Methodenartikel

Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET)

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66953

⸱

9 augustus 2024

 ,  , 
1Institute for Molecular Medicine, MSH Medical School Hamburg, 2Institute of Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin

In dit artikel

Samenvatting

Elektrofysiologie is de gouden standaard voor het onderzoeken van ionkanaalactiviteit. Er zijn echter tal van alternatieve benaderingen, waaronder optische methoden. Hier beschrijven we een methode om de activiteit van de leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8) gevormde anionkanalen te monitoren met behulp van een op Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde methode tussen subeenheden.

Samenvatting

Leden van de LRRC8-eiwitfamilie vormen heteromere ionen- en osmolytkanalen met een rol in tal van fysiologische processen. Als volumegereguleerde anionkanalen (VRAC's)/volumegevoelige outward-rectifying channels (VSOR's) worden ze geactiveerd bij het zwellen van osmotische cellen en bemiddelen ze de extrusie van chloride en organische osmolyten, wat leidt tot de uitstroom van water en dus celkrimp. Naast hun rol bij de regulatie van osmotisch volume, zijn VRAC's betrokken bij cellulaire processen zoals differentiatie, migratie en apoptose. Door hun effect op het membraanpotentiaal en hun transport van verschillende signaalmoleculen, spelen leucinerijke herhalingen met 8 (LRRC8) kanalen een rol bij de communicatie tussen neuron en glia, insulinesecretie en immuunrespons. Het activeringsmechanisme is ongrijpbaar gebleven. LRRC8-kanalen worden, net als andere ionkanalen, meestal bestudeerd met behulp van elektrofysiologische methoden. Hier beschrijven we een methode om LRRC8-kanaalactivering te detecteren door intra-complex gesensibiliseerde emissie Förster-resonantie-energieoverdracht (SE-FRET) te meten tussen fluorescerende eiwitten gefuseerd met de C-terminale leucinerijke herhalingsdomeinen van LRRC8-subeenheden. Deze methode biedt de mogelijkheid om kanaalactivatie in situ te bestuderen zonder uitwisseling van de cytosolische omgeving en tijdens processen zoals celdifferentiatie en apoptose.

Inleiding

Ionkanalen bestaande uit heteromeren van leucine-rijke herhaling die 8 (LRRC8) familie-eiwitten bevatten, worden aangetroffen in gewervelde cellen en nemen deel aan een breed scala aan fysiologische functies 1,2. Deze LRRC8-kanalen, voor het eerst geïdentificeerd als volumegereguleerde anionkanalen (VRAC's) of volumegevoelige naar buiten rectificerende kanalen (VSOR), spelen een cruciale rol bij de afname van het cellulaire regulerende volume 3,4. Ze vergemakkelijken de verdrijving van chloride-ionen en organische osmolyten, gevolgd door wateruitvloeiing als reactie op osmotische zwelling. Naast hun rol in de osmotische stressrespons, is hun rol in de regulatie van het cellulaire volume in verband gebracht met celproliferatie en -migratie, apoptose, spermiogenese en epitheliale integriteit 5,6,7. Het is aangetoond dat verandering van het membraanpotentiaal bij activering van LRRC8/VRAC bijdraagt aan myobuisdifferentiatie8 en insulinesecretie door pancreas-β-cellen 9,10,11. Bovendien geleiden LRRC8-kanalen een verscheidenheid aan organische osmolyten, zoals purinerge signaalmoleculen ATP en cGAMP of het exciterende aminozuur glutamaat, waardoor deze kanalen in cel-celcommunicatie in het immuunsysteem of glia-neuroninteractie worden geplaatst 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Zelfs xenobiotica, zoals de kleurstof fluoresceïne, het antibioticum blasticidine S of het antikankermedicijn cisplatine, worden uitgevoerd door LRRC8-kanalen 23,24,25.

Er zijn talrijke rapporten over de signaaltransductie die leidt tot LRRC8/VRAC-activering 26,27,28. Het mechanisme blijft echter onduidelijk en de literatuur presenteert een breed scala aan mogelijke mechanismen die kunnen afhangen van het specifieke fysiologische proces. Deze omvatten veranderingen in de sterkte van cytosolische ionen, interactie met het cytoskelet, membraansamenstelling, G-eiwitten, de redoxtoestand en fosforyleringscascades 2,27,29,30,31.

LRRC8/VRAC-kanalen bevatten LRRC8A als een essentiële subeenheid 3,4 die moet heteromeriseren met ten minste één van zijn paralogen, LRRC8B-E, om fysiologisch functionele kanalen 4,14,32 te vormen. De samenstelling van de subeenheid bepaalt de biofysische eigenschappen van het kanaal, zoals rectificatie en depolarisatie-afhankelijke inactivatie 4,29,32,33,34, substraatspecificiteit 15,17,20,21,24,35 en sommige activeringsroutes 36,37. Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structuren laten zien dat LRRC8A-homomeren, evenals heteromeren, zich assembleren als hexameren38,39,40, terwijl LRRC8A/LRRC8C-chimaera's die functionele kanalen vormen heptameren zijn41. Het N-terminale deel van alle LRRC8-eiwitten bestaat uit vier transmembraanhelices en het C-terminale deel bevat een domein met leucine-rijke herhalingen (LRRD). De beschikbare LRRC8-complexstructuren leveren bewijs dat de LRRD's, die zich uitstrekken tot in het cytosol 3,4,23, conformationele herschikkingen kunnen ondergaan tijdens kanaalpoorten 34,42,43. Dit idee wordt bevestigd door de bevinding dat C-terminale fusie van fluorescerende eiwitten resulteert in basale kanaalactiviteit14 en dat binding van nanobodies aan de domeinen kanaalactiviteit kan moduleren44. Bovendien werden conformationele veranderingen van de C-termini aangetoond door intra-complex Förster resonantie energieoverdracht (FRET)45.

