Methodenartikel

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66934

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuromuscular and Neurogenetic Disorders of Childhood Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2The Dubowitz Neuromuscular Centre, Molecular Neurosciences Section, Developmental Neurosciences Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 3Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 4NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, 5Genetics and Genomic Medicine Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Samenvatting

Veel aandoeningen tasten meerdere organen aan of hebben betrekking op verschillende delen van het lichaam, dus het is van cruciaal belang om therapieën systemisch toe te dienen om de aangetaste cellen op verschillende plaatsen aan te pakken. Intraveneuze injectie is een veelgebruikte systemische toedieningsroute in preklinische onderzoeken die behandelingen beoordelen die bedoeld zijn voor toediening in het hele lichaam. Bij volwassen muizen gaat het om de intraveneuze toediening van het therapeutische middel in de laterale staartaders van de muis. Als ze onder de knie zijn, zijn staartaderinjecties veilig en snel en vereisen ze alleen eenvoudige en algemeen verkrijgbare hulpmiddelen. Injecties met staartaders zijn echter technisch uitdagend en vereisen uitgebreide training en voortdurende oefening om de nauwkeurige afgifte van de beoogde dosis te garanderen.

Hier beschrijven we een gedetailleerd, geoptimaliseerd lateraal staart-ader injectieprotocol dat we hebben ontwikkeld op basis van onze ervaring en op basis van aanbevelingen die eerder door andere groepen waren gerapporteerd. Afgezien van de muismaskers en insulinespuiten, vereist dit protocol alleen reagentia en apparatuur die in de meeste laboratoria direct beschikbaar zijn. We ontdekten dat het volgen van dit protocol resulteert in consistent succesvolle intraveneuze toediening van adeno-geassocieerd virus (AAV) in de staartaders van niet-verdoofde muizen van 7-9 weken oud. Daarnaast beschrijven we de geoptimaliseerde protocollen voor de histologische detectie van fluorescerende reportereiwitten en vectorgenoom per diploïde genoom (vg/dg) kwantificering die wordt gebruikt om AAV-transductie en biodistributie te beoordelen. Het doel van dit protocol is om onderzoekers te helpen bij het gemakkelijk succesvol en consistent uitvoeren van staartaderinjecties, waardoor de oefentijd die nodig is om de techniek onder de knie te krijgen, kan worden verkort.

Inleiding

Monogene aandoeningen vormen 80% van de zeldzame ziekten, die samen wereldwijd 300 miljoen mensen treffen 1,2. Er zijn momenteel geen goedgekeurde curatieve therapieën voor de meeste van deze sterk slopende zeldzame aandoeningen 1,2,3. Monogene aandoeningen zijn echter ideale kandidaten voor gentherapieën die disfunctionele genen kunnen vervangen, aanvullen, corrigeren of tot zwijgen brengen 4,5. Momenteel worden meerdere vectoren ontwikkeld en gebruikt om gentherapieën af te leveren aan specifieke celtypen 4,6. Een van die vectoren is adeno-geassocieerd virus (AAV). AAV is een niet-pathogeen parvovirus dat steeds vaker wordt gebruikt als gentherapievector7. In vergelijking met andere virale vectoren heeft AAV een lagere immunogeniciteit, een lager potentieel om te integreren in het genoom van de gastheer en het vermogen om delende en niet-delende cellen in verschillende weefsels efficiënt te transduceren 7,8. Bovendien zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld om AAV's met gewenste kenmerken zoals specifiek weefseltropisme of verder verminderde immunogeniciteit te ontwikkelen en te identificeren, wat de veelzijdigheid van AAV als virale vector voorverschillende indicaties aanzienlijk vergroot. Deze factoren hebben AAV tot een veel onderzochte gentherapievector gemaakt en hebben geleid tot de ontwikkeling van meerdere door de FDA goedgekeurde op AAV gebaseerde gentherapieën10.

Muismodellen worden vaak gebruikt om potentiële gentherapieën in vivo te testen en de pathomechanismen van monogene aandoeningen beter te begrijpen. Dit komt door de recapitulatie van de pathologieën van verschillende aandoeningen door de muismodellen, de gelijkenis van hun genoom met het menselijk genoom en het relatieve gemak van het hanteren, onderhouden en genereren vanmuizen 11,12,13. In vivo testen is vooral belangrijk bij het bestuderen van aandoeningen die meerdere systemen of regio's van het lichaam aantasten, zoals spierdystrofieën. Voor deze aandoeningen zijn in-vitrotesten mogelijk niet voldoende om de veiligheid, werkzaamheid, farmacokinetiek en farmacodynamiek van therapieën die bedoeld zijn om verschillende lichaamsregio's te bereiken na systemische toediening uitgebreid te beoordelen14.

Er kunnen verschillende systemische toedieningsroutes worden gebruikt om medicijnen toe te dienen. Elke route heeft zijn voor- en nadelen en de mate van compatibiliteit met het onderzochte diermodel en medicijn15. Intraveneuze (IV) laterale staartaderinjectie is een veelgebruikte route voor systemische toediening van AAV bij muizen16. Laterale injecties in de staartader maken een snelle en directe toediening van het injectaat in de bloedbaan van de muis mogelijk, wat zorgt voor een hoge biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel in de systemische circulatie17. Ze vereisen ook relatief eenvoudige en algemeen beschikbare hulpmiddelen om te worden uitgevoerd. Echter, voornamelijk vanwege de kleine diameter van de staartader en de moeilijkheid om de ader te lokaliseren, zijn laterale staartaderinjecties technisch uitdagend en vereisen ze een hoge mate van vaardigheid en constante oefening om mislukte injectiepogingen of onvolledige dosisafgifte te voorkomen 16,17,18,19. Deze kunnen leiden tot het verlies van dure reagentia of onnauwkeurige resultaten, vooral als de onvolledige injectie niet wordt herkend tijdens het uitvoeren van de injectie. Onze ervaring die hier is samengevat, is gebaseerd op protocollen die zijn gerapporteerd in goed gedocumenteerde artikelen die we hebben aangepast voor ons gebruik, waarbij we verschillende stappen van de laterale staartaderinjectieprocedure hebben geoptimaliseerd om consistent succesvolle injecties te garanderen 20,21,22,23,24,25,26,27.

Hier beschrijven we dit gedetailleerde geoptimaliseerde laterale staartader-injectieprotocol om AAV toe te dienen aan niet-verdoofde muizen van 7-9 weken oud met behulp van eenvoudige en algemeen beschikbare hulpmiddelen. Daarnaast bieden we de protocollen voor methoden die worden gebruikt om AAV-afgifte en biodistributie te beoordelen. Deze protocollen hebben betrekking op weefselverzameling na injectie, weefselfixatie, DNA-extractie en kwantificering van het vectorgenoom van digitale polymerasekettingreactie (dPCR) per diploïde genoom (vg/dg). Het IV-injectieprotocol en de aanwijzingen die hier worden gegeven, zijn bedoeld om het gemak van het succesvol uitvoeren van laterale staartaderinjecties te vergroten. Dit zal mogelijk helpen de tijd die nodig is om de injectievaardigheden onder de knie te krijgen te verkorten en tegelijkertijd de nauwkeurigheid en consistentie van injecties te verbeteren.

Protocol

Alle procedures voor het hanteren en injecteren van dieren werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van NINDS. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de NINDS-richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik.

