Methodenartikel

Toepassing van DNA-barcodering om geneeskrachtige planten te identificeren

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66925

⸱

1 november 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van DNA-barcoderingstechnologie om plantaardige medicinale materialen te authenticeren, en de medicinale plant Angelica sinensis (Oliv.) Diels werd als voorbeeld aangewezen.

Samenvatting

Geneeskrachtige planten zijn wereldwijd waardevolle hulpbronnen en worden wereldwijd gebruikt om de gezondheid te behouden en ziekten te behandelen; De aanwezigheid van vervalsing belemmert echter hun ontwikkeling. DNA-barcodering, een techniek voor soortidentificatie aan de hand van standaard DNA-regio's, maakt een snelle en nauwkeurige identificatie van traditionele geneeskrachtige planten mogelijk. Het proces van DNA-barcodering omvat zes basisstappen: 1) het verwerken van de geneeskrachtige planten, 2) het extraheren van hoogwaardig totaal DNA uit de geneeskrachtige planten met behulp van de centrifugaalkolommethode, 3) het amplificeren van het interne getranscribeerde afstandsstuk 2 (ITS2) van het doelgebied met universele primers van planten en het uitvoeren van Sanger-sequencing, 4) het splitsen en uitlijnen van de sequentie om de doelsequentie te verkrijgen, 5) het matchen van de barcodesequentie met de barcodebibliotheek voor identificatie, 6) het uitlijnen van de sequentie, het vergelijken van intraspecifieke en interspecifieke variatie, het construeren van fylogenetische buur-verbindende boom. Zoals te zien is in de resultaten, kan de universele primer het doelgebied versterken. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) toont aan dat het geïdentificeerde percentage 100% was, en de buur-verbindende boom toont aan dat de splicing-sequenties waren geclusterd met de A. sinensis OR879715.1-clade en dat de clade-ondersteuningswaarde 100 is. Dit protocol biedt een referentie voor het toepassen van DNA-barcoderingstechnologie als een effectieve methode om geneeskrachtige planten en versnijdingsmiddelen te identificeren.

Inleiding

Geneeskrachtige planten hebben een breed scala aan farmacologische effecten en zijn belangrijke stoffen voor de behandeling en preventie van ziekten. De marktvraag naar geneeskrachtige planten in kruidengeneesmiddelen en farmaceutische producten is enorm en groeit nog steeds. Met de toenemende markt voor medicinale planten heeft het probleem van vervalsing de ontwikkeling van medicinale planten belemmerd. Momenteel lijdt vervalsing van medicinale planten onder de volgende redenen: 1) de vergelijkbare morfologie van medicinale planten maakt het moeilijk om ze te identificeren en correct te gebruiken 1,2,3,4,5, 2) de toenemende vraag naar medicinale planten heeft geleid tot onvoldoende aanbod op de markt 6,7, 3) geneeskrachtige planten zijn duur en hebben fluctuerende prijzen, en het gebruik van goedkope kruiden in plaats van economisch waardevolle materialen heeft geleid tot vervalsing en marktwinsten 8,9. Om de problemen van de juiste identificatie en het juiste gebruik van geneeskrachtige planten op te lossen, is er behoefte aan een technologie waarmee niet-specialisten de bron kunnen identificeren10.