De meest gebruikelijke methode om de activiteit van ionenkanalen te bestuderen zijn elektrofysiologische metingen46, die op grote schaal werden toegepast bij het onderzoek naar VRAC's vóór hun moleculaire identificatie47. Er zijn echter verschillende aanvullende manieren om de VRAC-activiteit indirect te volgen, waaronder de meting van de geleide substraten - halogenide-ionen of organische osmolyten - of het effect ervan op het celvolume48. In feite was de identificatie van LRRC8-eiwitten als VRAC gebaseerd op een test op basis van het afschrikken van een halogenidegevoelig fluorescerend eiwit49 door jodide dat de cel binnendringt via geactiveerde VRAC's 3,4. Een andere methode om de activiteit van het LRRC8/VRAC-kanaal te monitoren, maakt gebruik van de beweging van de cytosolische domeinen die, net als in andere ionenkanalen 50,51,52,53, kan worden waargenomen door veranderingen in FRET 45. Hiertoe werden fluorescerende eiwitten die dienen als FRET-paren, zoals cyaan-fluorescerend eiwit (CFP)/mCerulean3 als donor en geelfluorescerend eiwit (YFP)/mVenus als acceptor, gefuseerd met de C-termini van de LRRC8-eiwitten (Figuur 1). Intra-complexe FRET tussen LRRC8-subeenheden werd aangetoond door acceptor fotobleekexperimenten45. Door de destructieve fotobleekmethode te vermijden, werden FRET-veranderingen in de loop van de tijd gecontroleerd door gesensibiliseerde emissie FRET (SE-FRET), waarbij in feite de gesensibiliseerde emissie van de acceptor bij excitatie van de donor als gevolg van de overlap van het emissiespectrum van de donor met het excitatiespectrum van de acceptor wordt gemeten. Toepassing van extracellulaire hypotonie, een stimulus voor LRRC8/VRAC-activering, resulteerde in een omkeerbare vermindering van de SE-FRET-intensiteit45. Belangrijk is dat gelijktijdige patch-clampmetingen van de hele cel en FRET-monitoring tijdens hypotone behandeling aantoonden dat deze vermindering van FRET inderdaad een weerspiegeling was van LRRC8/VRAC-activering45. Deze methode, die vermijdt het plasmamembraan te verstoren of de intracellulaire omgeving te veranderen door middel van een pipetoplossing, biedt een alternatief voor het monitoren van LRRC8/VRAC-activiteit. Het is vooral nuttig in fysiologische omgevingen waar het behoud van het natieve cytosol cruciaal is, subcellulaire resolutie noodzakelijk is of langdurige observatie van kanaalactiviteit vereist is.

Hier presenteren we een protocol om LRRC8/VRAC te bestuderen met zo'n op FRET gebaseerde uitlezing. Het protocol geeft weer hoe cellen moeten worden behandeld en getransfecteerd, monster- en controlebeelden moeten worden verkregen, de gegevens moeten worden geanalyseerd en gesensibiliseerde emissie-FRET (SE-FRET)-waarden moeten worden berekend.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schema van het LRRC8 FRET-paarsysteem. mCerulean3 wordt weergegeven in cyaan en mVenus wordt weergegeven in geel. Na VRAC-opening verandert de afstand (en/of de ruimtelijke oriëntatie) tussen de fluoroforen, wat resulteert in een verminderde energieoverdracht tussen donor (Don) en acceptor (Acc) en, op zijn beurt, het verlagen van de waargenomen FRET. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van buffer en reagentia

  1. Bereid medium- en isotone, hypotone en hypertone buffers voor en meet de osmolariteit van de buffers met een osmometer om ervoor te zorgen dat de osmolariteit (Osm) binnen het verwachte bereik ligt met slechts een acceptabele afwijking.
    1. Celkweekmedia: Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine
    2. Isotone beeldvormingsbuffer (~340 mOsm): Bereid de isotone beeldvormingsbuffer voor door 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM D(+)-glucose en 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur (HEPES) te mengen.
    3. Hypotone beeldvormingsbuffer (~250 mOsm): Bereid de hypotone beeldvormingsbuffer voor door 105 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM D(+)-glucose en 10 mM HEPES te mengen.
    4. Hypertone beeldvormingsbuffer (~500 mOsm): Bereid de hypertone beeldvormingsbuffer voor door 160 mM D(-)-Mannitol, 150 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 10 mM D(+)-glucose en 10 mM HEPES te mengen.
      OPMERKING: Buffers kunnen worden aangevuld met specifieke medicijnen, afhankelijk van wat er zal worden onderzocht.

