Methodenartikel

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

DOI:

10.3791/66930

⸱

5 juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschikbaarheid van een reeks gemodificeerde synthetische oligonucleotiden van commerciële leveranciers heeft de ontwikkeling mogelijk gemaakt van geavanceerde assays om diverse eigenschappen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te karakteriseren die in elk standaard moleculair-biologisch laboratorium kunnen worden uitgevoerd. Het gebruik van fluorescerende labels heeft deze methoden toegankelijk gemaakt voor onderzoekers met standaard PAGE-elektroforese-apparatuur en een fluorescerende imager, zonder radioactieve materialen te gebruiken of een laboratorium nodig te hebben dat is ontworpen voor de opslag en bereiding van radioactieve materialen, d.w.z. een Hot Lab. De optionele toevoeging van standaardmodificaties zoals fosforylering kan het instellen van de test vereenvoudigen, terwijl de specifieke opname van gemodificeerde nucleotiden die DNA-schade of tussenproducten nabootsen, kan worden gebruikt om specifieke aspecten van enzymgedrag te onderzoeken. Hier worden het ontwerp en de uitvoering gedemonstreerd van tests om verschillende aspecten van DNA-verwerking door enzymen te ondervragen met behulp van in de handel verkrijgbare synthetische oligonucleotiden. Deze omvatten het vermogen van ligases om zich te verbinden of nucleasen om verschillende DNA- en RNA-hybride structuren af te breken, differentieel cofactorgebruik door de DNA-ligase en evaluatie van het DNA-bindende vermogen van enzymen. Factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van synthetische nucleotidesubstraten worden besproken en er wordt een basisset oligonucleotiden verstrekt die kunnen worden gebruikt voor een reeks nucleïnezuurligase-, polymerase- en nuclease-enzymassays.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle levensvormen hebben nucleïnezuurverwerkende enzymen nodig om fundamentele biologische processen uit te voeren, waaronder replicatie, transcriptie en DNA-reparatie. De belangrijkste enzymatische functionaliteiten voor deze routes zijn polymerasen, die kopieën van RNA/DNA-moleculen genereren, ligases die zich aansluiten bij polynucleotidesubstraten, nucleasen die ze afbreken, en helicasen en topoisomerasen, die nucleïnezuurduplexen smelten of hun topologie veranderen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Bovendien bieden veel van deze enzymen essentiële moleculaire hulpmiddelen voor toepassingen zoals klonen, diagnostiek en high-throughput sequencing 11,12,13,14,15.

De functionele kenmerken, kinetiek en substraatspecificiteiten van deze enzymen kunnen worden bepaald met behulp van gelabelde DNA/RNA-substraten die worden geproduceerd door oligonucleotiden te gloeien. Het traceren van substraten en producten wordt van oudsher bereikt door het aanbrengen van een radioactief label (32P) aan het uiteinde van de 5'-streng, dat vervolgens kan worden gedetecteerd met fotografische film of met een fosforbeeldvormingssysteem16,17. Hoewel radioactief gelabelde substraten het voordeel bieden van een verhoogde experimentele gevoeligheid en de chemische eigenschappen van een nucleotide niet veranderen, hebben de potentiële gezondheidsrisico's van het werken met radio-isotopen de ontwikkeling van niet-radioactieve nucleïnezuuretikettering aangemoedigd om een veiliger alternatief te bieden voor DNA- en RNA-detectie 18,19,20 . Hiervan vallen fluorescentiedetectie, inclusief directe fluorescentiedetectie, tijdopgeloste fluorescentie en energieoverdracht/fluorescentie-afschriktesten op als de meest veelzijdige 21,22,23,24. Het uitgebreide scala aan fluoroforen maakt verschillende ontwerpen van DNA/RNA-substraten mogelijk met unieke reporters op elk oligonucleotide25. Bovendien stelt de stabiliteit van fluoroforen, in vergelijking met radio-isotopen, gebruikers in staat om aanzienlijke hoeveelheden fluorescerend gelabelde DNA-substraten te produceren en te bewaren19. Deze met fluorofoor gelabelde substraten kunnen worden geïncubeerd met het eiwit van belang, samen met verschillende combinaties van metaal- en nucleotide-cofactoren, om bindings- en/of enzymactiviteit te analyseren. Visualisatie van binding of activiteit kan worden waargenomen met behulp van verschillende fluorofoorkleurkanalen met een gelbeeldvormingssysteem. Aangezien met deze techniek alleen de fluorescerend gelabelde oligonucleotiden zichtbaar zullen zijn, zal elke toename of afname van de grootte van het gelabelde oligonucleotide gemakkelijk te volgen zijn. Gels kunnen daarna ook worden gekleurd, met nucleïnezuurkleuringskleurstoffen om alle DNA-banden die op de gel aanwezig zijn te visualiseren.

Polynucleïnezuurligases zijn enzymen die fragmenten van DNA/RNA samenvoegen en de afdichting van breuken katalyseren door de vorming van een fosfodiësterbinding tussen 5' gefosforyleerde DNA-termini en de 3' OH van DNA. Ze kunnen in twee groepen worden verdeeld op basis van hun nucleotidesubstraatvereiste. De sterk geconserveerde NAD-afhankelijke ligases worden aangetroffen in alle bacteriën26, terwijl de structureel diverse ATP-afhankelijke enzymen in alle domeinen van het leven kunnen worden geïdentificeerd 8,27. DNA-ligases spelen een belangrijke rol bij de verwerking van Okazaki-fragmenten tijdens replicatie en zijn ook betrokken bij verschillende DNA-herstelroutes, zoals nucleotide- en base-excisiereparatie, door het afdichten van spontane inkepingen en inkepingen die overblijven na reparatie 8,10. Verschillende DNA-ligases vertonen verschillende capaciteiten om verschillende conformaties van DNA-breuken te verbinden, waaronder inkepingen in een duplex, dubbelstrengs breuken, mismatches en hiaten, evenals RNA- en DNA-hybriden 28,29,30. Een breed scala aan ligeerbare substraten kan worden geassembleerd door oligonucleotiden te gloeien met een 5'-fosfaat om naast elkaar geplaatste 5'- en 3'-termini te genereren in een nucleïnezuurduplex 31,32,33. De meest gebruikelijke analysemethode is resolutie door ureum PAGE in een eindpuntanalyseformaat; Recente innovaties zijn echter het gebruik van capillaire gelelektroforese, die een hoge doorvoer mogelijk maakt34, massaspectrometrische profilering35, evenals een homogene moleculaire bakentest, die tijdopgeloste monitoring mogelijk maakt36.

De eerste stap in een ligatiereactie is de adenylering van het ligase-enzym door adenosinetrifosfaat (ATP) of nicotinamide-adeninedinucleotide (NAD), wat resulteert in een covalent enzymtussenproduct. De tweede stap in de reactie is adenylering van het nucleïnezuursubstraat aan het 5'-uiteinde van de nick-plaats, gevolgd door ligatie van de nucleïnezuur-nick-strengen. Veel ligase-enzymen die recombinant tot expressie worden gebracht in E. coli worden gezuiverd in de geadenyleerde vorm en zijn daarom in staat om nucleïnezuren met succes te ligeren zonder de toevoeging van een nucleotide-cofactor. Dit maakt het moeilijk om te bepalen welk specifiek type nucleotide-cofactor ze nodig hebben voor de ligatie van nucleïnezuren. Naast het beschrijven van assays om de activiteit van DNA-ligase te evalueren, wordt ook een methode gepresenteerd om het cofactorgebruik betrouwbaar te bepalen door het enzym te de-adenyleren met behulp van niet-gelabelde substraten.

Nucleasen zijn een grote en diverse groep DNA/RNA-modificerende enzymen en katalytische RNA's die de fosfodiësterbindingen tussen nucleïnezuren splitsen37. Nuclease-enzymfunctionaliteiten zijn vereist bij DNA-replicatie, -reparatie en RNA-verwerking en kunnen worden geclassificeerd op basis van hun suikerspecificiteit voor DNA, RNA of beide. Endonucleasen hydrolyseren de fosfodiësterbindingen binnen een DNA/RNA-streng, terwijl exonucleasen DNA/RNA-strengen één nucleotide tegelijk hydrolyseren vanaf het 3' of 5' uiteinde en dit kunnen doen van het 3' tot 5' of het 5' tot 3' uiteinde van het DNA38.

Hoewel veel nuclease-eiwitten niet-specifiek zijn en bij meerdere processen betrokken kunnen zijn, zijn andere zeer specifiek voor een bepaalde sequentie of DNA-schade 6,39,40. Sequentiespecifieke nucleasen worden gebruikt in een breed scala aan biotechnologische toepassingen, zoals klonen, mutagenese en genoombewerking. Populaire nucleasen voor deze toepassingen zijn restrictienucleasen41, zinkvingernucleasen42, transcriptionele activator-achtige effectornucleasen en meest recentelijk de RNA-geleide gemanipuleerde CRISPR-nucleasen43. Schadespecifieke nucleasen zijn onlangs geïdentificeerd, zoals het EndoMS-nuclease, dat specifiek is voor mismatches in het DNA via zijn mismatch-specifieke RecB-achtige nucleasedomein 5,44. Nuclease-activiteitstesten zijn in het verleden uitgevoerd als discontinue tests met radioactief gelabelde substraten; Naast hun andere nadelen maken deze echter niet de identificatie mogelijk van de plaats die wordt doorsneden door een nuclease-eiwit, wat mogelijk is bij gebruik van fluorescerend geëtiketteerde substraten45,46. Meer recentelijk zijn continue nuclease-assays ontwikkeld die werken door verschillende DNA-kleurstoffen te gebruiken die in verschillende toestanden met DNA interageren; bijvoorbeeld het uitzenden van een hoger fluorescerend signaal bij interactie met dsDNA dan in zijn ongebonden toestand, of specifiek binden aan korte RNA's47. Andere continue nucleasetesten maken gebruik van DNA-haarspelden met een fluorofoorgroep aan de 5' en een quencher aan het 3'-uiteinde, zodat de fluorescentie toeneemt naarmate het oligonucleotide wordt afgebroken als gevolg van een scheiding van de fluorofoor en de quencher48. Hoewel deze tests het mogelijk maken om de kinetiek van DNA-afbrekende eiwitten te karakteriseren, vereisen ze voorkennis van de functie en het substraat van het enzym en zijn ze ook beperkt tot enzymen die de DNA-conformatie veranderen om een verschil in kleurstofbinding te veroorzaken. Om deze reden zijn endpoint-assays die individuele nucleaseproducten oplossen nog steeds wenselijk om inzicht te geven in DNA-modificaties veroorzaakt door eiwitactiviteit.

