Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het onmiddellijk verwijderen van een deel van de cumulus-eicelcomplexen na het ophalen van eieren om het IVF-observatieproces te versnellen, de tijd die nodig is voor het verwijderen van granulosacellen te verkorten, de blootstelling van eicellen aan externe elementen te minimaliseren en de ontwikkeling van embryo's niet te belemmeren, wat uiteindelijk de efficiëntie van IVF-laboratoriumprocedures verbetert.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De onmiddellijke gedeeltelijke verwijdering van cumulus-eicelcomplexen: een verfijnde aanpak voor snelle observatie van in-vitrofertilisatie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondanks de snelle vooruitgang in klinische en laboratoriumtechnologieën voor in-vitrofertilisatie (IVF), blijft een aanzienlijk deel (10%-15%) van de patiënten bevruchtingsstoornissen ervaren, wat leidt tot lage bevruchtingspercentages en de productie van niet-levensvatbare embryo's. Bevruchting op korte termijn omvat de vroege verwijdering van granulosacellen om de extrusie van het tweede poollichaam te observeren, waardoor de bemesting kan worden beoordeeld en vroege herstelmaatregelen kunnen worden genomen om lage bevruchtingspercentages en volledig mislukken van de bevruchting aan te pakken. De observatie van kortetermijnbevruchting bij IVF wordt echter belemmerd door uitdagingen zoals buitensporig grote onverwerkte clusters van cumulus-eicelcomplexen en hechting tussen eieren, waardoor complexe externe procedures voor het verwijderen van granulosacellen en een langere observatieduur nodig zijn. Om dit probleem aan te pakken, stelt deze studie een methode voor voor onmiddellijke gedeeltelijke verwijdering van granulosacellen na het ophalen van eieren. Deze aanpak stroomlijnt de volgende stadia van kortetermijnbevruchting en traditionele bevruchtingsmonitoring, verkort de tijd die nodig is voor eicelextrusie, minimaliseert de kans op externe milieueffecten op de eicellen en vermindert het risico op het missen van het kritieke waarnemingsvenster voor bevruchting. Bijgevolg levert de studie nieuw klinisch bewijs op dat gericht is op het verbeteren van de operationele efficiëntie van embryonale laboratoria bij IVF.
Inleiding
Op het gebied van in-vitrofertilisatie-embryotransfer (IVF-ET) ligt het typische bevruchtingspercentage tussen 60% en 80%1. Ongeveer 4% tot 16% van de gevallen heeft echter te maken met volledig mislukken van de bevruchting of lage bevruchtingspercentages, wat een uitdaging vormt bij de voorspelling 2,3. Om de klinische zwangerschapsuitkomsten te verbeteren en het aantal gevallen van volledige niet-bevruchting en lage bevruchting te verminderen, neemt het gebruik van kortetermijnbevruchting in IVF-procedures toe4. Deze aanpak omvat de onmiddellijke verwijdering van granulosacellen om de extrusie van het tweede poollichaam te controleren, de bevruchtingsstatus te beoordelen en mogelijk remediërende intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) uit te voeren. De binding tussen het cumuluscelcelcomplex van de eicel (OCCC) en de eicel is sterker tijdens kortetermijnbevruchting in vergelijking met traditionele nachtbevruchting, waardoor de uitdaging van OCCC-verwijdering toeneemt5. Factoren zoals een overmaat aan eicellen, grote OCCC-complexen of verklevingen tussen eicellen kunnen leiden tot langere verwijderingstijden van granulosacellen tijdens kortdurende bevruchting, waardoor de periode dat eieren buiten de broedmachine blijven wordt verlengd4. Om de observatieperiode van de bevruchting te optimaliseren, is een aangepaste aanpak na het ophalen van eieren bedacht, waarbij gedeeltelijke excisie van granulosacellen uit eicellen met significante OCCC-complexen wordt gebruikt. Deze techniek helpt bij het behouden van de granulosacellen rond de eicellen, het behouden van de integriteit van de vroege eicelstructuur6 en het mogelijk maken dat deze cellen vitale factoren blijven leveren voor de rijping van de eicellen en de daaropvolgende bevruchting-embryobinding7.
