Methodenartikel

Generatie en karakterisering van baarmoederorganoïden van ratten uit endometrium-epitheliale stamcellen van ratten

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66928

⸱

2 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om endometriumepitheliale stamcellen (reESC's) van ratten te isoleren en te kweken, waardoor endometriumorganoïden van ratten worden gegenereerd. Deze methode vergemakkelijkt in vitro studies van endometriumaandoeningen, waardoor genbewerking en andere cellulaire manipulaties mogelijk worden.

Samenvatting

Endometriumorganoïden bieden waardevolle inzichten in de ontwikkeling en pathofysiologie van endometriumziekten en dienen als platforms voor het testen van medicijnen. Hoewel er endometriumorganoïden bij mensen en muizen zijn ontwikkeld, blijft het onderzoek naar endometriumorganoïden bij ratten beperkt. Aangezien ratten bepaalde endometriumpathologieën, zoals intra-uteriene verklevingen, beter kunnen simuleren, was deze studie gericht op het vaststellen van endometriumorganoïden van ratten. We presenteren een gedetailleerd protocol voor de isolatie en kweek van endometriumepitheliale stamcellen van ratten (reESC's) en het genereren van endometriumorganoïden bij ratten. Met behulp van een verfijnd reESC-uitbreidingsmedium hebben we met succes reESC's geïsoleerd en stabiel uitgebreid, waardoor hun cultuurpotentieel op lange termijn is aangetoond. De door reESC gegenereerde organoïden vertoonden typische structurele en functionele kenmerken van het endometrium, waaronder hormoonresponsiviteit. Onze resultaten toonden aan dat endometriumorganoïden van ratten op lange termijn kunnen worden gekweekt met een stabiele proliferatie, waarbij de klierstructuur, celpolariteit en functionele kenmerken van het endometriumepitheel behouden blijven. Dit nieuwe, van ratten afgeleide endometriumorganoïdemodel biedt een waardevol platform voor het bestuderen van endometriumziekten en het testen van therapeutische interventies, met mogelijke toepassingen bij verschillende zoogdiersoorten.

Inleiding

Het endometrium, een veelzijdig en regeneratief weefsel in het menselijk lichaam, ondergaat periodieke afstoting, regeneratie en differentiatie onder invloed van eierstokhormonen1. Afwijkingen in het baarmoederslijmvlies houden verband met verschillende ziekten van het vrouwelijke voortplantingssysteem, zoals endometriose, endometriumkanker en onvruchtbaarheid2. Het gebrek aan betrouwbare onderzoeksmodellen voor het baarmoederslijmvlies belemmert diepgaande studies van de pathogenese, klinische diagnose en behandeling van deze ziekten. Hoewel cellijnen en diermodellen vaak worden gebruikt voor endometriumonderzoek, maken uitdagingen zoals fenotypische instabiliteit in cellijnen, verschillen tussen soorten in diermodellen en andere beperkingen het moeilijk om de complexe fysiologische structuur en dynamische functionele veranderingen in het menselijke endometrium te repliceren3.

Organoïden zijn driedimensionale structuren die worden gevormd door het kweken van stamcellen in een extracellulaire omgeving, met zelfvernieuwing en zelforganisatie. Ze kunnen de structuur en functie van fysiologische en pathologische weefsels nabootsen en worden erkend als preklinische modellen van ziekten bij de mens4. In 2017 werd een succesvolle constructie van endometriumorganoïden bij muizen en mensen bereikt door gefragmenteerd vrij endometriumweefsel verkregen door enzymatische digestie in te bedden in een extracellulaire matrixsteiger, gevolgd door het toevoegen van een mengsel van specifieke groeifactoren en signaalfactoren voor teelt5. De resultaten toonden aan dat ex vivo endometriumorganoïden een langdurige en stabiele proliferatieve capaciteit vertonen, waarbij de klierstructuur, celpolariteit en functionele kenmerken van het endometriumepitheel behouden blijven, waaronder slijmafscheiding en hormoonrespons6. De ex vivo kweek van volwassen stamcellen die de endometriumorganoïden vormen, vereist echter klierachtige structurele ondersteuning, wat leidt tot uitdagingen zoals verlies van stam en moeilijkheden bij het passeren7.