Hier wordt een gedetailleerde procedure gepresenteerd voor het ontwerp van fluorescerend gelabelde DNA/RNA-oligonucleotiden die kunnen worden gemengd en gematcht om substraten te genereren voor het testen van de activiteit van nieuwe nuclease-, polymerase- en ligase-enzymen. De validatie van deze basisset van oligonucleotidesequenties vereenvoudigt het experimentele ontwerp en vergemakkelijkt de economische profilering van een breed scala aan enzymatische functionaliteiten zonder dat een groot aantal op maat gemaakte substraten hoeft te worden aangeschaft. Er wordt een gedetailleerde procedure gegeven voor het uitvoeren van een standaard DNA-verwerkende enzymtest met deze substraten, met behulp van het voorbeeld van DNA-ligase-activiteit en modificaties voor het testen en analyseren van nuclease- en polymerase-enzymen worden beschreven. Bovendien wordt een gewijzigde test gegeven voor het bepalen van de cofactorspecificiteit van het DNA-ligase-enzym met hoge nauwkeurigheid, en worden dubbel gelabelde sondes gebruikt om de assemblage van ligaties met meerdere componenten te evalueren. Ten slotte worden aanpassingen aan het basistestformaat besproken om het mogelijk te maken om eiwit-DNA-interacties met dezelfde substraten te bepalen door middel van de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ontwerp en aankoop van oligonucleotiden

OPMERKING: Ontwerp enkelstrengs oligonucleotiden die moeten worden geassembleerd en gegloeid tot de gewenste duplexen. Een of meer van de strengen in een duplex moeten een fluorescerend deel dragen om de verwerking van oligonucleotide door het betreffende enzym te kunnen volgen. Tabel 1 bevat een basisset van enkelstrengs sequenties die voor een reeks activiteiten kunnen worden samengesteld.

  1. Neem de specifieke modificaties op die nodig zijn voor het enzym van belang, zoals hieronder beschreven.
    1. Voor DNA-ligasesubstraten (Figuur 1): Stel het eenvoudigste substraat samen uit drie oligonucleotiden: een 5' gefosforyleerde donorstreng (NL2), een 5' FAM-gelabelde acceptorstreng (NL1) en een complement dat de twee overbrugt (NL3).
      1. Zorg ervoor dat de strengen die het eindpunt van 5' van de ligatabele inkeping vormen, zijn gefosforyleerd voordat u de substraatmastermix in stap 2 monteert. Bestel dit als een modificatie op NL2 (zoals aangegeven in Tabel 1) of gebruik enzymatische fosforylering met T4 polynucleotide kinase na resuspendatie van de oligonucleotiden.
      2. Neem de 5'-terminale fosforylering van NL6 en NL8 op, die het complement van dubbelstrengs breuken vormen zoals afgebeeld in figuur 1A (NL6/NL7 en NL8/NL9), aangezien dit het meest lijkt op het natuurlijke substraat dat wordt geproduceerd uit een restrictie-endonuclease. Gebruik een dubbel gelabeld substraat om de relatieve mate van ligatie te bepalen voor assemblages met meerdere onderdelen (zie stap 6).
      3. Verander de complementstreng om mismatches (NL10) en hiaten (NL11) te produceren.
        OPMERKING: Variaties op het eenvoudige ingesneden substraat zijn weergegeven in figuur 1A. Het is mogelijk om andere sequenties te gebruiken om een nog breder scala aan mismatches of langere hiaten te produceren door de onderstreepte positie te variëren.
      4. Vervang DNA-oligonucleotiden door RNA-oligonucleotiden.
        OPMERKING: Variaties op het eenvoudige ingesneden substraat worden weergegeven in figuur 1B. Een breder scala aan DNA/RNA-duplexen kan worden gegenereerd door extra combinaties van de hier gegeven basisset om bijvoorbeeld dubbelstrengs breuken te genereren die zowel RNA als DNA bevatten. Een voorbeeld van deze variatie wordt gegeven in stap 6 hieronder, waar een dual-label strategie wordt gebruikt.
    2. Voor DNA-polymerasesubstraten: Monteer de oligonucleotiden NL1 en NL3 die in tabel 1 worden vermeld om een eenvoudige primer-uitbreidingstest te verkrijgen. Onderzoek aanvullende aspecten van polymerase-activiteit door modificaties aan te brengen in de NL1 (primer) of NL3 (sjabloon) strengen.
      1. Neem beschadigde base-analogen op in de NL3-oligonucleotide vóór positie 20 om het vermogen te bepalen om beschadigde laesies op de sjabloonstreng te omzeilen.
      2. Neem beschadigde base-analogen op in de NL1-oligonucleotide op positie 20 om het vermogen te bepalen om een beschadigde primer te verlengen.
      3. Gebruik RNL1 of RNL3 in de duplex om de uitbreiding van een RNA-primer of het gebruik van een RNA-sjabloon te onderzoeken.
    3. Voor nucleasesubstraten (Figuur 2): Assembleer oligonucleotiden om een niet-uitputtende reeks dubbel- en enkelstrengs substraten te verkrijgen (Figuur 2Ai), evenals een reeks geflapte en gespreide juncties (Figuur 2Aii) en beschadigde substraten (Figuur 2B).
      1. Als u ribonuclease-activiteiten wilt onderzoeken, vervangt u iteratief NL1, NL2 en NL3 door RNL1, RNL2 en RNL3. Gebruik extra RNA-versies van HJ5 en HJ6 om deze set verder uit te breiden.
      2. Gebruik oligonucleotiden MD5, MD6 en MD9 met een centraal geplaatste modificatie die oxidatieve schade nabootst, een abasisch reparatietussenproduct of een deaminatieproduct (Figuur 2B). De substraten zullen op deze positie splijting van de streng detecteren. Label de aanvulling NL3-streng met een orthogonale fluorofoor zoals TAMRA om dubbelstrengs splitsing te detecteren (zie stap 6).
      3. Gebruik orthogonale labeling van het complement om dubbelstrengs snijden te detecteren op de niet-overeenkomende plaatsen op zowel de sonde (NL5 en ND9) als de complementstrengen (MD10 en NL10).
  2. Bestel synthetische oligonucleotiden met relevante fluoroforen en andere modificaties bij een commerciële verkoper.
    OPMERKING: Een syntheseschaal van 100 nM en HPLC-zuivering na de synthese zijn geschikt voor de beschreven tests.

2. Het assembleren en gloeien van nucleïnezuurduplexen

  1. Resuspensie en verdunning van oligonucleotiden
    1. Centrifugeer voor het openen de gevriesdroogde oligonucleotiden in hun buisjes van 2 ml op volle snelheid in een tafelcentrifuge gedurende 2-5 minuten om er zeker van te zijn dat het nucleïnezuur zich op de bodem van de buis bevindt.
    2. Bereid een stamvoorraad van 100 μM voor door de oligonucleotiden te resuspenderen in TE-buffer (10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris), 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)). Zorg ervoor dat de oligonucleotiden grondig worden geresuspendeerd door herhaalde zachte vortexen en korte centrifugatie op volle snelheid.
    3. Bereid een voorraad van 10 μM voor door een aliquot mastermateriaal te verdunnen met TE-buffer. Verdun de voorraad van 10 μM met ultrapuur water (MQ-water) om werkvoorraden te bereiden met concentraties van 0.5 μM, 0.7 μM of 2.5 μM volgens tabel 2.
  2. Monteren en gloeien van de reactiemastermixen
    1. Gebruik werkvoorraden om de reactiemastermengsels samen te stellen met behulp van de combinaties in tabel 2 en de volumes in tabel 3. Voor de standaard DNA-ligasetest en de meeste andere hier beschreven tests is de uiteindelijke buffersamenstelling 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol (DTT) met 10 mM Mg als het tweewaardige kation.
    2. Gloei de oligonucleotiden in een PCR- of microcentrifugebuis door ze gedurende 5 minuten bij 95 °C te verwarmen met behulp van een verwarmingsblok of thermocycler. Laat 30 minuten (volumes <1 ml) tot 1 uur (volumes >1 ml) afkoelen tot kamertemperatuur. Voor langere oligonucleotiden (>40 nt) koelt u langzamer af met behulp van een thermocycler met een neerwaartse helling van 95 °C tot 25 °C gedurende 45 minuten, of laat u de buis met het gloeimengsel in een bekerglas kokend water van 1 liter drijven en een nacht afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Voeg nucleotidecofactoren en andere warmtegevoelige buffercomponenten toe aan de mastermix na afkoeling tot kamertemperatuur. Gebruik het uiteindelijke reactiemengsel rechtstreeks voor de bepaling door toevoeging van een enzym (zie stap 3 hieronder) of bewaar het bij -20 °C voor toekomstig gebruik.

