Methodenartikel

Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66948

⸱

29 november 2024

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een op maat gemaakt luchtdruksysteem dat is ontworpen om verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van een gesloten systeem bij muizen te induceren, inclusief oculaire, hersen- en ruggenmergtrauma's. Het doel van dit protocol is om een kader te bieden voor onderzoekers om het systeem gemakkelijk aan te passen en uit te breiden voor hun unieke CZS-traumastudies.

Samenvatting

De prevalentie van verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van het gesloten systeem onderstreept de noodzaak van een beter begrip van deze trauma's om beschermende en therapeutische interventies te verbeteren. Cruciaal voor dit onderzoek zijn diermodellen die CZS-letsels in een gesloten systeem nabootsen. In deze context werd een op maat gemaakt luchtdruksysteem ontworpen om een reeks CZS-letsels met een gesloten systeem in muizenmodellen te reproduceren, waaronder oculair-, hersen- en ruggenmergtrauma. Tot op heden is het systeem gebruikt om oog-, hoofd- of wervelkolomgerichte overdruklucht toe te dienen om anteroposterieure poolletsel in het oog, indirecte traumatische optische neuropathie (ITON), focaal traumatisch hersenletsel en ruggenmergletsel te modelleren. Dit document biedt een gedetailleerd protocol waarin het ontwerp en de werking van het systeem worden geschetst en deelt representatieve resultaten die de effectiviteit ervan aantonen. Het robuuste raamwerk dat hier wordt gepresenteerd, biedt een sterke basis voor lopend onderzoek naar CZS-trauma. Door gebruik te maken van de flexibele kenmerken van het systeem, kunnen onderzoekers de locatie, ernst en timing van verwondingen wijzigen en zorgvuldig controleren. Dit maakt uitgebreide vergelijkingen mogelijk van moleculaire mechanismen en therapeutische werkzaamheid bij meerdere CZS-letsels in het gesloten systeem.

Inleiding

Verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van het gesloten systeem zijn verwondingen die worden veroorzaakt door schade aan de hersenen of het ruggenmerg zonder een breuk in de schedel of wervelkolom te veroorzaken. Deze verwondingen omvatten traumatisch hersenletsel (TBI) en ruggenmergletsel (SCI) en kunnen het gevolg zijn van verschillende incidenten, waaronder verwondingen door stomp geweld (bijv. vallen, sportblessures, auto-ongelukken) en explosieve ontploffingen. CZS-letsels met een gesloten systeem worden over het algemeen als minder ernstig beschouwd in vergelijking met penetrerende CZS-letsels, maar ze komen vaker voor. Echter, net als bij penetrerende verwondingen, kunnen CZS-letsels in een gesloten systeem leiden tot langdurige en progressieve gezondheidsproblemen, vooral na herhaalde voorvallen 1,2,3,4,5,6. Zorgwekkend is dat opkomend bewijs suggereert dat zelfs subklinische CZS-letsels in een gesloten systeem, die onder de diagnostische criteria voor een TBI of SCI vallen na een enkele gebeurtenis 7,8,9,10,11,12,13, kunnen evolueren naar chronische neurodegeneratieve ziekten na herhaald letsel 6,14,15,16. Dit onderstreept de dringende behoefte aan een beter begrip van de mechanismen en gevolgen van enkelvoudige en herhaalde CZS-letsels in een gesloten systeem.  Dergelijke kennis is noodzakelijk voor verbeterde beschermende en therapeutische benaderingen. Cruciaal voor dit streven zijn diermodellen die CZS-verwondingen in een gesloten systeem nabootsen.

De huidige diermodellen van CZS-letsels in een gesloten systeem hebben een belangrijke rol gespeeld bij het vergroten van ons begrip van de pathofysiologie en mogelijke beschermende en therapeutische interventies voor deze trauma's. Knaagdieren zijn vooral populair vanwege hun lage kosten, beschikbaarheid, genetische manipuleerbaarheid, gebruiksgemak, gevestigde gedrags- en fysiologische tests en gunstigere ethische overwegingen17. Veelgebruikte methoden voor het induceren van TBI in een gesloten systeem bij knaagdieren zijn onder meer apparaten voor gewichtsval18,19, apparaten voor gecontroleerde corticale impact (CCI)20 en door compressielucht aangedreven schokbuizen21. Voor dwarslaesie vereisen modellen met stomp trauma doorgaans laminectomie22,23 of andere chirurgische technieken24 om rechtstreeks toegang te krijgen tot het ruggenmerg of de epidurale ruimte. Er zijn echter modellen voor SCI door ontploffing in een gesloten lichaam ontwikkeld met behulp van door compressielucht aangedreven schokbuizen 25. Ondanks dat ze waardevolle inzichten bieden, heeft elk van deze modellen unieke beperkingen. Modellen met gewichtsval kunnen een hoge variabiliteit en beperkte controle hebben over de locatie en ernst van het letsel, wat experimentele en ethische zorgen oplevert voor het veroorzaken van ernstig, ongecontroleerd letsel26. CCI-apparaten bieden precisie, maar vereisen training om te werken, kunnen een craniotomie omvatten en kunnen last hebben van mechanische variabiliteit die van invloed is op de reproduceerbaarheid27. Schokbuizen zijn over het algemeen minder invasief, maar kunnen moeilijk te verkrijgen zijn, complex om in te stellen en te bedienen, en kunnen onrealistische en zeer variabele letselomstandigheden veroorzaken als gevolg van omgevingsfactoren, golfreflecties en complexe drukinteracties28.

Om de mechanismen en effecten van enkelvoudige en herhaalde CZS-letsels in het gesloten systeem en hun behandelingen beter te bestuderen, presenteert dit artikel een modulaire, gebruiksvriendelijke, kosteneffectieve en niet-invasieve methode. Het primaire doel van deze aanpak is om nauwkeurige controle en flexibele wijziging van letselparameters mogelijk te maken, waaronder locatie, ernst en timing. Om dit doel te ondersteunen, biedt dit manuscript een gedetailleerd protocol voor het bouwen, kalibreren en oplossen van problemen met een overdrukluchtsysteem, dat enkele van de beperkingen van bestaande CNS-letselapparaten met gesloten systeem aanpakt. Dit systeem biedt niet alleen kosteneffectiviteit en minimale insteltijd, maar is ook zeer veelzijdig, biedt consistente en reproduceerbare resultaten, terwijl ethische zorgen worden geminimaliseerd en de klinische relevantie wordt gemaximaliseerd. Bovendien wordt het vermogen van het systeem om een reeks CZS-letsels in het gesloten systeem in muizenmodellen te produceren, beschreven, samen met de mogelijke toepassingen ervan in toekomstige studies. Het doel van dit manuscript is met name om een kader te bieden dat onderzoekers in staat stelt dit systeem gemakkelijk te verwerven, aan te passen en uit te breiden voor hun specifieke behoeften, waardoor lopend onderzoek naar CZS-trauma wordt bevorderd. Representatieve resultaten die de werkzaamheid van het systeem bij het induceren van axonaal trauma aantonen, worden ook gepresenteerd.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd volgens protocollen die waren goedgekeurd door het 29,30,31,32 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Vanderbilt University en volgens de richtlijnen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) en de Association for Research in Vision and Ophthalmology's (ARVO). Alle muizen werden in groepen gehuisvest en onderhouden op een licht/donker-cyclus van 12 uur en kregen ad libitum voedsel en water. Drie maanden oude 30,31,33 C57 Bl/6 muizen werden in dit protocol gebruikt.

