordt beschreven als een spuit gevuld met HP-gas. Het gebruik van een spuit met HP ¹²⁹Xe-gas is bijzonder nuttig voor het oplossen van problemen met diffusiegewogen sequenties, omdat de nauwkeurigheid van de gegevens kan worden beoordeeld op basis van de vraag of deze een bekende grondwaarheid weerspiegelen: de vrije diffusiecoëfficiënt van zuiver ¹²⁹Xe in de spuit.

Bij de toepassing van dit protocol moet rekening worden gehouden met een aantal beperkingen. Ten eerste is het afhankelijk van gespecialiseerde apparatuur en expertise, wat de toegankelijkheid voor nieuwe locaties vermindert. Met de recente goedkeuring van de regelgevende instanties voor klinisch gebruik in de VS wordt echter verwacht dat het aantal locaties dat is uitgerust met ¹²⁹Xe MRI-mogelijkheden zal toenemen. De techniek wordt ook beperkt door inherente beperkingen van gehyperpolariseerd gas, waaronder een relatief korte polarisatielevensduur en de noodzaak van snelle gegevensverzameling. Het gebruik van een mechanische ventilator verbetert doorgaans de SNR van het beeld en vermijdt intrinsiek bewegingsartefacten, maar het maskeert de natuurlijke ademhalingsdynamiek die kan worden vastgelegd door gebruik te maken van een apparaat voor de afgifte van vrij ademend gas. Bovendien moeten bevindingen van kleine diermodellen die dit protocol gebruiken, voorzichtig worden geïnterpreteerd bij extrapolatie naar de menselijke fysiologie, gezien de aanzienlijke variaties in soorten. Een andere beperking is de uitdagende aard van orale intubatie en mechanische beademing, die moeilijk zijn bij muizen met een gewicht van minder dan 25 g. Dit kan mannen jonger dan ~8 weken en vrouwen jonger dan ~20 weken uitsluiten, tenzij speciale apparatuur en procedures worden gebruikt. De meest in het oog springende beperking van dit protocol is de afwezigheid van pulsprogrammering en geavanceerde beeldreconstructietechnieken. Het opnemen van dergelijke methoden in een algemeen protocol is onpraktisch vanwege hun ingewikkelde technische details en gespecialiseerde kennis. Ten slotte beschrijft dit protocol kwantitatieve basismetingen zoals SNR, VDP en ADC, maar geen meer geavanceerde maatregelen zoals regionale fractionele ventilatie, diffusiemorfometrie en beeldvorming van gasuitwisseling. Deze geavanceerde metrieken zullen gemakkelijker kunnen worden geïmplementeerd zodra de hier beschreven basisinfrastructuur is opgezet.

Hoewel HP ¹²⁹Xe gas MRI van kleine dieren arbeidsintensief en experimenteel uitdagend is, heeft het het potentieel om preklinisch longonderzoek aanzienlijk vooruit te helpen. Het biedt een minimaal invasieve en gevoelige manier om regionale ventilatie, alveolaire luchtruimgrootte en gasuitwisselingsdynamiek te kwantificeren. Als zodanig kan het een uniek middel bieden om longfysiologie, ziekteprogressie en therapeutische interventies in de loop van de tijd te beoordelen. Het vertegenwoordigt daarom een verbetering ten opzichte van traditionele preklinische technieken, waaronder histologie, biochemische analyses, ioniserende beeldvormingsmodaliteiten en invasieve longmechanische metingen. Bovendien blijft ¹²⁹Xe MRI voor kleine dieren een zich actief ontwikkelend deelgebied van onderzoek, en het balanceren van de relevante beeldvormingsfysica met preklinische vereisten vertegenwoordigt op zichzelf al aanzienlijke onderzoeksmogelijkheden. Ten slotte, naarmate klinische ¹²⁹Xe MRI op grotere schaal wordt geaccepteerd en klinisch wordt gebruikt, zullen de mogelijkheden voor translationele studies van muis naar mens en terug in de loop van de tijd blijven groeien.