Momenteel wordt voor de teelt van endometriumorganoïden gebruik gemaakt van de weefselblokverteringscultuurmethode. In een eerdere studie heeft ons onderzoeksteam menselijke endometriumepitheliale stamcellen gedurende een langere periode in vitro gekweekt met behulp van een primair kweekmedium dat voornamelijk bestaat uit Y27632, dat we hebben gebruikt om endometriumorganoïden te construeren8. Voortbouwend op dit succes hebben we endometriumepitheliale stamcellen geïsoleerd en gekweekt uit endometriumweefsel van ratten met behulp van een klein molecuul samengesteld kweekmedium, waardoor een in vitro kweeksysteem voor de lange termijn werd opgezet. Verder hebben we endometriumepitheliale stamcellen (reESC's) van ratten gebruikt om endometriumorganoïden van ratten te genereren. De ontwikkeling van dit model zal toekomstige in vitro en in vivo studies van endometriumgerelateerde ziekten in combinatie met rattenmodellen verbeteren.

Protocol

Zes 7/8 weken oude vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 200-250 g werden voor dit werk gebruikt. De ratten werden gehuisvest in een geklimatiseerde dierenfaciliteit met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle experimentele procedures met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie voor dierproeven bij de Research Ethics Committee van het Meizhou People's Hospital.

In het volgende gedeelte wordt het proces beschreven voor het isoleren, passeren, invriezen en ontdooien van endometriumepitheelstamcellen van ratten met behulp van een verfijnd reESC-expansiemedium (REEM) dat voornamelijk bestaat uit Y27632, A8301 en CHIR990217 8,9. De REEM-formulering is gebaseerd op serumvrije DMEM/F12 verrijkt met specifieke concentraties van de belangrijkste componenten: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 en 0,5 μM A8301. Uitgebreide details over de componenten zijn te vinden in de Materiaaltabel. Nadat de ratten zijn verdoofd met isofluraaninhalatie, moeten de volgende procedures zoals weergegeven in figuur 1 worden uitgevoerd.

1. Chirurgische ingreep

  1. Verdoof de rat door isofluraan in te ademen.
    1. Plaats de ratten in een inductiekamer gevuld met 3-5% isofluraan gemengd met zuurstof. Bevestig de juiste verdoving door het ontbreken van een reactie op een teenbeknelling en het verlies van de oprichtreflex.
    2. Eenmaal verdoofd, houdt u de ratten tijdens de procedure onder 1-3% isofluraan via een neuskegel. Breng dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl de rat onder narcose is.
  2. Maak een lage incisie in de middellijn van de buik om de hoorns van de baarmoeder bloot te leggen.
    OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten moeten voor gebruik worden gesteriliseerd. Het operatiegebied van de rat wordt geschoren en gedesinfecteerd met een antiseptische oplossing. De chirurg draagt steriele handschoenen, een masker en een jas. De chirurgische ingreep wordt uitgevoerd op een steriel laken.
  3. Voer longitudinale incisies uit aan beide zijden van de baarmoeder om het binnenste baarmoederslijmvlies bloot te leggen. Gebruik een T10-scalpelmes om het baarmoederslijmvlies te schrapen tot het oppervlak ruw is.
  4. Breng de ratten na de chirurgische ingreep over naar een steriele en warme herstelruimte met gereguleerde temperatuur- en vochtigheidsniveaus en houd ze nauwlettend in de gaten totdat ze weer volledig bij bewustzijn zijn en zichzelf kunnen ondersteunen in een sternale liggende positie. Huisgroepen van drie postoperatieve ratten apart in aparte kooien. Om postoperatieve pijn te verlichten, worden pijnstillers zoals buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg, subcutaan) toegediend; Herhaal elke 8-12 uur gedurende maximaal 48-72 uur indien nodig.

2. Weefselverwerking

  1. Leg alle baarmoeder endometrium fragmenten in een schaaltje van 3,5 cm en was ze 3x met PBS.
  2. Meng de baarmoeder endometriumfragmenten met 3 ml 1% collagenase type I (verdund in 0,25% trypsine/1 mM EDTA) bij 37 °C gedurende 60 min. Filtreer het onverteerde weefsel met behulp van een celzeef van 100 μm om het filtraat te isoleren en op te vangen voor verdere kweek.
  3. Zaai de verzamelde cellen in platen met 12 putjes in REEM-medium voor verdere kweek. Bereken het volume van de celsuspensie die nodig is om de cellen in elk putje van de plaat met 12 putjes te zaaien om de gewenste celdichtheid te bereiken (meestal ~1-2 × 105 cellen/putje in 1,5 ml REEM).
  4. Was de cellen die in stap 2.2 zijn verzameld 3x met PBS. Centrifugeer de cellen na de eerste wasbeurt gedurende 5 minuten bij 300 × g . Gooi het bovenliggende weg; suspendeer de celpellet in PBS met 1% BSA (runderserumalbumine) om niet-specifieke binding te minimaliseren en incubeer gedurende 15-30 minuten op ijs.
  5. Incubeer de cellen met primaire antilichamen die specifiek zijn voor verschillende markers (zie de materiaaltabel) gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 4 °C. Verdun de antilichamen in PBS met 1% BSA volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Was de cellen na incubatie 2x met PBS om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Resuspendeer de cellen na de laatste wasbeurt in 600 μL PBS met 1% BSA voor flowcytometrie-analyse.
  7. Configureer het instrument met lasers en filters die geschikt zijn voor de fluoroforen die in het experiment worden gebruikt (bijv. FITC, PE, APC). Gebruik de instellingen voor voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) om de live, eencellige populatie te bepalen, met uitzondering van puin en celaggregaten. Kalibreer de flowcytometer met behulp van een ongekleurde knop om een goede uitlijning te garanderen. Stel specifieke poorten in op basis van de niet-gekleurde controle om positieve populaties te definiëren voor elke marker van belang (de drempelwaarde is 0,02%).

