Methodenartikel

Techniek voor intranasale toediening van α-synucleïne-aggregaten

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

8 november 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor intranasale toediening van α-synucleïneaggregaten. Deze methode geeft inzicht in de voortplanting van α-synucleïne van het reukslijmvlies naar de bulbus olfactorius bij de ziekte van Parkinson.

Samenvatting

De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van Lewy-lichaampjes, dit zijn aggregaten van α-synucleïne (α-Syn). Onlangs werd voorgesteld dat de ziekte zich zou ontwikkelen en zou evolueren door de prionachtige voortplanting van α-Syn-aggregaten uit de bulbus olfactorius (OB) of de dorsale kern van de nervus vagus. Hoewel de oorsprong van α-Syn-aggregaten in de OB onduidelijk blijft, is onlangs hun voortplanting uit het reukslijmvlies gesuggereerd. We hebben eerder aangetoond dat intranasale toediening van α-Syn-aggregaten in een muismodel α-Syn-pathologie induceerde in de OB van muizen. In deze studie presenteren we een methode voor intranasale toediening van α-Syn-aggregaten die α-Syn-pathologie induceerden in de OB van muizen. Intranasale toediening van α-Syn-aggregaten is een zeer eenvoudige en ongecompliceerde methode, en we geloven dat het een nuttig hulpmiddel zal zijn in het onderzoek naar de oorsprong van α-Syn-pathologie in de OB en de route van α-Syn-propagatie door het olfactorische systeem.

Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD), die wordt gekenmerkt door motorische symptomen zoals bradykinesie, tremoren in rust en spierstijfheid, is de op één na meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening1. PD vertoont ook niet-motorische symptomen, waaronder olfactorische disfunctie, cognitieve stoornissen, depressie, hallucinaties, constipatie en orthostatische hypotensie. De pathologische kenmerken zijn de dopaminerge celdood in de substantia nigra en de aanwezigheid van α-synucleïne (α-Syn) aggregaten, genaamd Lewy bodies2.

Merk op dat α-Syn een eiwit van 140 aminozuren is dat onder normale omstandigheden bestaat in de vorm van een oplosbaar monomeer (of tetrameer). Onder abnormale omstandigheden wordt het oplosbare monomeer echter omgezet in onoplosbare aggregaten met een hoog moleculair gewicht, waaronder oligomeren en fibrillen. De overgang van α-Syn naar oligomeren en fibrillen is naar verluidt betrokken bij cellulaire toxiciteit3.

Recente studies hebben de prionachtige voortplanting van α-Syn-aggregaten tussen neuronen gesuggereerd. Op basis van talrijke postmortale onderzoeken stelden Braak et al. in 2003 de hypothese voor dat Lewy body pathologie zich progressief verspreidt in de hersenen op een enigszins stereotiepe manier (hypothese van Braak)4,5. In 2008 onthulde postmortaal onderzoek van patiënten met PD die foetale middenhersentransplantaties hadden ondergaan, Lewy-lichaampjes in dopaminerge neuronen afgeleid van foetale weefsels 6,7. Deze studies suggereerden dat α-Syn-aggregaten zich van de zieke hersenen naar transplantaten zouden kunnen verspreiden, wat de hypothese van Braak ondersteunt.

Naar aanleiding van deze waarnemingen hebben experimenten met primaire neuronale culturen en intracerebrale injectie van α-Syn-aggregaten bij muizen de verspreiding van Lewy body-achtige aggregaten gereproduceerd, wat verder bewijs levert voor α-Syn-voortplanting op een prionachtige manier 8,9.