3. Standaard testopstelling

  1. Assemblage en initiatie van de analysereactie
    1. Combineer 22,5 μl van het substraatmastermengsel van belang met 2,5 μl van het DNA-ligase of een ander enzym van belang in een PCR-buis. Voer reacties in tweevoud of drievoud uit, vooral als de resultaten worden gekwantificeerd.
    2. Neem een controle zonder eiwit (alleen buffer) op in de analysemonsters. Neem op dit moment geen cofactorcontroles op, indien nodig.
      OPMERKING: Enzymen kunnen worden bewaard bij -20 °C in 50% v/v glycerol, waardoor ze rechtstreeks uit de oplossing kunnen worden gepipetteerd. Zorg ervoor dat enzymoplossingen met glycerol goed worden gemengd voordat ze worden toegevoegd, hetzij door pipetteren om te mengen of door zachte vortexen.
  2. Breng de reacties onmiddellijk over naar een PCR-machine bij 25 °C en incubeer gedurende 30 minuten. Varieer de temperatuur en duur afhankelijk van de optimale omstandigheden voor enzymactiviteit.
  3. Blus de reacties door 5 μL laadkleurstof toe te voegen (95% formamide, 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), broomfenolblauw) en incubeer bij 95 °C gedurende 5 min.

4. Analyse van de analyseresultaten

  1. Bereid Tris-Borate-EDTA (TBE)-Ureum PAGE gels zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid een voorraad van 20% acrylamide, 7 M ureum en 1x TBE-oplossing voor. Gebruik voor de hier beschreven oligonucleotideset acrylamide/bis-oplossing in een verhouding van 29:1 voor een optimale resolutie.
    2. Meng voor één gel 10 ml 20% acrylamide en 7 M ureumoplossing met 100 μl APS (10%) en 3 μl tetramethylethyleendiamine (TMED) en giet in een gelcaster.
  2. Nadat de gel is gestold, voert u de monsters uit op de TBE-ureumgel bij 45 - 55 °C.
    1. Laat de gel 30 minuten in 1x TBE-buffer lopen op 10 mA per gel met externe verwarming.
    2. Verwijder overtollig ureum in de putjes van de gel door te spoelen met 1x TBE met behulp van een weidepipet.
    3. Laad 10 μL van elke reactie en laat 1,0-1,5 uur op 10 mA draaien met externe verwarming.
  3. Visualiseer de gel op de imager met de juiste instellingen voor de gekozen fluorofoor. Gebruik voor FAM een filterset die excitatie/emissie geeft bij 495/519 nm, die in de meeste imagers als een pre-set wordt opgeslagen.
  4. Kwantificeer de bandintensiteit van het product en het substraat met behulp van beeldverwerkingssoftware met de imager, of een extern programma zoals ImageJ49,50 en bereken het percentage van het product met behulp van de formule
    figure-protocol-1
    Waarbij P de geïntegreerde waarde van de productband is en S het geïntegreerde gebied van de substraatband. In het geval van het voorbeeld van de DNA-ligasereactie loopt de productband op 40 nucleotiden (nt) en de substraatband op 20 nt.

5. De-adenylering van het DNA-ligase om de cofactorspecificiteit te testen

  1. Bereiding van reactiemastermixen
    1. Bereid één set van de mastermix met de FAM-gelabelde NL1-oligonucleotide zoals beschreven in tabel 4. Bereid een tweede set met het NL1-oligonucleotide zonder FAM-label, zoals beschreven in tabel 4.
    2. Verwarm beide DNA-duplexen afzonderlijk tot 95 °C gedurende 5 minuten en koel ze 30 min tot 1 uur af tot 25 °C. Voeg geen nucleotide-cofactor toe aan een van beide mastermixen.
  2. Assemblage en initiatie van de-adenylatiereactie
    1. Bereid een enkele de-adenylatiereactie voor voor elk te testen cofactortype/concentratie door 10 μl van het niet-geëtiketteerde mastermengsel te combineren met 2,5 μl ligase-enzym.
    2. Bereid extra buisjes voor als no-cofactor-controle en geen eiwit-controle (2,5 μL buffer toegevoegd in plaats van enzym).
    3. Incubeer de reacties bij een temperatuur die specifiek is voor de optimale activiteit van het enzym, gedurende 1-2 uur. De incubatietijd kan worden verlengd als het enzym nog steeds geadenyleerd is.
  3. Voer de ligatiereactie uit met de cofactor.
    1. Voeg 10 μL van het gelabelde mastermengsel en 2,5 μL van de gewenste nucleotidecofactoren (bijv. ATP, NAD, ADP of GTP) rechtstreeks toe aan de gedeadenyleerde reactie (eindconcentratie 0,1-1 mM).
    2. Voeg 2,5 μL reactiebuffer toe aan de cofactorcontrole zonder nucleotide.
    3. Incubeer de reacties voor dezelfde tijdsperiode en temperatuur als eerder gebruikt. Blus en visualiseer zoals beschreven in stap 4.

6. Gebruik van dubbel gelabelde substraten voor gespalkte ligatie of meerdelige assemblage

  1. Ontwerp en koop een oligonucleotide met een fluorescerend deel dat een ander excitatie-/emissiespectrum heeft dan de reeds gebruikte fluorofoor.
    1. Gebruik in de hier beschreven opstelling NL2 (TAMRA) oligonucleotide met 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) aan het 3'-uiteinde (tabel 1).
  2. Stel de mastermix samen zoals hieronder beschreven.
    1. Combineer de componenten van de reactie beschreven in stap 2, inclusief equimolaire verhoudingen van alle oligonucleotiden die in de assemblage worden gebruikt, evenals buffer- en tweewaardige kationen.
    2. Gloeien door verwarmen bij 95 °C gedurende 5 minuten en afkoelen bij 25 °C gedurende 30 min - 1 uur. Voeg de cofactor en het enzym toe en incubeer zoals beschreven in stap 3.
  3. Voer de monsters uit en beeldde ze af zoals beschreven in stap 4 met behulp van de juiste kanalen voor het fluorofoorpaar in het substraat. In het geval van FAM en TAMRA zijn dit de fluoresceïne (FITC) en tetramethylrhodamine (TRITC) kanalen die op de meeste beeldvormers aanwezig zijn.

7. Evaluatie van DNA-binding door middel van Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) op native gel

  1. Bereid een 10% native TBE PAGE gel zoals hieronder beschreven.
    1. Combineer 2,5 ml 40% acrylamide, 1 ml 10x TBE, 100 μl 10% APS, 3 μl TMED en 6,5 ml MQ-water en giet in een gelcaster.
  2. Monteer de bindingsreactie zoals hieronder beschreven.
    1. Monteer het EMSA-substraat volgens tabel 5 zodat EDTA (10 mM) is opgenomen en metaalionen zijn weggelaten.
    2. Combineer 20 μL van de EMSA substraat mastermix met 5 μL van het eiwit in een PCR-buisje. Voeg een controlemonster zonder eiwit toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij 25 °C.
  3. Analyseer door middel van natuurlijke elektroforese zoals hieronder beschreven.
    1. Voeg 5 μl 5x natuurlijke laadkleurstof (100 mM EDTA, 0,25 % broomfenolblauw, 25% v/v glycerol en MQ-water tot 1 ml) toe aan de monsters.
    2. Laad op de voorbereide gel en laat deze 2-3 uur op 60 V draaien met afkoeling door watercirculatie tot het verffront zich enkele cm boven het uiteinde van de gel bevindt.
    3. Visualiseer en analyseer gels zoals beschreven in stap 4.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligatie door DNA-ligase
De enzymatische activiteit van DNA-ligase zal resulteren in een toename van de grootte van het fluorescerend gelabelde oligonucleotide wanneer het wordt gevisualiseerd op een ureum PAGE-gel. In het geval van de substraten voor zowel DNA- als RNA-ligatie die in tabel 2 zijn vermeld, komt dit overeen met een verdubbeling in grootte van 20 nt naar 40 nt (figuur 3A). Optimale enzymactiviteit kan worden bepaald door veranderende omstandigheden zoals temperatuur, eiwitconcentratie of incubatietijd (Figuur 3B), nucleotidecofactoren, metaalcofactoren (Figuur 3C). De relatieve activiteiten van een ligase op verschillende substraten kunnen parallel worden vergeleken (Figuur 3D).

Kwantificering van product- en substraatbanden wordt uitgedrukt als het percentage van het totale substraat dat is geligeerd en, zoals weergegeven in figuur 3, kan worden gebruikt om de specifieke activiteit van het enzym te evalueren of om activiteitsoptima te bepalen, zoals tweewaardige kationvoorkeur, temperatuur of pH.

Het bacteriële DNA-ligase DV-1-1-Lig (Figuur 3) is in staat om DNA-substraten te ligeren en niet overeen te komen met DNA en kan zowel magnesium als mangaan gebruiken voor ligatieactiviteit, met een voorkeur voor magnesium. Verdere details over dit enzym zijn te vinden in51.

Primer-uitbreiding door DNA-polymerase
DNA-polymerase-activiteit door de uitbreiding van de 20 nt fluorescerend gelabelde primer zal resulteren in een groottetoename tot 40 nt bij gebruik van de hier gepresenteerde oligonucleotideset (Figuur 4A). Gedeeltelijk uitgevouwen producten verschijnen als een ladder van producten tot de grootte van de sjabloon (Figuur 4B en Figuur 4C). De hier afgebeelde primer-uitbreidingstest (figuur 4C) leidde tot de volledige synthese van de primerstreng.