3. Langdurige kweek van endometriumepitheliale stamcellen van ratten

  1. Test voor kolonievorming
    OPMERKING: Deze test hielp bij het bepalen van het optimale kweekmedium voor reESC's.
    1. Zaai P0 reESC's in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1.000 cellen/putje en kweek ze gedurende 14 dagen in REEM of REEM zonder A8301, Y27632 of CHIR99021.
    2. Fixeer de cellen na de kweekperiode gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met 4% paraformaldehyde en kleur ze vervolgens nog 20 minuten met een kristalviolette oplossing.
    3. Kwantificeer het aantal celclusters dat meer dan 50 cellen bevat. Selecteer het kweekmedium op basis van welk medium de groei van celclusters ondersteunt.
      OPMERKING: Het weglaten van specifieke factoren uit de REEM resulteerde in een verminderde proliferatieve capaciteit van reESC's (Figuur 1B,C). Op basis van deze bevindingen werd REEM geselecteerd als het voorkeursmedium voor de teelt van reESC's om de kweekomstandigheden te optimaliseren.
  2. Verander de REEM elke 2 dagen. Wanneer de cellen 80-90% samenvloeiing bereiken, verteer ze dan met 0,25% trypsine/1 mM EDTA gedurende 5-6 minuten.
  3. Passage de cellen in een verhouding van 1:3 in REEM.
  4. Proliferatie-test
    1. Zaai de P1-, P7- en P14-reESC's in platen met 96 putjes met een dichtheid van 4 × 103 cellen/putje in 150 μL REEM.
    2. Voeg 10 μL CCK-8-reagens toe aan elk putje na 24, 48, 72 en 96 uur cultuur, gevolgd door een incubatie van 2 uur bij 37 °C.
    3. Bepaal de proliferatiesnelheid door de extinctie bij 450 nm te meten met behulp van een microplaatlezer.
  5. Voorbereiden en gebruiken van diepvriesvoorraden
    1. Bereid de oplossing voor bevroren voorraad met behulp van REEM met 10% DMSO.
    2. Oogst de reESC's met 0,25% trypsine/1 mM EDTA.
    3. Resuspendeer de celpellet in een concentratie van 1 ×10 6 cellen/ml. Breng de celsuspensie over in buisjes.
    4. Vries de buisjes eerst in bij -80 °C en breng ze vervolgens binnen 24 uur over op vloeibare stikstof.
      OPMERKING: Als u van plan bent de cellen binnenkort te ontdooien, wordt aanbevolen de ingevroren cellen maximaal 6 maanden bij -80 °C te bewaren.
    5. Verwarm de REEM voor op 37 °C.
    6. Pak de bevroren reESC's en dompel ze 1-2 minuten onder in een waterbad van 37 °C.
    7. Breng de ontdooide reESC's over in platen met 6 putjes met een zaaidichtheid van 1 × 105 cellen/putje in REEM.
  6. Immunofluorescentie kleuring
    1. Zaai reESC's in de logaritmische groeifase op u-Slide 8-wells platen met een dichtheid van 2 × 103 cellen per putje en kweek ze in REEM.
    2. Wanneer de reESC's 90% samenvloeiing bereiken, fixeer ze dan gedurende 4 minuten met 20% paraformaldehyde. Was de reESC's 2x met PBS voor en na fixatie.
    3. Permeabiliseer de cellen met 0,2% Triton X-100 gedurende 10 minuten.
    4. Blokkeer de cellen met 30% geitenserum verdund in 5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de reESC's 2x met PBS voor en na het opspannen.
    5. Incubeer de cellen met primaire antilichamen (anti-SSEA-1 en anti-cytokeratine) gedurende 12 uur bij 4 °C. Was de reESC's 2x na incubatie met PBS.
    6. Incubeer de cellen met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de reESC's 2x na incubatie met PBS.
    7. Weeg de cellen tegen met 150 μL DAPI om alle kernen te labelen.
    8. Maak beelden van de gekleurde cellen met behulp van een omgekeerde confocale microscoop.