Bijgevolg richt deze studie zich op patiënten die een IVF-ET-behandeling ondergaan in een centrum voor reproductieve geneeskunde als onderzoeksdeelnemers, met als doel de impact te onderzoeken van een onmiddellijke gedeeltelijke granulosacel mechanische excisiemethode op de duur van procedures voor zowel kortetermijnbevruchting als nachtelijke bevruchtingsmonitoring, terwijl ook de resultaten van normale bevruchting en ontwikkeling in een laat stadium worden geëvalueerd. Dit onderzoek is bedoeld om waardevolle inzichten te bieden voor het verbeteren van embryolaboratoriumprocedures bij IVF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de standaardprocedures van de afdeling Reproductieve Geneeskunde van het Meizhou People's Hospital en werden onderworpen aan beoordeling door de ethische commissie van dezelfde afdeling. Van elk deelnemend paar werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. De studie omvatte deelnemers die hun eerste IVF-cyclus ondergingen met embryotransfer in het splitsings- of blastocyststadium, evenals vrouwen tussen 20 en 45 jaar. Uitsluitingscriteria waren onder meer het gebruik van donoreicellen/sperma en specifieke aandoeningen zoals aangeboren of secundaire baarmoederafwijkingen (bijv. septaat baarmoeder, eenhoornige baarmoeder, baarmoeder didelphys), adenomyose, submucosale vleesbomen van de baarmoeder of endometriumdikte van minder dan 7 mm op de dag van de embryotransfer. In totaal werden 115 patiënten die tussen december 2023 en februari 2024 waren ingeschreven, gestratificeerd in twee groepen op basis van het al dan niet onmiddellijk gedeeltelijk verwijderen van OCCC.
1. Voorbereiding voor het ophalen van de eicel
- Plaats de schaaltjes voor het oppakken van de eicellen (Materiaaltabel) een nacht in de broedmachine bij 37 °C.
- Incubeer een nacht 12 ml follikelmanipulerend medium (materiaaltabel) in reageerbuisjes met ronde bodem van 14 ml bij 37 °C. Breng de buisjes 30 minuten voor het ophalen van de eicellen over naar het voorverwarmde reageerbuisrek.
- Bereid het follikelmanipulerende medium voor: Voeg 9 ml follikelmanipulerend medium toe aan een reageerbuisje met ronde bodem van 14 ml (materiaaltabel) en incubeer een nacht bij 37 °C. Breng op de dag van het ophalen van de eicel 4,5 ml van het medium over naar een voorbebroede eicelopraapschaal (Materiaaltabel) bedekt met 2 ml 100% paraffineolie.
- Bereid de OCCC-spoeloplossing voor: Voeg 4,5 ml bemestingsmedium (Materiaaltabel) toe aan een eicelopraapschaaltje en incubeer een nacht bij 37 °C.
- Bereid het bemestingsmedium voor: Voeg 1 ml bemestingsmedium toe aan een schaal van 6 cm bedekt met 100% paraffineolie (Materiaaltabel) en incubeer een nacht bij 37 °C.
- Bereid de glazen pasteurpipetten voor (Materiaaltabel): Maak de uiteinden voorzichtig bot en rond ze af door ze ongeveer 5 s op een alcohollamp te branden (Figuur 1). Bevestig een zuigkop aan de punt van de pasteurpipetten en zorg ervoor dat deze de bodem van de schaal kan raken zonder te krassen. Spoel de glazen pasteurpipetten en schaaltjes van 10 cm af met een follikelmanipulatiemedium.
2. Eicelpunctie en onmiddellijke gedeeltelijke verwijdering van OCCC
OPMERKING: Gebruik een stereomicroscoop tijdens de isolatie van de eicellen en de OCCC-verwijderingsprocedures. Voor een optimaal resultaat moeten alle procedures worden uitgevoerd op een verwarmingstafel met temperatuurregeling (37 °C) en moet alle apparatuur 30 minuten voor het ophalen van de eicel worden voorverwarmd.
- Verzamel pre-ovulatoire follikelvloeistof tijdens het ophalen van de eicel volgens de ESHRE-aanbevelingen8.
- Gebruik in het kort een naald van 17 G om de eicellen op te halen onder transvaginale echografie. De juiste onderdruk varieert van 120-140 mmHg.
- Giet de follikelvloeistof die is verzameld in de 14 ml reageerbuis met ronde bodem in een schaaltje van 10 cm (Materiaaltabel), waarbij een vloeistofdiepte van minder dan 0,5 cm behouden blijft. Plaats de schaal op een platform met constante temperatuur (37 °C).
- Observeer de OCCC onder een stereomicroscoop om de aanwezigheid van eicellen te bevestigen en hun rijpheid te beoordelen.
OPMERKING: De rijpheid van de OOOC wordt beoordeeld op basis van de morfologie van de cumuluscellen en de zichtbaarheid van bepaalde eicelstructuren9. - Zuig de OCCC aan met behulp van een pasteurpipet met stomp uiteinde. Kantel de schaal van 10 cm ongeveer 15 graden en spreid alle grote OCCC uit. Vermijd het opzuigen van de eicel en de omliggende granulosacellen binnen een straal van 2500 μm. Snijd overtollige granulosacellen met de pasteurpipet langs de lengteas (Figuur 2). De gedetailleerde stappen zijn als volgt:
- Observeer met het blote oog om te zien of er een grijsachtige, doorschijnende slijmvliesmassa in de folliculaire vloeistof zit. Als het niet wordt gevonden, zoek dan snel naar de grijsachtige doorschijnende slijmvliesmassa door met de klok mee van buiten naar binnen te draaien onder een stereomicroscoop, de OCCC.