Er zijn beperkingen aan het correct identificeren en gebruiken van geneeskrachtige planten alleen op basis van uiterlijk en geur11. Voor een nauwkeurigere identificatie en kwaliteitscontrole worden fysisch-chemische methoden gebruikt12. Dunnelaagchromatografie (TLC) is bijvoorbeeld een snelle methode voor het identificeren van geneeskrachtige kruiden en is opgenomen in de Chinese farmacopee. Niettemin zijn er referentienormen nodig om de planten te identificeren13. High-performance vloeistofchromatografie (HPLC) kan zowel kwalitatieve als kwantitatieve tests uitvoeren, waardoor het geschikt is voor het testen van de kwaliteit van medicijnen. Dit instrument is echter duur en vereist gespecialiseerde kennis om14,15 te bedienen. DNA-barcodetechnologie is een snelle en nauwkeurige soortidentificatietechnologie die soorten identificeert door stabiele DNA-sequenties te gebruiken om onderscheid te maken tussen planten met een vergelijkbare morfologie. Hebert et al. stelden DNA-barcoderingstechnologie voor om soorten te identificeren, die gebruik maakt van een erkende en relatief korte DNA-sequentie binnen het genoom16, Chen et al. stelden ITS2 voor als een universele sequentie voor de moleculaire identificatie van geneeskrachtige planten en identificeerden meer dan 6600 planten en vonden een hoog identificatievermogen17. De studie van geneeskrachtige planten op basis van ITS2- en chloroplast-genfragmenten heeft aangetoond dat het in staat is om soorten op soortniveau te onderscheiden, met toepassingen op het gebied van bescherming van hulpbronnen, marktregulering en internationale handel 17,18,19. De toepassing van DNA-barcodering kan de beperkingen van traditionele identificatiemethoden overwinnen, wat nuttig is om de kwaliteit en veiligheid van geneeskrachtige planten te waarborgen en misbruik van hulpbronnen en verwarring te voorkomen20. Het is nuttig gebleken voor het bestuderen van geneeskrachtige planten, het ondersteunen van de groei van de kruidenindustrie op een duurzame manier en het bieden van een garantie dat de consument de juiste medicatie gebruikt 21,22,23,24.

Het artikel schetst protocollen voor het toepassen van DNA-barcodering om geneeskrachtige planten te identificeren, met A. sinensis als voorbeeld. DNA-barcodering maakt gebruik van een of meer gestandaardiseerde korte genetische markers in het DNA van een organisme om het te herkennen als behorend tot een bepaalde soort. De huidige methoden voor het identificeren van geneeskrachtige planten hebben bepaalde beperkingen. Traditionele morfologische identificatie is sterk afhankelijk van de uitgebreide ervaring van experts, die kan worden beïnvloed door menselijke factoren, terwijl chemische identificatie vatbaar is voor problemen zoals vervalsing van belangrijke verbindingen. DNA-barcodering daarentegen biedt een nauwkeurigere manier om soorten te identificeren, met voordelen zoals snelheid, hoge reproduceerbaarheid en stabiliteit. Bovendien maakt deze technologie gecentraliseerd beheer en het delen van bestaande soortsequentiegegevens mogelijk via internet en informatieplatforms, waardoor de efficiëntie en betrouwbaarheid van de soortidentificatie aanzienlijk wordt verbeterd11,12. Vanwege hun vergelijkbare morfologie en geneeskrachtige delen wordt A. sinensis vaak verward met andere soorten en wordt het vaak misbruikt of opzettelijk vervangen op de markt25. Yang et al. identificeerden A. anomala met behulp van DNA-barcodering om het te onderscheiden van valse medicijnen26. Yuan et al. verzamelden 23 soorten engelwortel en gebruikten DNA-barcodering om onderscheid te maken tussen de verschillende soorten27. Door de procedures te volgen die in dit protocol worden beschreven, kunnen gebruikers plantaardig medicinaal materiaal authenticeren, van de voorbewerking tot het uiteindelijk matchen van de streepjescodevolgorde met de barcodedatabase (Figuur 1).