4. Vaststellen van endometriumorganoïden bij ratten uit reESC's

  1. Genereren van de organoïden
    1. Wanneer reESC's 70% samenvloeiing bereiken, verteer de cellen dan met 0,25% trypsine/1 mM EDTA gedurende 5-6 minuten.
    2. Resuspendeer 5 × 105 reESC's in 500 μl ontdooid Matrigel en plaats in platen met 12 putjes. Incubeer de platen gedurende 20 minuten bij 37 °C om geleerling mogelijk te maken.
    3. Zodra het cel-Matrigel-mengsel stolt, voegt u 1,5 ml/putje REEM toe om de Matrigel te bedekken. Vervang de REEM elke 2-3 dagen.
  2. Immunofluorescentie kleuring
    1. Zuig de REEM op en voeg 1 ml/putje voorgekoelde organoïde oogstoplossing toe aan de platen met 12 putjes. Incubeer 40-60 minuten op ijs.
    2. Verzamel de organoïden met een pasteurpipet en centrifugeer bij 300 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    3. Spoel de organoïden 2-3x af met PBS.
    4. Fixeer de organoïden met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten en blokkeer met 5% BSA gedurende 60 minuten.
      OPMERKING: Was 2x met PBS voor en na elke stap.
    5. Incubeer de organoïden een nacht bij 4 °C met primaire antilichamen verdund in 1% BSA.
    6. Incubeer de organoïden met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    7. Bestkleur de organoïden met 200 μL DAPI.
    8. Maak foto's met een omgekeerde confocale microscoop.
  3. HE kleuring
    1. Dehydrateer de organoïden door middel van een gegradeerde ethanolreeks: 70% ethanol gedurende 30 min; 80% ethanol gedurende 30 min; 95% ethanol gedurende 30 min; 100% ethanol gedurende 2 x 30 min. Wis de organoïden schoon door ze 2 x 30 minuten onder te dompelen in xyleen.
    2. Dompel de geklaarde organoïden gedurende 1 uur onder in gesmolten paraffine bij 60 °C. Breng de met paraffine geïnfiltreerde organoïden over in inbeddingsvormen, vul de vormen met gesmolten paraffine en plaats de vormen in een koude plaat zodat de paraffine kan stollen. Haal de paraffineblokken uit de vormpjes nadat de paraffine is gestold en snijd het overtollige paraffine af.
    3. Monteer de paraffineblokken op de microtoom. Snijd 5 μm dikke stukken en laat ze op een warmwaterbad (42-45 °C) drijven om ze plat te maken. Breng de secties voorzichtig over op glazen dia's en droog ze op een diawarmer.
    4. Deparaffiniseer de secties door de dia's 2 x 5 minuten onder te dompelen in xyleen. Rehydrateer door een reeks graduele ethanol: 100% ethanol gedurende 2 x 3 minuten; 95% ethanol gedurende 3 minuten; 70% ethanol gedurende 3 min; Spoel af in gedestilleerd water.
    5. Bemiddel met hematoxyline gedurende 5 minuten; Spoel vervolgens 5 minuten af met stromend kraanwater. Differentiëren in 1% zure alcohol gedurende een paar seconden; spoel 5 minuten af in stromend kraanwater; plaats in blauw in 0,2% ammoniakwater gedurende 30 s; spoel 5 minuten af in stromend kraanwater; Kleur 2 minuten met eosine. Dehydrateer door gesorteerde ethanol: 70% ethanol gedurende 1 minuut; 95% ethanol gedurende 1 minuut; 100% ethanol gedurende 2 x 1 min. Helder in xyleen gedurende 2 x 1 min.
    6. Voeg een druppel montagemiddel toe aan de bevlekte delen. Plaats vervolgens een dekglaasje over het weefselgedeelte en vermijd luchtbellen. Bekijk de bevlekte delen onder een lichtmicroscoop.
  4. Fluorescentie kleuring
    1. Voer deparaffinisatie en rehydratatie uit zoals beschreven in stap 4.3.1. tot 4.3.4.
    2. Verwarm de antigeenoplossing voor in een magnetron. Plaats de glaasjes in de verwarmde antigeenoplossing en houd ze 20 minuten op een temperatuur onder de kook. Laat de glaasjes 40 minuten afkoelen in de antigeenoplossing. Spoel de dia's 5 minuten af in gedeïoniseerd water.
    3. Incubeer de objectglaasjes gedurende 10 minuten in 0,3% waterstofperoxide in methanol om de endogene peroxidase-activiteit te doven. Spoel de glaasjes 3 x 5 minuten in PBS en incubeer ze 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Tik de overtollige blokkeeroplossing eraf, maar spoel niet af.
    4. Verdun het primaire antilichaam in een blokkeeroplossing volgens de instructies van de fabrikant. Breng het verdunde primaire antilichaam aan op de weefselcoupes en incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    5. Was de dia's 3 x 5 min in PBS. Verdun het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam in een blokkeeroplossing volgens de instructies van de fabrikant. Breng het verdunde secundaire antilichaam aan op de weefselsecties en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Was de dia's 3 x 5 minuten in PBS om ongebonden secundair antilichaam te verwijderen.
    6. Bereid de Fluoresceïne Tyramide werkoplossing volgens de instructies van de kit. Breng de werkoplossing aan op de weefselcoupes en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Spoel de dia's 3 x 5 minuten uit in PBS.
    7. Herhaal stap 4.4.1. tot 4.4.5 totdat de kleuring met alle drie de antilichamen is voltooid. Breng een druppel fluorescerend montagemedium met DAPI aan op elk weefselgedeelte. Leg voorzichtig een dekglaasje over het tissuegedeelte om luchtbellen te voorkomen. Onderzoek de objectglaasjes omgekeerde confocale microscoop.
  5. Kwantitatieve PCR
    1. Verzamel de organoïden zoals beschreven in stap 4.2.1. tot 4.2.3. Zuig de PBS op en extraheer het totale aantal RNA's uit de organoïden volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Gebruik een in de handel verkrijgbare reverse transcription-kit om cDNA te synthetiseren uit 1 μg totaal RNA. Stel een q-PCR-reactie in volgens het protocol van de fabrikant van de kit. Zie Materiaaltabel voor primersequenties die worden gebruikt voor q-PCR.