1. Systeembouw

  1. Koop een in de handel verkrijgbaar paintballgeweer (zie Materiaaltabel) met een geïntegreerde luchtdrukregelaar.
  2. Wijzig de cilinder (Figuur 1A) indien nodig.
    1. Als de originele cilinder over de hele lengte is voorzien van openingen of perforaties, kan de perslucht lekken en in de lucht verdwijnen, waardoor het maximale uitgangsdrukniveau wordt verlaagd. Vervang deze door een stevige, niet-geraamde cilinder aan te schaffen om het uitgangsdrukbereik te vergroten (Figuur 1, I).
    2. Als de originele loop lang en omslachtig is, verkort deze dan door een kortere loop met een aangepaste lengte aan te schaffen of een pijpsnijder of zaag te gebruiken.
    3. Als de originele cilinder niet het gewenste uitgangsdrukniveau produceert, wijzig dan de binnendiameter (boringgrootte) van de loop door een vat aan te schaffen met een aangepaste boringdiameter. Door de diameter van de oorspronkelijke boring te verkleinen, wordt het bereik van de uitgangsdruk vergroot en vice versa.
  3. Wijzig indien nodig de regelaar (Figuur 1B).
    1. Verwijder de geleidingsdop om directe toegang tot de stelschroef te bieden (Figuur 1, II) als de originele regelaar wordt geleverd met een geleidingsdop.
    2. Vervang de inbusschroef door een inbusschroef met platte kop als de originele stelschroef wordt geleverd met een inbusbus.
  4. Verwijder de standaard zwaartekrachttoevoerlader (d.w.z. het reservoir voor het vasthouden en invoeren van paintballs in het pistool) en dicht de verticale toevoerbuis af (Figuur 1, III) om druklekkage te voorkomen.
    1. Zorg ervoor dat het paintballgeweer ongeladen is en dat de luchtbron (CO2 of persluchttank) is losgekoppeld voordat u de zwaartekrachttoevoerlader verwijdert.
    2. Zoek de invoerhals (Figuur 1C) waar de zwaartekrachttoevoerlader is bevestigd. Draai de invoerhalsklem los met het juiste gereedschap.
    3. Verwijder de standaard zwaartekrachtlader door deze omhoog te trekken.
    4. Plaats een afdekking of plug van de invoerhals om de opening af te dichten. Deze zijn meestal verkrijgbaar bij paintballwinkels of online en zijn ontworpen om goed in de invoerhals te passen en deze af te sluiten.
  5. Zet een platform (Figuur 1D) in elkaar voor het paintballgeweer en een x-y tafel voor het positioneren van dieren.
    1. Bouw de platformbasis door twee stukken vezelplaat met gemiddelde dichtheid te snijden.
      OPMERKING: Afhankelijk van de beschikbaarheid en voorkeur van het materiaal kunnen ook alternatieve materialen (bijv. multiplex) worden gebruikt.
    2. Snijd een kleiner, vierkant stuk om 1.5 x 1.5 ft te meten.
    3. Snijd een groter rechthoekig stuk om 2.5 x 1.5 ft te meten.
    4. Verhoog en beveilig het kleinere platform 3.5 inch boven het grotere platform met behulp van twee parallelle 2 x 4 s.
  6. Bevestig het aangepaste paintballgeweer aan het platform.
    1. Leg het paintballgeweer op zijn kant op het kleinere platform zodat het uiteinde van de loop een halve centimeter over de rand uitsteekt.
    2. Zet het paintballgeweer vast met behulp van montagebeugels of klemmen die passen op de loop en kolf van het paintballgeweer.
    3. Bevestig een luchtdruktank (Figuur 1E; zie Materiaaltabel) aan de regelaar van het paintballgeweer. U kunt ook een directe drukleiding aansluiten op een tank met gecomprimeerde stikstof om het bereik van betrouwbare uitgangsdrukniveaus te vergroten.
    4. Als u een luchtdruktank gebruikt, bevestig deze dan aan de vezelplaat met een duurzame stoffen band. Bevestig de riem met schroeven of bouten en voeg een verstelmechanisme toe voor eenvoudig aan- en losdraaien.
  7. Bevestig een x-y positioneringstafel aan het grotere stuk rechthoekige vezelplaat tegenover de loop van het paintballgeweer met behulp van schroeven of bouten (Figuur 1F).
    OPMERKING: Een x-y-positioneringstabel (zie Materiaaltabel), ook wel een x-y-fase genoemd, kan worden gekocht bij verschillende leveranciers, waaronder online retailers, industriële leveranciers en leveranciers van wetenschappelijke apparatuur. Houd bij de aanschaf van een x-y positioneringstafel rekening met het reisbereik, het laadvermogen, de precisie en de keuze tussen handmatige aanpassing of gemotoriseerde bediening. Deze x-y positioneringstafel maakt een nauwkeurige beweging en positionering van het dier langs twee assen mogelijk: de x-as (horizontaal naar of weg van de loop) en de y-as (verticaal omhoog of omlaag vanaf de loop).
  8. Pas de x-y positioneringstafel aan door drie PVC-klemmen te installeren.
    1. Bevestig twee 1 cm dikke PVC-klemmen aan weerszijden van de voorkant van de loop met schroeven of bouten. Zorg ervoor dat de klemmen breed genoeg zijn voor de dierhouder uit stap 1.9 en 1.10 (bijv. 1.5 inch).
    2. Zet een dikkere (4 cm) PVC-klem loodrecht en tegengesteld aan de twee 1 cm dikke klemmen vast met schroeven of bouten. Zorg ervoor dat de clamp breed genoeg voor de drukopnemer uit stap 2.4 (bijv. 1.5 inch).
    3. Boor twee gaten aan de bovenkant van de derde klem en plaats twee plastic schroeven voor extra stabilisatie van de drukopnemer tijdens de systeemkalibratie in stap 2.
  9. Pas de binnenkant van de dierenhouder aan (Figuur 2A).
    1. Koop en snijd een stuk PVC-buis (35 mm buitendiameter, 26 mm binnendiameter, 6.75 inch lang) voor de binnenkamer voor de muis.
    2. Maak een rechthoekig gat (3 x 5 cm) op 1 inch van het uiteinde van de buis om het hoofd en de bovenste schouders van de muis bloot te leggen terwijl de rest van het lichaam afgeschermd blijft.
      OPMERKING: Als de plaats van de CZS-verwonding zich lager op de rug van de muis bevindt (bijv. de thoracale of lumbale wervelkolom), maak dan het rechthoekige gat groter.
  10. Pas de buitenkant van de dierhouder aan (Figuur 2B).
    1. Koop en snijd een stuk PVC-buis (44 mm buitendiameter, 35 mm binnendiameter, 6 inch lang) voor de buitenste insluitingskamer voor de muis.
    2. Construeer een belichtingsopening (Figuur 2C) in de buitenste insluitingskamer voor nauwkeurige controle van de plaats van de verwonding door het CZS.
    3. Maak een wederzijdse opening aan de andere kant om de cilinder van de drukopnemer in te brengen tijdens de systeemkalibratie in stap 2 (bijv. een gat van 9 mm).
  11. Pas de buitenkant van de dierhouder aan om toediening van gasanesthesie mogelijk te maken. Als in plaats daarvan een injecteerbaar verdovingsmiddel wordt gebruikt, sla deze stap dan over.
    1. Sluit het ene uiteinde van de buitenkant van de dierenhouder af met tape. Zorg voor een strakke pasvorm om gaslekkage te voorkomen.
    2. Maak een klein gaatje in de afdichting om de anesthesielijn in te brengen.
    3. Plaats de anesthesielijn om isofluraan in de omgeving van de buis te brengen zonder direct contact met het dier.