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

  1. De huidige studie gebruikte de twee jaar oude A. sinensis met lage temperatuur en lange zonneschijn op een hoogte van 2800 m van Min County, in de provincie Gansu, als experimenteel materiaal. Er werden drie planten geselecteerd, waarvan meer dan drie wortels werden geselecteerd voor experimenten. Spoel de wortels eerst af met gesteriliseerd water en maak ze vervolgens schoon met een alcoholsproeier of alcoholdoekjes om besmetting te voorkomen die de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten zou kunnen beïnvloeden. Snijd de wortels met een gesteriliseerde scalpel in stukken kleiner dan 5 mm en meng voor verdere analyse. (Figuur 2).
    OPMERKING: U kunt de wortels ook in vloeibare stikstof plaatsen om ze knapperig te maken, zodat ze gemakkelijker te breken zijn. Afhankelijk van de vorm, hardheid en andere kenmerken van de geneeskrachtige planten, gebruik instrumenten om ermee om te gaan.
  2. Bereid drie buisjes met experimentele monsters voor op parallelle experimenten. Label elk monster als AS-1, AS-2 en AS-3. Neem ongeveer 100 mg vers of 20 mg droog gewicht tissue (aan de lucht gedroogd) en plaats het in een centrifugebuisje van 2 ml.
  3. Plaats twee roestvrijstalen kralen van 5 mm in de centrifugebuisjes van 2 ml. Breng de buizen over naar een tissuegrinder met hoge doorvoer die gedurende 60 s op 60 Hz werkt.

2 DNA-extractie uit monster

OPMERKING: Deze studie maakt gebruik van een Plant Genomic DNA Extraction Kit, die is gebaseerd op de CTAB-methode. DNA-extractie wordt uitgevoerd volgens de gebruiksaanwijzing met enkele aanpassingen, waaronder de toevoeging van een unieke Nuclear Isolation Buffer (NIB). Het protocol verbetert de DNA-zuiverheid door eerst de verontreinigingen van het weefsel te scheiden en vervolgens een eerste kernisolatiestap 28,29,30 toe te voegen.

  1. Voeg 800 μL voorgekoelde NIB toe en plaats het monster op een vortexmixer, terwijl u 5 minuten trilt.
  2. Plaats in een centrifuge en verwerk gedurende 10 minuten op 13.780 x g . Verwijder het supernatant.
  3. Herhaal stap 2.1-2.2 voor nog eens 3 ronden.
    OPMERKING: NIB extraheert DNA van hogere kwaliteit en het preparaat bevat enkele gevaarlijke chemicaliën die in een zuurkast moeten worden gehanteerd, waardoor het voor beginners moeilijker te hanteren is. Deze stap is echter niet verplicht. Gebruikers kunnen ervoor kiezen om deze aanbeveling op te volgen of deze stappen over te slaan. De gedetailleerde formulering is opgenomen in tabel 1.
  4. Voeg 600 μL Buffer P1 en 5 μL RNase A (10 mg/ml) toe. Plaats het monster op een vortexmixer en vortex om te mengen. Incubeer de monsters in een waterbad bij 65 °C gedurende 1,5 uur, waarbij de buisjes tijdens de incubatie 2x-3x worden omgekeerd.
  5. Voeg 200 μL Buffer P2 toe, meng grondig, leg 15 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 13.780 x g .
  6. Zuig het supernatans voorzichtig op een filterkolom AF, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.780 x g en breng het onderste filtraat dat in de verzamelbuis is opgevangen over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
  7. Bereken het volume van het filtraat, voeg 1,5x het volume van P3 toe en schud onmiddellijk om een gemengde oplossing te krijgen.
  8. Voeg 650 μL van het bereide mengsel toe aan een adsorptiekolomadsorptiekolom (AC) en incubeer gedurende 5 minuten, centrifugeer vervolgens bij 13.780 x g gedurende 30-60 s.
  9. Voeg het filtraat verkregen uit stap 2.8 opnieuw toe aan de AC, centrifugeer en gooi de afvalvloeistof weg. Herhaal de procedure met de resterende gemengde oplossing uit stap 2.7.
  10. Voeg 600 μL spoeloplossing WB toe, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.780 x g , gooi de afvaloplossing weg en herhaal de procedure 1x.
  11. Plaats de kolom AC terug in de lege opvangbuis, centrifugeer gedurende 2 minuten op 13.780 x g en laat op kamertemperatuur staan om de resterende ethanol te verwijderen.
  12. Neem de adsorptiekolom AC en plaats deze in een schone centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 45 μL gesteriliseerd gedeïoniseerd water (ddH2O) toe aan het midden van het adsorbensmembraan, dat is verwarmd tot 65 °C. Laat 5 minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer op 13.780 x g gedurende 2 min.
  13. Voeg de resulterende oplossing weer toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur bij 13.780 x g .
  14. Verzamel de gefilterde oplossing. Gebruik een spectrofotometer om de DNA-concentratie te bepalen; OD260 vertegenwoordigt de absorptie van nucleïnezuren. Gebruik de volgende criteria voor de standaard voor DNA-kwaliteitsbepaling: OD260/OD280=1.80-2.00, het normale bereik; OD260/OD280>2.00; er is een grote hoeveelheid RNA-besmetting; OD260/OD280<1.80, er zijn eiwitten, fenolen en andere verontreinigingen.