- Bevestig of er eicellen in de OCCC zijn en maak een voorlopige beoordeling van de rijping van de eicellen.
- Bereid vervolgens een siliconen aspiratiepipet voor met een ronde, vlamgepolijste pasteurpipet, zuig de OCCC op en til tegelijkertijd de kweekschaal voorzichtig op 9-10 uur met de linker ringvinger van de hand die de schaal van 10 cm vasthoudt, kantel de cultuurschaal iets ongeveer 15° naar links (plaats de ringvinger onder de schaal is ongeveer de vereiste hoek).
- Terwijl u de aangezogen OCCC uitspuugt op de 11 uur-positie van de schaal, verlengt u deze voorzichtig horizontaal naar rechts. Observeer vervolgens de grootte van de granulosacellen rond de geëxpandeerde OCCC. Gebruik vervolgens, op de geschikte positie van de horizontaal langwerpige OCCC, de Pasteur-pipet om een snelle en zachte dalende snede te maken op de overtollige granulosacellen van boven naar beneden.
- Breng de gesneden OCCC over in een opvangschaal met OCCC-spoeloplossing. Giet de resterende follikelvloeistof in een steriele monstercontainer (Materiaaltabel). Herhaal deze stappen totdat alle complexen zijn verzameld.
3. Spermabereiding en in-vitro-inseminatie
- Verzamel de spermamonsters via ejaculatie op de ochtend van het ophalen van de eicel. Evalueer de concentratie, beweeglijkheid en morfologie van het sperma onder een lichtmicroscoop volgens de criteria van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO, 2010)10. Breng vervolgens de spermakorrel over in een nieuwe centrifugebuis en was deze twee keer in bevruchtingsmedium11. Incubeer ze bij 6% CO2 en 37 °C tot ze nodig zijn.
- Insemineer OCCC's met 1 x 105 tot 3 x 105 beweeglijke spermatozoa per milliliter in een enkele druppel ongeveer 2-3 uur na het ophalen in de bevruchtingsschaal (Materiaaltabel). Voeg 6-8 OCCC en 1 ml van het bemestingsmedium toe aan de bemestingsschaal.
OPMERKING: Na het wassen van de kleverige OCCC worden ze met behulp van een pasteurpipet overgebracht naar de bemestingsschaal. Laat één OCCC tegelijk los, til de pipet voorzichtig van het vloeistofoppervlak voordat u de volgende loslaat, zorg ervoor dat elke OCCC afzonderlijk in de schaal wordt geplaatst om clustering te voorkomen.
4. Verwijdering van cumuluscellen
- Volg voor kortdurende bemesting de onderstaande stappen.
- Co-incubeer OCCC's met spermatozoa gedurende 4-6 uur. Verwijder na de incubatie mechanisch de cumuluscellen rond de eicellen.
- Zuig de eicellen op met behulp van een pipet met een binnendiameter die iets kleiner is dan de eicellen om ervoor te zorgen dat de cumuluscellen volledig worden verwijderd.
- Bevestig de bevruchting door de aanwezigheid van twee poollichamen te observeren. Eicellen die een tweede poollichaam vertonen, worden als bevrucht beschouwd.
- Identificeer die gevallen waarin het tweede poollichaam niet te zien is als mislukte bevruchting, waardoor redding-ICSI nodig is.
- Voor regelmatige bevruchting verwijdert u na 18-20 uur co-incubatie cumuluscellen met behulp van de pipetten voor bevruchtingsbeoordeling.
5. Embryo cultuur
- Kweek en controleer de bevruchte eicellen gedurende 3-5 dagen na het ophalen van de eicel. Beoordeel de bevruchting 20 uur na de inseminatie om het aantal pronuclei te bepalen. Kweek vervolgens elke zygote afzonderlijk in een mediumdruppel en breng de embryo's na de bevruchting over naar een splitsingsmedium.
OPMERKING: Een ideaal embryo op de derde dag moet bestaan uit zes of meer blastomeren van gelijke grootte en een fragmentatiesnelheid vertonen van minder dan of gelijk aan 10%12. - De beslissing om door te gaan met blastocystcultuur hangt af van de voorkeuren van de patiënt en de specifieke omstandigheden, zoals de kwantiteit en kwaliteit van de embryo's die op dag 3 zijn verkregen. Breng de embryo's van dag 3 over naar het blastocystmedium en beoordeel op dag 5. Gebruik het scoresysteem van Gardner om blastocysten te evalueren, waarbij blastocysten van hoge kwaliteit een score van ≥ 4 BB13 hebben.