1. Voorbereiding vóór de injectie

  1. Voorbereiding van de AAV-dosis
    1. Bepaal het gemiddelde gewicht van de muizen die geïnjecteerd zullen worden.
    2. Bereken het maximaal toegestane injecteervolume volgens de richtlijnen voor dierverzorging van de instelling, zoals weergegeven in vergelijking (1). Het maximale injectaatvolume is doorgaans een volumewaarde (μL)/muisgewicht (g) (bijv. 10 μL/g.).
      Maximaal injectaatvolume (μL)/muis= (maximaal injectaatvolume (μL/g)) × (gemiddeld muisgewicht (g)) (1)
      OPMERKING: Voorbeeldberekening: Maximaal injecteervolume/muis = 10 μL/g × 20 g/muis = 200 μL/muis
    3. Stel de dosis AAV-vectorgenoom (vg) in die per muis moet worden toegediend.
      OPMERKING: Dit kan dezelfde absolute waarde zijn voor verschillende muizen (bijv. alle muizen ontvangen 1,5 × 1012 vg, ongeacht hoeveel elke muis weegt). Of de dosis kan in vg/kg zijn, dus het totale vg dat per muis moet worden geïnjecteerd, moet voor elke muis worden berekend op basis van het gewicht van die muis op de injectiedag.
      1. Als de dosis in vg/kg is, weeg dan elke muis op de injectiedag voorafgaand aan de dosisbereiding.
      2. Bereken de vectorgenomen die voor elke muis moeten worden geleverd op basis van zijn gewicht met behulp van vergelijking (2):
        Vectorgenomen die in een specifieke muis moeten worden afgeleverd (vg) = Vooraf gespecificeerde vg/kg-waarde (vg/kg) × figure-protocol-1 (2)
        OPMERKING: Het gebruik van vg/kg als dosiseenheid in plaats van vg/muis kan in bepaalde preklinische onderzoeken geschikter zijn om geldige vergelijkingen tussen geïnjecteerde doses te garanderen. Dit komt door de gewichtsverschillen tussen mannelijke en vrouwelijke muizen van dezelfde leeftijd of mogelijk tussen muizen van hetzelfde geslacht.
      3. Gebruik het maximale injectaatvolume en de AAV-dosis (vg) om de hoeveelheden AAV-voorraad en steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te berekenen die nodig zijn om de vereiste dosis te bereiden (zie vergelijkingen (3-6)). Zorg ervoor dat het te injecteren volume gelijk is aan of kleiner is dan het toegestane maximale injecteervolume. Bereid altijd een injecteervolume voor dat ten minste 15 μl groter is dan het volume dat zal worden geïnjecteerd om rekening te houden met pipetteerfouten en de dode ruimte van de spuit.
        Concentratie van injectaat (vg/μL) = figure-protocol-2 (3)
        Totaal aantal AAV-vectorgenomen dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden (vg) = Concentratie van het injectaat (vg/μL) × te bereiden volume (μL) (4)
        Volume AAV-voorraad dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden) (μL) = figure-protocol-3 (5)
        Volume PBS dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden (μL) = Volume dat moet worden bereid (μL) - Volume AAV-voorraad dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden (μL) (6)
        OPMERKING: Voorbeeld berekening:
        6 × 1013 vg/kg (de dosis) wordt toegediend in 200 μL/muis (het te injecteren volume) in een muis die 25 g weegt. De AAV-voorraadtiter is 3,0 × 1013 (vg/ml)
        Vectorgenomen die in deze specifieke muis moeten worden afgeleverd (vg) = 6 × 1013 (vg/kg) × figure-protocol-4 = 1,5 × 1012 vg voor deze muis
        Concentratie van injectaat = figure-protocol-5 = 7,5 × 109 (vg/μL)
        Totaal AAV-vectorgenomen die moeten worden toegevoegd om het injectaat voor te bereiden = 7,5 × 109 (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1,6125 × 1012 (vg)
        Volume AAV-voorraad dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden = figure-protocol-6 = 53,75 (μL)
        Volume PBS dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden = 215 (μL) - 53,75 (μL) = 161,25 (μL)
    4. Procedure voor de voorbereiding van de AAV-dosis
      OPMERKING: Volgens de bioveiligheids- en PBM-richtlijnen van de instelling voor het omgaan met AAV, bereidt u in een geautoclaveerde steriele RNasevrije en DNasevrije microcentrifugebuis van 1,7 ml het AAV-injectaat voor met behulp van de AAV-voorraad en steriele PBS volgens de berekeningen in stap 1.1.3.3. Bewaar altijd de voorraad AAV en AAV injecteren op ijs. Gebruik schone micropipetten en nieuwe micropipettipdoosjes om de steriliteit te garanderen. Gooi de met AAV besmette micropipetpunten weg volgens de richtlijnen voor afvalbeheer van de instelling.
      1. Ontdooi de voorraad AAV op ijs.
        OPMERKING: Vermijd het ontdooien en opnieuw invriezen van de AAV-voorraad. Bestel of bereid de AAV-voorraad in aliquots van 100-200 μL om te voorkomen dat er na de dosisbereiding een teveel aan AAV ontstaat dat opnieuw moet worden ingevroren.
  2. Voorbereiding van het injectiestation
    1. Reiniging
      1. Reinig het werkgebied met 70% ethanol (EtOH).
      2. Desinfecteer het werkgebied met een bacteriedodend, schimmeldodend en virusdodend reagens(en).
      3. Reinig de muisslanghouder met water en zeep.
    2. Installatie van stationstools
      1. Plaats een schone, lege conische slang van 15 ml in een slanghouder/rek.
      2. Zet een verhoogd platform op waarop de muisbuishouder wordt geplaatst (Figuur 1A,B).
      3. Plaats de schone muisslangbeschermer in het werkgebied.
      4. Als u muizen injecteert die veel kleiner zijn dan de beschikbare muisbuisbeschermer, gebruik dan een plastic knaagdierbeschermerkegel om een fixatiehuls te maken. Zie stappen 2.1.3-4.
      5. Plaats de spuiten die voor injecties zullen worden gebruikt in het werkgebied. Gebruik insulinespuiten van 0,3 ml met naalden van 29 G.
      6. Plaats de afvalcontainer zo dicht mogelijk bij het injectiestation om met AAV besmette gereedschappen onmiddellijk te kunnen afvoeren.
      7. Trek en duw meerdere keren aan de zuiger van elke spuit om ervoor te zorgen dat de zuiger soepel beweegt, zodat er tijdens de injectie geen weerstand wordt veroorzaakt door de spuit. Als de zuiger niet soepel beweegt, gooi deze spuit dan weg en vervang deze door een nieuwe.
      8. Zorg dat er een muisweegschaal en minicentrifuge beschikbaar zijn naast het injectiegebied.
      9. Houd de voorbereide AAV op ijs klaar in het injectiegebied.
      10. Bereid warm water (38-40 °C). Zorg ervoor dat de watertemperatuur niet hoger is dan 40 °C om brandwonden aan de muizenstaart te voorkomen.