3 Versterking en detectie van doelfragmenten

OPMERKING: Selecteer de juiste amplificatieprimers op basis van de door de plant voorgestelde DNA-barcoderingsregio's van de plant; De reactiecondities zijn weergegeven in tabel 2.

  1. Stel de reactiecondities in die overeenkomen met primerversterking. Gebruik centrifugebuisjes van 0,2 ml gevuld met 9,5 μl ddH2O, 12,5 μl 2x PCR Master Mix en 1 μl forward primer, reverse primer en template DNA voor een totaal volume van 25 μl. Bereid een negatieve controle voor en vervang de sjabloon door water.
  2. Voeg 20 ml 1x Tris-acetaat-EDTA (TEA)-buffer en 0,2 g agarose toe om te verwarmen en een 1% agarosegel te bereiden, voeg vervolgens 2 μL nucleïnezuurgelkleuring toe (10.000x) en meng grondig. Giet het mengsel in een gelgietvormig bakje en laat het stollen om de agarosegel te verkrijgen. Voeg 3 μL van het PCR-product en 2 μL DNA-marker 5000 bp toe aan de gel.
  3. Stel de spanning in op 120 V, de stroom op 400 mA en elektroforese gedurende 40 minuten. Gebruik een veelzijdig gelbeeldanalysesysteem om gels te bekijken en de resultaten te controleren.

4. Gegevensverzameling en -analyse

OPMERKING: Er is een breed scala aan software voor sequentieassemblage en -analyse; we gebruiken Codon code Aligner V11.0.1 en MEGA11 als voorbeelden ter illustratie.