2. Kalibratie van het systeem

  1. Sluit een druktransducer (Figuur 2D; zie Materiaaltabel voor opties) aan op een data-acquisitiesysteem (DAQ) en computer om fysieke drukmetingen te vertalen in digitale gegevens.
    1. Sluit de drukopnemer aan op de DAQ-module (zie Materiaaltabel) en zorg voor de juiste polariteit en veilige verbindingen.
    2. Plaats de DAQ-module in een DAQ-chassis (zie Materiaaltabel) zodat deze stroom kan ontvangen en met de computer kan communiceren.
    3. Gebruik een USB-kabel om het DAQ-chassis op de computer aan te sluiten.
    4. Zorg ervoor dat de benodigde software en stuurprogramma's op de computer zijn geïnstalleerd voor de interface met de DAQ-hardware en het verkrijgen van gegevens (zie Materiaaltabel voor opties).
  2. Configureer de DAQ-systeeminstellingen.
    1. Open de geïnstalleerde DAQ-software.
    2. Zorg ervoor dat het DAQ-systeem wordt herkend door de computer.
    3. Raadpleeg de specificatie en kalibratiegegevensbladen voor uw specifieke DAQ-module/chassis en druktransducer en configureer de DAQ-systeeminstellingen:
      OPMERKING: De DAQ-instellingen voor de DAQ-hardware die in dit manuscript wordt gebruikt, zijn openbaar beschikbaar op GitHub. Geïnteresseerde lezers hebben toegang tot de repository op https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Analoge ingang: Selecteer het fysieke ingangskanaal op de DAQ-module waarop de druktransducer is aangesloten.
      2. Excitatiebron (Vex-bron): Specificeer de excitatiebron van de DAQ-module (bijv. intern of extern).
      3. Excitatiespanning (Vex-waarde): Stel de vex-waarde in op de waarde die is opgegeven door de fabrikant van de druktransducer (bijv. 5 of 10 V).
      4. Brugtype: Kies het juiste brugtype van uw DAQ-module (bijv. volledige brug, halve brug of kwartbrug).
      5. Brugweerstand: Stel de brugweerstand in op de waarde die is opgegeven door de fabrikant van de drukopnemer (bijv. 350 ).
      6. Kalibratiefactor/aangepaste schaling: Configureer de schaling op basis van het kalibratiegegevensblad dat door de fabrikant van de drukopnemer is verstrekt. De fabrikant kalibreert de drukopnemer door een bekende fysische eenheid (psi) toe te passen en de resulterende elektrische eenheden (mV/V) te meten. Maak een kalibratiecurve door de bekende fysische eenheden uit te zetten tegen de verkregen elektrische eenheden.
      7. Bemonsteringsfrequentie (Hz): Stel de bemonsteringsfrequentie hoog genoeg in om de dynamiek van de drukveranderingen vast te leggen zonder aliasing (bijv. 1 of 10 kHz, afhankelijk van de snelheid van drukveranderingen in uw experiment).
        OPMERKING: Hoe smaller uw overdrukluchtgolfvorm (d.w.z. hoe sneller de druk verandert), hoe breder het frequentiebereik dat het opwekt en dus hoe hoger de bemonsteringsfrequentie moet zijn. Dit is vooral belangrijk bij experimenten met CZS-letselmodellen waarbij drukveranderingen snel kunnen optreden.
  3. Creëer een digitale tool in de DAQ-software voor data-acquisitie.
    NOTITIE: Deze digitale tool zal worden gebruikt om de uitgangsdrukken van het systeem nauwkeurig te meten, vast te leggen, weer te geven en te analyseren. De digitale tool die in dit manuscript wordt gebruikt, is openbaar beschikbaar op GitHub. Geïnteresseerde lezers hebben toegang tot de repository op https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. Implementeer signaalverwerkingsalgoritmen om de onbewerkte gegevens van de transducer te filteren, te versterken of anderszins te verwerken.
    2. Voeg analysetools toe om metrische gegevens te berekenen, zoals piekdruk, gemiddelde druk en duur van drukgebeurtenissen.
    3. Integreer visuele elementen (bijv. grafieken) om real-time drukgegevens en besturingselementen weer te geven om gegevensverzameling te starten, te stoppen en te resetten.
    4. Sla de digitale tool op.
  4. Meet de uitgangsdruk van het systeem
    1. Steek de drukopnemer in de dikke klem op de x-y-tafel en de cilinder door het gat van de dierhouder (gemaakt in stap 1.10.3).
    2. Stel de cilinder van de drukopnemer af totdat de punt precies op de plaats van de CNS-verwonding is.
    3. Zet de drukopnemer vast met twee plastic schroeven (geïnstalleerd in stap 1.8.3).
  5. Voer de digitale tool uit in de data-acquisitiesoftware terwijl u de trekker van het paintballgeweer loslaat om de uitgangsdruk van het systeem vast te leggen, te analyseren en te visualiseren.
  6. Stel de stelschroef af totdat de uitgangsdruk van het systeem het gewenste niveau bereikt.
    NOTITIE: Na het aanpassen van de loop van het paintballgeweer om niet-gefenestrateerd te zijn, 1.5 inch lang en 6.5 mm in diameter, is het systeem in staat om op betrouwbare wijze overdrukluchtniveaus te leveren in het bereik van 15-50 psi op 5 mm vanaf de voorkant van de loop34. Luchtniveaus onder overdruk onder 15 psi en boven 50 psi vertonen grote variabiliteit in intensiteit. Voor een uitgebreide weergave van de uitgangsdruk (psi) van het systeem als functie van de ingangsdruk (psi), de afstand tot de loop (cm) en de tijd (ms), zie figuur 2 van Hines-Beard et al.34. Gebruik gecomprimeerde stikstof in plaats van perslucht om met dit systeem op betrouwbare wijze overdrukluchtniveaus van meer dan 50 psi te verkrijgen.

3. Voorbereiding van dieren en blootstelling aan overdruk

  1. Verdoof de muis met isofluraan in een inductiekamer met 1,5-3%30,31,32,33 isofluraan in zuurstof tot het volledig verdoofd is.
    1. Bevestig de verdoving door te beoordelen of er geen reactie is op een teenknijp.
    2. Zet de muis vast in de binnenste dierenhouder met zijn kop en bovenste achterschouders bloot door de rechthoekige opening, terwijl de rug en de onderste achterpoten afgeschermd blijven.
    3. Ondersteun de kop van de muis met een kussen dat is bevestigd aan het intacte onderste segment van de binnenste dierenhouder.
    4. Zet de muis vast door chirurgische tape over de bovenste achterschouders aan te brengen.
    5. Plaats de binnenste dierenhouder in de buitenste dierenhouder.
    6. Open de secundaire anesthesielijn voor de toediening van isofluraan in de dierhouder.
    7. Plaats een extra kussen aan het uiteinde van de dierhouder om te voorkomen dat er verdovingsmiddel uit de buis lekt en om te voorkomen dat de muis beweegt tijdens blootstelling aan lucht onder overdruk.
  2. Luchttoevoer onder overdruk
    1. Lijn de cirkelvormige opening van 4 mm van de buitenste dierenhouder recht uit over het linkeroog van de muis.
    2. Plaats de dierenhouder met behulp van de bedieningsknoppen op de x-y-tafel zo dat de opening is uitgelijnd met de loop van het paintballgeweer en het buitenoppervlak zich op 5 mm van het uiteinde van de loop bevindt.
      NOTITIE: Pas de afstand van het dier tot het uiteinde van de loop aan om het overdrukluchtniveau (psi) en de vorm te wijzigen. Verplaats het dier verder van de loop om het luchtniveau van de overdruk te verlagen en een meer diffuse overdrukgolf te creëren.
    3. Start de overdrukluchtsequentie om ITON te induceren:
      1. Lever twee uitbarstingen van 15 psi overdruklucht af met een interval van 0.5 s, dagelijks herhaald gedurende 3 dagen 29,30,31,32.
        OPMERKING: Vergelijkbare ITON kan worden geïnduceerd door de afgifte van drie opeenvolgende uitbarstingen van 15 psi overdruklucht, gescheiden door intervallen van 0.5 s23. De mate van ITON die ontstaat na toediening van zes opeenvolgende uitbarstingen van 15 psi overdruklucht, gescheiden door intervallen van 0,5 s, wordt hier weergegeven in Representatieve resultaten.
      2. Stel schijnmuizen bloot aan het geluid van de overdruklucht, maar niet aan de overdruklucht zelf door de dierhouder zo te draaien dat de opening niet meer naar de loop is gericht en de lucht te blokkeren met een kartonnen schild.
  3. Herstel van de muis
    1. Laat de muizen herstellen van de narcose.
      1. Dien oogdruppels met glijmiddel toe (zie Materiaaltabel) om te voorkomen dat de ogen uitdrogen door anesthesie.
      2. Zorg voor warmte met behulp van een gecontroleerde verwarmingsondersteuning (zie Materiaaltabel).
    2. Houd de muizen visueel in de gaten totdat ze een rechtopstaande houding behouden en normaal lopen. Laat ze in het gezelschap zijn van hun kooigenoten.
    3. Geef alle muizen die worden blootgesteld aan lucht onder overdruk de eerste 3 dagen na het letsel met gelherstelvoedsel (zie Materiaaltabel) om gewichtsverlies te voorkomen.