2. Procedure voor injectie

  1. Muis in bedwang houden
    1. Weeg elke muis om de dosis in vg/kg te berekenen, indien nodig.
    2. Zorg ervoor dat de muis volledig in bedwang wordt gehouden en niet kan bewegen.
      OPMERKING: Als de muis niet volledig wordt vastgehouden, kan deze bewegen tijdens de IV-toediening, wat kan leiden tot verplaatsing van de naald. Hierdoor kan de naald uit de ader komen en/of de muis verwonden.
    3. Voor buisvergrendeling:
      1. Was de restrainer met warm water en zeep tussen de muizen om de houder schoon te maken en op te warmen.
      2. Houd de muis bij zijn staart vast. Steek de staart van de muis in de bovenste opening van de buis; Trek vervolgens de muis langzaam in de slangvergrendeling. Als de maat van de buisbeschermer geschikt is voor de grootte van de muis, plaatst u de plug voor de muis om te voorkomen dat de muis ontsnapt.
        NOTITIE: De plug moet dicht genoeg bij de muis zijn om te voorkomen dat de muis beweegt of draait in de buis, maar de plug mag de neus van de muis niet belemmeren zodat de muis vrij kan ademen. Als de muis kleiner is dan de maat van de slangbeschermer, gebruik dan naast de slangbeugel ook een flexibele wegwerpbeugelconus, zoals hieronder beschreven in stap 2.1.4.
    4. Voor de flexibele wegwerp restrainer cones indien nodig (om een fixatiehuls te maken voor kleinere muizen):
      1. Maak een snee aan het neusuiteinde van de kegel om ervoor te zorgen dat de neus van de muis niet wordt belemmerd en dat de muis voldoende ruimte heeft om te ademen.
      2. Knip de achterkant van de kegel zo af dat de kegel bijna even lang is als de muis (zodat de kegel in de buis past) (Figuur 1A,B).
      3. Plaats de muis in de buishouder zoals hierboven beschreven in stap 2.1.3. Terwijl u de staart van de muis vasthoudt, steekt u de conus van de restrainer met de bredere openingszijde eerst in de buis.
      4. Terwijl je de staart van de muis vasthoudt, laat je de muis in de kegel lopen; Schuif vervolgens de rest van de kegel in de buis. Zorg ervoor dat de staart van de muis helemaal uit de achterkant van de buis komt en dat de muis ruimte heeft om in de kegel te ademen.
      5. Zet de slangplug direct voor de neusopening van de kegel vast en zorg ervoor dat de muis volledig op zijn plaats wordt gehouden en voldoende ruimte heeft om te ademen.
  2. De muis injecteren
    1. Vul de conische slang van 15 ml met warm water.
    2. Plaats de buisrestrainer met de muis erin op het verhoogde platform (Figuur 1B).
    3. Dompel zoveel mogelijk van de staart van de in bedwang gehouden muis minimaal 1 minuut in het warme water totdat de zijaders duidelijk verwijd en zichtbaar zijn (Figuur 1B).
    4. Laad tijdens de stap van het opwarmen van de staart de AAV-dosis in de spuit.
      1. Plaats de niet-afgedekte AAV-bevattende microcentrifugebuis van 1.7 ml in een buisrek. Steek de naald verticaal in de buis met de dominante hand. Zodra de naald in de buis zit, houdt u de buis vast met de niet-dominante hand.
        NOTITIE: Het verticaal inbrengen van de naald voorkomt schade aan de naald die kan worden veroorzaakt door het aanraken van de buiswand. Er kunnen andere alternatieve methoden voor het laden van injectiespuiten worden gebruikt, maar de veiligheid van de onderzoeker en de geïnjecteerde muis moet worden gegarandeerd. Het vasthouden van de slang met de niet-dominante hand beschermt tegen verwondingen door het per ongeluk prikken van de naald als de naald wordt ingebracht terwijl u de slang vasthoudt.
      2. Met de naald in de tube tilt u de tube en de spuit tegelijkertijd op tot ooghoogte en zorgt u ervoor dat de naald de wand van de tube niet raakt. Laat beide armen op de tafel rusten om ze te stabiliseren. Trek de dosis langzaam in de spuit.
        OPMERKING: Langzame aspiratie voorkomt dat fijne luchtbellen zich hechten aan de zijkanten van de spuitcilinder.
      3. Verdrijf luchtbellen uit de spuit. Als u AAV injecteert, zorg er dan voor dat de luchtbellen uit de spuit worden verdreven via een absorberend wegwerpverband dat wordt weggegooid in een doos met biologisch gevaar.
      4. Houd het injectaat minstens 40 s vast om het op te warmen.
        OPMERKING: Zorg er altijd voor dat het injectaat warm is voordat u gaat injecteren. Als een koude injectie wordt toegediend, kan het zijn dat de injectie niet door de ader stroomt, behalve de eerste paar μL.
      5. Controleer de staartaders elke minuut.
        OPMERKING: De aderen moeten ZEER zichtbaar zijn tot aan de injectieplaats (voeg de opwarmtijd van de staart toe en vervang indien nodig door vers warm water totdat de ader duidelijk zichtbaar is, maar niet langer dan de fixatietijd van de muis die is toegestaan door het protocol voor het omgaan met dieren van de instelling).
      6. Nadat u ervoor heeft gezorgd dat de aders duidelijk zichtbaar zijn, verwijdert u de buisbeugel van de bovenkant van het verhoogde platform en plaatst u de buisbeugel direct op de tafel. Plaats de muis in de restrainer met de voeten naar beneden en niet opzij om de staart gemakkelijk te kunnen hanteren.
        NOTITIE: De muis mag niet op zijn zij of rug in de restrainer liggen. De muis moet volledig in bedwang worden gehouden en niet in staat zijn om in de beugel te bewegen of te draaien of zijn staart te bewegen/trekken.
      7. Veeg de staart snel af met een gaasje om de staart te drogen; Veeg de staart af met een alcoholdoekje en veeg hem vervolgens droog met een droog gaasje.
        OPMERKING: Gebruik droog gaas om de staart droog genoeg te maken om de staart stevig vast te pakken, maar niet helemaal droog. Het kan moeilijker zijn om de ader te zien als de staart helemaal droog is.
      8. Draai de staart ongeveer 90° naar links of rechts zodat een van de twee zijaders naar boven wijst. Zoek een geschikte injectieplaats in het middelste derde deel van de staart. Start de eerste injectie distaal (dichter bij het puntje van de staart) en beweeg proximaal als er extra injecties nodig zijn vanwege mislukte pogingen of als het experimentele ontwerp dit vereist.
        OPMERKING: Probeer niet distaal van een eerdere injectieplaats te injecteren, aangezien het injectiemiddel uit die vorige injectieplaats kan lekken. Optioneel: gebruik de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand om gedurende 10 s proximaal (stroomopwaarts/dichter bij het muislichaam) druk uit te oefenen op de injectieplaats. De vingers fungeren als tourniquets om de ader op de injectieplaats verder te verwijden. Laat onmiddellijk na de tourniquet van 10 s de vingers van de tourniquet los en zorg ervoor dat een van de twee zijaders naar boven wijst en duidelijk zichtbaar is.
      9. Houd de staart vast met de niet-dominante hand met behulp van de duim en wijsvinger direct distaal van de injectieplaats. Vouw de staart over de wijsvinger zodat de injectieplaats plat op de wijsvinger ligt. Trek de staart naar achteren zodat de staart gestrekt is en de injectieplaats volledig horizontaal is (op 0°) (evenwijdig aan de horizontale tafel) (Figuur 1C).
      10. Houd de spuit vast met de wijs- en middelvinger van de dominante hand aan weerszijden van de flens van de cilinder van de spuit terwijl u de duim bij de zuiger gereed houdt.
        NOTITIE: Dit maakt het gemakkelijker om de duim of de naald niet te bewegen als de naald eenmaal in de ader zit (Figuur 1C).
      11. Laat beide handen op de tafel rusten om ze te stabiliseren en plaats de naald direct op en evenwijdig aan de staart en de ader met de afschuining naar boven gericht. Houd de injectieplaats dicht bij de wijsvinger en houd de staart vast om de controle en stabiliteit van de injectieplaats te verbeteren.
        NOTITIE: De buisvergrendeling moet diep genoeg in de tafel zitten, zodat beide handen op de tafel worden ondersteund.
      12. Terwijl u de naald evenwijdig aan de staartader houdt en neerwaartse druk uitoefent op de naald, schuift u de naald naar voren in de ader.
        NOTITIE: De neerwaartse druk moet voldoende zijn om de naald in de juiste hoek in de ader te steken. De ader is extreem ondiep, dus de naald moet zo plat mogelijk zijn als u in de ader probeert te komen.
      13. Injecteer de oplossing langzaam in de ader. Trek na toediening van de dosis de naald langzaam terug en oefen onmiddellijk druk uit met een gaasje op de injectieplaats gedurende ten minste 10 s om het bloeden te stoppen.
        OPMERKING: Oefen de druk zo lang als nodig uit totdat het bloeden volledig is gestopt om mogelijk verlies van het geïnjecteerde reagens te voorkomen. Na het terugtrekken van de naald verschijnt er meestal een bloeddruppel, wat aangeeft dat de naald de ader is binnengedrongen. Af en toe verschijnt de bloeddruppel niet, zelfs niet bij een succesvolle injectie. De bloeddruppel geeft geen succesvolle injectie aan; Het geeft alleen aan dat de naald de ader is binnengedrongen. De betrouwbare indicator voor succesvolle injectie is de volledige afwezigheid van plunjerweerstand tijdens de injectie. Als de naald zich in de ader bevindt, mag er tijdens de injectie van het injectaat geen weerstand zijn bij de zuiger van de naald en zal de ader proximaal van de injectieplaats tijdelijk iets lichter van kleur lijken (blanches) (het blancheren van de ader is mogelijk niet erg duidelijk bij sommige muizenstammen). Als er weerstand is en/of er begint een uitstulping te verschijnen op de injectieplaats, dan is de naald niet correct in de ader geplaatst. Als dit gebeurt, verwijder dan de naald volledig van de staart en probeer de ader te injecteren op een nieuwe injectieplaats proximaal van de mislukte injectieplaats (dichter bij het lichaam van de muis).
      14. Gooi de met AAV besmette spuiten en slangen weg volgens de richtlijnen voor afvalbeheer van de instelling.
      15. Bevrijd de muis van de restrainers en plaats hem terug in een nieuwe kooi, gescheiden van niet-geïnjecteerde muizen. Houd de muizen gedurende 10 minuten in de gaten om een normaal activiteitsniveau na de injectie te garanderen.
        OPMERKING: Dit voorkomt mogelijke overdracht van geïnjecteerde middelen naar niet-geïnjecteerde muizen als overdraagbare middelen worden toegediend.
      16. Desinfecteer het werkgebied met bacteriedodende, schimmeldodende en virusdodende reagens(en) en 70% EtOH. Reinig de muisslanghouder met water en zeep.