2. Groei van aanhangende cellen op schalen met glazen bodem

  1. Bereid ten minste één gerecht voor transfectie slechts voor met het eiwit van belang (POI) dat aan of de donor of de acceptor fluorofoor wordt gefuseerd en minstens één gerecht voor transfectie met het donor en het paar van de acceptor (Lijst 1 en Figuur 2). Gebruik schalen met glazen bodem om fluorescentiemicroscopie mogelijk te maken. Afhankelijk van het celtype kunt u het oppervlak voorbehandelen door het speciaal te reinigen of te coaten met polylysine.
    OPMERKING: Hier worden FRET-donor mCerulean3 (mCer)54 en FRET-acceptor mVenus (mVen)55 gebruikt als FRET-paar, maar andere combinaties van fluoroforen zijn ook van toepassing. Steekproeven die de POI uitdrukken die alleen aan de donor of acceptor is gefuseerd, worden gebruikt om de correctiefactoren te bepalen β en γ (tabel 1) die nodig zijn om te corrigeren voor het doorbloeden van de donor in het acceptorkanaal en kruisexcitatie van de acceptor door de golflengte van de donorexcitatie (Figuur 2Ac, Bf).
  2. Zaai de dag vóór de transfectie 1 x 105 HeLa-cellen in 2 ml celkweekmedia op schaaltjes van 35 mm met een glazen bodem die geschikt is voor fluorescentiemicroscopie. Kweek cellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2 -atmosfeer in een celkweekincubator.
    OPMERKING: De hoeveelheden reagentia kunnen worden aangepast aan het oppervlak van andere celkweekschaaltjes/kolven met een andere grootte. Het celaantal kan worden aangepast aan een dichtheid die geschikt is voor verschillende cellijnen en experimentele benaderingen.
    1. Zuig het celkweeksupernatans op uit de monolaag van aanhangende cellen die op T75-celkweekkolven zijn gekweekt met behulp van een vacuümpomp.
    2. Was de cellen door 10 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen aan de celkweekkolf en de oplossing daarna op te zuigen met een vacuümpomp.
    3. Bedek de cellen volledig met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA en incubeer de cellen gedurende 2 minuten bij 37 °C en 5% CO2 -atmosfeer in een celkweekincubator.
    4. Voeg 9 ml celkweekmedia toe en suspendeer de cellen door te pipetteren.
    5. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 700 x g bij kamertemperatuur (RT).
    6. Zuig het bovenstaande op met een vacuümpomp en resustrier de celpellet in 10 ml celkweekmedia.
    7. Meng gelijke hoeveelheden celsuspensie en 0,4% trypanblauw in een buisje en voeg 10 μl toe aan een telglaasje. Plaats de dia in de geautomatiseerde cellenteller en begin met tellen met behulp van het juiste programma voor het tellen van cellen.
    8. Om het volume celsuspensie te berekenen dat nodig is voor elk gerecht, deelt u het benodigde celaantal per gerecht (1 x 105) door het celaantal per milliliter dat uit de cellenteller wordt verkregen.
    9. Bereid een celsuspensie in een geschikte tube met het aantal cellen dat per gerecht nodig is, in de hoeveelheid die per gerecht nodig is (2 ml) plus de hoeveelheid voor één gerecht extra.
    10. Meng de celsuspensie ten minste 20 keer door de buis om te keren en pipetteer 2 ml van de celsuspensie in elk schaaltje.
    11. Om een gelijkmatigere celverdeling te garanderen, laat u de schaaltjes 30 minuten bij RT staan voordat u ze in de celkweekincubator plaatst.

3. De transfectie van de cel

OPMERKING: Hier werd FuGENE gebruikt als transfectiereasens. Andere transfectiereagentia en -methoden zijn ook van toepassing. De optimale verhoudingen van plasmide-DNA (pDNA) tot transfectiereagentia en de tijd voor optimale expressie voor elk POI en celmodel moeten empirisch worden beoordeeld. Hier werd 2 μg totaal pDNA per schotel van 35 mm gebruikt. FRET-donor en acceptor constructen werden gebruikt in een verhouding van 1:1, en de pDNA-to-transfectie reagensverhouding was 1:4 (Tabel 1).

  1. Vóór transfectie, vervang het supernatans van de celcultuur met verse 2 ml voorverwarmde media.
  2. Verdun pDNA in Opti-Minimal Essential Medium (MEM) met een eindvolume van 100 μL (=pDNA-oplossing).
  3. Verdun het transfectiereagens in Opti-MEM met een eindvolume van 100 μL (=reagensoplossing).
    OPMERKING: Voor een meer uniforme transfectie, bereid een hoofdmengsel voor de pDNA en reagensoplossing voor.
  4. Meng pDNA en reagensoplossing goed.
  5. Voeg de pDNA-oplossing toe aan de reagensoplossing (= transfectieoplossing).
  6. Meng de transfectieoplossing goed.
  7. Incubeer de transfectieoplossing 15 min bij RT.
  8. Voeg de transfectieoplossing druppelsgewijs in een spiraalvormige beweging toe aan de schaal.
  9. Meng door de schaal 5 keer horizontaal en verticaal op het oppervlak van de bank te bewegen.
  10. Kweek cellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2 -atmosfeer in een celkweekincubator.

  

ConditieConstructie (en)MonsterGebruikt voor
1LRRC8A-mCeruleanAlleen donor construerenBepaal de correctiefactor β
2LRRC8E-mVenusAlleen acceptorconstructieBepaal de correctiefactor γ
3LRRC8A-mCerulean en LRRC8E-mVenusFRET paarSE-FRET kwantificering

Tabel 1: Voorbeeld van voorwaarden die nodig zijn voor een typisch SE-FRET-experiment om de LRRC8/VRAC-activiteit te meten van een kanaal dat bestaat uit de LRRC8A-subeenheid die is gefuseerd met de donor (mCerulean3) en de LRRC8E-subeenheid die is gefuseerd met de acceptor (mVenus) fluorofoor.