Braak et al. toonden aan dat de Lewy body pathologie bij PD begint in de bulbus olfactorius (OB) en/of de dorsale kern van de nervus vagus (dmX)4. Op basis van de hypothese van Braak hebben verschillende onderzoeken de toediening van α-Syn-aggregaten of Lewy body-extracten van PD-hersenen in de OB en het maagdarmkanaal van proefdieren gerapporteerd 10,11,12. In 2018 toonde een studie aan dat de toediening van α-Syn-aggregaten in de OB van wildtype muizen de verspreiding van α-Syn-pathologie langs de olfactorische route induceerde, wat resulteerde in olfactorische disfunctie13. We hebben eerder α-Syn-aggregaten geïnoculeerd in de OB van α-Syn transgene muizen en ontdekten dat dit leidde tot hippocampale atrofie en geheugenstoornissen14.

In 2022 hebben we α-Syn-aggregaten geïnoculeerd in de OB van zijdeaapjes, een kleine niet-menselijke primaat; dit resulteerde in de verspreiding van α-Syn-pathologie langs de olfactorische route, OB-atrofie en wijdverbreid cerebraal glucosehypometabolisme10.

Als de voortplanting van α-Syn-aggregaten echter plaatsvindt vanuit de OB, rijst een kritische vraag: door welk mechanisme verschijnen α-Syn-aggregaten in eerste instantie? Saito et al. rapporteerden eerder de aanwezigheid van Lewy-lichaampjes in het neusslijmvlies15. De aanwezigheid van α-Syn-aggregaten werd gedetecteerd in het neusslijmvlies van patiënten met PD en meervoudige systeematrofie (MSA) met behulp van real-time quaking-induced conversion (RT-QUIC) analyse16. Met name het analyseren van neusslijmvliesmonsters van patiënten met slaapgedragsstoornis (RBD) met snelle oogbewegingen, die wordt beschouwd als een prodromaal stadium van PD, onthulde een toename van α-Syn-niveaus17. Deze studie suggereerde dat α-Syn-pathologie zelfs in de prodromale fase van PD in het neusslijmvlies zou kunnen bestaan.

Hoewel deze bevindingen een mogelijke route van het neusslijmvlies naar de OB suggereerden, is er beperkt experimenteel bewijs dat dit scenario ondersteunt. Om deze kloof te dichten, hebben we α-Syn-aggregaten toegediend in de neusholte van muizen en de voortplanting van α-Syn-pathologie van neusslijmvlies naar de OB onderzocht. Onze experimentele aanpak toonde aan dat een intranasale toediening van α-Syn met een enkelvoudige dosis bij wildtype muizen α-Syn-pathologie in de OB induceerde, wat experimenteel bewijs leverde voor de voortplantingsroute van het neusslijmvlies naar de OB.

Protocol

Voor dit onderzoek werden C57BL/6J mannelijke muizen van 2 maanden oud gebruikt. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de nationale richtlijnen. De Animal Research Committee van de Universiteit van Kyoto heeft ethische goedkeuring en toestemming verleend voor deze studie (MedKyo 23.544).