4. Weefselverzameling en -verwerking

  1. Euthanaseer de muizen via intraperitoneale injectie van Avertin Working Solution.
    1. Maak Avertin Stock door 10 g 2,2,2,-tribroomethanol (zie Materiaaltabel) te mengen met 10 ml 1-Pentanol (zie Materiaaltabel). Bewaren in het donker bij 4 °C.
    2. Maak Avertin Working Solution door 1,25 ml Avertin Stock, 45 ml dubbel gedestilleerd water en 5 ml 10x PBS (zie Materiaaltabel) te combineren in een tube van 50 ml. Filter, steriliseer het mengsel en bewaar in het donker bij 4 °C.
  2. Transcardiaal doordrenken van de muizen met 4% paraformaldehyde (zie Tabel met materialen) in 1x PBS (zie Tabel met materialen).
  3. Ontnucleer het oog dat is blootgesteld aan lucht onder overdruk met behulp van een fijne pincet (zie Tabel met materialen) en een schaar (zie Tabel met materialen), zorg ervoor dat de oogzenuw (AAN) behouden blijft.
  4. Verzamel de AAN samen met het ontkernde oogweefsel voor verdere analyse.
  5. Osmicaat OP weefsel.
    1. Postfix ON tissue 's nachts in 4% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde (zie Materiaaltabel) in 1x PBS. Als u werkt met weefsel dat niet geperfundeerd is (zoals in stap 4.2), stel dan 5 dagen uit in plaats van 's nachts.
    2. Breng ON tissue over naar een plaat met 12 of 24 putjes (zie Tabel met materialen) met 1x PBS met behulp van een penseel (zie Tabel met materialen) of een scherpe houten stok.
    3. Vervang in een zuurkast 1xPBS door 2% osmiumtetroxide (zie Materiaaltabel) in een cacodylaatbuffer van 0,2 M (recept is openbaar beschikbaar op GitHub. Geïnteresseerde lezers kunnen de repository op https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) openen met behulp van een transferpipet. Incubeer 2 uur op ijs.
    4. Voer drie wasbeurten uit met 1x PBS
      1. Gooi osmiumafval op de juiste manier weg.
      2. Laat de plaat na de derde PBS-wasbeurt twee nachten in de zuurkast staan.
  6. Dehydrateer OP weefsel in een gesorteerde ethanolreeks.
    1. Breng de zenuwen over op een nieuwe plaat met 50% ethanol en incubeer gedurende 30 minuten.
    2. Vervang door 70% ethanol gedurende 30 min.
    3. Vervang door 95% ethanol gedurende 30 min.
    4. Vervang door 100% ethanol gedurende 30 min.
  7. Insluiten OP weefsel in epon.
    OPMERKING: Het Epon-recept is openbaar beschikbaar op GitHub. Geïnteresseerde lezers hebben toegang tot de repository op https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; zie Tabel met materialen voor materialen die in het recept worden vermeld.
    1. Dag 1: Breng het weefsel over in een injectieflacon van 2 ml met propyleenoxide (zie materiaaltabel)/100% ethanol (1:1) en schud gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervang door puur propyleenoxide en schud gedurende 15 minuten, herhaal dit eens. Vervang door propyleenoxide/epon (1:1) en schud een nacht in de koelcel.
    2. Dag 2: Breng het weefsel over naar een plaat met 12 of 24 putjes met 100% epon en schud gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Vervang door verse 100% epon en incubeer een nacht bij kamertemperatuur in een vacuüm.
    3. Dag 3: Herhaal de epon incubatie zoals op dag 2.
    4. Dag 4: Breng het weefsel over in een platte vorm met 100% epon, heroriënteer het weefsel en plaats het 48 uur in een oven van 60 °C.
  8. Sectie OP weefsel.
    1. Snijd mallen onder een ontleedscoop tot een dubbele piramide met de zenuw in het midden.
    2. Verzamel doorsneden van 700 nm dik met behulp van een ultramicrotoom en een diamantmes (zie Materiaaltabel).
    3. Verzamel secties op geladen witglazen microscoopglaasjes met behulp van gedestilleerd water.
    4. Droog de glaasjes in een oven van 60 °C tot het water is verdampt. Koel af op kamertemperatuur.
  9. Vlek op weefsel.
    1. Dompel de objectglaasjes onder in 1% parafenyleendiamine (PPD) (zie Materiaaltabel) in een 1:1 mengsel van methanol en 2-propanol gedurende 28 minuten.
    2. Spoel de objectglaasjes af in twee opeenvolgende mengsels van 1:1 methanol (zie Materiaaltabel) en 2-propanol (zie Materiaaltabel) gedurende elk 1 minuut.
    3. Spoel de glaasjes 1 minuut af met 100% ethanol en laat ze aan de lucht drogen.
    4. Plaats de objectglaasjes in een vochtige doos en bedek de secties met 1% toluïdineblauw (zie Materiaaltabel) met behulp van een transferpipet.
    5. Incubeer in een oven van 60 °C gedurende 20 min.
    6. Spoel de glaasjes af met dubbel gedestilleerd water en laat ze aan de lucht drogen.
  10. Monteer en beeld OP weefsel.
    1. Dekglaasjes met behulp van bevestigingsmedia (zie Tabel met methoden), overtollige media verwijderen.
    2. Laat de glaasjes een nacht drogen.
    3. Beelddoorsneden met behulp van helderveldmicroscopie met een 100x olie-onderdompelingsobjectief.
  11. Inbedding, doorsnede en immunohistochemische kleuring van netvliesweefsel.
    1. Postfixeer het hele oogweefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 2-4 uur.
    2. Cryoprotecteer het hele oogweefsel in 30% sucrose (zie Materiaaltabel in 1x PBS 's nachts bij 4 °C.
    3. Veranker het oogweefsel in een vriesmedium (zie Tabel met materialen).
    4. Verzamel 10 μm dikke netvliesdoorsneden op een cryostaat en monteer de secties op geladen witglazen microscoopglaasjes (zie Materiaaltabel).
    5. Was de objectglaasjes in 1x PBS en incubeer in een blokkeerbuffer (5% Triton X-100 en 2% runderserumalbumine (BSA) (zie Materiaaltabel) in 1x PBS) met 5% normaal ezelserum (NDS) (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    6. Incubeer objectglaasjes 's nachts bij 4 °C (of bij kamertemperatuur gedurende 4 uur) in primair antilichaam (zie materiaaltabel) in 0,5% Triton X-100 (zie materiaaltabel) in 1xPBS (PBT).
    7. Was objectglaasjes in PBT en incubeer in secundair antilichaam (zie materiaaltabel) in blokkeerbuffer met 5% NDS.
    8. Was de glaasjes in PBT, breng het montagemedium aan met DAPI (zie Materiaaltabel), het dekglaasje en sluit af met nagellak.
    9. Beelddia's op een epifluorescentiemicroscoop.
    10. Als u de fluorescentie-intensiteit kwantificeert, zorg er dan voor dat de beelden worden gemaakt van hetzelfde netvliesgebied met identieke instellingen voor vergroting, versterking en belichting.
  12. Reken OP axonen.
    1. Tel handmatig het aantal axonen met behulp van beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen) door 20% van de totale dwarsdoorsnede van de zenuw te bemonsteren met behulp van een vaste rasteroverlay om de axondichtheid te schatten (axonen/mm2).
    2. Meet de oppervlakte van de AAN-doorsnede.
      1. Gebruik de functie Schaal instellen om pixels/microns in te stellen voor het objectief dat wordt gebruikt om de afbeelding te maken.
      2. Gebruik het selectiegereedschap Polygoon om langs de myelineschede van de oogzenuw te traceren, met uitzondering van het vaatstelsel.
      3. Meet de oppervlakte van de AAN met behulp van de functie Meten .
      4. Bepaal 20% van de totale oppervlakte door de gemeten oppervlakte te vermenigvuldigen met 0,2.
    3. Leg het vaste raster over de AAN-doorsnede.
      1. Download de Counting Array-plug-in.
        OPMERKING: Deze plug-in is openbaar beschikbaar op GitHub. Geïnteresseerde lezers hebben toegang tot de repository op https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. Open de Counting Array-plug-in om een vast raster bovenop de doorsnede te leggen, bestaande uit 9 gelijkmatig verdeelde vierkanten in de vorm van een plusteken.
      3. Bewerk de oppervlakte per elk van de 9 regio's door 20% van de totale oppervlakte van de AAN-doorsnede (berekend in stap 4.6.2.4) te delen door 9.
      4. Centreer het vaste raster zo dat het midden van het plusteken in het midden van de AAN-doorsnede ligt.
    4. Tel levende en degenererende axonen afzonderlijk.
      1. Download en open de Cell Counter-plug-in.
        OPMERKING: Deze plug-in is openbaar beschikbaar op GitHub. Geïnteresseerde lezers hebben toegang tot de repository op https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. Tel voor elk van de 9 regio's het aantal levende en degenererende axonprofielen afzonderlijk door de toestand van de myelineschede te visualiseren. Zorg ervoor dat axonkwantificering wordt uitgevoerd terwijl u blind bent voor de experimentele groep van het dier om vertekening te voorkomen.
      3. Zoek voor levende axonen naar die waarin de myelineschede intact lijkt, gelijkmatig gekleurd is en soepel en gelijkmatig rond het axon is omcirkeld.
      4. Zoek voor degenererende axonen naar axonen met een verdikking, uivorming of instorting van de myelineschede.
      5. Als het axon gedeeltelijk wordt afgesneden door het overlappende raster, neem het dan alleen op in het aantal axonen als het lumen wordt gezien.
      6. Zorg ervoor dat langwerpige axonen niet per ongeluk meer dan één keer worden geteld en verwar vuil of stof niet met een degenererend axonprofiel.
    5. Voer statistische analyses uit om te testen op significante verschillen in het gemiddelde aantal axonen tussen groepen. Zorg ervoor dat er minimaal vier ON's in elke groep worden opgenomen om rekening te houden met de normale variabiliteit die in eerdere analyses is waargenomen.
      1. Voer een Independent Samples t-test uit (ook bekend als de Student's t-test voor onafhankelijke steekproeven) om te beoordelen op significante verschillen tussen de gemiddelden van twee onafhankelijke groepen.
      2. Voer het niet-parametrische alternatief uit, de Mann-Whitney U-test, als niet aan de voorwaarden voor een onafhankelijke steekproef t-test kan worden voldaan (d.w.z. als de gegevens niet normaal worden verdeeld of de steekproefomvang te klein is).