  1. Gebruik de aligner om het sequentiebestand te openen om de piekkaart te observeren en de bidirectionele sequencing-piekkaartbestanden te splitsen.
    1. Selecteer Een nieuw project maken en klik op OK om naar de startpagina van de software te gaan. Selecteer Monsters toevoegen in het menu Bestand, selecteer het bestand dat moet worden verwerkt als sequentietraceringsindeling en importeer het rechtstreeks in de software als het geïmporteerde bestand bij Niet-geassembleerde monsters.
    2. Kies Contig, kies vervolgens in de sectie Geavanceerde assemblage en kies vervolgens Assembleren in groepen. Nieuwe gebruikers krijgen na het selecteren van Assembleren in groepen dit dialoogvenster te zien: Kies Namen definiëren. Wijzig de Definieer voorbeeldnaam onderdelen volgens de bestandsnaam en klik op Assembleren. De uitgelijnde volgorde wordt weergegeven.
    3. Haal de volledige ITS2-sequenties op volgens de op verborgen Markov model (HMM) gebaseerde modelanalyse. Gebruik de sequenties 5.8s (CGAGGGCACGCCTGGGGCGTCA) en 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGCCCCACC) sequenties31 om de uitgelijnde sequentie vanaf het begin te zoeken om de 5.8s- en 28s-regio's te verwijderen.
    4. Selecteer Ga, selecteer vervolgens in de sectie Zoekvolgorde en klik op OK om de overeenkomende reeks op te halen. Kies Contig, kies Verwijderen in de sectie om de 5.8s- en 28s-regio's en de sequenties van lage kwaliteit te verwijderen, en vervolgens zal de software de splicing-sequenties uitvoeren voor matching.
  2. Gebruik de splicingsequenties die zijn verkregen uit de drie parallelle experimentele stappen voor identificatie, selecteer BLAST-zoekopdracht met behulp van de nucleotidedatabase bij The National Center for Biotechnology Information (NCBI) en selecteer de Species Identification Tool en de Specific Primer ITS2 die overeenkomen in de Global Pharmacopoeia Genome Database (GPGD) -database.
    OPMERKING: NCBI32 en GPGD33 omvatten de nucleotidesequenties van geneeskrachtige planten en dieren en worden erkend als gezaghebbende databases. Hun belangrijkste identificatiemethoden zijn de methoden op basis van sequentievergelijking34 (BLAST). De procentuele identiteit uit de identiteitsresultaten wordt gebruikt om te bepalen of de soort met de grootste gelijkenis het doelgeslacht is.
  3. Gebruik MEGA11 voor sequentie-uitlijning, analyseer en vergelijk intraspecifieke en interspecifieke sequentievariatie en construeer een fylogenetische buur-verbindende boom.
    1. Download de sequenties van drie soorten engelwortel en één soort Peucedanum praeruptorum als een out-group van NCBI. Analyseer deze sequenties samen met de verkregen resultatensequentie.
    2. Klik op Bestand, kies Open een bestand/sessie om het bestand te importeren en er verschijnt een dialoogvenster. Kies Align > DNA en selecteer Align by ClustalW voor sequentievergelijking. Kies Fylogenetische analyse in Gegevens en keer terug naar de startpagina. Klik op Constructeur/Test Neighbor-Joining Tree in PHYLOGENY. De software genereert een fylogenetische boom.

Resultaten

Monster DNA-kwaliteit

Het bereik van OD260/OD280 absorptieverhoudingen was 1,80-1,84. De DNA-hoeveelheid gemeten met een spectrofotometer voor elk monster was groter dan 100 ng/μL (tabel 3), wat wijst op een goede kwaliteit van de DNA-extractie van het monster. Dit geeft aan dat de monsters tijdens het extractieproces niet besmet waren met eiwitten, RNA of reagentia en dat ze van goede kwaliteit waren en geschikt voor downstream PCR-amplificatie.

PCR-analyse

Gelelektroforese werd uitgevoerd op het PCR-product van de drie parallelle experimentele monsters. De opstelling was: Marker, monsters 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) en negatieve controle (0), zoals weergegeven in figuur 3. De maten van AS-1, AS-2 en AS-3 liggen allemaal tussen 500 bp met enkele, heldere, heldere banden, en er zijn geen banden in de 0, wat aangeeft dat het geëxtraheerde DNA werd geamplificeerd tot 500 bp met behulp van ITS2-primers.

Databasevergelijking van sequentieresultaten

De sequentieresultaten identificeerden A. sinensis met 100% sequentiegelijkenis door de BLAST-identificatieresultaten van de NCBI-database te combineren, wat hetzelfde is als de soortidentificatieresultaten van de GPGD-database (tabel 4). Het BLAST-resultaat werd bepaald aan de hand van de hoogste identiteitsscore en de laagste e-waarde. Soortidentificatie werd als succesvol beschouwd wanneer het hoogste maximale percentage identiteit een enkele soort omvatte en >99% scoorde. Als een score ≤ 99% is, controleer dan de kwaliteit van het sequencingbestand of dat het PCR-product besmet is.