1. Intranasale toediening van α-Syn voorgevormde fibrillen

  1. Bereid de α-synfibrillen oplossing van muizen in PBS (4 mg/ml) volgens de eerder gerapporteerde methode11. Wikkel de tube in met een transparante film om besmetting te voorkomen.
  2. Sonificeer 200 μL α-Syn-fibrillenoplossing om α-Syn voorgevormde fibrillen (PFF's) te genereren met behulp van een sonicator van het waterbadtype (Materiaaltabel). Vul het ultrasoonbad met water en voeg ijsblokjes toe om af te koelen tot 4 °C voor sonicatie. Soniceerfibrillen gedurende in totaal 5 minuten, waarbij elke cyclus bestaat uit 30 s sonicatie gevolgd door een interval van 30 s (in totaal vijf cycli).
    OPMERKING: Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen zoals wegwerphandschoenen, masker en veiligheidsbril om blootstelling van α-Syn te voorkomen.
  3. Bereid een P10-pipet voor (materiaaltabel) met een pipetpunt van 10 μl. Verdoof elke muis met een combinatie van medetomidinehydrochloride, midazolam en butorfanol (MMB) door middel van intraperitoneale (i.p.) injectie. Het MMB-combinatie-anestheticum bevatte midazolam (0,3 mg/kg), medetomidine (4 mg/kg) en butorfanoltartraat (5 mg/kg). Gebruik 0,005 ml/g via i.p. injectie bij het mengen van midazolam (1 mg/ml) 0,3 ml, medetomidine (5 mg/ml) 0,8 ml, butorfanoltartraat (5 mg/ml) 1 ml en zoutoplossing 2,9 ml.
  4. Wacht 10 minuten om er zeker van te zijn dat de muizen volledig verdoofd zijn. Een goede verdoving kan worden bevestigd als de muis lateraal ligt en zichzelf niet kan rechtzetten. Eenmaal verdoofd, breng oogzalf aan met behulp van een steriele katoenen applicator om uitdroging van de ogen te voorkomen.
    OPMERKING: Zonder verdoving is het bij het toedienen van nasale doses moeilijk om de muizen in rugligging te houden en α-Syn-oplossing op de juiste manier toe te dienen terwijl de muizen niezen. Om deze redenen was sedatie noodzakelijk.
  5. Plaats de verdoofde muis in rugligging. Plaats een papieren handdoek of iets dergelijks onder het lichaam en zorg ervoor dat het hoofd iets naar beneden kantelt (Figuur 1A,B). Deze positionering voorkomt dat de toegediende α-Syn-oplossing snel in de longen of slokdarm stroomt, waardoor deze gemakkelijker in de neusholte wordt vastgehouden. De neusgaten zijn te zien in figuur 1C.
  6. Zuig 1 μl α-Syn-oplossing (4 mg/ml) op in een P10-pipet en plaats de pipetpunt in de buurt van de neus van de muis. Vorm langzaam een ronde druppel en houd deze aan het einde van de pipetpunt (Figuur 1D, rode pijl). Intranasale toediening wordt uitgevoerd voor het unilaterale neusgat, gebruik de contralaterale zijde als controlezijde.
  7. Breng de druppel dicht bij één kant van de neusgaten van de muis en laat de muis deze op natuurlijke wijze inademen. Let op de inademing en wacht 30 s tot 1 minuut (Figuur 1E).
  8. Herhaal stap 1.6.-1.7. totdat een totaal volume van 20 μl α-Syn-oplossing is toegediend. Gooi na alle procedures de handschoenen weg en veeg een bank af met in de handel vervuilde reinigingsmiddelen als het oppervlak vervuild is met α-Syn
    OPMERKING: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een veiligheidskast om te voorkomen dat α-fibrillen worden ingeademd door het personeel dat de procedure uitvoert. Een eerder rapport heeft aangetoond dat het volume van 25 μL het meest efficiënt is voor de toediening van geneesmiddelen tussen neus en hersenen18. In deze studie gebruiken we een vergelijkbaar volume van 20 μL. We gebruiken ook dezelfde concentratie PFF's als die voor injectie in de OB in het vorige rapport10, die dicht bij de 400 μM (5,6 mg/ml) van PFF's19 ligt.
  9. Atipamezol (3 mg/kg; Tabel van materialen) door i.p. injectie om medetomidine om te keren en het herstel te vergemakkelijken. Gebruik 0,005 ml/g via i.p. injectie bij het mengen van atipamezol (5 mg/ml) 0,6 ml en zoutoplossing 4,4 ml.
    OPMERKING: Zorg voor analgesie omdat het niet volledig duidelijk is hoe belastend de intranasale toediening van α-Syn zou zijn.
  10. Laat de muis niet zonder toezicht achter totdat hij weer voldoende bewustzijn heeft om de sternale lighouding te behouden. Nadat de muis volledig hersteld is, plaatst u de muis terug in de kooi.