Afbraak door nuclease
Nuclease-activiteit resulteert in een vermindering van de grootte van het fluorescerend gelabelde oligonucleotide wanneer het wordt gevisualiseerd op een ureum PAGE-gel. Nucleasen met specifieke endonuclease-activiteit kunnen resulteren in een enkel 20 nt-product (Figuur 5A-C). Nucleasen met exonuclease-activiteit zullen resulteren in fluorescerend gelabelde oligonucleotiden van verschillende grootte (Figuur 5D-F). Hier worden de resultaten getoond van een bacterieel Antarctisch metagenoomnuclease-eiwit, dat specifieke endonuclease-activiteit vertoont op het dubbelstrengs abasische plaatssubstraat en niet-specifieke exonuclease-activiteit op het enkelstrengs substraat (respectievelijk Figuur 5C en Figuur 5F).

Ligase de-adenylatie en nucleotide cofactor gebruik assay
Veel recombinant tot expressie gebrachte ligase-enzymen worden in een reeds geadenyleerde toestand gezuiverd van ATP of NAD die uit hun gastheer zijn opgeslokt 51,52,53,54,55. Verwijdering van dit covalente AMP-tussenproduct is noodzakelijk voor een nauwkeurige identificatie van het bereik van de nucleotide-cofactoren die het enzym kan gebruiken voor de ligatie van nucleïnezuursubstraten51. Omzet van het geadenyleerde ligase-enzym met niet-gelabeld substraat bij afwezigheid van een exogene nucleotide-cofactor zal het adenyleringstussenproduct uitputten. Door fluorescerend gelabelde DNA-substraten te gebruiken en nucleotide-cofactor toe te voegen in de tweede stap, is elk ligatieproduct dat zichtbaar is bij gebruik van een fluorescerend kanaal (Fluoresceïne-FITC) op de gelimager het resultaat van adenylering met de nucleotide-cofactor die bij deze stap wordt toegevoegd.

Activiteitstesten die zijn opgezet met een bacterieel DNA-ligase dat tot expressie wordt gebracht in een E. coli-systeem, tonen aan dat het werd gezuiverd in een gepre-adenyleerde vorm en een achtergrondvermogen vertoonde om het ingepikte DNA te ligate zonder extra cofactor (Figuur 6Ai-ii). De toevoeging van ATP aan het geadenyleerde ligase verhoogt de hoeveelheid geligeerd product die in de reactie wordt gevormd, maar dit is niet altijd betrouwbaar omdat deze basale activiteit een onjuiste indruk zou kunnen geven van het gebruik van breedspectrumcofactoren of verdere toevoegingen van nucleotidecofactoren aan een reactie de ligatie van het substraat zouden kunnen remmen. Door het ligase eerst te incuberen met een niet-gelabelde versie van het geknipte DNA-substraat, wordt het AMP omgedraaid en wordt er geen ligatie waargenomen op het gelabelde DNA-nick-substraat, tenzij ATP aan de reactie wordt toegevoegd. De tweede activiteitstest (Figuur 6B) laat zien dat het gedeadenyleerde DNA-ligase een verbeterde ligatie-activiteit heeft op nick-DNA-substraat met de toevoeging van ATP en ADP. Er is ook enige verbetering in ligatie met de toevoeging van GTP, die groter is dan de achtergrondligatie die wordt gezien in de no-cofactor-controle. De ligatie die wordt waargenomen in reacties met NAD is vergelijkbaar met de ligatie die wordt gezien in de controlereacties zonder cofactor, wat NAD uitsluit als een cofactor voor ligatie.

Resultaten van dual-labeled assay
De orthogonale fluoroforen kunnen worden gebruikt om activiteit in verschillende delen van een complex substraat vast te stellen. Het voorbeeld in figuur 7 toont de activiteit van een recent beschreven DNA-ligase R2D56 in vergelijking met T4-DNA-ligase op een gespalkte DNA/RNA-duplex. Ligatie van de DNA-acceptor aan het RNA-donorgedeelte van het substraat werd gedetecteerd met behulp van 6-FAM, terwijl ligatie van de RNA-acceptor aan een DNA-donor werd gedetecteerd met 5-TAMRA (Figuur 7A). De relatieve mate van DNA-ligatie aan beide uiteinden van het RNA-substraat kan worden geëvalueerd door de aanwezigheid van een productband met fluorescentie in zowel de 6-FAM- als de 5-TAGRA-kanalen, die in het samengestelde beeld geel verschijnt, terwijl de individuele 6-FAM en 5-TAMRA respectievelijk groen en geel zijn (Figuur 7B). Zoals beschreven in een eerdere publicatie56, was alleen R2D-ligase in staat om DNA te binden aan het 5'-uiteinde van RNA, terwijl beide liga's in staat waren om DNA te binden aan het 3'-uiteinde van het RNA. Bij het ligeren van beide DNA-moleculen aan het RNA in mengsels van enkele reacties, kan R2D-ligase de DNA-oligos aan beide uiteinden van het RNA binden, aangezien een band naar boven verschuift en een verandering van kleur naar geel wordt waargenomen (Figuur 7C).

Het tweede voorbeeld in figuur 8 maakt gebruik van een dubbele etiketteringsbenadering om de ligatie van meerdere oligonucleotiden bij verschillende pH-waarden aan te tonen. Het substraat, samengesteld uit een mengsel van zeven oligonucleotiden, werd gebruikt om het vermogen van de R2D-ligase aan te tonen om korte fragmenten te assembleren. De 5'-streng heeft een FAM-fluorofoor-gelabelde 14 nt-streng, terwijl de complementstreng een TAGRA-fluorofoor heeft aan het 3'-uiteinde van de 16 nt-oligonucleotide. Succesvolle ligatie is te zien aan extra hogere banden voor de FAM (groene) oligo en de TAMRA (rode) oligo. De overlapping van beide fluoroforen geeft de nucleotideband in geel als volledig geligeerde strengen van dezelfde grootte.

Resultaten van DNA-binding van een DNA-ligase-enzym met behulp van EMSA
De binding van het DNA-ligase-enzym aan een gefosforyleerd gefruisonderd DNA resulteert in een complex dat een hoger molecuulgewicht heeft dan het oligonucleotide alleen (Figuur 9A). Hier wordt de binding van een bacterieel ATP-afhankelijk DNA-ligase aan nick-DNA-substraat getoond. Bij hoge eiwitconcentraties is het grootste deel van het gelabelde DNA-substraat gebonden en te zien in de hogere molecuulgewichtbanden; bij lagere eiwitconcentraties overheerst het vrije DNA-substraat (Figuur 9B).