Resultaten

Met behulp van het hier beschreven luchtproducerende overdruksysteem werd indirecte traumatische optische neuropathie (ITON) opgewekt door het linkeroog van volwassen (3 maanden oude) mannelijke C57Bl/6-muizen (n = 4) bloot te stellen aan zes opeenvolgende uitbarstingen van 15 psi overdruklucht, gescheiden door intervallen van 0,5 s. Schijndieren (n = 8; gegevens ontleend aan Vest et al.33) werden verdoofd, in de dierhouder geplaatst en blootgesteld aan het geluid, maar niet aan de overdruklucht.

De proximale oogzenuwen van schijndieren (figuur 3A) leken gezond met dicht opeengepakte axonen van uniforme grootte omgeven door gliacellen met een normale morfologie en distributie. Ter vergelijking: de proximale oogzenuwen van muizen die waren blootgesteld aan ITON (d.w.z. 6 opeenvolgende uitbarstingen van 15 psi overdruklucht gescheiden door intervallen van 0,5 s) (Figuur 3B) leken te degenereren met tekenen van axonverlies, zoals een grotere afstand tussen de resterende axonen, tekenen van axondegeneratie, waaronder zwelling, onregelmatigheden in de axonvorm en afbraak van de myelineschede van de axonen, en tekenen van gliose, waaronder de hypertrofie en hyperplasie van gliacellen. Mann-Whitney U-tests bevestigden een significant verschil in totale axonen (p = 0,0040) (Figuur 3C) en degeneratieve profielen (p = 0,0028) (Figuur 3D) tussen ITON en nepmuizen. Deze resultaten suggereren dat ITON het totale aantal axonen aanzienlijk vermindert en degeneratieve profielen aanzienlijk verhoogt. Mann-Whitney U-tests werden uitgevoerd omdat de gegevens voor de ITON-groep geen steekproefomvang hadden die groot genoeg was voor een Independent Samples-t-test.

Immunohistochemische kleuring van netvliesdoorsneden met anti-Iba1 (zie Materiaaltabel), een marker voor microglia (de primaire immuuncellen van het centrale zenuwstelsel), werd uitgevoerd op zowel schijnmuizen (Figuur 4A) als ITON (Figuur 4B) muizen. De kleuring onthulde dat microglia zich in hun rusttoestand bevonden voor alle muizen, gekenmerkt door kleine cellichamen met lange, dunne en sterk vertakte processen. Met name werd een verhoogd aantal microglia opgemerkt bij ITON-muizen (Figuur 4B), wat wijst op microgliale proliferatie als reactie op letsel. Bovendien werd bij ITON-muizen waargenomen dat microglia zich abnormaal uitstrekken tot in de buitenste nucleaire laag (ONL), waar fotoreceptorcellichamen zich bevinden (Figuur 4B). Dit in tegenstelling tot de schijndieren (Figuur 4A), waar microglia waren gelokaliseerd in de ganglioncellaag (GCL), de binnenste plexiforme laag (IPL), de binnenste nucleaire laag (INL) en de buitenste plexiforme laag (OPL) - de lagen waar microglia zich doorgaans bevinden in een gezond, onbeschadigd netvlies.

Daaropvolgende immunohistochemische kleuring met anti-PKC-α (zie Materiaaltabel) en antisynaptofysine (zie Materiaaltabel), markers voor respectievelijk staafbipolaire cellen en fotoreceptorlintsynapsen, onthulden intacte synaptische verbindingen in zowel schijnmuizen (Figuur 5A) als ITON-muizen (Figuur 5B). In het bijzonder werden de dendrieten van staafbipolaire cellen waargenomen die zich uitstrekten en overlapten met de synaptische uiteinden van staaffotoreceptoren. Deze bevinding staat in contrast met een vroege studie35, die een terugtrekking van staafbipolaire celdendrieten naar hun cellichamen aantoonde vier weken na ITON van twee opeenvolgende uitbarstingen van 15 psi overdruklucht (0,5 s uit elkaar) eenmaal daags gedurende 3 dagen. Deze discrepantie kan worden toegeschreven aan de verschillende tijdstippen voor weefselverzameling tussen de twee onderzoeken. De huidige monsters werden 2 weken na ITON verzameld, vergeleken met 4 weken na ITON in de eerdere studie. Hoewel er in de huidige analyse geen synaptopathie werd gedetecteerd, merkten we wel de uitbreiding van microgliaprocessen op naar de ONL (Figuur 4B), waar fotoreceptorcellichamen zich bevinden. Deze observatie suggereert dat de verstoring van synaptische verbindingen tussen bipolaire cellen en fotoreceptoren kan optreden als een secundair effect van het letsel, terwijl axonverlies, axondegeneratie en gliose primaire effecten van schade vormen.

figure-results-1
Figuur 1: Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel. Gestippelde rechthoeken in de bovenste afbeelding worden vergroot en weergegeven als B, C en A in de twee onderstaande afbeeldingen (zoals aangegeven met witte pijlen). (A) Aangepaste 1,5-inch, niet-gefenestreerde loop (I) aan het uiteinde van het paintballgeweer. (B) Drukregelaar met verwijderde geleidingsdop om de stelschroef (II) bloot te leggen. (C) Invoerhals met de zwaartekrachttoevoerlader verwijderd en een afdekking van de invoerhals geïnstalleerd (III). (D) Basisplatform bestaande uit een stuk vezelplaat van 1.5 ft x 1.5 ft verheven boven een groter stuk vezelplaat van 2.5 ft x 1.5 ft. (E) Persluchttank aangesloten op de drukregelaar van het paintballgeweer en bevestigd aan het vezelplaatplatform met behulp van een duurzame riem. (F)x-y dier positioneringstabel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Aangepaste dierhouder voor focale toediening van overdruklucht. (A) Binnenkant van de dierhouder, bestaande uit een smalle PVC-buis met een rechthoekig gat (3 x 5 cm) om de kop en de bovenste achterschouders van het dier bloot te leggen. (B) Buitenkant van de houder van het dier, bestaande uit een bredere PVC-buis waar de smallere PVC-buis in schuift, waardoor het hele lichaam van het dier wordt afgeschermd, met uitzondering van het blootgestelde weefsel binnen de belichtingsopening. (C) Belichtingsopening voor focale afgifte van overdruklucht naar de betreffende plaats van CZS-letsel. (D) Drukopnemer om de uitgangsdruk van het systeem te kalibreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: ITON als gevolg van focale afgifte van overdruklucht. (A,B) Representatieve helderveldmicrofoto's van dwarsdoorsneden van proximale oogzenuwen van (A) schijnvertoning en (B) ITON. (C) Kwantificering van het totale aantal axonen. (D) Kwantificering van degeneratieve axonprofielen. n = 4 voor ITON. n = 9 voor schijnvertoning. De gegevens over het aantal axonen voor de schijngroep zijn ontleend aan Vest et al.33. **p < 0,005. Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Schaal balken = 20 μm. Afkorting: ITON = indirecte traumatische optische neuropathie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Abnormale proliferatie en migratie van microglia naar het ONL als gevolg van door het systeem geïnduceerde ITON. (A,B) Representatieve fluorescentiemicrofoto's van netvliesdoorsneden met anti-Iba1-etikettering van microglia (rood) van (A) schijn- en (B) ITON-dieren. Schaal balken = 100 μm. Afkortingen: ITON = indirecte traumatische optische neuropathie; GCL = ganglioncellaag, INL = binnenste kernlaag, ONL = buitenste kernlaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Vroege volharding van synaptische verbindingen tussen staafbipolaire cellen en fotoreceptoren als gevolg van door het systeem geïnduceerde ITON, ondanks het potentieel voor vertraagde synaptopathie. (A,B) Representatieve fluorescentiemicrofoto's van netvliesdoorsneden met anti-synaptofysine-etikettering van synapsen van fotoreceptorlintsynapsen (rood) en anti-PKC-α labeling van staafbipolaire cellen (groen) van (A) schijnvertoning en (B) ITON dieren. Schaal balken = 100 μm. Afkortingen: ITON = indirecte traumatische optische neuropathie; PKC = proteïnekinase C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit op maat gemaakte overdrukluchtsysteem is een handig hulpmiddel voor het bestuderen van CZS-letsels in gesloten systemen in muizenmodellen. De representatieve resultaten van het voorbeeldexperiment tonen aan dat de focale toediening van overdruklucht met behulp van dit systeem effectief ITON kan induceren, wat resulteert in aanzienlijk axonverlies en degeneratie. Dit benadrukt het vermogen van het systeem om nauwkeurig en reproduceerbaar CZS-letsel te produceren.