5. Langdurige cultuur van endometriumorganoïden bij ratten

  1. Zuig de REEM op en voeg 1 ml organoïde oogstoplossing toe gedurende 40 minuten om de organoïden te dissociëren. Incubeer op ijs om de integriteit van de organoïde te behouden.
  2. Na de incubatie worden de organoïden met behulp van een pasteurpipet verzameld en centrifugeren ze 3 minuten bij 300 × g bij 4 °C om ze te pelleteren voor verdere verwerking.
    OPMERKING: Het bijsnijden van de pipetpunt kan nuttig zijn voor het hanteren van grotere organoïden (meer dan 500 μm) zonder schade aan te richten.
  3. Resuspendeer de gepelleteerde organoïden in Matrigel, in een verhouding van 1:2 of 1:3, om ze in te bedden en vervolgens te kweken in platen met 12 putjes.
  4. Bereid de oplossing voor bevroren bouillon: REEM met 10% DMSO.
  5. Oogst de organoïden, suspendeer ze opnieuw in de diepvriesoplossing en bewaar ze vervolgens in een vriezer bij -80 °C of in vloeibare stikstof voor langdurige bewaring.
  6. Om de bevroren organoïden te ontdooien, verwarmt u de REEM voor in een waterbad van 37 °C en dompelt u de bevroren bouillonbuis onder in het waterbad om de organoïden voorzichtig te ontdooien.
  7. Na het ontdooien suspendeer je de organoïden opnieuw in 500 μL Matrigel om ze opnieuw in te bedden en te kweken in een plaat met 12 putjes. Volg stap 4.1.2. tot 4.1.3.
    LET OP: Het wordt aangeraden om ingevroren organoïden voor kortere tijd bij -80 °C te bewaren of over te brengen op vloeibare stikstof voor langere opslag.

6. Optioneel: Overgang van organoïden naar aanhangende cultuur

OPMERKING: Het protocol vermeldt een alternatieve methode voor het verkrijgen van flat-cultured reESC's door organoïden over te zetten naar adherente cultuur, waardoor de organoïde morfologie kan worden geherstructureerd.

  1. Zuig de REEM op en voeg 1 ml organoïde oogstoplossing toe om de organoïden te dissociëren. Incubeer op ijs om de integriteit van de organoïde te behouden.
  2. Verzamel de organoïden na de incubatie met behulp van een pasteurpipet en centrifugeer ze om ze te pelleteren bij 300 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  3. Resuspendeer de organoïden in 3 ml voorverwarmde REEM en breng de geresuspendeerde organoïden over in een schaaltje van 3,5 cm. Vervang de REEM-media elke 2 dagen.
  4. Wanneer de cellen 70% samenvloeiing bereiken, verteer ze dan met 0,25% trypsine/1 mM EDTA gedurende 5-6 minuten.
  5. Reconstrueer de organoïden met reESC's door stap 4.1.1 tot en met 4.1.3 te volgen.