3. Dissectie en weefselafname en fixatie27

  1. Voorbereiding van het weefselafnamestation
    1. Reinig het werkstation met een DNA-afbraakreagens volgens de instructies van de fabrikant om besmettend DNA dat in het werkgebied aanwezig kan zijn, af te breken.
    2. Doe methylbutaan in een metalen bakje. Plaats de methylbutaan metalen container in een piepschuimdoos; Omring vervolgens de metalen container met droogijs, zodat het niveau van het droogijs rond de container hoger is dan het methylbutaangehalte in de container.
    3. Etiketteer en plaats lege 2 ml microcentrifuge-tissuebewaarbuisjes op het droogijs. Laat de methylbutaan- en weefselopslagbuisjes minstens 20 minuten afkoelen op droogijs voordat u begint met het invriezen van de weefsels. Plaats een weefseltransfertang op droogijs.
    4. Label en vul nog een set van 2 ml microcentrifuge-weefselbewaarbuisjes met verse 4% paraformaldehyde (PFA) en bewaar ze op kamertemperatuur. Voeg voldoende 4% PFA toe aan elke buis om de weefsels die in de buis worden geplaatst volledig onder te dompelen.
  2. Weefselverzameling en fixatie
    1. Euthanaseer de muis volgens de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling.
      OPMERKING: Hier werden de muizen geëuthanaseerd met behulp van cervicale dislocatie.
    2. Spuit de muis volledig in met 70% EtOH.
    3. Verzamel de benodigde tissues.
      OPMERKING: Het hier beschreven verzamel- en fixatieprotocol is getest op skeletspieren en de lever.
    4. Voor weefsels die zullen worden gebruikt voor DNA-extractie:
      1. Laat het weefsel in voorgekoeld methylbutaan op droogijs vallen en laat het weefsel minstens 1 minuut in methylbutaan vallen. Gebruik de voorgekoelde transfertang om de bevroren weefsels van het methylbutaan over te brengen naar de voorgekoelde lege microcentrifuge-weefselopslagbuisjes van 2 ml. Bewaar het weefsel bij -80 °C.
        OPMERKING: Optioneel: Het weefsel kan in stukjes van 20 mg worden gesneden voordat het in methylbutaan wordt gedruppeld, zodat het klaar is voor gebruik in stap 4.1.4.
    5. Voor weefsels die zullen worden gebruikt voor histologische analyse en voor het behoud van de fluorescentie van reportereiwitten:
      1. Gebruik een PFA-specifieke pincet die op kamertemperatuur wordt gehouden, laat de weefsels in hun respectievelijke microcentrifugebuis vallen die 4% PFA bevat (op kamertemperatuur bewaard) terwijl u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de 4% PFA-oplossing.
        OPMERKING: PFA-verontreiniging kan een negatieve invloed hebben op verschillende stroomafwaartse moleculaire tests. Gebruik alleen een door PFA aangewezen pincet bij het hanteren van PFA om PFA-besmetting van andere weefsels of gereedschappen te voorkomen.
      2. Plaats de microcentrifugebuisjes op een rekje en bedek het rekje met foliepapier om de buisjes in het donker te houden. Incubeer het afgedekte rek bij 4 °C op een shaker en schud het een nacht zachtjes.
      3. Bereid na een nacht incubatie 5% sacharose (% g/v) in 1x PBS door 5,0 g. sucrose op te lossen in 70 ml 1x PBS door krachtig te schudden. Voeg voldoende 1x PBS toe aan een uiteindelijk totaal volume van 100 ml om een sucrose-oplossing van 5% (% m/v) te verkrijgen.
      4. Steriliseer de 5% sucrose-oplossing met behulp van het spuitfilter van 0,22 μm. Etiketteer en vul 2,0 ml microcentrifugebuisjes met vers bereide 5% sucrose.
      5. Breng de weefsels van 4% PFA over naar hun respectievelijke microcentrifugebuis die 5% sucrose bevat (op kamertemperatuur bewaard) terwijl u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de 5% sucrose-oplossing.
      6. Plaats de microcentrifugebuisjes op een rekje en bedek het rekje met foliepapier om de buisjes in het donker te houden. Incubeer het afgedekte rek bij 4 °C op een shaker en schud het een nacht zachtjes.
      7. Bereid na een nacht incubatie 20% sacharose (% m/v) in 1x PBS door 20,0 g. sucrose op te lossen in 70 ml 1x PBS door krachtig te schudden. Voeg voldoende 1x PBS toe aan een uiteindelijk totaal volume van 100 ml om een 20% sucrose-oplossing (% w/v) te verkrijgen.
      8. Steriliseer de 20% sucrose-oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Etiketteer en vul 2,0 ml microcentrifugebuisjes met vers bereide 20% sucrose.
      9. Breng de weefsels van 5% sucrose over naar hun respectievelijke microcentrifugebuis die 20% sucrose bevat (bewaard bij kamertemperatuur) terwijl u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de 20% sucrose-oplossing.
      10. Plaats de microcentrifugebuisjes op een rekje en bedek het rekje met foliepapier om de buisjes in het donker te houden. Incubeer het afgedekte rek bij 4 °C op een shaker en schud het een nacht zachtjes.
      11. Plaats na een nacht incubatie methylbutaan in een metalen container en plaats de methylbutaan metalen container in een piepschuimdoos. Omring de metalen container met droogijs zodat het niveau van het droogijs rond de container hoger is dan het methylbutaangehalte in de container.
      12. Etiketteer en plaats lege 2 ml microcentrifuge-tissuebewaarbuisjes op droogijs. Laat de methylbutaan- en weefselopslagbuisjes minstens 20 minuten afkoelen op droogijs voordat u begint met het invriezen van de weefsels. Plaats een transfertang op droogijs.
      13. Dep de weefsels snel met precisiedoekjes om overtollige 20% sucrose te verwijderen. Laat het weefsel in methylbutaan voorgekoeld op droogijs vallen. Laat het weefsel minstens 1 minuut in methylbutaan liggen.
      14. Gebruik de voorgekoelde transfertang om de bevroren weefsels van het methylbutaan over te brengen naar de voorgekoelde lege microcentrifuge-weefselopslagbuisjes van 2 ml. Bewaar het weefsel bij -80 °C.