Een van de belangrijkste sterke punten van dit systeem is de aanpasbaarheid om een reeks CZS-letsels te veroorzaken. De ernst van de verwonding kan worden aangepast door de totale uitgangsdruk van het systeem, de afstand van het dier tot het einde van de loop te wijzigen met behulp van de x-y-positioneringsfase, de grootte en vorm van de belichtingsopening, het aantal blootstellingen aan overdruklucht en het interval tussen blootstellingen. Bovendien kan de locatie van de CZS-verwonding worden aangepast door de locatie van de belichtingsopening in de dierhouder te wijzigen. Deze veelzijdigheid heeft het systeem in staat gesteld om een spectrum van CZS-letsels met een gesloten systeem te produceren in muizenmodellen. Aanvankelijk werd het systeem gebruikt om verwondingen aan de gesloten bol te modelleren, waarbij de nadruk lag op schade aan de voorste en achterste pool en gerelateerde tekorten34,36, inclusief de effecten van de reactie van het immuunsysteem37, stamspecifieke uitkomsten38 en de werkzaamheid van neuroprotectieve middelen39. Uiteindelijk werd deze toepassing uitgebreid om de gevolgen van herhaalde ooggerichte blootstellingen te beoordelen om indirecte traumatische optische neuropathie (ITON)30 te modelleren en het effect van het aantal en het interval tussen herhaalde blootstellingen te onderzoeken33. Sindsdien is de toepassing van het systeem uitgebreid naar het modelleren van mild traumatisch hersenletsel (mTBI) met gesloten hoofd door middel van hoofdgerichte blootstellingen40,41 en ruggenmergletsel (SCI) met gesloten lichaam door middel van dorsumgerichte blootstellingen42, waarbij de nadruk wordt gelegd op het aanpassingsvermogen en de veelzijdigheid van het apparaat bij het bestuderen van verschillende domeinen van CZS-letsel.

Bij het gebruik van dit systeem is het van cruciaal belang om maatregelen te nemen om de variabiliteit in letseluitkomsten te minimaliseren om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van experimentele resultaten te garanderen. Belangrijke maatregelen zijn onder meer het kalibreren van de uitgangsdrukniveaus van het systeem voor en na elke reeks van drie blootstellingen om een consistente drukafgifte te garanderen. Hoewel de variabiliteit laag is wanneer het systeem wordt gebruikt tussen 15 psi en 50 psi bij gebruik van perslucht34, helpt consistente kalibratie bij het detecteren van onverwachte fouten, zoals een bijna lege batterij of bijna lege lucht. Plaats bovendien elk dier op dezelfde afstand van het uiteinde van de loop om een consistente overdrukgrootte te garanderen, aangezien de intensiteit van de drukgolf afneemt met de afstand. Uniforme positionering zorgt er ook voor dat elk dier wordt beïnvloed door hetzelfde deel van de ether. Bovendien zorgt het gelijkmatig vastzetten van dieren in de houder ervoor dat het weefsel van belang consequent wordt geviseerd, vooral in modellen met herhaalde blootstelling wanneer er een risico op verplaatsing bestaat. Ten slotte is uniformiteit in de leeftijd, het geslacht en de genetische achtergrond van de dieren cruciaal, aangezien deze factoren de reactie op letsel beïnvloeden. Eerdere studies met dit systeem vergeleken bijvoorbeeld de effecten van ooggerichte overdruklucht op verschillende muizenstammen, waarbij significante verschillen in letselrespons tussen C57Bl/6J36, DBA/2J37 en Balb/c38 muizen aan het licht kwamen. De DBA/2J- en Balb/c-muizen vertoonden ernstigere voorpoolpathologieën, grotere schade aan het netvlies, hogere oxidatieve stress en meer uitgesproken neuro-inflammatoire reacties in vergelijking met de C57Bl/6J-muizen met Balb/c-muizen die bijzonder robuuste en blijvende letselprofielen vertoonden38.

Systeemproblemen oplossen
Als de drukwaarden ongewoon laag zijn voor een bepaalde instelling van de manometer, haalt u de trekker 5-10x over, zodat de lucht door het systeem kan stromen en de regelaar zich kan aanpassen aan een nieuwe instelling. Er mogen geen lekken in de luchttank zitten. De O-ring op de luchttank mag niet beschadigd of versleten zijn, de luchttank moet voldoende lucht hebben en de batterij van het pistool mag niet leeg zijn. De x-y-tafel mag niet zijn verschoven van zijn gebruikelijke positie vanaf het einde van de loop en de opening voor blootstelling aan overdruklucht moet op één lijn liggen met de loop van het pistool en deze niet afsluiten. De regelaar moet stevig aan de greep van het pistool worden bevestigd. Als de drukwaarden te laag zijn ondanks het gebruik van de hoogste instelling op de manometer, mag de manometer niet verder worden verhoogd dan 200 psi en moet de snelheidsinstelling op het pistool worden aangepast aan de maximale instelling. Als de drukinstellingen inconsistent zijn (bijv. hoog en vervolgens laag), zorg er dan voor dat de luchttank voldoende lucht heeft, dat de regelaar stevig vastzit aan de handgreep van het pistool, dat er geen lekken in de luchttank zijn en dat deze stevig is vastgeschroefd, en dat de O-ring op de luchttank niet beschadigd of versleten is.

Om de volledige mogelijkheden van dit systeem volledig te begrijpen, is het belangrijk om de beperkingen ervan te erkennen. Het nabootsen van scenario's uit de echte wereld in een laboratoriumomgeving blijft een uitdaging. Hoewel dit systeem lucht onder overdruk genereert, repliceert het niet de complexe dynamiek van een explosieve gebeurtenis, zoals de variërende druk- en temperatuurgradiënten, de aanwezigheid van puin en gereflecteerde golven, en een multifasisch karakter. Bovendien bootst het geen Friedlander-golfvorm ("primaire ontploffingsgolf") na, die wordt gekenmerkt door een scherpe, bijna onmiddellijke drukpiek, gevolgd door een snel exponentieel verval dat onder de omgevingsdruk daalt voordat het terugkeert naar basislijn43. Integendeel, de golfvorm die door dit systeem wordt geproduceerd, vertegenwoordigt een eenvoudiger, meer symmetrisch profiel waarin er een meer geleidelijke stijging en daling van de druk is zonder duidelijke negatieve fase (zie figuur 2C in Hines-Beard et al.34). Enigszins voordelig combineert deze golfvorm elementen van zowel ontploffings- als stompe verwondingen. De klokvormige "drukpuls" zorgt voor een consistente overdrukimpact, vergelijkbaar met een "muur van lucht" die het onderwerp raakt. Toch is de overdruklucht die door de golf wordt geleverd ook een belangrijk kenmerk van verwondingen door ontploffingen. Sommigen zullen misschien beweren dat hoewel deze golfvorm aspecten van beide soorten letsel omvat, het de complexiteit van beide niet volledig weergeeft. Deze consistente en reproduceerbare "drukpuls" is echter ideaal voor gecontroleerde experimenten in een laboratoriumomgeving om focale CZS-schade in het gesloten systeem te bestuderen. We hebben de focale aard van de blessure eerder aangetoond. Blootstelling aan één oog veroorzaakt bijvoorbeeld geen schade aan het primaire neusepitheel of de hersenen44. Ook wordt een klein deel van de hersenen aangetast wanneer het naar de zijkant van het hoofd van de muis wordt gestuurd45. Ten slotte had de energie van de overdruklucht van dit systeem op het drukniveau dat voor ITON werd gebruikt geen invloed op de muis, tenzij herhaald met een kort tijdsinterval33. De druk is dus niet-schadelijk en repliceert daarom geen straalkracht. Verder was er, zelfs bij herhaalde blootstelling van lucht aan overdruk aan het oog, geen effect op de structuren van het voorsteoog33. Significante degeneratie van de oogzenuw en verlies van het gezichtsvermogen traden alleen op bij herhaalde blootstelling met een interval tussen de blootstellingen van minder dan 1 minuut33.