4. Beeldacquisitie voor het bepalen van de correctiefactor

OPMERKING: Er is een doorbloeding van de donoremissie in de gedetecteerde emissie van de acceptor tijdens FRET. Bovendien is er kruisexcitatie van de acceptorfluorofoor door de golflengte van de donorexcitatie. Deze processen moeten worden gecompenseerd tijdens de berekening van de SE-FRET. Daartoe worden correctiefactoren bepaald in cellen die 24 uur na transfectie alleen de FRET-donor of -acceptor tot expressie brengen. Hier werd de beeldvorming uitgevoerd op een Leica THUNDER Imager uitgerust met een Leica LED8 lamp, de filter cube CYR71010, een HC PL APO 63x/1.40 OIL objectief, long pass filter voor 460/80 en 553/70 en een Leica DFC9000GTC camera. Experimenten werden uitgevoerd zonder omgevingscontrole, maar in aanwezigheid van HEPES in de beeldvormingsbuffers om de pH te stabiliseren. Voor langdurige observatie/metingen wordt geadviseerd om een milieucontrolesysteem te gebruiken. Voor analyse wordt SE-FRET berekend op basis van de vastgelegde onbewerkte beelden. Dit kan gelijktijdig tijdens de acquisitie of daarna. Hier werd de Leica LAS X-software met de SE-FRET-plug-in gebruikt om de experimentele procedure te vereenvoudigen met betrekking tot de berekening van de correctiefactoren en het visualiseren van de SE-FRET-waardeveranderingen in real-time tijdens het verkrijgen van beelden. Voor post-acquisitie kunnen correctiefactoren en SE-FRET worden bepaald met andere softwarepakketten (bijv. FIJI) na het verzamelen van ruwe gegevens volgens het onderstaande protocol.

  1. Alvorens beeldacquisitie van afzonderlijke getransfecteerde cellen om de correctiefactoren te berekenen, gebruikt u één steekproef die het FRET-paar tot uitdrukking brengt om de microscopie-instelling voor alle kanalen in te stellen (donorexcitatie/donoremissie DD, donor/acceptor DA en acceptor/acceptor AA; zie Tabel 1 en Figuur 2C en Figuur 3A).
    OPMERKING: Voor SE-FRET-metingen met mCerulean3- en mVenus-gelabelde VRAC-subeenheden getransfecteerd zoals hierboven beschreven, werden de volgende parameters gebruikt: 8x8 pixel binning, 100ms belichtingstijd en 10% LED-lampintensiteit.
  2. Neem het monster dat alleen het donorconstruct tot expressie brengt (figuur 2A), zuig de celkweekmedia op en was de cellen driemaal met 2 ml isotone buffer.
  3. Voeg 3 ml isotone buffer toe en plaats het monster op de microscooptafel.
  4. Zoek een gezichtsveld (FOV) met ten minste één cel die het donorconstruct tot expressie brengt.
  5. Beeld alle kanalen af (DD, DA en AA zie Tabel 2 en Figuur 2A).
  6. Teken een interessegebied (ROI) rond de cel/cellen en meet de gemiddelde intensiteit van DA (= IDA; Figuur 2Ac) en DD (= IDD; Figuur 2Aa).
  7. Teken voor achtergrondaftrekking een ROI in de DA- enDD-kanalen waar alleen het achtergrondsignaal wordt gevonden en meet de gemiddelde intensiteit (IBDA en I BDD).
  8. Trek de gemiddelde intensiteit van de ROI op de achtergrond af van de gemiddelde intensiteit gemeten in de cel-ROI van het corresponderende kanaal (figure-protocol-1 en figure-protocol-2).
  9. Herhaal de stappen 4.2-4.5 met het monster dat alleen de acceptorconstructie tot uitdrukking brengt (Figuur 2B).
  10. Teken een ROI rond de cel(len) en meet de gemiddelde intensiteit van DA (= IDA; Figuur 2Bf) en AA (= IAA; Figuur 2Be).
  11. Teken voor achtergrondaftrekking een ROI in de DA- en AA-kanalen waar alleen het achtergrondsignaal wordt gevonden en meet de gemiddelde intensiteiten (IBDA en IBAA).
  12. Trek de gemiddelde intensiteit van de ROI op de achtergrond af van de gemiddelde intensiteit gemeten in de cel-ROI van het corresponderende kanaal (figure-protocol-3 en figure-protocol-4).
  13. Gebruik de waarden die zijn bepaald voor IDA*, IDD* en IAA* om de correctiefactoren figure-protocol-5 en figure-protocol-6,
    Waarbij de correctiefactor β wordt gebruikt om de doorbloeding van de donoremissie in het DA-kanaal te compenseren. De correctiefactor γ wordt gebruikt om de kruisexcitatie van de acceptorfluorofoor door de donorexcitatiegolflengte in het DA-kanaal te compenseren.
Excitatie vanEmissie vanNaam van het kanaalLED-lijnFilter kubusFilter met lange doorlaat
GeverGeverDD440 nmCYR71010460/80 nm
GeverAcceptantDA440 nmCYR71010535/70 NM
AcceptantAcceptantAA510 nmCYR71010535/70 NM

Tabel 2: Overzicht van de kanalen die nodig zijn voor SE-FRET-experimenten.

figure-protocol-7
Figuur 2: Representatieve fluorescentiebeelden van monsters die zijn gebruikt om de correctiefactoren te berekenen β en γ die nodig zijn om de VRAC-activiteit te bepalen van een kanaal dat bestaat uit de LRRC8A-subeenheid die is gefuseerd met de donor mCerulean3 (mCer) en de LRRC8E-subeenheid die is gefuseerd met de acceptor mVenus (mVen) fluorofoor door SE-FRET-metingen. (een, b) Detectie van het donor/donor DD-, acceptor/acceptor AA- en donor/acceptor DA-kanaal in HeLa-cellen die alleen de donor (A) LRRC8A-mCer of de acceptor (B) LRRC8E-mVen tot expressie brengen. (C) Detectie van DD-, AA- en DA-kanalen in HeLa-cellen die samen met het donor- en acceptorpaar LRRC8A-mCer en LRRC8E-mVen zijn getransfecteerd. Panelen a-i tonen beelden die zijn gemaakt in het donordetectiekanaal (excitatie van de donor en detectie van het donorsignaal; DD; a, d en g), het detectiekanaal van de acceptor (excitatie van de acceptor en detectie van het acceptorsignaal; AA; b, e en h ) en het FRET-signaaldetectiekanaal (excitatie van de donor en detectie van het acceptorsignaal; DA; c, f en i). Paneel j is de overlay van de panelen g en h. Het DD-kanaal wordt weergegeven in groen en het AA-kanaal in magenta. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