figure-results-1
Figuur 1: Schema's van de verschillende nucleïnezuursubstraten ontworpen voor het testen van ligase-enzymatische activiteit. Sterren vertegenwoordigen de etikettering met de 6-carboxyfluoresceïne op het eindpunt van 5' (5' FAM). Gelabelde strengen worden aangeduid met een zwarte of donkerblauwe/rode (in het geval van DNA/RNA-duplexen) lijn, terwijl niet-gelabelde delen van substraatduplexen worden aangegeven met een grijze of lichtblauwe/rode (in het geval van DNA/RNA-duplexen) lijn. Gelabelde strengen zijn 20 nt, en als de strengen worden geligeerd, vormen ze een product van 40 nt. 5' gefosforyleerde plaatsen worden aangegeven met een P in een cirkel. Oligonucleotidestrengen zijn gelabeld en de namen worden vermeld in tabel 1 en tabel 2. (A) Ontwerp van dubbelstrengs DNA-substraten met verschillende soorten breuken, gebruikt om de enzymatische activiteit van DNA-ligasen te testen. (B) Ontwerp van RNA en RNA/DNA dubbelstrengs substraten die DNA en RNA oligonucleotiden bevatten. De substraten bevatten een enkele nick-plaats en worden gebruikt om het vermogen van ligases te testen om nick-breuken van RNA/DNA-duplexen af te dichten. De rode lijn vertegenwoordigt RNA-oligonucleotiden en de blauwe lijnen vertegenwoordigen DNA-oligonucleotiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema's van de verschillende nucleïnezuursubstraten ontworpen voor het testen van nuclease-enzymatische activiteit. Sterren vertegenwoordigen de etikettering met de 6-carboxyfluoresceïne op de 5'-terminal (5' FAM). Gelabelde strengen worden aangegeven met een zwarte lijn, terwijl niet-gelabelde delen van substraatduplexen worden aangegeven met een grijze lijn. 5' gefosforyleerde plaatsen worden aangegeven met een P in een cirkel. Oligonucleotidestrengen zijn gelabeld en de namen worden vermeld in tabel 1 en tabel 2. (A) Ontwerp van substraten met dubbel- en enkelstrengs delen. (B) Het ontwerp van dubbelstrengs DNA-substraten wordt gewijzigd om enkelstrengs flappen te genereren aan het 3' of 5' uiteinde (geflapt 3', geflapt 5' of geflapt aan beide uiteinden (gespreid)). (C) Ontwerp van dubbelstrengs substraten met beschadigde ondergronden of mismatches op een centrale positie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Testen van de ligatieactiviteit van een bacterieel ATP-afhankelijk DNA-ligase DV-1-1-Lig. (A) Schema van enzymtesten voor ligase-activiteit op DNA-substraten met resultaten geanalyseerd op een TBE-ureum PAGE-gel. Sterren vertegenwoordigen de etikettering met de 6-carboxyfluoresceïne op de 5'-terminal (5' FAM). Gelabelde strengen worden aangegeven met een zwarte lijn, terwijl niet-gelabelde delen van substraatduplexen die niet zichtbaar zijn tijdens de analyse worden aangegeven met grijze lijnen. (B) Kwantificering van ligatie door DV-1-1-Lig op genicked DNA op verschillende tijdstippen. De activiteit tegen elk substraat werd in tweevoud uitgevoerd. Reacties werden geïncubeerd gedurende verschillende tijdsperioden (0,5 uur, 1 uur, 2 uur, 3 uur en 4 uur) bij 25 °C, met een eindeiwitconcentratie van 4 μM, een ATP-eindconcentratie van 1 mM en een eindconcentratie van 10 mM magnesiumionen. (C) Ligatie van gescheurd DNA-substraat met magnesium (Mg) of mangaan (Mn). De reacties werden gedurende 3 uur bij 25 °C uitgevoerd met een ATP-eindconcentratie van 1 mM en een metaalionenconcentratie van 10 mM. (D) Resultaten van ligatie op verschillende DNA-substraten. Reacties werden uitgevoerd gedurende 8 uur, bij 20 °C, met een eindeiwitconcentratie van 2 μM, een eindconcentratie van 1 mM ATP en een eindconcentratie van 10 mM magnesium. De toevoeging van eiwit aan de reactie wordt aangegeven met een plusteken (+). Controlereacties worden aangegeven met C en de afwezigheid van ingesloten eiwit wordt aangegeven met een minteken (-). Product (40 nt) en substraat (20 nt) zijn aangegeven met rode pijlen. De resultaten van activiteitstesten werden gevisualiseerd met behulp van een beeldvormingssysteem. Banden werden gekwantificeerd door integratie van intensiteit met behulp van de ImageJ-software49 en grafieken werden gegenereerd met behulp van grafische software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: DNA-polymerasetest. (A) Schema van de primer-uitbreidingstest op een DNA-substraat. Sterren vertegenwoordigen de etikettering met de 6-carboxyfluoresceïne op de 5'-terminal (5' FAM). Gelabelde strengen worden aangegeven met een zwarte lijn, terwijl niet-gelabelde delen van substraatduplexen die niet zichtbaar zijn tijdens de analyse worden aangegeven met grijze lijnen. (B) Schema van een verwachte TBE Ureum PAGE-gelresultaten die een toename van de lengte van de gelabelde primer laten zien met de toevoeging van nucleotiden. (C) Voorbeeld van primerverlenging met het enzym E. coli Klenow-fragment-DNA-polymerase. De toevoeging van eiwit aan de reactie wordt aangegeven met een plusteken (+). Rijstrook 1, 12,5 U; Rijstrook 2, 2,5 U; Rijstrook 3, 1.25U. Controlereacties worden aangegeven met een C en de afwezigheid van ingesloten eiwit wordt aangegeven met een minteken (-). De reacties werden gedurende 15 minuten bij 25 °C uitgevoerd en bevatten 5 mM MgCl2, 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl2, 1 mM DTT en 0,25 mM dNTP's. Product (40 nt) en substraat (20 nt) zijn aangegeven met rode pijlen. De resultaten van activiteitstesten werden gevisualiseerd met behulp van een beeldvormingssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Testactiviteit van een bacterieel Antarctisch metagenoomnuclease met behulp van verschillende substraten, metalen en incubatietemperaturen. (A) Schematisch-specifieke endonuclease-activiteit van een nuclease-eiwit op het abasische substraat (aangegeven met een x). Sterren vertegenwoordigen de etikettering met de 6-carboxyfluoresceïne op de 5'-terminal (5' FAM). Zwarte lijnen vertegenwoordigen de gelabelde strengen en grijze lijnen vertegenwoordigen de niet-gelabelde DNA-strengen. Specifieke doorsnijding door de nuclease wordt weergegeven aan de rechterkant van de abasische plaats, maar kan ook aan de linkerkant voorkomen. (B) Schema van een denaturerende ureum PAGE-gel met ongesneden substraat (40 nt) in afwezigheid van eiwit, aangegeven met een minteken (-) en het gesneden product (20 nt), in aanwezigheid van een nuclease aangegeven met een plusteken (+). (C) Een voorbeeld van een TBE ureum PAGE-gel die resultaten toont van specifieke endonuclease-nuclease-activiteit op een dubbelstrengs DNA-substraat met een abasische plaats. De test werd uitgevoerd met een eiwitconcentratie van 1,0 μM en 1 mM MgCl2. Bij 20 °C werden twee controlereacties uitgevoerd, één zonder eiwit (put 1) en één zonder metaal (put 2). De reacties werden gedurende 5 uur geïncubeerd bij oplopende temperaturen van 1 °C tot 50 °C, zoals aangegeven boven de gelafbeelding. De toevoeging van het eiwit wordt aangegeven met een plusteken (+) en de afwezigheid van het eiwit wordt aangegeven met een minteken (-). Het substraat en product worden aangegeven met rode pijlen. (D) Schema met de niet-specifieke exonuclease-activiteit van een nuclease-eiwit op een enkelstrengs substraat. Sterren vertegenwoordigen de etikettering met het 6-carboxyfluoresceïne op het eindpunt 5' (5'FAM). Zwarte lijnen geven de gelabelde strengen weer. Niet-specifiek knippen van de nuclease resulteert in gelabelde strengen van verschillende lengtes (<39 nt). (E) Schema van een denaturerende ureum PAGE-gel met ongesneden substraat (40 nt), waar geen eiwit is toegevoegd (-), en met gesneden substraat van verschillende lengtes, waar het eiwit is toegevoegd (+) dat het gevolg kan zijn van de activiteit van een niet-specifiek exonuclease. (F) TBE ureum PAGE-gels tonen een voorbeeld van niet-specifieke exonuclease-activiteit van hetzelfde Antarctische metagenoomnuclease met een enkelstrengs substraat. De test werd uitgevoerd bij 20 °C gedurende 4 uur met eiwit in een eindconcentratie van 1,5 μM en een eindconcentratie van het metaalion in 10 mM. Het gebruikte metaalion is boven de afbeelding aangegeven. De toevoeging van het eiwit wordt aangegeven met een plusteken (+) en de afwezigheid van het eiwit wordt aangegeven met een minteken (-). Het substraat (40 nt) wordt aangegeven door de rode pijl en de producten van verschillende lengtes worden aangegeven door de rode klem. De resultaten van alle nucleasereacties werden gevisualiseerd met behulp van een beeldvormingssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Ligatieresultaten van gescheurd DNA-substraat door geadenyleerde en gede-adenyleerde versies van een bacterieel DNA-ligase. (A) i) Kwantificering van ligatie door geadenyleerd en gede-adenyleerd ligase-enzym, met en zonder ATP. Punten op de grafiek vertegenwoordigen gemiddelden van elke replicatie van reacties. Standaard foutbalken zijn inbegrepen. ii) TBE ureum PAGE-gel met de resultaten van ligatie op nick-DNA-substraat door geadenyleerd en gedeadenyleerd ligase-enzym, met en zonder ATP. Reacties werden uitgevoerd in drievoud. Het gedeadenyleerde enzym werd gedurende 2 uur bij 25 °C voorgeïncubeerd met niet-gelabeld nick-DNA-substraat en 0,1 μM-enzym, gevolgd door een incubatie van 1 uur met gelabeld nick-DNA-substraat. Het geadenyleerde enzym werd niet voorgeïncubeerd met het niet-gelabelde substraat. ATP (1 mM) werd toegevoegd aan reacties naast de toevoeging van gelabeld DNA-substraat. (B) i) Kwantificering van ligatie door het gedeadenyleerde ligase op nick-DNA met verschillende cofactoren (ATP, NAD, ADP en GTP). Punten op de grafiek vertegenwoordigen gemiddelden van elke concentratie. Foutbalken met standaarddeviatie zijn inbegrepen. ii) DE ureumpagina met de resultaten van de ligatie door de ligase, met en zonder de toevoeging van verschillende cofactoren. De activiteit tegen elk substraat werd in tweevoud uitgevoerd. Reacties werden gedurende 2 uur bij 25 °C voorgeïncubeerd met niet-gelabeld gepikt DNA-substraat, 4 μM-eiwit en 5 mM magnesiumion, gevolgd door een incubatie van 4 uur met de toevoeging van gelabeld genicked DNA-substraat, 5 mM magnesium en verschillende cofactoren bij een eindconcentratie van 1 mM. De toevoeging van eiwit aan de reactie wordt aangegeven met een plusteken (+). Er werden controlereacties gebruikt die geen eiwit (Controls, C) of cofactor (No cofactor) bevatten. Product (40 nt) en substraat (20 nt) zijn aangegeven met rode pijlen. De resultaten van activiteitstesten werden gevisualiseerd met behulp van een beeldvormingssysteem. Banden werden gekwantificeerd door integratie van intensiteit met behulp van de ImageJ-software49. Grafieken werden gegenereerd met behulp van een grafische software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Ligatie van kort fluorescerend gelabelde DNA-oligonucleotiden aan beide uiteinden van een 5' gefosforyleerde RNA-oligo, gepositioneerd door DNA-sjablonen. (A) Schema van DNA-gespalkte DNA-RNA-ligatie die laat zien hoe mogelijke ligatieproducten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een dubbele labelstrategie. (B) Schema van mogelijke producten die naar verwachting te zien zullen zijn op een Urea-PAGE-gel, afgebeeld in twee kanalen. (C) Experimentele resultaten van dubbele fluorofoorligatie. De ligatiereacties werden getest met behulp van T4-DNA-ligase en R2D-ligase, beide in geïsoleerde reacties waarbij DNA werd geligeerd aan het 5'-uiteinde (baan 2-4) of het 3'-uiteinde (baan 5-7) van het RNA of in een enkele reactie waarbij beide DNA-oligonucleotiden werden geligeerd in hetzelfde reactiemengsel (baan 8-10). Geen eiwitcontrole (NPC) had geen enzym toegevoegd. De reactiecondities en de specifieke oligonucleotiden die in dit voorbeeld worden gebruikt, zijn dezelfde als gegeven in56. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Ligatie van meerdere korte oligonucleotidesegmenten met drie R2D-varianten bij verschillende pH. (A) Schema van de meerdelige ligatiestrategie. (B) Representatieve gel die de pH-afhankelijkheid van een meerdelige assemblage aantoont, afgebeeld met zowel FAM- als TAGRA-kanalen. Baan C geen enzymcontrole, banen 1-3 pH 6.0, baan 4-6 pH 6.5, baan 7-9 pH 7 en baan 10-12 pH 7.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: EMSA-resultaten. Schematische en native TBE PAGE-gel van een elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) die de bindingsactiviteit van een ATP-afhankelijke DNA-ligase visualiseert (afkomstig van metagenoomgegevens vande MCMurdo Dry Valleys, Antarctica) op een DNA-substraat. (A) Schema van de EMSAs/DNA-bindingsactiviteit door een DNA-ligase op een nick-DNA-substraat. Bindende resultaten worden gevisualiseerd op een niet-denaturerende TBE PAGE-gel. DNA-substraten gebonden aan ligase-enzym migreren langzamer door de gel, terwijl enzymvrije substraten sneller migreren, wat resulteert in een verschuiving van de bandgrootte (gele vakken) die op de gel wordt gevisualiseerd. Terwijl de substraten worden gevisualiseerd op een niet-denaturerende gel, blijven de oligonucleotiden gegloeid, waardoor de FAM-gelabelde streng (gele ster) aanwezig kan zijn op zowel vrije als gebonden substraten. Een eiwitconcentratiegradiënt kan worden gebruikt om de eiwitconcentratie te bepalen voor een optimale binding. (B) Visualisatie van een EMSA op een native TBE PAGE-gel, die het bindingsvermogen van een ATP-afhankelijke DNA-ligase aan een nick-DNA-substraat bij verschillende eiwitconcentraties aantoont. Het enzym werd gedurende 30 minuten bij 25 °C geïncubeerd met gescheurd DNA-substraat, met een uiteindelijke ATP-concentratie van 1 mM en 40 mM EDTA. Er werden drie verschillende eiwitconcentraties gebruikt (5,5 μM, 2,3 μM en 1,5 μM). De reacties werden uitgevoerd op een 10 % native TBE-gel, met native laadkleurstof in de reacties. Monsters die eiwit bevatten, werden in drievoud opgevoerd voor verschillende eiwitconcentraties. De controlebanen bevatten gescheurd DNA-substraat met 1 mM, uiteindelijk ATP en EDTA, maar geen eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: DNA-substraatoligonucleotidesequenties die worden gebruikt om testsubstraten te construeren. Beschadigingen zijn vetgedrukt en onderstreept aangegeven. Posities van mismatches en hiaten in de uiteindelijke duplex worden onderstreept. Afkortingen: 5' 6-carboxyfluorescien (5' FAM), 8-Oxo-deoxyguanosine (8OxodG), basisch tetrohydrofuraan (dSpacer). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Combinaties van oligonucleotiden die worden gebruikt om mastermixen voor verschillende enzymassays samen te stellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Opstelling van testmastermengsels met maximaal vier oligonucleotiden. Zie Tabel 2 voor oligonucleotidecombinaties die moeten worden gebruikt voor verschillende testsubstraten en tekst voor details van de reactieomstandigheden. Er is minimaal een gelabeld oligonucleotide vereist - extra delen van de duplex worden aangegeven met haakjes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Componenten voor een gelabelde en niet-gelabelde mastermix voor het maken van nick DNA duplex. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Opzetten van EMSA-mastermixen voor verschillende combinaties van duplexen. Zie Tabel 3 voor oligonucleotidecombinaties die kunnen worden gebruikt voor verschillende EMSA-substraten en tekst voor details van de reactieomstandigheden. De EMSA-substraten zijn ontworpen met behulp van dezelfde oligonucleotiden als die voor de activiteitstests. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cruciale stappen in het protocol
Ontwerp en aankoop van oligonucleotide: Bij de aankoop van de oligonucleotiden voor duplexvorming is het essentieel om rekening te houden met het sequentieontwerp. Het wordt aanbevolen om een oligo-analysetool te gebruiken om eigenschappen van de nucleotidesequentie te voorspellen, zoals GC-gehalte, smelttemperatuur, secundaire structuur en dimerisatiepotentieel, voordat u57 bestelt.