Fylogenetische boomgebaseerde analyse van soortidentificatie

De resultaten toonden aan dat in de geconstrueerde NJ-fylogenetische boom alle vier de soorten in afzonderlijke clades waren geclusterd en dat de P. praeruptorum als een outgroup was gescheiden van de Angelica-clades . De Splicing-sequenties waren geclusterd met de A. sinensis OR879715.1-clade, en de clade-ondersteuningswaarde (bootstrap) was 100, en vervolgens werden de andere twee soorten, A. dahurica en A. cartilaginomarginata , elk geclusterd in een aparte clade, wat bewijst dat de Splicing-sequenties A. sinensis waren (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Stroomschema voor de identificatie van medicinale plantensoorten. (A) Procesplant, extractie-DNA en sequentiebepaling van medicinale plant, (B) vergelijking van soortensequentie met behulp van databases, en (C) gebruik van fylogenetische bomen voor taxonomische validatie om de fylogenetische relaties tussen soorten te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Workflow voor DNA-extractie van medicinale planten. (A) Er zijn in totaal 6 stappen betrokken bij het extraheren van DNA uit geneeskrachtige planten. (B) PCR-instrumentamplificatie en PCR-cyclusproces. (c) Elektroforese. (D) Sanger-sequencing en het sequentiechromatogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Gelelektroforese van Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Met behulp van de DL5000 DNA-marker als moleculaire marker worden AS-1, AS-2 en AS-3 gebruikt als monsters en 0 als controlegroep. Gelelektroforese werd uitgevoerd en de resultaten toonden aan dat de AS-1-, AS-2- en AS-3-monsters allemaal banden hadden van 500 bp, terwijl de controle geen banden vertoonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Buur-Joining fylogenetische boom gemaakt van 13 sequenties. In totaal werden 10 sequenties van vier plantensoorten gedownload uit de NCBI-database, en de Splicing-sequenties werden vergeleken om intraspecifieke en interspecifieke sequentievariatie te analyseren en te vergelijken en om fylogenetische buurbomen te construeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van materiaal/uitrustingdosis
Polyvinyl pyrrolidon10 gr
Tris-HCl1 M 50 ml
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur0,5 m 20 ml
NaCl20,45 gr
β-mercaptoethanol10 ml
Gesteriliseerd gedeïoniseerd water500 ml

Tabel 1: Reagentia voor de formulering van nucleaire isolatiebuffers.

BarcodeAbcPrimer sequentie (5'-3')PCR-amplificatie sequentiebepaling
ITS2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5 minuten
94°CJaren '3040cycli
56°CJaren '30
F:2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72°Cjaren '45
72°C10min

Tabel 2: DNA-barcodeprimers en PCR-reactieomstandigheden.

MonstersDNA-extractie (ng/μL)OD260/OD280
ZOALS-11241.84
ZOALS-21841.81
ZOALS-31641.82

Tabel 3: Angelica sinensis (Oliv.) Diels extraheerde DNA-kwaliteit.

MonstersUitgelijnde sequentie Lengte (bp)Splicing sequentie Lengte (bp)GC(%)NCBI:Percentage BLAST(%)GPGD:Percentage Soortidentificatie(%)
ZOALS-1500 bp229 bp55.50%100%100%
ZOALS-2504 bp229 bp55.50%100%100%
ZOALS-3499 bp229 bp55.50%100%100%

Tabel 4: Databasevergelijking van sequentieresultaten.

Discussie

Moleculaire identificatietechnologie is gemakkelijker te leren en te beheersen dan traditionele identificatiemethoden. Het overwint de beperkingen van de traditionele identificatie van geneeskrachtige kruiden, omdat het niet wordt beïnvloed door de groeifase van de plant en niet afhankelijk is van subjectief oordeel of de accumulatie van gespecialiseerde expertise35. Andere soorten worden verward met A. sinensis vanwege zijn vergelijkbare morfologie en geneeskrachtige delen, maar met behulp van DNA-barcodering kan het definitief worden geïdentificeerd36.