7. Sequentiële kweek van organoïden met oestradiol (E2) en progesteron (P4)

  1. Bereid voorraadoplossingen van E2 en P4 in DMSO. Verdun de stamoplossingen tot de gewenste werkconcentraties (E2: 10 nM; P4: 1 μM) in REEM, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de uiteindelijke DMSO-concentratie niet hoger is dan 0,1% om cytotoxische effecten te voorkomen.
  2. Cultuurorganoïden in REEM als stap 4.1.1. tot 4.1.3. gedurende 4 dagen. Vervang het medium door REEM aangevuld met E2 en kweek gedurende 7 dagen. Monitor de groei en morfologie van organoïden dagelijks. Vervang het medium elke 2-3 dagen.
  3. Vervang het medium door REEM aangevuld met E2 en P4. Monitor de groei en morfologie van organoïden dagelijks. Vervang het medium elke 2-3 dagen. Ga 7 dagen door met het kweken van de organoïden.

Resultaten

De reESC's en organoïden van de baarmoeder van ratten werden vastgesteld uit zes vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht tussen 200 g en 250 g volgens het protocol dat wordt beschreven in figuur 1. Voortbouwend op het succes van de langetermijncultuur van menselijke endometriumepitheliale stamcellen, bestond de REEM-formulering voornamelijk uit Y27632, A8301 en CHIR99021. Om de reESC's in vitro te stabiliseren, isoleerden we in eerste instantie endometriumcellen uit het baarmoederslijmvlies van de rat met behulp van enzymatische en mechanische technieken. Flowcytometrie-analyse in figuur 2A toonde aan dat de primaire endometriumcellen voor ongeveer 50% uit epitheelcellen bestonden die CD9 tot expressie brachten (49,8%), met lage niveaus van EpCAM (4,49%) en CD24 (2,64%). De SSEA-1-marker voor reESC's was aanwezig op 6,58%, terwijl endotheliale markers CD31 (30,9%) en CD45 (70,3%) relatief hoog waren.

Kweek in REEM resulteerde er echter in dat P1 reESC's een uniforme kransvormige of veelvlakkige morfologie vertoonden en compacte kloonstructuren vormden (Figuur 2D). Geleidelijke verwijdering van individuele factoren uit REEM leidde tot een overeenkomstige afname van de proliferatieve capaciteit van reESC's. De kloonvormingstest benadrukte de cruciale rol van Y27632 in de stabiele cultuur van reESC's (Figuur 2B,C). Bij de derde passage vertoonden reESC's een consistente expressie van SSEA-1 en cytokeratine, wat wijst op een succesvolle uitbreiding van primaire reESC's tijdens de kweek (Figuur 2F). Bovendien behielden reESC's een robuuste en stabiele proliferatieve capaciteit, zelfs bij late passages (Figuur 2E), wat hun succesvolle isolatie en uitbreiding in het huidige REEM-systeem aantoont.

Organoïdeculturen werden tot stand gebracht volgens een eerder gerapporteerd systeem afgeleid van menselijke endometriumstamcellen8. Binnen 3 dagen vertoonden de reESC's een snelle zelforganisatie in organoïde-achtige structuren met een hol centrum, dat vervolgens in omvang en dikte toenam (zie Figuur 3A). De typische HE-kleuringsresultaten die de vorming van organoïden door reESC's illustreren, worden weergegeven in Figuur 3B. Deze organoïdeculturen kunnen in stand worden gehouden door middel van passaging, zoals blijkt uit de hoge levensvatbaarheid van cellen die wordt aangegeven door Ki67-kleuring na zowel directe passage als vries-dooicycli. Verder werd HE-kleuring uitgevoerd op de 10e generatie organoïden, en de resultaten toonden aan dat de organoïdestructuur intact kon worden gehouden (zie figuur 3E). Bovendien gaven qPCR-resultaten aan dat Nanog, Sox2 en Oct4 tot expressie werden gebracht op niveaus die vergelijkbaar waren met die van de P1-generatie (Figuur 3F). Deze bevinding suggereert het potentieel voor langdurige cultuur van organoïden binnen het huidige systeem.