Assemblage en gloeien van nucleïnezuurduplexen: Bij de bereiding van RNA/RNA-DNA-duplexen moet ervoor worden gezorgd dat RNase-besmetting wordt voorkomen door reagentia en water te gebruiken die RNase-vrij zijn of door een RNAse-remmer toe te voegen (zolang het onderzochte enzym zelf geen RNAse is). Apparatuur, handschoenen en werkruimte moeten worden behandeld met een RNase-ontsmettingsoplossing voordat de mastermixen worden geassembleerd om afbraak van de oligonucleotiden58 te voorkomen. Stamvoorraden van de RNA-oligonucleotiden kunnen in geval van contaminatie in kleinere batches worden aangemaakt.

DNA-ligases vereisen altijd een nucleotide-cofactor, ATP of NAD, bij een eindconcentratie tussen 0,1 en 1 mM. DNA-polymerasen hebben dNTP's nodig voor de synthese van strengen, en deze worden meestal toegevoegd in equimolaire verhoudingen op 50 μM van elk. Bij het bereiden van mastermixen voor ligase- en polymeraseduplexen moeten nucleotidecofactoren, zoals ATP, NAD en dNTP's, aan het mastermengsel worden toegevoegd nadat het mengsel is verwarmd en afgekoeld tot kamertemperatuur, omdat ze warmtegevoelig zijn.

De 10x buffer voor het gloeien van de oligonucleotiden vereist de toevoeging van DTT, dat een korte halfwaardetijd heeft en idealiter vers of ingevroren moet worden bereid voor gebruik. Kleinere aliquots van de 10x buffer kunnen van tevoren worden voorbereid en opgeslagen bij 4 °C, met toevoeging van DTT voor gebruik.

Oligonucleotidevoorraden en mastermixen moeten worden bewaard bij -20 °C voor langdurig gebruik, en fluorescerend geëtiketteerde oligonucleotiden of mengsels moeten in folie worden verpakt om fotobleken van de fluorofoor te voorkomen. Om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen die de integriteit van de oligonucleotide in gevaar kunnen brengen, is het raadzaam om kleinere volumes (>1 ml) te bereiden en te gebruiken.

Opzet van de test en analyse van de resultaten: Het opnemen van controles is essentieel voor de juiste interpretatie van de testresultaten. Een niet-eiwitcontrole (DNA-substraat met bufferoplossing) moet worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de schijnbare activiteit op het substraat het resultaat is van het enzym. In het geval van nuclease zal exogene substraatdegradatie leiden tot lage molecuulgewichtbanden of laddering bij de controle, terwijl in het geval van ligase of polymerase onvolledige duplexdenaturatie zal resulteren in een hoge moleculaire gewichtsband bij controle. Een positieve controle van de grootte van het verwachte product is opgenomen in tabel 2 en moet worden opgenomen om de juiste productgrootte te verifiëren.

Belangrijke parameters voor een succesvolle elektroforese van het testproduct zijn beschreven in een eerder protocol59. Deze omvatten het ervoor zorgen dat het percentage acrylamide geschikt is voor de substraatgrootte en het gebruik van een geschikte laadkleurstof, afhankelijk van de grootte van het substraat en het type gel dat nodig is voor de visualisatie van de resultaten. De volgkleurstof broomfenolblauw heeft ongeveer de grootte van een oligonucleotide met 10 basen en is daarom geschikt voor de hier beschreven oligonucleotideset; Als er echter een kleurstofband overlapt met het fluorescerende product of de substraatbanden bij gebruik van kortere nucleotiden, kan de volgkleurstof worden vervangen door xyleencyanol, dat langzamer loopt60.

Om een goede resolutie van substraat/productbanden te garanderen, moet de geltank ofwel extern worden verwarmd met behulp van een waterbad of door een hoge spanning (bijv. 180 V). Het is essentieel om ureum PAGE gels gedurende ten minste 30 minuten voor te laten lopen en de putjes met een pipet te spoelen om overtollig ureum te verwijderen om scherpe, rechte banden te verkrijgen die geschikt zijn voor kwantificering.

Voor het kwantificeren van substraten en producten moet een bereik van 20%-80% van het totale materiaal worden omgezet in product om een nauwkeurige integratie van de fluorescerende gelbanden mogelijk te maken. Bij het testen van een nieuw enzym wordt aanbevolen om een gradiënt van eiwitconcentraties uit te voeren, zodat latere metingen in dit bereik kunnen worden uitgevoerd. Veel fluorescentiecamera's hebben ingebouwde bandintegratiefuncties die voor dit doel kunnen worden gebruikt. Als u een extern programma zoals ImageJ49 gebruikt, zorg er dan voor dat de gelafbeelding met hoge kwaliteit in tiff-formaat wordt geëxporteerd.