De belangrijkste stappen in dit protocol omvatten een aantal kritische overwegingen. Ten eerste is het vermijden van besmetting bij het hanteren van kruiden en het extraheren van DNA essentieel om te voorkomen dat vreemd DNA of onzuiverheden de resultaten in gevaar brengen. Een goede reiniging van de monsters is noodzakelijk om externe verontreinigingen te verwijderen, terwijl grondige verpulvering de DNA-extractie verbetert door het oppervlak voor reagensinteractie te vergroten. Het is ook belangrijk om een geschikte hoeveelheid monster te gebruiken om een efficiënte menging met de reagentia te garanderen, waardoor een betere cytolyse en afgifte van DNA mogelijk is. Ten slotte is het beheersen van de waterbadtijd cruciaal, omdat overmatige verhitting kan leiden tot DNA-afbraak, wat de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA beïnvloedt. Samen zorgen deze stappen voor de succesvolle extractie van hoogwaardig DNA voor analyse.

Geneeskrachtige planten bevatten polysacchariden en polyfenolen die de DNA-extractie en -amplificatie beïnvloeden. Het gebruik van Nuclear Isolation Buffer vermindert het effect van deze stoffen en maakt Nuclei lysis mogelijk, wat resulteert in een betere extractie van hoogzuiver gDNA 28,29,30. Momenteel zijn er drie primaire DNA-extractiemethoden: de centrifugale kolommethode, de CTAB-methode en de SDS-methode. Deze studie koos echter voor de centrifugale kolommethode voor de experimenten vanwege de stabiliteit, eenvoud, efficiëntie en het vermogen om hoge concentraties DNA37 te extraheren, en het verwarmen van de elutiebuffer kan helpen om DNA met een betere kwaliteit te elueren. Hier koos deze studie ITS2-specifieke primers17,38, de korte ITS2-sequentie dient als een efficiënte taxonomische sequentietag in vergelijking met de andere primers39, die een hoge interspecifieke variatie en een breder scala aan identificaties hebben. De mogelijke reden voor het mislukken van de amplificatie is DNA-degradatie in sommige monsters; een andere mogelijkheid is dat het gebruikte paar ITS2 universele primers mogelijk niet werkt voor bepaalde soorten of voor het gebruik van de alternatieve set universele primers40. Het BLAST-resultaat werd bepaald aan de hand van de hoogste identiteitsscore en de laagste e-waarde. Soortidentificatie werd als succesvol beschouwd wanneer het hoogste maximale percentage identiteit een enkele soort omvatte en >99%40,41 scoorde, voor de score ≤99%, controleer de kwaliteit van het sequentiebestand of of het PCR-product besmet is.