4. dPCR voor kwantificering van vg/dg

  1. DNA-extractie uit weefsels en initiële RNA-vertering
    OPMERKING: Het handboek van de DNA-extractiekit die in de materiaaltabel wordt vermeld, is gebruikt om dit DNA-extractieprotocol af te leiden. Bewaar de buisjes met de bevroren tissuestukjes altijd op droogijs.
    1. Zet een emmer ijs klaar.
    2. Label voor elk DNA-monster één lysiskombuisje van 1,5 ml en twee lege RNasevrije en DNasevrije microcentrifugebuisjes van 1,7 ml.
    3. Voeg 180 μL van de buffer van de eerste DNA-extractiekit toe aan elke parelbuis. Tarra de eerste hielbuis met buffer.
      OPMERKING: Als de tissues niet zijn voorgesneden in stap 3.2.4.1, gebruik dan een scheermesje dat is voorgekoeld op droogijs om het weefsel in stukjes van 20 mg te snijden. Deze stap moet worden uitgevoerd in een schone cryostaat die bij -20 °C of kouder wordt bewaard.
    4. Voeg een stuk weefsel toe aan de buis; Weeg en registreer het gewicht van het weefsel (~20 mg.).
    5. Plaats het lysis-kralenbuisje met het weefsel erin direct op ijs. De buffer kan kristalliseren.
    6. Herhaal de vorige stappen voor elk weefselmonster.
    7. Breng de buizen over in de blender van de lysiskralenbuis en laat ze 1 minuut draaien op maximale snelheid (snelheid 10) bij 4 °C.
    8. Leg de monsters op ijs om ze over te brengen naar de centrifuge. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 20.000 × g bij 4 °C.
    9. Voeg tijdens de centrifugatiestap 20 μl proteïnase K toe aan de eerste reeks microcentrifugebuisjes van 1,7 ml. Breng na de centrifugatiestap het supernatans van de homogenaten over in de buisjes van 1,7 ml die de proteïnase K bevatten en meng goed. Incubeer bij 56 °C gedurende 15 minuten, met 500 RPM mengen.
    10. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Voeg 4 μL RNase A toe en meng door middel van korte pulsvortexen. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. Pulse-vortex gedurende 15 s.
    12. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Voeg 200 μL van de buffer van de tweede DNA-extractiekit toe. Pulse-vortex gedurende 15 s.
    13. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Voeg 200 μL 100% EtOH toe. Pulse-vortex gedurende 15 s.
    14. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Breng de lysaten over naar de spinkolom van de DNA-extractie. Centrifugeer op 6.000 × g gedurende 1 min.
    15. Plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis. Voeg 500 μL van de buffer van de derde DNA-extractiekit toe aan de spinkolom. Centrifugeer op 6.000 × g gedurende 1 min.
    16. Plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis. Voeg 500 μL van de buffer van de vierde DNA-extractiekit toe aan de spinkolom. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 3 min.
    17. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml. Voeg 100 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan de spinkolom. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Centrifugeer op 6.000 × g gedurende 1 minuut op kamertemperatuur.
    18. Meet indien nodig de DNA-concentratie. Bewaren bij 4 °C voor kortstondige opslag of -20 °C voor langdurige opslag.
  2. DNA-extractie uit FACS-gesorteerde cellen
    OPMERKING: Het handboek van de DNA-extractiekit die in de materiaaltabel wordt vermeld, is gebruikt om dit DNA-extractieprotocol af te leiden.
    1. Centrifugeer de monsters na het sorteren van de cellen gedurende 5 s bij 300 × g om alle druppels aan de zijkanten en het deksel op te vangen. Zorg ervoor dat alle druppels worden opgevangen.
      OPMERKING: Als het monstervolume minder is dan 1.5 ml, ga dan direct verder met de volgende stap. Als het monstervolume groter is dan 1,5 ml, verwijder dan voorzichtig het bovenste gedeelte van het supernatans met behulp van een micropipet en gooi het weg, zodat er 1-1,5 ml van het monster overblijft.
    2. Meng het monster door meerdere keren op en neer te pipetteren en breng het monster over in een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Centrifugeer bij 515 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    3. Gooi het supernatans weg, behalve de laatste 50 μl. Resuspendeer de pellet in 50 μl van de buffer van de eerste DNA-extractiekit voor een eindvolume van 100 μl.
    4. Volg het protocol van de fabrikant voor de isolatie van genoom-DNA uit kleine hoeveelheden bloed (zie Materiaaltabel).
      1. Voeg 10 μL proteïnase K en 100 μL tweede DNA-extractiekitbuffer toe; Meng door pulse-vortexing gedurende 15 s. Incubeer de monsters bij 56 °C gedurende 10 minuten met 300 RPM mengen. Meng de monsters tijdens deze incubatieperiode twee keer door middel van zachte inversie.
      2. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Voeg 50 μL 100% EtOH toe en meng door pulse-vortexing gedurende 15 s. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Breng de monsters over naar de DNA-extractiekolom (de kolom bevindt zich in een verzamelbuis van 2 ml) zonder de rand nat te maken. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut.
      4. Nadat u de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml hebt geplaatst, gooit u de verzamelbuis met de doorstroom weg. Voeg 500 μL van de buffer van de derde DNA-extractiekit toe aan de kolom zonder de rand nat te maken en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 × g .
      5. Nogmaals, nadat u de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml hebt geplaatst, gooit u de opvangbuis met de doorstroom weg. Voeg 500 μL van de buffer van de vierde DNA-extractiekit toe aan de kolom zonder de rand nat te maken en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 × g .
      6. Plaats de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de doorstroombevattende opvangbuis weg. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 3 minuten.
      7. Plaats de kolom in een schone microcentrifugebuis van 1.7 ml en gooi de doorstroombevattende verzamelbuis weg. Voeg 20 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan het midden van het kolommembraan voor elution; Sluit het deksel en incubeer de monsters met het water van moleculaire kwaliteit bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      8. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 1 min. Bewaar het geëlueerde DNA bij 4 °C voor kortstondige opslag of -20 °C voor langdurige opslag.
  3. RNA-vertering en opruiming
    OPMERKING: Het handboek van de DNA-extractiekit die in de materiaaltabel wordt vermeld, is gebruikt om dit DNA-opruimprotocol af te leiden. Afhankelijk van de dPCR-omstandigheden, reagentia en primer- en sondeontwerpen, kan het nodig zijn om de volledige afwezigheid van RNA in het DNA-monster te garanderen voordat wordt overgegaan tot de kwantificering van dPCR vg/dg. RNA-contaminatie kan onder bepaalde dPCR-omstandigheden leiden tot verschillende gradaties van onnauwkeurige vg/dg-waarden.
    1. Voeg in een PCR-buisje van 0,2 ml of een microcentrifugebuisje van 1,7 ml maximaal 20 μl van het geëxtraheerde DNA-monster en 1,5 μl van het DNasevrije RNase toe aan elk DNA-monster. Als het volume van de DNA/RNase-mix minder is dan 21,5 μL, voeg dan voldoende water van moleculaire kwaliteit toe tot een eindvolume van 21,5 μL en meng 25x door de buisjes om te keren. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met periodiek mengen om de 10 minuten door de buizen om te keren.
      OPMERKING: De totale hoeveelheid nucleïnezuren die aan de buis wordt toegevoegd, moet tussen 175 ng en 700 ng zijn. Aanpassingen kunnen nodig zijn als de DNA-monsters volumes of nucleïnezuurhoeveelheden bevatten die buiten dit bereik liggen of als DNA-monsters anders zijn geïsoleerd.
    2. Zet 2 minuten op het ijs. Voeg voldoende moleculair water toe aan elke DNA/RNase-mix tot een eindvolume van 100 μL.
      OPMERKING: Het hier vermelde RNase wordt aanbevolen omdat het het verontreinigende RNA verteert zonder het doel-DNA of stroomafwaartse PCR-tests negatief te beïnvloeden.
    3. Volg het protocol van de fabrikant voor het opschonen van genoom-DNA (zie Materiaaltabel).
      1. Voeg 10 μL van de buffer van de eerste DNA-extractiekit en 250 μL van de buffer van de tweede DNA-extractiekit toe. Meng door pulse-vortexing gedurende 10 s.
      2. Breng de monsters over naar de DNA-extractiekolom in een verzamelbuisje van 2 ml zonder de rand nat te maken. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut.
      3. Nadat u de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml hebt geplaatst, gooit u de verzamelbuis met de doorstroom weg. Voeg 500 μL van de buffer van de tweede DNA-extractiekit toe aan de kolom zonder de rand nat te maken. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut.
      4. Plaats de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de doorstroombevattende opvangbuis weg. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 6 minuten.
      5. Plaats de kolom in een schoon microcentrifugebuisje van 1,7 ml en gooi het verzamelbuisje met de doorstroom weg. Voeg 20 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan het midden van het kolommembraan voor elutie, sluit het deksel en incubeer de monsters met het water van moleculaire kwaliteit bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      6. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 1 minuut. Bewaren bij 4 °C voor kortstondige opslag of -20 °C voor langdurige opslag.
      7. Bevestig de afwezigheid van RNA-besmetting in het RNase-verteerde monster met eindpunt PCR of dPCR of kwantitatieve PCR (qPCR) met behulp van een PCR-primerpaar dat een mRNA-gebied zou amplificeren dat meerdere exonen omvat en niet slechts een enkel exon.
        OPMERKING: Het mRNA-doelwit moet van een gen zijn dat sterk tot expressie komt in het doelweefsel/celtype om ervoor te zorgen dat de mRNA-besmetting correct wordt geïdentificeerd indien aanwezig. Amplicons die meerdere exonen overspannen, maken onderscheid tussen banden die het gevolg zijn van het besmetten van mRNA versus genomisch DNA. Zorg altijd voor een niet-RNase verteerd DNA-monster als positieve controle voor de PCR-reactie om ervoor te zorgen dat mRNA-besmetting wordt gedetecteerd indien aanwezig.
  4. Digitale PCR (dPCR)
    1. Eindpunt PCR om de specificiteit van primers en optimale PCR-omstandigheden te controleren (optioneel)
      1. Ontwerp dPCR-primerparen en sondes voor het vectorgenoom en dPCR-primerparen en sondes voor het muisreferentiegen die zullen worden gebruikt om de diploïde genomen in het monster te kwantificeren.
        OPMERKING: Streef naar een amplicongrootte tussen 60 bp en 150 bp. Het referentiegen voor muizen moet een gen zijn met een constant aantal genkopieën per diploïde genoom. Voor de hier genoemde berekeningen heeft het referentiegen (Polr2a) twee kopieën per diploïde genoom.
      2. Voor een PCR-reactie met een eindpunt van 10 μl bereidt u het PCR-mengsel met behulp van de reagentia en de uiteindelijke concentraties die later voor de dPCR-reactie zullen worden gebruikt. Voeg het RNase-verteerde sjabloon-DNA-monster (hoeveelheidsbereik van nucleïnezuren 56-223 ng) toe aan een eindconcentratie van 1x dPCR-mastermix die de DNA-polymerase en dNTP's bevat, 0.8 μM van elke voorwaartse primer, 0.8 μM van elke omgekeerde primer, 0.4 μM van elke sonde en 0.025 E/μL restrictie-enzym (uiteindelijke concentratie van restrictie-enzym is afhankelijk van het gebruikte restrictie-enzym en merk). Voeg water van moleculaire kwaliteit toe om een eindvolume van 10 μl te bereiken.
        OPMERKING: Er moeten ten minste twee primerparen en twee sondes in de PCR-mix zitten: een primerpaar en een sonde om het vectorgenoom te detecteren en een primerpaar en een sonde om het muizengenoom te detecteren.
      3. PCR thermische cyclusomstandigheden: Eerste warmteactiveringsstap bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 35-45 cycli van een denaturatiestap bij 95 °C gedurende 25 s en een gecombineerde gloei-/extensiestap bij 58-62 °C gedurende 1 min.
        OPMERKING: De optimale gloeitemperatuur moet voor elk amplicon- en primerpaar worden bepaald. Het aantal cycli kan worden aangepast aan de hoeveelheid sjabloon-DNA in het monster.
      4. Visualiseer het PCR-product op een agarosegel met behulp van gelelektroforese om de aanwezigheid van de doelampliconbanden en eventuele niet-specifieke amplificatiebanden te bepalen.
      5. Ga verder met de volgende dPCR-stap nadat u hebt bevestigd dat de primerparen en cyclusomstandigheden resulteren in specifieke amplificatie van de doelsequenties.
    2. dPCR-reactie
      1. Voeg voor een dPCR-reactie van 40 μl tot 4 μl van het RNase-verteerde sjabloon-DNA-monster (hoeveelheidsbereik nucleïnezuren 50-330 ng) toe aan een eindconcentratie van 1x dPCR-mastermix die de DNA-polymerase en dNTP's bevat, 0,8 μM van elke voorwaartse primer, 0,8 μM van elke omgekeerde primer, 0,4 μM van elke sonde, en 0,025 E/μL restrictie-enzym (de uiteindelijke concentratie van het restrictie-enzym is afhankelijk van het gebruikte restrictie-enzym en het gebruikte merk). Voeg water van moleculaire kwaliteit toe om een eindvolume van 40 μl te bereiken.
      2. dPCR thermische cyclusomstandigheden: Eerste warmteactiveringsstap bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40-50 cycli van een denaturatiestap bij 95 °C gedurende 25 s, en een gecombineerde gloei-/extensiestap bij 58-62 °C gedurende 1 minuut.
        OPMERKING: De optimale gloeitemperatuur moet voor elk amplicon- en primerpaar worden bepaald. Het aantal cycli kan worden aangepast aan de hoeveelheid sjabloon-DNA in het monster. De volumes, concentraties en omstandigheden die hier worden vermeld, zijn geoptimaliseerd voor dPCR-platen, reagentia en apparaten die worden vermeld in de materiaaltabel. Deze omstandigheden verminderen het effect van mogelijke dPCR-remmers die de nauwkeurigheid van de reactie kunnen verminderen.
      3. Na het uitvoeren van de dPCR-reactie en het verkrijgen van de absolute waarden voor de vectorgenomen en het referentiegen van muizen, berekent u vg/dg in het monster met behulp van vergelijkingen (7-8).
        Voor referentiegenen met twee genkopieën/diploïde genoom:
        Absolute waarde van diploïde genomen (dg) = figure-protocol-7 (7)
        vg/dg = figure-protocol-8 (8)
      4. Controleer het 1D-spreidingsdiagram van de dPCR-reactie om de geldigheid van de test en kwantificering te bevestigen (Figuur 3A,C). Om de test geldig te laten zijn, moet u bevestigen dat het 1D-spreidingsdiagram aan alle volgende criteria voldoet: de aanwezigheid van positieve en negatieve partities; duidelijke scheiding tussen de positieve en negatieve partities om een nauwkeurige bepaling van de drempelwaarde mogelijk te maken; en de aanwezigheid van niet-tot-weinig druppeltjes tussen de positieve en negatieve partities (ook wel regen genoemd), wat de nauwkeurigheid van de dPCR-kwantificering kan verminderen.