5. Time-lapse-beeldvorming voor SE-FRET-kwantificering

  1. Neem het monster dat de donor en de acceptor tot expressie brengt (Tabel 1, Figuur 2C en Figuur 3A), aspireer de media van de celcultuur op, en was de cellen driemaal met 2 ml isotone buffer 24 h na transfectie.
  2. Voeg 3 ml isotone buffer toe en plaats het monster op de microscopiefase.
  3. Voor latere afzuiging van de isotone buffer fixeert u een slangcanule en stelt u deze af zodat de canulepunt de bodem van de schaal bereikt.
  4. Voor het toevoegen van buffers, fixeert en past u de slangen aan zodat de buffer die wordt aangedreven door de zwaartekracht in de schaal kan vallen.
    OPMERKING: Hier werd een klepgestuurd zwaartekrachtperfusiesysteem met vier magnetische kleppen gebruikt om de bufferstroom te regelen, maar er zijn ook andere methoden van toepassing.
  5. Zoek een FOV met ten minste één cel die het donor- en acceptorconstruct tegelijkertijd tot expressie brengt.
  6. Zet een time-lapse-experiment op voor de kanalen DD, DA en AA met een interval van 10 s en een duur om alle omstandigheden van de stimulatiesequentie te dekken, bijv. 12 basiscycli gevolgd door 15 cycli per conditie (Figuur 3).
    OPMERKING: Het interval en het aantal cycli kunnen worden aangenomen op basis van de experimentele behoeften, maar moeten altijd een basismeting bevatten voor normalisatie voor een betere visualisatie en vergelijking van de gegevens.
  7. Was het monster na de nulmeting in de buffer voor de eerste voorwaarde.
    1. Zuig de isotone buffer op via de slangcanule en vacuüm met een spuit.
    2. Voeg 3 ml van de buffer van de volgende toestand toe door zwaartekracht.
    3. Zuig de buffer op en voeg opnieuw 3 ml van dezelfde buffer toe.
    4. Herhaal stap 5.7.3 nog een keer.
  8. Was na het meten van de eerste voorwaarde het monster in de buffer voor de volgende toestand (stappen 5.7.1-5.7.4).
  9. Herhaal stap 5.5-5.8 totdat alle voorwaarden zijn vastgelegd.
  10. Teken voor SE-FRET-kwantificering een ROI rond de cel(s) en meet de gemiddelde intensiteit in het DD = (IDD), DA (IDA) en AA (IAA) kanaal voor alle afbeeldingen (tijdstippen) in de tijdreeks (Figuur 3A, B).
  11. Voor achtergrondaftrekking voor het FRET-signaal, tekent u een ROI in het DA-kanaal waar alleen het achtergrondsignaal wordt gevonden en meet u de gemiddelde intensiteit (IBDA).
  12. Trek de gemiddelde intensiteit van de achtergrond-ROI af van de gemiddelde intensiteit gemeten in de cel-ROI van het DA-kanaal (figure-protocol-8).
  13. Gebruik de bepaalde waarden om de gemiddelde SE-FRET-waarden voor elke ROI en alle tijdstippen figure-protocol-9te berekenen.
  14. Voor een betere vergelijkbaarheid van verschillende omstandigheden en visualisatie van de SE-FRET-waarden, gebruikt u het gemiddelde van de basislijnwaarden van elke ROI om alle tijdstippen van de bijbehorende ROI te normaliseren.
  15. Zet de genormaliseerde SE-FRET-waarden in de tijd uit (Figuur 3B).

figure-protocol-10
Figuur 3: Representatieve fluorescentiebeelden en SE-FRET-kwantificering. (A) Representatieve fluorescentiebeelden en de schijnbare SE-FRET van het eerste tijdstip van een timelaps-experiment om de VRAC-activiteit door SE-FRET te meten van een kanaal dat bestaat uit LRRC8A- en LRRC8E-subeenheden, afhankelijk van de toniciteit. Schaalbalk = 10 μm. Dezelfde cellen worden weergegeven in figuur 2C. Panelen a-i tonen de detectie van de DD-, AA- en DA-kanalen en de berekende schijnbare SE-FRET. Witte contouren geven de ROI's weer (cellen i-iii in paneel d) die worden gebruikt om de gemiddelde signaalintensiteiten in DD, AA en DA en het schijnbare SE-FRET-beeld te meten. (B) Kwantificering van de SE-FRET-waarden in de tijd. De opeenvolging van omstandigheden was 12 cycli van isotone beeldvormingsbuffer (baseline) gevolgd door 15 cycli van hypotone en 15 cycli van hypertone beeldvormingsbuffer. De ruwe gemiddelde SE-FRET-waarde van elke ROI (cellen i-iii) en tijdstip werd genormaliseerd naar het gemiddelde van de basislijn (isotone) waarde voor de overeenkomstige ROI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Met deze op FRET gebaseerde methode kan de LRRC8/VRAC-activiteit worden gevolgd tijdens osmotische stimulatie, en de vermindering van SE-FRET correleert met de mate van extracellulaire hypotonie45. Representatieve resultaten voor door hypotoniciteit geïnduceerde kanaalactivering worden hier ook getoond (Figuur 3 en Figuur 4). Bovendien kan LRRC8/VRAC-activering door verschillende isosmotische stimuli, zoals manipulatie van diacylglycerolsignalering45 of tijdens myocytenactivering56, worden waargenomen.