Vergeleken met andere laboratoriumapparaten voor het creëren van CZS-letsels in een gesloten systeem, biedt dit systeem unieke voordelen. Het kan opeenvolgende uitbarstingen van overdruklucht leveren in snelle opeenvolging (intervallen van 0,5 s)33, waardoor omstandigheden worden nagebootst in risicovolle werkomgevingen waar snelle blootstelling aan ontploffingen een veelvoorkomend gevaar is. Militair personeel, zowel in trainings- als gevechtsscenario's, gebruikt bijvoorbeeld een groot aantal automatische vuurwapens die snel herhaald kunnen vuren, waaronder automatische geweren (bijv. M16, AK-47), machinegeweren (bijv. M2 .50 kaliber), Gatling-geweren en miniguns. Andere langzamere, maar repetitieve wapens die door militair personeel worden gebruikt, zijn onder meer artillerie, mortieren, granaten en geïmproviseerde explosieven (IED's). Sloopwerkers die betrokken zijn bij gecontroleerde sloop en mijnwerkers die betrokken zijn bij explosiewerkzaamheden om gesteente te breken en mineralen te extraheren, ervaren ook opeenvolgende ontploffingen die snel achter elkaar plaatsvinden. Ten slotte kunnen bouwvakkers die pneumatisch gereedschap, heimachines of ander zwaar materieel gebruiken dat krachtige percussieve krachten genereert, snelle herhaalde inslagen ervaren die blootstelling aan ontploffingen nabootsen. Met name is een snelle levering van overdruklucht niet mogelijk met apparaten zoals schokbuizen die tussen elke gebeurtenis uitgebreid opnieuw moeten worden geconfigureerd of opnieuw onder druk moeten worden gezet. Schokbuizen gebruiken membranen die barsten om schokgolven te genereren, en na elke uitbarsting moet het diafragma worden vervangen. Dit proces kost tijd, omdat de schokbuis moet worden geopend, het gebruikte membraan moet worden verwijderd, een nieuw membraan moet worden geïnstalleerd en het systeem de tijd moet krijgen om te resetten en opnieuw onder druk te komen. Dus, vooral voor studies die CZS-letsel onderzoeken na snelle herhaalde blootstelling aan ontploffingen, is een systeem dat geen uitgebreide herconfiguratie of herdruk vereist tussen elke gebeurtenis ideaal.

Toekomstige toepassingen van dit modulerende, gebruiksvriendelijke en kosteneffectieve systeem zijn veelbelovend. Door gebruik te maken van zijn aanpasbare en unieke eigenschappen, opent dit systeem verschillende veelbelovende wegen voor toekomstige preklinische therapeutische studies. Het vermogen om snelle, opeenvolgende uitbarstingen van overdruklucht te leveren, kan worden gebruikt om de cumulatieve effecten van herhaalde blootstelling aan ontploffingen te bestuderen, wat relevant is voor het begrijpen van chronische traumatische encefalopathie en andere langdurige neurodegeneratieve aandoeningen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt om de effectiviteit te onderzoeken van verschillende farmacologische interventies die gericht zijn op het verminderen van CZS-letsels in het gesloten systeem, inclusief de timing en dosering van neuroprotectieve geneesmiddelen om optimale behandelingsvensters te bepalen. Bovendien maakt de precisie van het systeem bij het nabootsen van aspecten van zowel stompe als explosieletselmechanismen de ontwikkeling mogelijk van uitgebreide verwondingsmodellen die het complexe trauma weerspiegelen dat individuen in real-world scenario's ervaren. Dit kan het testen van multimodale therapieën vergemakkelijken die veelvoorkomende wereldwijde aspecten van letsel aanpakken, zoals ontsteking, oxidatieve stress en neuronale dood. Over het algemeen biedt dit apparaat een veelzijdig en krachtig platform voor het vergroten van ons begrip van CZS-letsels in een gesloten systeem en het ontwikkelen van effectieve therapeutische interventies.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van NIH NEI P30 EY008126, de Potocsnak Discovery Grant in Regenerative Medicine, de Ret. Maj. General Stephen L. Jones, MD Fund en Research Prevent Blindness, Inc Unrestricted Funds (VEI).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-PentanolFisher ScientificAC160600250Gebruikt om Avertin-oplossing te maken 
2,2,2-tribomethylethanolSigma AldrichT48402Gebruikt om Avertin-oplossing te maken 
24-well platen met dekselVWR76520-63424-well plaat
2-Propanol Fisher ScientificA451-1 
50 kS/s/kanaal Bridge Analog Input Module National InstrumentsNI-9237DAQ module
Albumine bovien Fractie V (BSA) Research Products International A30075BSA
Anti-Iba1 primaire antistof (Geiten polyklonaal) Abcam ab5076Marker voor microglia, Gebruikt op 1:500 concentratie 
Anti-Synaptophysin primaire antistof (Muis monoklonaal) Abcam ab8049Marker voor fotoreceptor ribbon synapsen, Gebruikt op 1:20 concentratie
Araldite GY 502 Electron Microscopy Sciences10900
Cacodylate bufferElectron Microscopy Sciences11652
HoutskoolfilterbusE-Z SystemsEZ-258Verzameling van anesthesieafval
Clear H20 DietGel 76AClear H2O 72-07-5022Gebruikt na de ontploffing om dierlijk herstel te bevorderen
CompactDAQ ChassisNational InstrumentsUSB-9162DAQ chassis
PersluchtA-L GasGSMCA300 Gebruikt om persluchttank bij te vullen
DAPI Fluoromount-G Southern BiotechMontage media met DAPI
DiamantzaagknijptangMicro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. Voor het doorsnijden van oogzenuwen, 3 mm/45 graden/Stijl H 
Ezel Anti-Geiten IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alex Fluor 594Invitrogen (Leverancier: Fisher Scientific)A-11058Secundair antilichaam voor microglia, Gebruikt op 1:200 concentratie
Ezel Anti-Muis IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alex Fluor 594Invitrogen (Leverancier: Fisher Scientific)A-21203Secundair antilichaam voor fotoreceptor ribbon synapsen, Gebruikt op 1:200 concentratie
Ezel Anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alex Fluor 488Invitrogen (Leverancier: Fisher Scientific)A-21206Secundair antilichaam voor staafjesbipolare cellen, Gebruikt op 1:200 concentratie 
Ezelserum Sigma Aldrich D9662NDS
Dumont #3 TangFine Science Tools11231-30Fijne pincet voor gehele ogenukleatie 
Ethanol (200 proof) KOPTEC (Leverancier: VWR) 89125-188Ethanol 
Fluoromount-G Invitrogen (Leverancier: Fisher Scientific)00-4958-02Montage media
Genteal Tears Ophthalmisch GelCovetrus72359Oogsmering om de ogen te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens/na anesthesie 
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16200
Meetcilinder 1000 mLFisher Scientific08-572G
Meetcilinder 250 mLFisher Scientific08-572E
Meetcilinder 500 mLFisher Scientific08-572F
Verwarmingskussen Braintree ScientificAP-R 26EGecontroleerde verwarmingsondersteuning
HogedrukvulstationNinja PaintballHPFSV2Gebruikt om persluchttank bij te vullen
ImageJNational Institutes of Health Beeldanalyse software
Invert MiniEmpire PaintballPaintballpistool
IsofluraanCovetrus29405Inhalatieanesthesie
IsofluraanverdamperVetEquip901806Dierenanesthesie
Masterflex PompCole-ParmerGebruikt voor dierlijke perfusie
Methanol Sigma Aldrich322415-2L 
MicroscoopglazenGlobe Scientific1358WWitte glazen microscoopglazen
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) National InstrumentsSoftware om DAQ-systeem instellingen te configureren
NI-DAQmx drivers National InstrumentsDriver voor interactie met DAQ-systeem 
Nikon Eclipse Ni-E microscoopNikon Instruments
Osmiumtetraoxide 2%Electron Microscopy Sciences19152
Paraformaldehyde 32%Electron Microscopy Sciences15714-SPFA verdund tot 4%
Parafenyleendiamine Sigma AldrichP6001
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044PBS verdund tot 1x
Propyleenoxide Electro