Resultaten

Zeven tot negen weken oude mannelijke muizen werden geïnjecteerd met AAV via laterale staartaderinjectie bij 1,5 ×10 12 vg/muis toegediend in een injectaatvolume van 150-200 μl. De ssDNA AAV die hier werd gebruikt, leverde een Cre-recombinasetransgen afgeleverd dat werd aangedreven door een CMV-promotor. De geïnjecteerde muizen waren homozygoot voor het Cre reporter Ai14-allel. Bij blootstelling aan Cre-recombinase brengen Ai14-allelbevattende cellen het fluorescerende tdTomato-eiwit tot expressie. Aangezien tdTomato-expressie wordt veroorzaakt door Cre-geïnduceerde genomische recombinatie, duiden tdTomato-expressiecellen op cellen die ofwel direct door de AAV werden getransduceerd of nageslachtcellen waren van getransduceerde cellen. De hier getoonde gegevens zijn van muizen die zijn geïnjecteerd met AAV9-CMV-Cre in een dosis van 1,5 × 1012 vg/muis, toegediend in 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). De muizen werden 28 dagen na de injectie geofferd en de weefsels werden verzameld zoals hierboven beschreven. Een paar skeletspieren en leverkwabben werden verteerd en hun cellen werden verzameld met behulp van FACS. Een paar leverkwabben werden onmiddellijk ingevroren met behulp van voorgekoeld methylbutaan voor nucleïnezuurextractie. Een paar skeletspieren en leverkwabben werden gefixeerd ingevroren voor histologische beeldvorming van fluorescerende tdTomato. tdTomaat werd diffuus tot expressie gebracht door de lever (Figuur 2A) en quadriceps (Figuur 2C), wat aangeeft dat AAV9 in grote lijnen verschillende regio's van beide weefsels bereikte en transduceerde.