figure-results-1
Figuur 4: SE-FRET-sporen. (A) Schijnbare SE-FRET-sporen van 5 onafhankelijke experimenten. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van N = 2 tot N = 7 cellen per gezichtsveld (FOV). (B) Gemiddelde ± SD van alle cellen (N = 31 cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aangezien LRRC8/VRAC-kanalen ook betrokken zijn bij de afname van het apoptotische volume24,57, zou het observeren van kanaalactiviteit bij inductie van apoptose een andere toepassing zijn voor de hier beschreven methode. Dienovereenkomstig werd het protocol voor het monitoren van SE-FRET in HeLa-cellen die LRRC8A-mCerulean3 en LRRC8E-mVenus tot expressie brengen, uitgevoerd tijdens het toepassen van door de doodsreceptor gemedieerde apoptose-inducerende geneesmiddelen. Van tumornecrosefactor (TNF)-α en cycloheximide (CHX) werd eerder aangetoond dat ze binnen enkele minuten VRAC-stromen opriepen58. Na de toevoeging van 2 ng/ml TNF-α en 1 μg/ml CHX in isotone buffer was er een robuuste afname van SE-FRET (Figuur 5). Door de buffer te vervangen door een hypertoon medium, ook al bevatte het TNF-α en CHX, herstelden de SE-FRET-waarden zich dicht bij de uitgangswaarde (Figuur 5A), wat overeenkomt met afnemende VRAC-stromen in hypertone badoplossing tijdens behandeling met apoptose-inducerend Fas-ligand58. Behandeling van de cellen met DMSO, het oplosmiddel voor TNF-α en CHX, resulteerde niet in SE-FRET-reductie. TNF-α + CHX hadden geen invloed op SE-FRET van CFP-18aa-YFP, een EYFP- en ECFP-tandemconstructie als FRET-controle59, wat de specificiteit voor LRRC8/VRAC aantoont (Figuur 5B).

figure-results-2
Figuur 5: Isosmotische VRAC-activering door doodreceptor-gemedieerde apoptose. (A) Genormaliseerde SE-FRET-waarden van LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen-expressie van HeLa-cellen (n = 8 schaaltjes, 23 cellen) in de loop van de tijd. Na 15 cycli in isotone beeldvormingsbuffer (baseline) werd de badoplossing vervangen door isotone buffer aangevuld met 2 ng/ml TNF-α en 1 μg/ml cycloheximide (CHX) gedurende 30 cycli, gevolgd door 20 cycli hypertone beeldvormingsbuffer met TNF-α en CHX. De ruwe gemiddelde SE-FRET-waarde van elke ROI en elk tijdstip werd genormaliseerd naar het gemiddelde van de basislijn (isotone) waarde voor de respectieve ROI. (B) Kwantificering van genormaliseerde SE-FRET-waarden van HeLa-cellen die LRRC8A/E tot expressie brengen zoals in A met isotone oplossing die DMSO bevat als mediumcontrole voor CHX (n = 5 schaaltjes, 12 cellen) of isotone buffer met apoptose-inductoren zoals in A (n = 8 schaaltjes, 23 cellen), of van HeLa-cellen die CFP-18aa-YFP tot expressie brengen met apoptose-inductoren (n = 3 schaaltjes, 9 cellen). Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van de laatste 10 tijdstippen in de respectieve buffer van individuele cellen (symbolen) en het gemiddelde van alle cellen ± SD; ** p < 0,01 gewone eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijking post-hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

FRET-microscopie is een gevestigde, veelgebruikte techniek om de interactie tussen eiwitten te bestuderen. Daarom kunnen op FRET gebaseerde methoden worden toegepast in veel laboratoria met variabele expertise. Conformationele herschikkingen tijdens gating zijn gemonitord voor een breed scala aan ionenkanalen met behulp van FRET-gebaseerde assays (zie voor voorbeelden de referenties 34,50,51,52,53,60,61,62,63,64,65,66,67), in sommige gevallen gecombineerd met elektrofysiologie in patch-clamp fluorometrie 68,69,70,71. FRET kan worden gebruikt om de structuur-functierelaties van deze ionenkanalen te bestuderen of om hun activiteit onafhankelijk van ionentransport te volgen. De hier gepresenteerde methode kan duidelijke voordelen hebben ten opzichte van elektrofysiologie, omdat het de activiteit van LRRC8/VRAC-kanalen in situ mogelijk maakt.