Aanvullende afbeelding 1: Een schakelschema voor de magnetische draagtas. Een solenoïde van geëmailleerd koperdraad, L1, is parallel verbonden met V1, een 12 volt oplaadbare verzegelde loodzuuraccu. De weerstand van weerstand R1 kan worden geselecteerd om de stroom via V1 en L1 te regelen. Een LED-lampje voor paneelindicatoren, R2 en D1, is ook parallel geschakeld met V1. Een aan-uitschakelaar, S1, is in serie geschakeld met V1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Kalibratieresultaten van de beademingsapparatuur voor stikstof. Het volume van 30 ademhalingen werd gemeten in drievoud. Een lineaire regressie werd uitgevoerd om de aandrijfdruk te bepalen die nodig is om relevante gasvolumes te produceren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Spiekbriefje voor de instellingen van de ventilatordruk. De helling en het snijpunt van de lineaire regressie van elk gas worden gebruikt in vergelijking S1. Deze vergelijking werd gebruikt om de aandrijfdruk te bepalen die nodig is om een ademvolume van 10 ml/kg ideaal lichaamsgewicht te produceren voor gasmengsels van 70% N₂ + 30% O₂ en 70% ¹²⁹Xe + 30% O₂ voor relevante diergewichten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL spuit	fisher scientific	Catalog No.14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464
10 mL graduaalcilinder	Cole-Parmer	UX-34502-69	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-essentials-graduated-cylinder-glass-hexagonal-base-10-ml-2-pk/3450269?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1&gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7h3do -ssjascARuVviKd7V7kC5ztdIB6 _70DnMr-K3qk9RKeJ7-IrhoCeT 0QAvD_BwE
18 G - veneuze PFTE katheters (niet steriel)	Terumo Surflo	SROX1832CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-18-x-1-25inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google&utm_medium=google_ shopping&gad_source=1&gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 4oTvZkAgWQCda6ocVtQlulVrG 2536FNbu5soMVSFN8xK_g1Uh pXIRoCGwoQAvD_BwE
20 G - veneuze PFTE katheters (niet steriel)	Terumo Surflo	SROX2051CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-20-x-2inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source =google&utm_medium=google_ shopping&gad_source=1&gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 87ggCkgToD_XF_UgpQBTpmN dgSNfCml6TkDKlW8k27Dq_daR itPuhoCnBQQAvD_BwE
22 G - veneuze PFTE katheters (niet steriel)	Terumo Surflo	SROX2225CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-22-x-1inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google&utm_medium=google_ shopping&gad_source=1&gclid =CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEso W9IM6mpee6m7e-lBfR8dZhSN KYbMUs7qgEU4gYCRTW_rJAs W_lGkthoCm30QAvD_BwE
400 mL Tedlar-zakken	Jensen Inert Products	GST-001S-3507TJC	NA
60 mL spuit	fisher scientific	Catalog No.14-955-461	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955461
70% alcohol	Cole-Parmer	UX-80024-34	https://www.coleparmer.com/i/labchem-isopropyl-alcohol-70-v-v-500-ml/8002434?PubID=UX&persist=true&ip= no&gad_source=1&gclid=CjwKC AiA6KWvBhAREiwAFPZM7gGh p8g7MBHBBKadaRCAwfEMgV gna5fhYRsuXIuqoqOiToCC4fem nhoCGMEQAvD_BwE
Dewar voor vloeibare stikstof	Terra Universal	4LDB	https://www.laboratory-equipment.com/tw-4ldb-liquid-nitrogen-dewar-ic-biomedical.html?srsltid=AfmBOooxwMtOA1Z2TweR P8V5Iy5EvYT3alZuzoiY 3UF3Ib9RgFnDxVTfWP0
Oogsmeer	Refresh	REFRESH P.M.	https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-pm
Vezeloptische verlichting	AmScope	HL250-AY	https://amscope.com/products/hl250-ay?tw_source=google &tw_adid=&tw_campaign= 16705014684&gad_source= 1&gclid=CjwKCAiA6KWvBhA REiwAFPZM7p-DpyvHJaGxR pAD1385hzGf1oPdKHHLFDR Sp8yrtxry11SNJeJnKxoCtAoQ AvD_BwE
Gaussmeter	Apex Magnets	GMHT201	https://www.apexmagnets.com/magnets/accessories/ht-digital-gaussmeter-with-peak-hold-can-display-gauss-or-tesla
Glasvat (phantom)	Ace Glass	8648-24	https://aceglass.com/results.php?t=8648-24&t=8648-24
Verwarmingskussen	Office Depot	9206211	Pure Enrichment PureRelief Express Designer Series Heating Pad 12 x 15 Palm Aqua - Office Depot
Hyperpolarisator	Polarean	9820	https://polarean.com/xenon-mri-platform/
Intubatieblok	Hallowell EMC	000A3467	https://hallowell.com/product/rodent-tilting-workstand/
Intubatiemateriaal	De onderdelenlijst is elders gepubliceerd	NA	https://app.jove.com/t/50318/a-simple-method-of-mouse-lung-intubation
Isotopenverrijkte xenoncylinder	Linde Isotopes	XE-129(1%)N2(10%)HE CGMP 302SZ	NA
Vloeibare stikstof	Linde	NI LC160-22	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_liquid _lc160_22_psi_ni_lc160_22 /ni-lc160-22?cat_id=shop&node=b89
Mannelijke slip luer