DNA geëxtraheerd uit vers ingevroren lever en FACS-gesorteerde cellen werd gebruikt om vg/dg te kwantificeren met behulp van dPCR. Kwantificering van Vg/dg kan worden gebruikt om de injectieconsistentie en de transductie-efficiëntie van AAV in het geanalyseerde monster te beoordelen. De 1D-druppelverspreidingsdiagrammen van het vers ingevroren leverweefselmonster en FACS-gesorteerde cellen werden gebruikt om de geldigheid van de test te waarborgen (Figuur 3A,C). Het spreidingsdiagram toonde de aanwezigheid van positieve en negatieve partities, een duidelijke scheiding tussen de positieve en negatieve partities die een nauwkeurige bepaling van de detectiedrempel mogelijk maakt, en de aanwezigheid van niet-tot-weinig druppeltjes tussen de positieve en negatieve partities, wat de nauwkeurigheid van de dPCR-test kan verminderen. Het voldoen aan al deze criteria gaf aan dat de resultaten van de dPCR-test geldig waren. Het aantal Polr2a-genkopieën in elk monster werd gekwantificeerd om het aantal diploïde genomen van muizen te bepalen (2 Polr2a-genkopieën/diploïde genoom van muizen), en primers/sonde tegen de Cre-recombinase-transgensequentie werden gebruikt om het virale genoom te kwantificeren (1 transgenkopie/viraal genoom, tabel 1). De vg/dg-waarde werd gekwantificeerd voor het vers ingevroren leverweefselmonster en FACS-gesorteerde cellen en toonde de aanwezigheid van respectievelijk 187,7 vg/dg en 4,7 vg/dg in elk monster (figuur 3B,D). Monsters van PBS-geïnjecteerde muizen en niet-sjablooncontroles die geen nucleïnezuren bevatten, werden gebruikt als negatieve controles.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van het intraveneuze injectiestation. (A) Gereedschap dat nodig is om IV-injectie uit te voeren. Hier ziet u de (1) timer, (2) muisslangbeschermer, (3) ongesneden en (4) doorgesneden plastic fixussen, (5) alcoholdoekje, (6) lege pipetpuntjesdoos die wordt gebruikt als platform om de muisslanghouder omhoog te tillen, (7) wegwerpabsorberende pads, (8) conische slang van 15 ml met warm water, (9) slanghouder van 15 ml, (10) gaas en (11) insulinespuit. (B) De muis wordt eerst in de buishouder geplaatst. Vervolgens wordt de conus van de afgesneden restrainer ingebracht om een fixatiehuls rond de muis te creëren, als de muis te klein is om alleen door de buisrestrainer te worden vastgehouden. Zorg ervoor dat de ademhaling van de muis niet wordt belemmerd door de weerbarstten. De buisvergrendeling wordt bovenop het verhoogde platform geplaatst om de muisstaart in warm water te kunnen plaatsen. (C) Positionering van de staart van de muis en hoek van het vasthouden van de naald onmiddellijk voordat de injectie wordt uitgevoerd. Trek de staart naar achteren zodat de staart gestrekt is en de injectieplaats volledig horizontaal is. De naald is evenwijdig aan de staart en de ader en de afschuining is naar boven gericht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Detectie van fluorescerend reportereiwit na IV-injectie. Zeven tot negen weken oude mannelijke muizen met het Cre-reporter Ai14-allel werden IV geïnjecteerd met AAV9-CMV-Cre op 1,5 × 1012 vg/muis toegediend in 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) of PBS. Representatieve fluorescentiebeelden van muissecties (A) lever of (C) quadriceps na AAV9 toediening van Cre IV-injectie. (B) Lever- of (D) quadricepssecties van PBS-geïnjecteerde muizen werden afgebeeld om als negatieve controles te dienen. De weefsels werden 28 dagen na de IV-injectie verzameld en ingevroren. Na blootstelling aan Cre wordt fluorescerend tdTomato-eiwit tot expressie gebracht in getransduceerde cellen en nakomelingcellen van getransduceerde cellen. Secties van 10 μm dik werden afgebeeld bij een vergroting van 10x. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kwantificering van het vectorgenoom per diploïde genoom (vg/dg). 1D-spreidingsdiagram van kwantificering van dPCR-vectorgenomen in (A) leverweefsel of (C) FACS-gesorteerde cellen verzameld van muizen die zijn geïnjecteerd met AAV9-CMV-Cre of PBS. De spreidingsdiagrammen tonen de positieve en negatieve dPCR-verdelingen, evenals de detectiedrempel die wordt aangegeven door de horizontale lijn over de monsters. (B,D) kwantificering van vg/dg na kwantificering van de diploïde genomen en vectorgenomen van muizen in het (B) leverweefsel of (D) FACS-gesorteerde celmonsters. De hier getoonde resultaten zijn van een enkele AAV9-geïnjecteerde muis en een enkele PBS-geïnjecteerde muis met een technisch dPCR-duplicaat voor elke muis. Foutbalken geven het betrouwbaarheidsinterval van 95% voor elk monster aan. Afkortingen: NTC= Non-template control; dPCR = digitale PCR; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AbcVolgorde
Cre voorwaartse primerCTGACGGTGGGAGAATGTTAAT
Cre omgekeerde primerCATCGCTCGACCAGTTTAGTT
Cre sonde/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/
Polr2a voorwaartse primerGACTCCTTCACTCACTGTCTTC
Polr2a omgekeerde primerTCTTGCTAGGCAGTCCATTATC
Polr2a-sonde /5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/

Tabel 1: Sequenties van primers en sondes die worden gebruikt voor de kwantificering van vg/dg. Cre-primers en sonde werden gebruikt om het vectorgenoom te kwantificeren. Polr2a-primers en sonde werden gebruikt om het diploïde genoom van muizen te kwantificeren.

Discussie

Op AAV gebaseerde therapieën hebben een groot potentieel voor monogene aandoeningen vanwege de veelzijdigheid van AAV als gentherapievector, waardoor het mogelijk is om AAV's aan te passen aan de verschillende toedieningsbehoeften van verschillende aandoeningen 4,5,7,9. AAV's worden vaak toegediend via IV-injectie in preklinische muismodellen om de veiligheid en werkzaamheid van potentiële therapieën te testen16. Aangezien verschillende geïnjecteerde AAV-doses kunnen leiden tot duidelijke verschillen in de experimentele resultaten, is het van cruciaal belang dat onderzoekers in staat zijn om de beoogde AAV-dosis consequent te injecteren om de validiteit en robuustheid van de gegenereerde in-vivogegevens te waarborgen28. IV-injecties worden veel gebruikt, maar ze zijn technisch uitdagend en vereisen uitgebreide training en voortdurende oefening om een vaardigheidsniveau te ontwikkelen en te behouden dat zorgt voor consistent succesvolle injecties 16,17,18,19. Naast het correct injecteren van AAV, is het meestal gewenst om assays te gebruiken om de biodistributie en afgifte-efficiëntie van de geïnjecteerde AAV aan de doelweefsels of -cellen te beoordelen29,30.

Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen om gemakkelijk IV-injecties met succes en consistent uit te voeren door de details van een geoptimaliseerd IV-injectieprotocol voor het toedienen van AAV bij 7-9 weken oude, niet-verdoofde muizen grondig te beschrijven. Het is belangrijk op te merken dat muizen die duidelijk kleiner of groter zijn dan wildtype muizen in de hier gebruikte leeftijdscategorie, een grotere uitdaging kunnen vormen vanwege een verminderde zichtbaarheid van de aderen of onverenigbaarheid met de restrainers die bij deze methode worden gebruikt. Eerder is gemeld dat staart IV-injecties niet geschikt zijn voor intraveneuze toediening van reagentia bij muizen jonger dan 6 weken oud vanwege de kleine vaatgrootte31. Hoewel het mogelijk is, kan het moeilijk zijn om muizen met een gewicht van minder dan 22,0 g consequent met succes te injecteren. Onderzoekers die muizen van atypische grootte gebruiken, moeten mogelijk aanpassingen aan de procedure maken. Dit protocol schetst ook verschillende tests die kunnen worden gebruikt om de biodistributie en transductie-efficiëntie van AAV te beoordelen.

Bij het volgen van dit protocol moeten enkele kritieke punten in gedachten worden gehouden. Tijdens de injectie zorgen naalden van 29 G voor meer weerstand als de naald zich niet in de ader bevindt. Dit vermindert het volume dat verloren gaat door onbedoelde perivasculaire injectie van de oplossing tijdens mislukte injectiepogingen. Insulinespuiten hebben kleinere dode volumes dan gewone spuiten. Als u een andere spuit en/of naald gebruikt dan de hier vermelde, moet mogelijk een extra injectievolume worden voorbereid in protocolstappen 1.1.3.3 om rekening te houden met een groter dode ruimtevolume (bijv. voeg 30 μl toe aan de beoogde dosis in plaats van 15 μl).

Als er fijne luchtbellen worden gevormd aan de zijkanten van de spuit tijdens het opzuigen van de AAV-dosis in de spuit, trek de injectie dan langzaam verder omhoog in de spuit. Hierdoor worden de meeste kleine luchtbelletjes verwijderd. Laad ten minste 10-15 μL extra AAV tot het beoogde volume dat moet worden geïnjecteerd. Dit extra volume is bedoeld om rekening te houden met eventueel volume dat verloren zou kunnen gaan tijdens het verdrijven van luchtbellen of mogelijke mislukte injectiepogingen. (bijv. als het te injecteren doelvolume 150 μl is, laadt u 165 μl in de spuit (halverwege tussen de markeringen van 160 μl en 170 μl op de schaal van de spuit). Als de naald correct in de ader is geplaatst en het volume in de spuit 165 μl bedraagt onmiddellijk voor de succesvolle injectiepoging, dient u het reagens toe te dienen totdat er nog 15 μl in de spuit zit (halverwege tussen de markeringen van 10 μl en 20 μl), waardoor 150 μl (165 μl - 150 μl = 15 μl)) wordt toegediend). Door het afschuinlumen (schuine kant naar boven) uit te lijnen met de schaal van de spuit, kan het geleverde volume tijdens de injectie worden gevolgd.