2. Voorbereiding van het monster

  1. Offer de behandelde muizen 1, 3, 6 en 12 maanden na intranasale toediening van α-Syn voorgevormde fibrillen.
    1. Plaats de muizen in de inductiebox, dien sevofluraan (>6,5%) toe en ga door totdat > 60 s ademhalingsstilstand optreedt. Verwijder de muizen en voer een snelle verbloeding uit door middel van een rechter atriale incisie om euthanasie te garanderen.
  2. Steek een naald van 25 G (tabel met materialen) in de top van het hart. Verdrink de muis met 4 ml/min met 15 ml PBS en vervolgens 15 ml 4% PFA in PBS.
  3. Knip het hoofd af met een schaar en maak met een scalpel een incisie van 2 cm in de hoofdhuid. Snijd het schedelbot in met een schaar aan de zijkant van de onderkant tot aan de neus (Figuur 2A,B). Om de OB's te verkrijgen, verwijdert u het schedelbot van de OB's volledig (Figuur 2B, gele cirkel).
  4. Draai het hoofd om, snijd de hersenzenuwen door en verwijder de hersenen vervolgens voorzichtig met een tang (Figuur 2C, D). Verkrijg de hersenen met intacte OB's (Figuur 2E). Om de intacte OB's te verkrijgen, snijdt u voorzichtig de reukzenuwen door met een tang terwijl de OB's zich aan het schedelbot hechten (Figuur 2D, gele cirkel).
  5. Plaats de hersenmonsters 's nachts bij 4 °C in de 4% PFA in PBS. Laat de hersenmonsters niet langer dan 24 uur staan.
    OPMERKING: Overmatige fixatie zal de immunohistochemische kleuring verminderen. Als langdurige opslag vereist is, bewaar dan hersenmonsters in 70% ethanol of PBS met 0,1% natriumazide om de steriliteit te behouden.

3. Immunohistochemische kleuring van de OB

  1. Paraffiniseer de monsters met behulp van een automatische weefselverwerker (materiaaltabel) zoals hieronder beschreven.
    1. Dompel 120 minuten onder in 70% ethanol, gevolgd door 8x onderdompeling in 100% ethanol gedurende 60 minuten. Dompel vervolgens 3x 120 minuten onder in 100% xyleen.
    2. Dompel 120 minuten onder in paraffine bij 60 °C, gevolgd door onderdompeling in paraffine bij 60 °C gedurende 240 minuten.
  2. Integreer de monsters in paraffine zoals hieronder beschreven.
    1. Veranker de monsters in paraffine bij 60 °C met een modulair weefselinbeddingscentrum (Materiaaltabel). Koel ze af op ijs.
  3. Snijd de monsters in secties van 8 μm dik met een microtoom (Table of Materials)18.
  4. Voer deparaffinisatie uit zoals hieronder beschreven.
    1. Dompel 2x 5 minuten onder in 100% xyleen, gevolgd door 2x 3 minuten onderdompelen in 100% ethanol.
    2. Dompel 3 minuten onder in 70% ethanol. Wassen in PBS gedurende 3 min.
  5. Voer het ophalen van antigeen uit zoals hieronder beschreven.
    1. Dompel 15 minuten onder in 100% mierenzuur. Spoel gedurende 2 minuten in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Autoclaaf bij 120 °C gedurende 10 min. Laat het op natuurlijke wijze afkoelen.
  6. Dompel 10 minuten onder in 1% waterstofperoxide in methanol. Wassen in PBS gedurende 5 min.
  7. Voeg 500 μL 5% magere melk in PBS toe op de glaasjes en incubeer ze 30 minuten op kamertemperatuur.
  8. Doe het 500 μL anti-gefosforyleerd α-Syn-antilichaam (p-α-Syn, 1/10000) in PBS op de objectglaasjes en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Was 2x met PBS gedurende 5 minuten elk.
  9. Incubeer met universeel immunoperoxidasepolymeer, anti-konijn (materiaaltabel) gedurende 1 uur bij 25 °C. Was 2x met PBS gedurende 5 minuten elk.
  10. Ontwikkel met behulp van de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kleuringskit (Materiaaltabel) gedurende 5 minuten volgens de instructies van de fabrikant.
  11. Dompel 1 minuut onder in hematoxylineoplossing (Materiaaltabel). Ontkleur 10 minuten in stromend water.
  12. Voer de montage uit zoals hieronder beschreven.
    1. Dompel 5 minuten onder in 70% ethanol. Dompel 2x 5 minuten onder in 100% ethanol.
    2. Dompel 2x 5 minuten onder in 100% xyleen. Monteer met behulp van een inbeddingsmedium (Materiaaltabel). Breng de 100 μL van een inbeddingsmedium aan op de objectglaasjes en dek af met een glazen dekglaasje.
  13. Verkrijg afbeeldingen met behulp van een alles-in-één microscoop met een vergroting van 20x en 40x (materiaaltabel).