Onze studie voerde een voorlopig onderzoek uit naar de respons van baarmoederachtige structuren van ratten op E2 en P4. Immunofluorescentiekleuring in figuur 4A onthulde de aanwezigheid van oestrogeen- en progesteronreceptoren. Na suppletie met E2 ondergingen deze organoïden een overgang van een holle bolvorm naar een dichter bevolkt inwendig groeipatroon (Figuur 4C). Daaropvolgende blootstelling aan P4 leidde tot verminderde permeabiliteit van de dichte structuren, wat uiteindelijk resulteerde in hun desintegratie (Figuur 4B). Deze bevindingen suggereren dat E2 mogelijk verdere differentiatie van baarmoederachtige structuren van ratten stimuleert, terwijl P4 apoptotische routes kan activeren.

figure-results-1
Figuur 1: Procedures die worden gebruikt om endometriumepitheliale stamcellen van ratten en baarmoederorganoïden van ratten vast te stellen. Afkorting: SD = Sprague-Dawley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Generatie en langdurige kweek van endometriumepitheliale stamcellen van de rat in vitro. (A) Flowcytometrische analyse die het aandeel positieve cellen in het endometrium van de rat aantoont. (B) Kristalviolette kleuring van klonen in REEM met of zonder respectievelijk A8301, Y27632 of CHIR99021. Schaal balken = 1 cm. (C) De kloonnummers in REEM met of zonder factoren. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer; n = 3 donateurs (***, p<0,001). (D) Lichtmicroscopiebeelden van P1-rat endometriumepitheliale stamcellen met en zonder kristalviolette kleuring. (E) CCK-8-analyses van endometriumepitheelstamcellen van ratten in passage 1, passage 7 en passage 14. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan, n = 3. (F) Immunofluorescentieanalyses die de expressie van cytokeratine en SSEA-1 aantonen. Afkorting: REEM = reESCs expansiemedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Generatie en langetermijncultuur van endometriumorganoïden bij ratten in vitro. (A) Lichtmicroscopiebeelden van P1 rat endometriumorganoïden. (B) H&E-kleuring voor P1-organoïden van endometriumepitheliale stamcellen van ratten. (C) Immunofluorescentieanalyses die de expressie van cytokeratine en SSEA-1 aantonen. (D) Immunofluorescentieanalyses die de expressie van Ki67 en SSEA-1 aantonen. (E) H&E-kleuring voor P 10 rattenorganoïden. (F) qPCR-analyses voor de expressie van Nanog, Sox2 en Oct-4 in P1 en P10 endometriumorganoïden van ratten. Expressie genormaliseerd naar GAPDH (n = 3, tweezijdige ongepaarde t-toets, n.s. = niet-significant). Afkorting: H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Sequentiële kweek van organoïden met E2 en P4. (A) Immunofluorescentieanalyses die de expressie van oestrogeenreceptor, progestageenreceptor en SSEA-1 aantonen. (B) Overzicht van lichtmicroscopiebeelden van organoïden van ratten gekweekt in E2 en P4. (C) Lichtmicroscopiebeelden tonen de transformatie van een holle bol naar dicht in de binnenholte van organoïden na 7 dagen te zijn gekweekt in E2. Afkortingen: ER = oestrogeenreceptor; PR = progestageen receptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In deze studie hebben we een eenvoudige methode beschreven voor het isoleren en kweken van endometriumepitheliale stamcellen van ratten (reESC's) en het eerder gevestigde ex vivo-systeem voor menselijke endometriumepitheliale stamcellen verfijnd8. Onze aanpak maakt gebruik van een kweekmedium met kleine moleculen dat Y27632, A8301 en CHIR99021 als kerncomponenten bevat om een stabiele en langdurige ex vivo-cultuur mogelijk te maken. Bovendien hebben we met succes in realtime endometriumorganoïden bij ratten gegenereerd met behulp van reESC's. Dit nieuwe systeem vereenvoudigt de huidige kweekmethoden voor endometriumorganoïden, die doorgaans afhankelijk zijn van weefselblokken, waardoor meer duidelijkheid wordt verkregen over de celafstamming10. Belangrijk is dat ons systeem genbewerking en andere manipulaties op cellulair niveau mogelijk maakt om organoïden te genereren die specifieke genen tot expressie brengen. Bovendien maakt dit organoïdesysteem de gerichte knock-out of overexpressie van specifieke genen in het endometrium van de rat mogelijk, waardoor endometriumepitheliale stamcellen kunnen worden gescreend en gekweekt om endometriumorganoïden te produceren. Deze uitgebreide onderzoeksaanpak verduidelijkt specifieke genfuncties vanuit zowel in vivo als ex vivo perspectieven, en maakt de weg vrij voor het onderzoeken van ziekten die verband houden met het endometriumepitheel.