Kritieke stappen in het protocol omvatten het plateren van de cellen om een optimale samenvloeiing voor transfectie en beeldvorming te bereiken, wat idealiter een gemakkelijke celscheiding voor latere analyse vergemakkelijkt. Effectieve co-transfectie van de verschillende subeenheden is cruciaal voor een correcte subcellulaire lokalisatie; een overmaat van de niet-LRRC8A-subeenheid zal bijvoorbeeld leiden tot verbeterde lokalisatie van het endoplasmatisch reticulum (ER)4. Daarom moeten de plasmideverhoudingen mogelijk worden aangepast. Afhankelijk van het systeem moeten nieuw gegenereerde FRET-paren worden geverifieerd, bijvoorbeeld door acceptorbleking. Binning en belichtingstijd moeten tegen elkaar worden afgewogen om een optimale temporele en ruimtelijke resolutie voor de onderzoeksvraag mogelijk te maken. Binning maakt kortere belichtingstijden mogelijk en vermindert zo de mogelijke bleking van de FRET-sensor, terwijl de ruimtelijke resolutie wordt verlaagd. Daarom, als de experimentele opstelling bijvoorbeeld subcellulaire discriminatie van LRRC8/VRAC-activiteit vereist, moet binning worden vermeden. De onderzoeksvraag bepaalt ook het aantal en het interval van cycli in een time-lapse-reeks. Het interval is alleen relevant als de kinetiek van de FRET-veranderingen (en dus LRRC8/VRAC-activering/inactivering) vereist is; Anders kunnen ook eenvoudige "voor-en-na"-opnames worden uitgevoerd. De duur van het experiment is afhankelijk van het fysiologische proces. Idealiter zou de LRRC8/VRAC-activiteit op stimuli moeten worden gecontroleerd totdat SE-FRET is gestabiliseerd. Deze factoren kunnen worden bepaald in pilotexperimenten. Correctiefactoren om het echte SE-FRET-signaal te berekenen, moeten voor alle omstandigheden worden bepaald. Onjuist bepaalde correctiefactoren kunnen leiden tot een over- of onderschatting van de SE-FRET-intensiteiten. Ten slotte moet het tijdsinterval tussen de beelden, na het vaststellen van een stabiele basislijn, kort genoeg zijn om het fysiologische proces van belang vast te leggen.

De methode heeft enkele beperkingen. Een daarvan is dat veranderingen in inter-LRRC8 FRET-intensiteiten, hoewel ze de bewegingen van de LRRD's weerspiegelen, niet noodzakelijkerwijs overeenkomen met ionen- of osmolytentransport door de porie. Dit blijkt duidelijk uit de FRET-veranderingen die zijn waargenomen met LRRC8A-homomeren45 ondanks hun minimale stromen 4,32,72. Porieblokkers van LRRC8/VRAC-kanalen hebben mogelijk geen invloed op het FRET-signaal, waardoor deze methode ongeschikt is voor het zoeken naar specifieke kanaalmodulatoren. Bovendien kunnen de expressieniveaus van de overexpressie van LRRC8-eiwitten de fysiologische processen die worden waargenomen beïnvloeden, vooral omdat de C-terminaal gelabelde LRRC8-eiwitten basale activiteit vertonen14.

Een aspect dat afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag als een beperking of een voordeel kan worden beschouwd, is dat bij deze methode alleen de ectopisch tot expressie gebrachte LRRC8-subeenheden selectief worden gemeten. Achtergrondniveaus van endogene eiwitten interfereren dus nauwelijks met de metingen. Aan de andere kant gedragen de eiwitten met overexpressie zich mogelijk niet als de endogene LRRC8-kanalen met mogelijk verschillende subeenheidsamenstelling en stoichiometrie. Verschillende stimuli, zoals oxidatie, kunnen bijvoorbeeld tegengestelde modulerende effecten hebben op verschillend samengestelde LRRC8-kanalen36. Door de verhoudingen tussen subeenheden met co-expressie te veranderen, kunnen hun stoichiometrie en algehele ionengeleiding worden aangepast14,73, maar hun oorspronkelijke samenstelling, met waarschijnlijk vaak meer dan twee paralogen binnen één complex21, is niet duidelijk en kan variëren tussen celtypen 74,75,76. Bovendien bleek de fusie van fluorescerende eiwitten met de cytosolische C-termini van LRRC8-eiwitten de basale LRRC8/VRAC-kanaalactiviteit in Xenopus-eicellen 14 te verhogen, waarschijnlijk omdat de grote tags de conformatie van de LRRD's moduleren, die de kanaalopening kunnen bepalen 14,44,45. Daarom kunnen de grootte van de fluorescerende eiwitten, de linker en hun oriëntatie niet alleen de FRET-efficiëntie beïnvloeden, maar ook de kanaalactiviteit. Belangrijk is echter dat VRAC-kanalen van LRRC8-eiwitten gefuseerd met fluorescerende eiwitten bleven reageren op hypotone stimulatie14, waardoor ze konden worden gebruikt als FRET-sensoren45.

Voordelen van deze niet-invasieve methode om de activiteit van het LRRC8/VRAC-kanaal te monitoren door middel van lichtmicroscopie in vergelijking met andere methoden zijn: (i) Het maakt het mogelijk om LRRC8/VRAC te observeren in cellen of compartimenten die doorgaans ontoegankelijk zijn voor elektrofysiologie. Dit omvat intracellulaire organellen waarop LRRC8-complexen kunnen worden gevonden of gericht op 45,77,78. (ii) De cytosolische samenstelling blijft ongewijzigd door de methode, terwijl tijdens patch-clamp-metingen van de hele cel het cytosol grotendeels wordt vervangen door pipetoplossing, wat de signaalroutes kan beïnvloeden zoals waargenomen bij phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA)-geïnduceerde LRRC8/VRAC-activering45. (iii) Het biedt de mogelijkheid om LRRC8/VRAC-activering met subcellulaire resolutie te observeren, zoals het onderscheiden van activiteit aan de voor- en achterrand tijdens celmigratie, waarbij -beperkt tot besloten ruimtes- VRAC betrokken is 79,80. (iv) Het maakt continue monitoring van LRRC8/VRAC-activiteit mogelijk tijdens uitgebreide fysiologische processen zoals myocytendifferentiatie56.