Aanpassingen en probleemoplossing van de techniek
Ontwerp en aankoop van oligonucleotide: De oligonucleotiden die in dit protocol worden gegeven, zijn nuttige uitgangspunten en kunnen worden uitgebreid, zoals voorgesteld in de sectie methoden, door de oligonucleotidesequenties te wijzigen en wijzigingen aan te brengen.

Standaardtestopstelling en analyse van de resultaten: Proefexperimenten zijn essentieel bij het testen van de activiteit van een nieuw enzym, aangezien de optimale reactieomstandigheden variëren tussen verschillende eiwitten; De parameters die in dit protocol worden gegeven, zijn alleen bedoeld als uitgangspunt. Factoren zoals enzymconcentratie, reactietemperatuur, incubatieduur, cofactor en buffersamenstelling/pH kunnen worden gevarieerd tijdens de assemblage van de mastermix en de analysereactie. Cofactorconcentraties zijn vooral belangrijk omdat een overmaat aan nucleotidecofactoren of metaalionen remmend kan werken, en het is raadzaam om een reeks concentraties van elk te testen. Voor DNA-polymerasen variëren de aanbevolen dNTP-concentraties van 20 tot 200 μM totaal, maar hoge dNTP-concentraties verminderen de getrouwheid61. Evenzo worden polynucleotide-ligases doorgaans getest met een nucleotide-cofactor van 0,1-1,0 mM, maar overmatige concentraties zorgen ervoor dat geaccumuleerd DNA adenylaat wordt en reactieremming62.

Het standaardprotocol gebruikt hier Mg als tweewaardig kation; sommige enzymen zijn echter actiever met mangaan (Mn) of zink (Zn). Mastermixen die Mn of Zn bevatten, moeten worden bereid met een lagere pH-buffer (<7,5) en metalen moeten na verhitting worden toegevoegd. Mastermixen moeten op dezelfde dag worden gebruikt om neerslag en remming van de enzymactiviteit te voorkomen.

Additieven, waaronder verdringingsmiddelen zoals polyethyleenglycol (PEG) of stabilisatoren zoals runderserumalbumine, kunnen worden gebruikt om de activiteit van sommige enzymen te verhogen63,64. Deze moeten vanwege hun thermolabiliteit na de gloeistap worden toegevoegd. Alle biologisch afgeleide reagentia moeten van moleculair-biologische kwaliteit zijn om te voorkomen dat er verontreinigende nucleasen worden geïntroduceerd.

Het volume formamide quenchbuffer dat in dit protocol wordt gebruikt, is geschikt voor de basisset van oligonucleotiden. Voor langere oligonucleotiden moet het volume formamide echter worden verhoogd tot tussen 10 μl en 20 μl om volledige scheiding van de strengen te garanderen, en gedoofde reacties kunnen op ijs worden gekoeld en bij 4 °C worden bewaard tot elektroforese.

Bij sommige enzymen kan een nauwe binding van het eiwit aan het substraat/product de migratie van de oligonucleotiden in de gel tijdens elektroforese verhinderen, vooral wanneer het enzym in hoge concentraties wordt gebruikt. Dit zal zich uiten in een gebrek aan product/substraatbanden op de gel en vaak een ophoping van fluorescerend materiaal (product en/of substraat gecomplexeerd met eiwit) in de putjes. Om deze complexen te verstoren, kan het analysemengsel worden behandeld met proteïnase K voordat de quenchbuffer wordt toegevoegd, of kan natriumdodecylsulfaat (SDS) worden toegevoegd tijdens het blussen.

De activiteit van DNA-ligase produceert twee afzonderlijke banden, die eenvoudig te kwantificeren zijn. Het is mogelijk om dezelfde methode te gebruiken om endonuclease-activiteit te kwantificeren op DNA-schadesubstraat waar een enkel 20-nucleotideproduct wordt verwacht, of EMSA-assays waarbij de gebonden/ongebonden toestanden duidelijk worden onderscheiden. Nauwkeurige kwantificering van polymerase- en processieve nuclease-activiteit is moeilijk door bandintegratie, en in het algemeen wordt aanbevolen om real-time assay met sondes of bakens te gebruiken, zoals beschreven in de inleiding.

De-adenylatie en cofactorspecificiteit van DNA-ligase: Enige optimalisatie van dit protocol kan nodig zijn om alle achtergrondactiviteit te verwijderen, die vervolgens zal worden hersteld door de toevoeging van de nucleotide-cofactor(en). Als de achtergrondligase-activiteit overblijft na de-adenylatie (gezien als ligatie in de no-cofactor-controle), kan de incubatietijd van de de-adenylatiestap worden verlengd of de concentratie van ligase worden verlaagd. Zorg ervoor dat de DNA-nick duplex zonder label geconcentreerder is dan het eiwit (> 4:1::substraat: eiwit). Als de toevoeging van een cofactor in aanwezigheid van gelabeld DNA de ligatie voor geen van de geteste cofactoren herstelt, is het mogelijk dat het enzym is gedenatureerd en moet de de-adenyleringsstap worden verkort. Voor een nieuw ligase of een nieuwe batch van het recombinante enzym is het nuttig om de mate van achtergrondligatie met het geadenyleerde enzym te bepalen in afwezigheid van extra nucleotide-cofactoren. Dit omvat het opzetten van een andere reactie waarbij 10 μL niet-gelabelde mastermix, 10 μL gelabelde mastermix en 2,5 μL van een vers enzym dat niet is gedeadenyleerd, tegelijkertijd worden geïncubeerd.

Gebruik substraten met twee labels: Dit protocol vereist het ontwerp en de aanschaf van een oligonucleotide met een fluorescerend deel dat een ander excitatie-/emissiespectrum heeft dan de oorspronkelijk gebruikte fluorofoor en vervolgens assemblage van dit tot een duplex zodat de twee orthogonale fluoroforen verschillende delen van het substraat labelen. In geval van twijfel zijn er een aantal online spectrale viewers beschikbaar voor het controleren van excitatie- en emissiespectra, bijvoorbeeld FPbase Spectra Viewer en BD Spectrum Viewer, die kunnen worden gebruikt om zowel de compatibiliteit van het fluorofoorpaar als de meest geschikte beeldvormingsinstellingen te controleren. De specifieke instellingen die worden gebruikt voor het visualiseren van de gel zijn afhankelijk van het model van de imager en de gebruikte fluorofoor(en). Het samengestelde beeld registreert het signaal van beide kanalen op de enkele gel en de band waar beide fluoroforen aan hetzelfde product zijn bevestigd, wordt weergegeven als een tussenkleur. Afzonderlijke beelden van individuele kanalen kunnen worden geanalyseerd om de mate van ligatie of degradatie op differentieel gelabelde strengen te kwantificeren.

Beperkingen van de techniek
Hoewel het werken met fluorescerend gelabelde substraten veel voordelen heeft, zoals lage gezondheidsrisico's, zijn er enkele beperkingen waarmee men rekening moet houden bij het werken met dit soort gelabelde substraten. Een daarvan zijn de relatief hoge kosten van het bestellen van deze oligonucleotiden met fluorofoorlabels of modificaties, zoals de toevoeging van beschadigde basen, in vergelijking met interne radiolabeling. Een andere is dat gespecialiseerde verbeeldingsapparatuur en software nodig zijn voor de detectie van gelabelde strengen. Deze functies zijn nu echter opgenomen in de meeste nieuwe gel-verbeeldingssystemen. Men moet ook rekening houden met het potentieel van de fluoroforen om de bindingseigenschappen van de doelinteractie-eiwitten te veranderen. Fluoresceïne en zijn derivaat FAM worden vaak gebruikt om oligonucleotiden te labelen en zijn gevoelig voor veranderingen in pH en nucleobase-quenching65. Deze beperkingen moeten zorgvuldig worden overwogen bij het bepalen van het type en de plaatsing van fluoroforen op het oligonucleotide voor duplexontwerp.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEG en UR zijn werknemers van ArcticZymes Technologies AS, dat de R2D-ligase distribueert. AW, ER-S en RS hebben geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AW wordt ondersteund door een Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS is de ontvanger van een Nieuw-Zeelandse Post Antarctic Scholarship. SG en UR erkennen het Chemisch Instituut van de Universiteit van Tromsø - de Noorse Arctische Universiteit voor technische ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)BioRad1610156
Adenosinetrifosfaat (ATP)Veel leveranciers
Ammoniumpersulfaat (APS)Veel leveranciers
Centrifuge voor op tafelVeel leveranciers
BorateVeel leveranciers
BroomfenolblauwVeel leveranciers
Dithiothreitol (DTT)Veel leveranciers
Elektroforesesysteem met circelair waterbadVeel leveranciers
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Veel leveranciersAndere metaalionen kunnen de voorkeur hebben, afhankelijk van het bestudeerde eiwit
Fluorescentie imager, bijv. iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamideVeel leveranciers
GelgietsysteemVeel leveranciers
VerwarmingsblokVeel leveranciers
Microcentrifugebuisjes (1,5 ml)Veel leveranciers
Micropipetten en tipsVeel leveranciers1 ml, 0,2 ml, 0,02 ml, 0,002 ml
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)Veel leveranciers
OligonucleotidenIntegrated DNA TechnologiesNAThermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript en anderen leveren deze ook
WeidepipetVeel leveranciers
PCR thermocyclerVeel leveranciers
PCR-buisjesVeel leveranciers
RNAse awayThermoFisher7002PKAlleen nodig bij het werken met RNA oligo's
RNase AWAYMerck83931-250MLOplosmiddel voor het verwijderen van RNAse-besmetting op oppervlakken
RNAse-vrij waterNew England BiolabsB1500LAlleen nodig bij het werken met RNA oligo's
NatriumchlorideVeel leveranciers
SUPERase IN RNase inhibitorThermo Fisher ScientificAM2694Breed spectrum RNAse-remmer (eiwit-gebaseerd)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Dit kan worden gebruikt om gels na te kleuren en ongelabelde oligonucleotiden te visualiseren
Tetramethylethyleendiamine (TMED)Veel leveranciers
Tris, of tris(hydroxymethyl)aminomethaanVeel leveranciers
Ultrapuur water (Milli-Q)Merck
UreaVeel leveranciers
VortexVeel leveranciers