Sommige onderzoekers geven er misschien de voorkeur aan om de muis op zijn zij te leggen, zodat een van zijn aderen recht en gemakkelijk toegankelijk is in vergelijking met een muis op zijn poten. De staart van een muis op zijn kant zal echter onder verschillende hoeken schuin staan, afhankelijk van de grootte van de muis, waardoor de injectiehoek moet worden aangepast bij het injecteren van muizen van verschillende groottes. Dit kan een negatieve invloed hebben op de consistentie van het succes van de procedure. Tijdens de eerste oefenpogingen kunnen onderzoekers beide muisbeperkende oriëntaties proberen om hun voorkeursaanpak te bepalen. Door de muis op zijn poten te hebben, hebben beide laterale staartaders snel en gemakkelijk toegang. Dit verkort de fixatietijd wanneer toegang tot beide aders nodig is in het geval van meerdere mislukte injectiepogingen.

Als de laterale ader dicht bij de staartbasis (dichter bij het lichaam van de muis) wordt geïnjecteerd (vooral voor muizen met een gewicht van >30 g.), pas dan de injectiehoek aan van evenwijdig aan de ader tot 5°-10° ten opzichte van de ader, aangezien de ader aan de staartbasis iets dieper is dan distaal.

De hier vermelde RNase-digestie- en RNA-contaminatiecontroleprotocollen werden geverifieerd op DNA-monsters geïsoleerd uit vers ingevroren leverweefsels die in totaal 175-700 ng nucleïnezuren in 20 μL bevatten. Het RNase-verteringsprotocol werd ook getest op DNA-monsters geïsoleerd uit vers ingevroren leverweefsels en FACS-gesorteerde cellen om de aanwezigheid van het vectorgenoom en het muizengenoom na RNase-spijsvertering te bevestigen. De resultaten werden gevisualiseerd met behulp van agarosegelelektroforese van eindpunt PCR-amplificatie van de doelamplicons.

Het volgen van de beschreven methodologie kan de trainings- en oefentijd die nodig is om IV-injecties onder de knie te krijgen, verminderen en resulteren in een hogere succesvolle injectiesnelheid, wat reagentia zou besparen. Dit protocol maakt gebruik van eenvoudige en veelgebruikte tools zonder dat er geavanceerde apparatuur of instellingen nodig zijn die mogelijk niet direct beschikbaar zijn. Bovendien kunnen de hier vermelde IV-injectiestappen worden toegepast op een breed scala aan injectaten die intraveneus moeten worden toegediend, zoals antisense-oligonucleotiden (ASO's), met de juiste aanpassingen aan de injectiebereidingsstappen, afhankelijk van het injectaat.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen openbaarmakingen die relevant zijn voor het werk dat in dit artikel is gepubliceerd.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de medewerkers van de NINDS-dierenverzorgingsinstelling bedanken voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramuraal Onderzoek van de NIH, NINDS (Jaarverslag nummer 1ZIANS003129). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm spuitfilterMilliporeSLGVM33RS
0.3 mL insulin spuit met 29G naaldBD Biosciences324702
1.7 mL microcentrifuge  buisCrystalgen23-2051
10 mL spuitBD Biosciences302995
100% EtOHThe Warner Graham Company201096
10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Corning46-013-CMGebruikt om 1x PBS voor weefselfixatie te bereiden
15 mL kegelvormige buisCorning430766
15 mL kegelvormige buishouderMeerdere bronnenN/A
190 proof ethylalcoholThe Warner Graham Company6810-01-113-7320Gebruikt om 70% ethanol te bereiden
1x steriele PBSGibco10010023
2 mL microcentrifuge weefselopslagbuisjesEppendorf022363344
4% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences157-4
Adeno-geassocieerd virus (AAV)Charles RiverN/AEenstrengs DNA (ssDNA) AAV werd verpakt om Cre recombinase als transgen te leveren, aangedreven door CMV-promotor
AlcoholdoekjeBD Biosciences326895
Bead lysisbuisNext AdvanceGREENE5
BsuRI (HaeIII) restrictie-enzymThermo Fisher ScientificER0151 
Bullet blenderNext AdvanceBBX24B
Ai14-afgeleide muizen uit JAX 007914 stam (genetische achtergrond: C57BL/6J)N/AN/AMuizen met Ai14 Cre-reporter allel werden gekocht bij JAX (catalogusnummer: 007914)
Wegwerp absorberende kussentjesFisherbrand1420662
DissectietangFine Science Tools (F.S.T)11251-35
Dissectie schaarFine Science Tools (F.S.T)14085-08
DNA-degradatie reagens (DNAZap)InvitrogenAM9890
DNA-Extractie RNase AQiagen19101Voor RNA-digestie tijdens nucleïnezuurextractie
DNase-vrije RNase voor DNA-opruiming F. Hoffmann-La Roche11119915001Voor RNA-digestie na nucleïnezuurextractie
dPCR Probe PCR KitQiagen250102
dPCR software Qiagen N/A QIAcuity Software Suite 
Verhoogd platformMeerdere bronnenN/AEen lege doos pipettenpunten werd gebruikt om de muisbegrenzer tijdens het opwarmen van de staart te verhogen
FluorescentiemicroscoopMeerdere bronnenN/AGebruikte model: Nikon Eclipse Ti
Fluorescentiemicroscoop software Meerdere bronnen N/A Gebruikte software: NIS-Elements 
GaasCovidien9022
Heat blockEppendorfThermomixer 5350
HogesnelheidscentrifugeEppendorf22620689
Metaal containerVollrath80125
MethylbutaanJ.T. BakerQ223-08
Moleculair waterQuality Biological351-029-131
MuisbuisbegrenzerBraintree ScientificTV-RED-150-STD
Myfuge mini centrifugeBenchmark ScientificC1012
Polymerasekettingreactie thermocyclusBio-Rad Laboratories1851148Model: C1000 Touch
PrecisiedoekjesKimberly-Clark Professional7552
Proteinase KQiagen19131
QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-welQiagen250001
QIAcuity One dPCR systeemQiagen911020
Qiagen DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69504Gebruikt voor DNA-extractie uit weefsels
Qiagen QIAamp DNA Micro KitQiagen56304Gebruikt voor opruiming van genomisch DNA, en de isolatie van DNA uit kleine volumes van bloedprtocotol werd gebruikt voor DNA-extractie uit FACS-gesorteerd cellen
Knaagdier begrenzer kegelBraintree ScientificMDC-200
WeegschaalOhaus72212663
Styrofoam doosMeerdere bronnenN/A
SucroseSigma-AldrichS9378-1kg
Oppervlaktereiniger en ontsmettingsmiddelPeroxigard29101 
TimerMeerdere bronnenN/A
TransfertangFine Science Tools (F.S.T)91113-10
VortexDaigger & Company22220AModel: Daigger Vortex Genie 2

Referenties

  1. Tisdale, A., et al. The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429(2021).
  2. Condo, I. Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies. Int J Mol Sci. 23 (12), 6525(2022).
  3. Vaisitti, T., et al. The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374(2021).
  4. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).
  5. Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023. Viruses. 15 (3), 698(2023).
  6. Wang, C., et al. Emerging non-viral vectors for gene delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 272(2023).
  7. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl 3rd, W. R. Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  8. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).
  9. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  10. Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
  11. Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: A review. Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).
  12. Jucker, M. The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases. Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).
  13. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
  14. Anders, H. J., Vielhauer, V. Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design. Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).
  15. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  16. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
  17. Hauff, P., Nebendahl, K. Drug administration. Small Animal Imaging: Basics and Practical. Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. , Springer International Publishing. Cham. 127-152 (2017).
  18. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), (2019).
  19. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).
  20. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
  21. Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction. J Vis Exp. (126), e55994(2017).
  22. Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model. J Vis Exp. (165), e61961(2020).
  23. Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs. J Vis Exp. (154), e60687(2019).
  24. JoVE. Lab Animal Research. Compound administration I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2023).
  25. Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice. UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf (2023).
  26. Jones, K. Tail vein injections in the mouse and rat sop. UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , Available from: https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf (2012).
  27. Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections. Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).
  28. Burr, A., et al. Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).
  29. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  30. Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics. Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).
  31. Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. Tumor formation assays. Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Intraveneuze injectiesystemische toedieninggentherapievectorenfixatie van muizenfluorescent reportereiwithistologische beeldvormingAAV transductiebiodistributieanalyse
Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.