Referenties

  1. Schneiderman, A. I., Braver, E. R., Kang, H. K. Understanding sequelae of injury mechanisms and mild traumatic brain injury incurred during the conflicts in Iraq and Afghanistan: Persistent postconcussive symptoms and posttraumatic stress disorder. Am J Epidemiol. 167 (12), 1446-1452 (2008).
  2. Terrio, H., et al. Traumatic brain injury screening: Preliminary findings in a us army brigade combat team. J Head Trauma Rehabil. 24 (1), 14-23 (2009).
  3. Morissette, S. B., et al. Deployment-related tbi, persistent postconcussive symptoms, ptsd, and depression in oef/oif veterans. Rehabil Pyschol. 56 (4), 340(2011).
  4. Cooper, D. B., et al. Treatment of persistent post-concussive symptoms after mild traumatic brain injury: A systematic review of cognitive rehabilitation and behavioral health interventions in military service members and veterans. Brain Imaging Behav. 9, 403-420 (2015).
  5. Elder, G. A. Update on tbi and cognitive impairment in military veterans. Curr Neurol Neurosci Rep. 15 (10), 68(2015).
  6. Vincent, A. S., Roebuck-Spencer, T. M., Cernich, A. Cognitive changes and dementia risk after traumatic brain injury: Implications for aging military personnel. Alzheimers Dement. 10, S174-S187 (2014).
  7. St Onge, P., Mcilwain, D. S., Hill, M. E., Walilko, T. J., Bardolf, L. B. Marine corps breacher training study: Auditory and vestibular findings. US Army Med Dep J. , 97-107 (2011).
  8. Capó-Aponte, J. E., et al. Effects of repetitive low-level blast exposure on visual system and ocular structures. J Rehabil Res Dev. 52 (3), 273-290 (2015).
  9. Tate, C. M., et al. Serum brain biomarker level, neurocognitive performance, and self-reported symptom changes in soldiers repeatedly exposed to low-level blast: A breacher pilot study. J Neurotrauma. 30 (19), 1620-1630 (2013).
  10. Carr, W., et al. Repeated low-level blast exposure: A descriptive human subjects study. Mil Med. 181 (suppl_5), 28-39 (2016).
  11. Caplan, B., et al. Relation of repeated low-level blast exposure with symptomology similar to concussion. J Head Trauma Rehabil. 30 (1), 47-55 (2015).
  12. Woodall, J. L., et al. Repetitive low-level blast exposure and neurocognitive effects in army ranger mortarmen. Mil Med. 188 (3-4), e771-e779 (2023).
  13. Stone, J. R., et al. Functional and structural neuroimaging correlates of repetitive low-level blast exposure in career breachers. J Neurotrauma. 37 (23), 2468-2481 (2020).
  14. Gavett, B. E., Stern, R. A., Cantu, R. C., Nowinski, C. J., Mckee, A. C. Mild traumatic brain injury: A risk factor for neurodegeneration. Alzheimers Res Ther. 2, 1-3 (2010).
  15. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive tbi: Substrates of dementia. Nat Rev Neurol. 9 (4), 211-221 (2013).
  16. Juan, S. M., Daglas, M., Adlard, P. A. Tau pathology, metal dyshomeostasis and repetitive mild traumatic brain injury: An unexplored link paving the way for neurodegeneration. J Neurotrauma. 39 (13-14), 902-922 (2022).
  17. Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. Spinal cord injury: Current mammalian models. Am J Neurosci. 4 (1), 1-12 (2013).
  18. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  19. Khalin, I., et al. A mouse model of weight-drop closed head injury: Emphasis on cognitive and neurological deficiency. Neural Regen Res. 11 (4), 630-635 (2016).
  20. Jamnia, N., et al. A clinically relevant closed-head model of single and repeat concussive injury in the adult rat using a controlled cortical impact device. J Neurotrauma. 34 (7), 1351-1363 (2017).
  21. Mishra, V., et al. Primary blast causes mild, moderate, severe and lethal tbi with increasing blast overpressures: Experimental rat injury model. Sci Rep. 6 (1), 1-14 (2016).
  22. Hu, C. -K., Chen, M. -H., Wang, Y. -H., Sun, J. -S., Wu, C. -Y. Integration of multiple prognostic predictors in a porcine spinal cord injury model: A further step closer to reality. Front Neurol. 14, 1136267(2023).
  23. Lim, J. -H., et al. Establishment of a canine spinal cord injury model induced by epidural balloon compression. J Vet Sci. 8 (1), 89(2007).
  24. Fukuda, S., et al. New canine spinal cord injury model free from laminectomy. Brain Res Protoc. 14 (3), 171-180 (2005).
  25. Norris, C., et al. A closed-body preclinical model to investigate blast-induced spinal cord injury. Front Mol Neurosci. 16, 1199732(2023).
  26. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  27. Osier, N. D., Dixon, C. E. The controlled cortical impact model: Applications, considerations for researchers, and future directions. Front Neurol. 7, 214364(2016).
  28. Chen, Y., Constantini, S. Caveats for using shock tube in blast-induced traumatic brain injury research. Front Neurol. 4, 117(2013).
  29. Bernardo-Colón, A., et al. Antioxidants prevent inflammation and preserve the optic projection and visual function in experimental neurotrauma. Cell Death Dis. 9 (11), 1097(2018).
  30. Bernardo-Colón, A., et al. Progression and pathology of traumatic optic neuropathy from repeated primary blast exposure. Front Neurosci. 13, 719(2019).
  31. Thomas, C. N., et al. Assessment of necroptosis in the retina in a repeated primary ocular blast injury mouse model. Exp Eye Res. 197, 108102(2020).
  32. Naguib, S., Bernardo-Colón, A., Rex, T. S. Intravitreal injection worsens outcomes in a mouse model of indirect traumatic optic neuropathy from closed globe injury. Exp Eye Res. 202, 108369(2021).
  33. Vest, V., Bernardo-Colón, A., Watkins, D., Kim, B., Rex, T. S. Rapid repeat exposure to subthreshold trauma causes synergistic axonal damage and functional deficits in the visual pathway in a mouse model. J Neurotrauma. 36 (10), 1646-1654 (2019).
  34. Hines-Beard, J., et al. A mouse model of ocular blast injury that induces closed globe anterior and posterior pole damage. Exp Eye Res. 99, 63-70 (2012).
  35. Naguib, S., Bernardo-Colon, A., Cencer, C., Rex, T. S. Galantamine confers neuroprotection in a model of indirect traumatic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (9), 4407-4407 (2019).
  36. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., Rex, T. S. Molecular changes and vision loss in a mouse model of closed-globe blast trauma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 4853-4862 (2014).
  37. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., D'surney, L., Rex, T. S. Exacerbation of blast-induced ocular trauma by an immune response. J Neuroinflammation. 11 (1), 1-15 (2014).
  38. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., Rex, T. S. Eye-directed overpressure airwave-induced trauma causes lasting damage to the anterior and posterior globe: A model for testing cell-based therapies. J Ocul Pharmacol Ther. 32 (5), 286-295 (2016).
  39. Bricker-Anthony, C., et al. Erythropoietin either prevents or exacerbates retinal damage from eye trauma depending on treatment timing. Optom Vis Sci. 94 (1), 20-32 (2017).
  40. Heldt, S. A., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury caused by primary overpressure blast to the cranium produces sustained emotional deficits in mice. Front Neurol. 5, 2(2014).
  41. Guley, N. H., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury using focal primary overpressure blast to the cranium in mice. J Neurotrauma. 33 (4), 403-422 (2016).
  42. Del Mar, N., et al. A novel closed-body model of spinal cord injury caused by high-pressure air blasts produces extensive axonal injury and motor impairments. Exp Neurol. 271, 53-71 (2015).
  43. Wolf, S. J., Bebarta, V. S., Bonnett, C. J., Pons, P. T., Cantrill, S. V. Blast injuries. Lancet. 374 (9687), 405-415 (2009).
  44. Bricker-Anthony, C., Rex, T. S. Neurodegeneration and vision loss after mild blunt trauma in the c57bl/6 and dba/2j mouse. PLoS One. 10 (7), e0131921(2015).
  45. Heldt, S. A., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury caused by primary overpressure blast to the cranium produces sustained emotional deficits in mice. Front Neurol. 5, 2(2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gesloten systeem voor CNS letseltraumatische oogzenuwneuropathieoverdrukluchtsysteemfocale hersenbeschadigingruggenmergletseldierlijke letselmodellenaxonale degeneratiemicrogliaproliferatiesecundaire degeneratiecontrole van letselernst
Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.