Resultaten

Figuur 3 toont verschillende voorbeelden van α-Syn-aggregaten in de OB. In de huidige studie hebben we α-Syn-aggregaten toegediend in het unilaterale neusgat. De twee neusholten worden gescheiden door het neustussenschot en elke OB projecteert de olfactorische sensorische neuronen afzonderlijk op elke neusholte. Daarom kan de OB aan de contralaterale zijde als controle worden gebruikt.

P-α-Syn-pathologie werd na 1 en 3 maanden niet waargenomen bij de OB aan de behandelde zijde (Figuur 3A, B). Lewy neuriet-achtige p-α-Syn-aggregaten werden na 6 en 12 maanden waargenomen in de glomeruli aan de behandelde zijde. (Figuur 3C,D,F,G). Deze aggregaten werden niet waargenomen in de OB aan de controlezijde (Figuur 3E).

We kunnen de α-Syn-pathologie schatten door α-Syn-aggregaten te tellen of de grootte te onderzoeken, enz., met behulp van ImageJ (Table of Materials). We hebben bijvoorbeeld eerder het aantal α-Syn-aggregaten in dit model20 geteld en gerapporteerd. In de OB aan de behandelde zijde namen de Lewy neuriet-achtige aggregaten in de OB significant toe gedurende 12 maanden (eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de test van Dunnett, p < 0,01; Figuur 3H). In de OB aan de besturingszijde zijn er weinig α-Syn-aggregaten.

Een eerdere studie toonde aan dat geïnjecteerde PFF's in de hersenen van muizen binnen een week werden afgebroken en dat endogene α-Syn van muizen werd omgezet in α-Syn-aggregaten19. In de huidige studie geeft de toename van α-Syn-pathologie in de loop van de tijd aan dat endogene α-Syn bij muizen is omgezet in α-Syn-aggregaten door intranasale toediening van PFF's met een enkelvoudige dosis. Deze resultaten gaven aan dat α-Syn-pathologie zich kon verspreiden van het reukslijmvlies naar de OB.