Drugsscreening is een cruciale toepassing van organoïden. De huidige bronnen en bereidingsmethoden van organoïden zijn echter complex, wat leidt tot aanzienlijke variabiliteit tussen batches die van invloed kunnen zijn op de resultaten van screeningsstudies11,12. Ons systeem toont aan dat organoïden die zijn afgeleid van stabiele ex vivo gekweekte cellijnen verschillen tussen gevormde organoïden effectief kunnen minimaliseren, waardoor de uniformiteit in experimentele opstellingen wordt verbeterd. Bovendien hebben organoïden van ratten gevormd door reESC's aangetoond dat ze in vitro kunnen reageren op oestrogeenstimulatie, wat leidt tot morfologische veranderingen, wat suggereert dat ze kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van geneesmiddelen ex vivo. De reESC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit endometriumweefsel en ex vivo worden geëxpandeerd met minder kleine moleculen in vergelijking met menselijke endometriumepitheliale stamcellen. Deze eigenschap is vooral waardevol voor het onderzoeken van stamceleigenschappen, voorlopercellen, differentiatieprocessen en interacties in de micro-omgeving. Belangrijk is dat deze benadering kan worden geëxtrapoleerd naar andere zoogdiersoorten zoals apen, varkens en honden, waardoor endometriumorganoïde kweeksystemen kunnen worden opgezet die dienen als meer fysiologisch relevante modellen voor het bestuderen van endometriumbiologie, functie, ziekten en geneesmiddelreacties. Ondanks de voordelen heeft deze techniek beperkingen. Een belangrijke beperking is het vertrouwen op Matrigel, een complexe en variabele extracellulaire matrix die inconsistenties tussen experimenten kan introduceren. Bovendien, hoewel rattenmodellen waardevolle inzichten bieden, bestaan er nog steeds verschillen tussen soorten en kunnen bevindingen zich mogelijk niet volledig vertalen naar menselijke endometriumfysiologie en pathologieën. Toekomstige studies zouden gericht moeten zijn op het aanpakken van deze beperkingen, mogelijk door de ontwikkeling van meer gedefinieerde en consistente extracellulaire matrices en door de toepasbaarheid van dit model op andere soorten te onderzoeken.

Ondanks de voordelen heeft deze techniek beperkingen. Een belangrijke beperking is het vertrouwen op Matrigel, een complexe en variabele extracellulaire matrix die inconsistenties tussen experimenten kan introduceren. Daarom is een belangrijke techniek in deze studie het verwijderen van Matrigel. Het gebruik van een zachte matrixgelverdigestie, die zorgt voor operaties op ijs en voldoende verteringstijd zijn cruciaal voor succes. Door de grotere diameter van de Pasteurpipet kan het gebruik van Pasteurpipetaspiratie schade aan organoïden verminderen en de vertering van de matrixgel versnellen. Vervolgonderzoek kan verschillende extracellulaire matrix gelkweekmethoden vergelijken om de kweek- en verteringssystemen van organoïden verder te optimaliseren. Toekomstige studies zouden gericht moeten zijn op het aanpakken van deze beperkingen, mogelijk door de ontwikkeling van meer gedefinieerde en consistente extracellulaire matrices en door de toepasbaarheid van dit model op andere soorten te onderzoeken.

Hoewel in de bestaande literatuur technieken zijn beschreven voor het ex vivo kweken van epitheliale organoïden, presenteert deze studie een nieuw, eenvoudig en gemakkelijk reproduceerbaar systeem voor het kweken en uitbreiden van endometriumorganoïden bij ratten afkomstig van heldere cellen. Deze vooruitgang is klaar om het tempo van het onderzoek op het gebied van de reproductieve biologie van vrouwen te verhogen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de GuangDong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515110760).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Konijn, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alphaAbcamab32063Konijn, 1:200 (IHC)
Anti-pan CytokeratinAbcamab7753Muis, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone ReceptorAbcamab101688Konijn, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67Abcamab279653Muis, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-EstradiolMerckE8875
Cell Counting Kit-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Organoid Harvesting SolutionR&D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescerend systeem KitAPExBIOK1051
Cy5 TSA Fluorescerend systeem KitAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μg/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
Fluoresceïne TSA Fluorescerend systeem KitAPExBIOK1050
Geit anti-Konijn IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
Geit anti-Muis IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Geit Anti-konijn IgG/HRP antilichaamAPExBIObs-0295G-HRP
Knockout serum vervangerInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteronMerck57-83-0
Sprague-Dawley rat Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNRNA extractie
u-Slide 8-well platenIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
qPCR primers van doelgenen 
GenenBedrijfSequenties
rat GAPDH FSangon biotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH RSangon biotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog FSangon biotechGACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R Sangon biotechCTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 FSangon biotechATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 RSangon biotechATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 FSangon biotechCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 RSangon biotechACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Referenties

  1. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  2. Garcia-Alonso, L., et al. Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro. Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).
  3. Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med. 380 (6), 569-579 (2019).
  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  6. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).
  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Endometriumorgano denorgano dkweekorgano dekarakteriseringendometriumziektenorgano degeneesmiddelentestenorgano de genbewerkingcelisolatieMatrigel inbedding
Generatie en karakterisering van baarmoederorganoïden van ratten uit endometrium-epitheliale stamcellen van ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.