Samenvattend zou DNA-barcodering een sleutelrol moeten spelen in de kwaliteitscontrole van de traditionele kruidengeneeskunde en de internationale kruidenhandel. Dit artikel biedt enkele inzichten in het extraheren van planten-DNA en een gedetailleerde gids voor het gebruik van DNA-barcodetechnologie voor het identificeren van medicinale planten. Het belicht de belangrijkste punten die tijdens het experimentele proces moeten worden opgemerkt. Dit artikel biedt dus referenties voor basisidentificatie van kruiden en helpt meer mensen om de technologie snel onder de knie te krijgen. In speciale gevallen waarin de efficiëntie van de identificatie van een barcode op één plaats onvoldoende is, hangt dit echter af van de referentiebibliotheek. Het opbouwen van een referentiebibliotheek met een hoge soortendekking zou een belangrijke stap zijn in de richting van het identificeren van soorten met behulp van DNA-barcodes42, en veel onderzoekers hebben voorgesteld dat multi-locus barcodetechnologie de efficiëntie kan verbeteren43,44. Bovendien hebben Zheng et al. met de ontwikkeling van moleculaire technologie DNA-barcoderingstechnologie gecombineerd met isotherme DNA-amplificatietechnologie en RPA-LFD-detectie om giftige planten snel te authenticeren45 en er zijn ook enkele kant-en-klare kits ontwikkeld46. De DNA-barcodedatabase wordt voortdurend verbeterd, wat een belangrijke rol speelt bij het bevorderen van de generalisatie, standaardisatie en internationalisering van de identificatiemethoden van de kruidengeneeskunde.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door introduceert de getalenteerde persoon wetenschappelijk onderzoek start fondsen subsidie project van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (030040015).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MGeschikt voor snelle extractie van hoogwaardige genomische DNA uit verschillende weefsels van een breed scala aan planten
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Klaar voor gebruik product, neem een geschikte hoeveelheid van dit product direct voor elektroforese wanneer u de gel laat lopen.
ElectroforeseBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAanneemt touchscreen-ontwerp, kan ingestelde spanning, ingestelde stroom tegelijkertijd weergeven, parallelle output
EthyleendiaminetetraazijnzuurBeijingpsaitongBiotechnologyCo.,LtdE70015-100GReagentia voor formulering van nucleaire isolatiebuffer.
Goldview Nucleinzuur Gel Stain(10.000×)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03Bindt aan DNA bij het gebruik van agarosegelelektroforese om DNA te detecteren en produceert een sterk fluorescerend signaal.
High-Speed Tabletop CentrifugeChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650Voor snelle en efficiënte scheiding van monsters, biedt deze compacte en lichtgewicht centrifuge betrouwbare veiligheid
High-Throughput Tissue GrinderShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48Een hoogfrequent vibratie-instrument voor het malen van monsters
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics-database bevat genoomsequenties, gensets, orgaangenomen, genoomgegevens met lage dekking en DNA-barcodesequenties.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-Het National Center for Biotechnology Information bevordert wetenschap en gezondheid door toegang te bieden tot biomedische en genomische informatie.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Snel mengen in de vorm van een sneldraaiende vortex, snelheid, uniformiteit, grondigheid van het mengen
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BGebruik van geavanceerde thermo-elektrische koeltechnologie en nieuw gecreëerde TAS-technologie om de algehele prestaties te verbeteren
Multi-functional Gel Image Analysis SystemSouthwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Voert snelle genamplificatie-experimenten uit met een gradiëntfunctie voor het in kaart brengen van amplificatiecondities en een gradiënttemperatuurbereik tot 30°C
NaClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.S8210-100Reagentia voor formulering van nucleaire isolatiebuffer.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONEKwantificeer DNA-, RNA- en eiwitmonsters in seconden met slechts 1-2 µL van monster
PolyvinylpyrrolidonShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gReagentia voor formulering van nucleaire isolatiebuffer.
Sneeuwvlok-ijsmachineShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XGebruik van roterende extrusie-ijsmethode, snelle ijssnelheid en hoge efficiëntie van ijsproductie
Roestvrijstalen kralen voor weefselhomogenisatorBeyotime Biotechnology. F6623Apparatuur voor het malen en mengen van weefsel en andere monsters door middel van vibratie
Tris Acetaat-EDTA-bufferBeyotime Biotech IncST716TAE is een veel gebruikte buffer voor DNA-elektroforese, vaak gebruikt bij agarosegelelektroforese.
Tris-HClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.T8230Reagentia voor formulering van nucleaire isolatiebuffer.
WaterbadketelShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecieze thermostaat en temperatuurregeling, nauwkeurige en betrouwbare temperatuurregeling
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml  Reagentia voor formulering van nucleaire isolatiebuffer.

Referenties

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Identificatie van geneeskrachtige plantensoortidentificatieDNA extractieITS2 amplificatieSanger sequencinggelelektroforeseBLAST zoekopdrachtfylogenetische stamboomuniversele primers

Gerelateerde artikelen