6. Uitkomstmetingen en statistische analyse
- Rapporteer continue gegevens als het gemiddelde ± standaarddeviatie en druk ordinale gegevens uit als verhoudingen. Voer statistische analyse uit met behulp van de t-toets van de student of de chi-kwadraattoets in een geschikte software voor gegevensanalyse (hier IBM SPSS Statistics). Beschouw een significantieniveau van P < 0,05 als statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de groep die korte co-incubatieprocedures onderging, werden patiënten die gered werden uitgesloten. Van de 47 patiënten die een kortdurende inseminatie kregen, werden geen significante verschillen waargenomen in termen van leeftijd van de patiënt en het aantal afgenomen eicellen (tabel 1). De onmiddellijke gedeeltelijke verwijdering van OCCC resulteerde in een loslating van de resterende OCCC rond de eicellen (Figuur 3), waardoor de detec...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De onmiddellijke gedeeltelijke verwijdering van granulosacellen kan het vroege desintegratieproces van kortetermijnbevruchting versnellen, de observatietijd voor het tweede poollichaam verkorten bij zowel kortetermijnbevruchting als conventionele IVF en de daaropvolgende embryonale ontwikkeling niet in gevaar brengen. Momenteel gebruiken laboratoria wereldwijd verschillende strategieën om bevruchtingsstoornissen en lage slagingspercentages te verminderen. De voorkeursmethode omvat het ve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs betuigen hun dankbaarheid aan het personeel van het Department of Reproductive Medicine van het Meizhou People's Hospital in Guangdong, China, voor hun actieve deelname aan deze studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| G-IVFT PLUS | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | Vitrolife | 10130 | |
| Falcon 3003 schaal | Corning | 353003 | |
| Falcon 3001 schaal | Corning | 353001 | |
| Falcon 2001 buis | Corning | 352001 | |
| Falcon 4013 kop | Corning | 354013 | |
| Falcon 3037 schaal | Corning | 351058 | |
| Pasteur pipette | Darwin | D1150-5P |
Referenties
- Chen, C., Kattera, S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF. Hum Reprod. 18 (10), 2118-2121 (2003).
- Barlow, P., et al. Fertilization failure in IVF: why and what next. Hum Reprod. 5 (4), 451-456 (1990).
- Kuczyński, W., et al. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF. Hum Reprod. 17 (9), 2423-2427 (2002).
- He, Y., et al. Effect of early cumulus cells removal and early rescue ICSI on pregnancy outcomes in high-risk patients of fertilization failure. Gynecol Endocrinol. 34 (8), 689-693 (2018).
- Turathum, B., Gao, E. M., Chian, R. C. The function of cumulus cells in oocyte growth and maturation and in subsequent ovulation and fertilization. Cells. 10 (9), 2292(2021).
- Bárcena, P., Rodríguez, M., Obradors, A., Vernaeve, V., Vassena, R. Should we worry about the clock? Relationship between time to ICSI and reproductive outcomes in cycles with fresh and vitrified oocytes. Hum Reprod. 31 (6), 1182-1191 (2016).
- Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
- D'Angelo, A., et al. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up. Hum Reprod Open. 2019 (4), hoz025(2019).
- Hu, Y., et al. Transcriptomic profiles reveal the characteristics of oocytes and cumulus cells at GV, MI, and MII in follicles before ovulation. J Ovarian Res. 16 (1), 225(2023).
- Lu, W. H., Gu, Y. Q. Insights into semen analysis: a Chinese perspective on the fifth edition of the WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Asian J Androl. 12 (4), 605-606 (2010).
- Delos Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Hum Reprod. 31 (2015), 685-686 (2016).
- Nagy, Z. P., et al. Pronuclear morphology evaluation with subsequent evaluation of embryo morphology significantly increases implantation rates. Fertil Steril. 80 (1), 67-74 (2003).
- Gardner, D. K., Lane, M., Stevens, J., Schlenker, T., Schoolcraft, W. B. Reprint of: Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril. 112 (4), Suppl1 e81-e84 (2019).
- Esfandiari, N., Claessens, E. A., Burjaq, H., Gotlieb, L., Casper, R. F. Ongoing twin pregnancy after rescue intracytoplasmic sperm injection of unfertilized abnormal oocytes. Fertil Steril. 90 (1), e5-e7 (2008).
- Wetzels, A. M., et al. The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitro and implantation. Hum Reprod. 13 (5), 1325-1330 (1998).
- Kattera, S., Chen, C. Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study. Fertil Steril. 80 (4), 1017-1021 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