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363 (6429), 7003(2019).
  2. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  3. Lohman, T. M., Fazio, N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD Helicase. Bioessays. 40 (6), e1800009(2018).
  4. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Res. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  5. Wozniak, K. J., Simmons, L. A. Bacterial DNA excision repair pathways. Nat Rev Microbiol. 20 (8), 465-477 (2022).
  6. Zhang, L., Jiang, D., Wu, M., Yang, Z., Oger, P. M. New insights into DNA repair revealed by NucS endonucleases from hyperthermophilic Archaea. Front Microbiol. 11, 1263(2020).
  7. Saathoff, J. H., Kashammer, L., Lammens, K., Byrne, R. T., Hopfner, K. P. The bacterial Mre11-Rad50 homolog SbcCD cleaves opposing strands of DNA by two chemically distinct nuclease reactions. Nucleic Acids Res. 46 (21), 11303-11314 (2018).
  8. Williamson, A., Leiros, H. S. Structural insight into DNA joining: from conserved mechanisms to diverse scaffolds. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8225-8242 (2020).
  9. Caglayan, M. Interplay between DNA polymerases and DNA ligases: Influence on substrate channeling and the fidelity of DNA ligation. J Mol Biol. 431 (11), 2068-2081 (2019).
  10. Shuman, S. DNA ligases: Progress and prospects. J Biol Chem. 284 (26), 17365-17369 (2009).
  11. Lohman, G. J., Tabor, S., Nichols, N. M. DNA ligases. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 3, Unit 3.14 (2011).
  12. Rittié, L., Perbal, B. Enzymes used in molecular biology: a useful guide. J Cell Commun Signal. 2 (1-2), 25-45 (2008).
  13. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of programmable nucleases for genome engineering. J Mol Biol. 428 (5), Part b 963-989 (2016).
  14. Aschenbrenner, J., Marx, A. DNA polymerases and biotechnological applications. Curr Opin Biotechnol. 48, 187-195 (2017).
  15. Loenen, W. A. M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 42 (1), 3-19 (2013).
  16. Voytas, D., Ke, N. Detection and quantitation of radiolabeled proteins and DNA in gels and blots. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3 (A) (2002).
  17. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  18. Huang, C., Yu, Y. T. Synthesis and labeling of RNA in vitro. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 4, Unit 4.15 (2013).
  19. Ballal, R., Cheema, A., Ahmad, W., Rosen, E. M., Saha, T. Fluorescent oligonucleotides can serve as suitable alternatives to radiolabeled oligonucleotides. J Biomol Tech. 20 (4), 190-194 (2009).
  20. Anderson, B. J., Larkin, C., Guja, K., Schildbach, J. F. Using fluorophore-labeled oligonucleotides to measure affinities of protein-DNA interactions. Meth Enzymol. 450, 253-272 (2008).
  21. Liu, W., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci Rep. 7 (1), 40125(2017).
  22. Ma, C., et al. Simultaneous detection of kinase and phosphatase activities of polynucleotide kinase using molecular beacon probes. Anal Biochem. 443 (2), 166-168 (2013).
  23. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Meth Mol Biol. 429, 209-224 (2008).
  24. Yang, C. J., Li, J. J., Tan, W. Using molecular beacons for sensitive fluorescence assays of the enzymatic cleavage of nucleic acids. Meth Mol Biol. 335, 71-81 (2006).
  25. Nikiforov, T. T., Roman, S. Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores. Anal Biochem. 477, 69-77 (2015).
  26. Pergolizzi, G., Wagner, G. K., Bowater, R. P. Biochemical and structural characterisation of DNA ligases from bacteria and Archaea. Biosci Rep. 36 (5), 00391(2016).
  27. Martin, I. V., MacNeill, S. A. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol. 3 (4), REVIEWS3005 (2002).
  28. Bilotti, K., et al. Mismatch discrimination and sequence bias during end-joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 50 (8), 4647-4658 (2022).
  29. Bauer, R. J., et al. Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS One. 12 (12), e0190062(2017).
  30. Lohman, G. J. S., Zhang, Y., Zhelkovsky, A. M., Cantor, E. J., Evans, T. C. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1831-1844 (2014).
  31. Bullard, D. R., Bowater, R. P. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J. 398 (1), 135-144 (2006).
  32. Magnet, S., Blanchard, J. S. Mechanistic and kinetic study of the ATP-dependent DNA ligase of Neisseria meningitidis. Biochemistry. 43 (3), 710-717 (2004).
  33. Williamson, A., Grgic, M., Leiros, H. S. DNA binding with a minimal scaffold: structure-function analysis of Lig E DNA ligases. Nucleic Acids Res. 46 (16), 8616-8629 (2018).
  34. Lohman, G. J., et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity. Nucleic Acids Res. 44 (2), e14(2016).
  35. Kim, J., Mrksich, M. Profiling the selectivity of DNA ligases in an array format with mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 38 (1), e2(2010).
  36. Tang, Z. W., et al. Real-time monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (23), e148(2003).
  37. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys. 44 (1), 1-93 (2011).
  38. Marti, T. M., Fleck, O. DNA repair nucleases. Cell Mol Life Sci. 61 (3), 336-354 (2004).
  39. Wang, B. B., et al. Review of DNA repair enzymes in bacteria: With a major focus on AddAB and RecBCD. DNA Repair. 118, 103389(2022).
  40. Pidugu, L. S., et al. Structural insights into the mechanism of base excision by MBD4. J Mol Biol. 433 (15), 167097(2021).
  41. Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 5905-5908 (2005).
  42. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  43. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  44. Takemoto, N., Numata, I., Su'etsugu, M., Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors. Nucleic Acids Res. 46 (12), 6152-6165 (2018).
  45. Reardon, J. T., Sancar, A. Molecular anatomy of the human excision nuclease assembled at sites of DNA damage. Mol Cell Biol. 22 (16), 5938-5945 (2002).
  46. Kunkel, T. A., Soni, A. Exonucleolytic proofreading enhances the fidelity of DNA synthesis by chick embryo DNA polymerase-gamma. J Biol Chem. 263 (9), 4450-4459 (1988).
  47. Sheppard, E. C., Rogers, S., Harmer, N. J., Chahwan, R. A universal fluorescence-based toolkit for real-time quantification of DNA and RNA nuclease activity. Sci Rep. 9 (1), 8853(2019).
  48. Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), e52(2000).
  49. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
  50. Sharma, J. K., et al. Methods for competitive enrichment and evaluation of superior DNA ligases. Meth Enzymol. 644, 209-225 (2020).
  51. Rzoska-Smith, E., Stelzer, R., Monterio, M., Cary, S. C., Williamson, A. DNA repair enzymes of the Antarctic Dry Valley metagenome. Front Microbiol. 14, 1156817(2023).
  52. Williamson, A., Pedersen, H. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Protein Expres Purif. 97 (0), 29-36 (2014).
  53. Akey, D., et al. Crystal structure and nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem. 281 (19), 13412-13423 (2006).
  54. Kim, D. J., et al. ATP-dependent DNA ligase from Archaeoglobus fulgidus displays a tightly closed conformation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65, Pt 6 544-550 (2009).
  55. Nishida, H., Kiyonari, S., Ishino, Y., Morikawa, K. The closed structure of an archaeal DNA ligase from Pyrococcus furiosus. J Mol Biol. 360 (5), 956-967 (2006).
  56. Gundesø, S., et al. R2D ligase: Unveiling a novel DNA ligase with surprising DNA-to-RNA ligation activity. Biotechnol J. 19 (3), e2300711(2024).
  57. Hendling, M., Barišić, I. In silico design of DNA oligonucleotides: Challenges and approaches. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1056-1065 (2019).
  58. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harb Prot. 2019 (2), 10.1101/pdb.top101857 (2019).
  59. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), e1485(2009).
  60. Smith, D. R. Gel Electrophoresis of DNA. Mol Biometh Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-33 (1998).
  61. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  62. Rousseau, M., et al. Characterisation and engineering of a thermophilic RNA ligase from Palaeococcus pacificus. Nucleic Acids Res. 52 (7), 3924-3937 (2024).
  63. Kestemont, D., Herdewijn, P., Renders, M. Enzymatic synthesis of backbone-modified oligonucleotides using T4 DNA ligase. Curr Prot Chem Biol. 11 (2), e62(2019).
  64. Farell, E. M., Alexandre, G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 5, 257(2012).
  65. Nazarenko, I., Pires, R., Lowe, B., Obaidy, M., Rashtchian, A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30 (9), 2089-2195 (2002).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nucle nezuurenzymenDNA ligase assayRNA ligase assayfluorescerende markeringPAGE elektroforeseDNA reparatie enzymennucleaseactiviteitDNA RNA hybridenontwerp van enzymsubstraten

Gerelateerde artikelen