figure-results-1
Figuur 1: Methode voor toediening van de neusholte van de muis. (A) De muis ligt in rugligging met het hoofd iets naar beneden gekanteld. (B) De neusgaten van de muis worden aangegeven door gele pijlpunten. (C, D) De α-Syn-fibriloplossing wordt in het neusgat van de muis gedruppeld (C, rode pijl) en snel ingeademd (D, rode pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Overzicht van de stappen om de intacte bulbus olfactorius te verkrijgen. (A) Snijd met een schaar sagitraal en lateraal in het schedelbot (gele stippellijn). (B) Verwijder het schedelbot van de bulbus olfactorius (OB's) volledig. (C) Draai het hoofd om en verwijder voorzichtig de hersenen. Snijd de hersenzenuwen door. (D) Snijd de reukzenuwen door die aan het schedelbot vastzitten. (E) Het hele brein met de intacte OB's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: P-α-Syn aggregeert in glomeruli van de bulbus olfactorius. (A-G) P-α-Syn (EP1536Y) immunohistochemie van de OB op (A-D) de behandelde zijde 1, 3, 6 en 12 maanden (respectievelijk 1 m, 3 m, 6 m en 12 m) na de intranasale toediening en (E) de controlezijde 12 maanden na de intranasale toediening. (C, D) Lewy neuriet-achtige draadachtige α-Syn-aggregaten verschijnen rond de glomeruli. (F, G) Vergrote beelden zijn sterk vergrote beelden van Lewy neuriet-achtige p-α-Syn 6 en 12 maanden na de intranasale toediening. (H) De hoeveelheid Lewy neuriet-achtige p-α-Syn-afzetting in de OB aan de behandelde en controlezijde (n = 4-5). Grafieken tonen het gemiddelde ± SEM. Eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door de test van Dunnett; **<0,01. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerder rapport20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In een eerdere studie induceerde de toediening van α-Syn-aggregaten in de neusholte van makaken de dood van dopaminerge cellen en ijzerafzetting in de substantia nigra, hoewel α-Syn-aggregaten niet werden waargenomen21. Dagelijkse toediening van A53T humaan α-Syn aggregeert in de neusholte van prionpromotor α-Syn transgene muizen (M83-muizen) gedurende 28 dagen bleek α-Syn-pathologie in de hersenen en motorische symptomen bij muizen te induceren19,22. In de huidige studie hebben we aangetoond dat een enkelvoudige dosis toediening van α-Syn samenklontert in de neusholte van wildtype muizen geïnduceerde α-Syn-pathologie in de OB. Deze eenvoudige methode kan als waardevol worden beschouwd voor het onderzoeken van α-Syn-voortplanting van het neusslijmvlies naar de OB.

Voldoende sonicatie van α-Syn-fibrillen in deze methode is cruciaal omdat eerdere rapporten aantoonden dat de kleine omvang van gefragmenteerde α-Syn-aggregaten het meest efficiënt is om α-Syn-pathologie op gang te brengen23,24. Onvoldoende sonicatie van α-Syn-fibrillen zal resulteren in weinig voortplanting naar de OB. Aangezien verschillende sonicators een verschillend sonicatievermogen hebben, is optimalisatie van dit proces noodzakelijk. De rugligging van de muis wanneer de α-Syn-oplossing in de neusgaten van de muis wordt toegediend, is ook cruciaal. Als het hoofd van de muis omhoog staat, stroomt de α-Syn-oplossing in de longen en de slokdarm. Een verkeerde houding kan leiden tot een onverwachte dood of onvoldoende α-Syn-voortplanting.

In de huidige studie gebruikte i.p. een MMB-combinatie-anestheticum voor anesthesie. Er werd gemeld dat MMB-combinatie-anesthesie goede sedatie en analgesie opleverde, en het effect ervan kon snel worden teruggedraaid door atipamezol23. Aangezien inhalatie-anesthesie vereist dat de neusgaten worden bedekt met een masker om de anesthesie te behouden, is het moeilijker om de α-Syn-oplossing intranasaal toe te dienen. Bovendien is het rotenonmodel uitgebreid bestudeerd en is het een zeer nuttig model25. Het is echter een door geneesmiddelen geïnduceerd model en kan andere pathomechanismen hebben dan de idiopathische ziekte van Parkinson (iPD)25. Aangezien dit model α-Syn-propagatie induceerde, denken we dat het dichter bij de iPD ligt.

Onze studie suggereerde ook dat exogene α-Syn-aggregaten via het neusslijmvlies kunnen worden overgedragen. Daarom moeten bij het uitvoeren van experimenten met α-Syn-aggregaten voorzorgsmaatregelen worden genomen om het inademen van α-Syn-aggregaten te voorkomen. Er kunnen bijvoorbeeld α-Syn-aerosolen worden gegenereerd tijdens de sonicatiestap. We raden het gebruik van een verzegelde sonicator of sonicatie in een veiligheidskast aan. Bovendien kunnen muizen niezen, waardoor mogelijk α-Syn-aerosolen ontstaan. Om dit risico te beperken, moeten alle handelingen binnen een veiligheidskast worden uitgevoerd. Onderzoekers moeten ook persoonlijke beschermingsmiddelen gebruiken, zoals wegwerphandschoenen, maskers en veiligheidsbrillen om blootstelling aan α-Syn te voorkomen. Na alle procedures moeten onderzoekers een bank afvegen met commerciële reinigingsmiddelen als het oppervlak vervuild is met α-Syn. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat zowel commerciële wasmiddelen als SDS aggregaten losmaakten van verontreinigde oppervlakken26,27.

In deze studie werden paraffinesecties gebruikt om α-Syn-pathologie in de OB te evalueren, aangezien de kleine structuur van de OB beter bewaard blijft in paraffinesecties in vergelijking met die in bevroren secties. Deze studie toonde aan dat α-Syn-pathologie werd geïnduceerd in de OB; de waargenomen α-Syn-pathologie was echter mild en beperkt en werd meestal vertegenwoordigd door draadachtige aggregaten die bekend staan als Lewy-neurieten in de glomeruli.

Opgemerkt moet worden dat schijnbare gedragsveranderingen bij experimentele muizen niet werden waargenomen in de huidige studie. De α-Syn-pathologie die door deze methode wordt geïnduceerd, kan onvoldoende zijn om veranderingen in het gedragsfenotype te induceren. Verder onderzoek is nodig om de specifieke aandoeningen die leiden tot ernstige pathologie en gedragsveranderingen op te helderen. Als we in de toekomst een efficiëntere manier zouden kunnen vinden voor voortplanting van het neusslijmvlies naar de verloskundige, biedt deze eenvoudige methode een alternatieve manier om α-Syn-voortplanting te evalueren zonder operatietechniek.

Daarnaast gebruikten we de OB aan de contralaterale zijde bij de behandelde muizen als controle. Retrograde voortplanting van de voorste olfactorische kern of piriforme cortex naar de contralaterale OB zou echter kunnen plaatsvinden in een follow-up op langere termijn. In dat geval werden niet-behandelde muizen als controle gebruikt.

Hoewel deze eenvoudige methode waardevolle inzichten biedt in de voortplanting van α-Syn van het neusslijmvlies naar de OB, zijn verdere studies nodig om de mechanismen die ten grondslag liggen aan PD volledig te begrijpen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Alle experimenten werden ondersteund door Rie Hikawa. We danken Yasuko Matsuzawa voor het papierwerk. Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 en JP20H00663).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710KEYENCEN/AAll-in-One microscoop
Ampicillin Sodium SaltNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006ASonicator voor waterbad.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
Cellulose tubeMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Competente cel
EntellanSigma-Aldrich107961Snel montagemedium voor microscopie
Graefe Extra Fine Forceps Curved SerratedFST11152-10 tang
Hardened Fine ScissorsFST14090-09schaar
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Universele Immuno-peroxidase Polymeer, anti-Konijn
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick scientific9105085Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB broth, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Modulair weefsel inbeddingscentrum
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Automatische weefsel processor 
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
New hematoxylin Type GMuto65-9197-38Hematoxyline oplossing
Normal winged needle for vein D type, 25GTERUMONN2332R25G naald
Optima TLX UltracentrifugeBeckman Couler8043-30-1197Ultracentrifuge
P10 pipetteGilsonFA10002P
ParaffinLeica39601095
paraformaldehydeNacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Assay KitsThermo Scientific23225BCA test
pRK172Addgene#134504Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow. cytiva17051001Ionenuitwisselingshars

Referenties

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21(2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24(2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738(2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440(2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81(2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189(2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961(2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788(2018).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Alfa synucle ne aggregatenbulbus olfactoriusziekte van Parkinsonprion achtige propagatiemuismodelneusslijmvliesvooraf gevormde fibrillenLewy lichaampjesneurodegeneratieve aandoening
Techniek voor intranasale toediening van α-synucleïne-aggregaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.