Hoewel er beperkingen en uitdagingen zijn met deze methode, is het veelbelovend voor verder onderzoek, inclusief mogelijke toepassingen in diermodellen. In combinatie met andere methoden om deze ionen- en osmolytkanaalfamilie te bestuderen, kan deze op FRET gebaseerde test aanzienlijk bijdragen aan het ontrafelen van activeringsmechanismen en het onderzoeken van de diverse fysiologische functies van LRRC8-kanalen in hun oorspronkelijke omgeving.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken C.F. Kaminski voor de vriendelijke gift van het plasmide dat codeert voor de CFP-18aa-YFP-constructie, A. Klemmer voor technische assistentie, en alle huidige en voormalige leden van het Stauber-laboratorium die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze methode.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin-EDTAgibco25300-054
Camera DFC9000GTCLeica11547007
CFP-18aa-YFPN/AN/AElder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Gift van C.F. Kaminski (University of Cambridge, UK)
Cycloheximide (CHX)Sigma-Aldrich66-81-9
D(-)-MannitolCarl Roth4175.1
D(+)-GlucoseCarl RothHN06.1
DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)PAN-BiotechP04-03590
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)PAN-BiotechP04-36500
Emission filter wheel (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)Leica11525480
FBS (Fetal Bovine Serum)PAN-BiotechP30-3302
Filter cube CYR71010Leica11525416
FuGENEPromegaE2691
Glas Bottom Culture Dishes 35 mmMatTekP35G-0-10-C
HeLa cellsLeibniz Forschungsinstitut DSMZACC 57Mammalian cervix carcinoma/ verkregen van Leibniz Forschungsinstitut DSMZ
HEPESCarl Roth9105.4
ibidi µ-Disch 35 mmibidi81156
KCl (Potassium chloride)Carl Roth6781.1
LAS X FRET WizardLeica11640862
Light source LED8Leica11504256
LRRC8A-mCerulean3N/AN/AKönig et al. 2019
LRRC8E-mVenusN/AN/AKönig et al. 2019
Luna-II Automated Cell Counterlogos biosystemsL40002
Luna-II Cell Counter Slideslogos biosystemsL12001
MgCl2 (Magnesium chloride)Carl RothKK36.1
Microscope THUNDER Imager live cellLeica11525681
NaCl (Sodium chloride)Carl Roth9263
Objective HC PL APO 63x/1.40 OILLeica11506349
Opti-Minimal Essential Medium (MEM)gibco11058
Osmometer OM807VogelV04807
Penicillin Streptomycin (Pen Step)gibco15070-063
Trypan blue solution (0,4%)SigmaT8154
Tumor necrosis factor (TNF)-aSigma-Aldrich94948-59-1
Valve Controlled Gravity Perfusion SystemALA Scientific InstrumentsVC3-4xG

Referenties

  1. Jentsch, T. J. VRACs and other ion channels and transporters in the regulation of cell volume and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 293-307 (2016).
  2. Chen, L., et al. More than just a pressure relief valve: physiological roles of volume-regulated LRRC8 anion channels. Biol Chem. 400 (11), 1481-1496 (2019).
  3. Qiu, Z., et al. SWELL1, a plasma membrane protein, is an essential component of volume-regulated anion channel. Cell. 157 (2), 447-458 (2014).
  4. Voss, F. K., et al. Identification of LRRC8 heteromers as an essential component of the volume-regulated anion channel VRAC. Science. 344 (6184), 634-638 (2014).
  5. Hoffmann, E. K., Schettino, T., Marshall, W. S. The role of volume-sensitive ion transport systems in regulation of epithelial transport. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (1), 29-43 (2007).
  6. López-Cayuqueo, K. I., et al. Renal deletion of LRRC8/VRAC channels induces proximal tubulopathy. J Am Soc Nephrol. 33 (8), 1528-1545 (2022).
  7. Lück, J. C., Puchkov, D., Ullrich, F., Jentsch, T. J. LRRC8/VRAC anion channels are required for late stages of spermatid development in mice. J Biol Chem. 293 (30), 11796-11808 (2018).
  8. Chen, L., Becker, T. M., Koch, U., Stauber, T. The LRRC8/VRAC anion channel facilitates myogenic differentiation of murine myoblasts by promoting membrane hyperpolarization. J Biol Chem. 294 (39), 14279-14288 (2019).
  9. Best, L., Brown, P. D., Sener, A., Malaisse, W. J. Electrical activity in pancreatic islet cells: The VRAC hypothesis. Islets. 2 (2), 59-64 (2010).
  10. Kang, C., et al. SWELL1 is a glucose sensor regulating beta-cell excitability and systemic glycaemia. Nat Commun. 9 (1), 367(2018).
  11. Stuhlmann, T., Planells-Cases, R., Jentsch, T. J. LRRC8/VRAC anion channels enhance beta-cell glucose sensing and insulin secretion. Nat Commun. 9 (1), 1974(2018).
  12. Hisadome, K., et al. Volume-regulated anion channels serve as an auto/paracrine nucleotide release pathway in aortic endothelial cells. J Gen Physiol. 119 (6), 511-520 (2002).
  13. Burow, P., Klapperstück, M., Markwardt, F. Activation of ATP secretion via volume-regulated anion channels by sphingosine-1-phosphate in RAW macrophages. Pflügers Arch. 467 (6), 1215-1226 (2015).
  14. Gaitán-Peñas, H., et al. Investigation of LRRC8-mediated volume-regulated anion currents in Xenopus oocytes. Biophys J. 111 (7), 1429-1443 (2016).
  15. Lahey, L. J., et al. LRRC8A:C/E heteromeric channels are ubiquitous transporters of cGAMP. Mol Cell. 80 (4), 578-591 (2020).
  16. Chen, X., et al. Regulation of anion channel LRRC8 volume-regulated anion channels in transport of 2'3'-cyclic GMP-AMP and cisplatin under steady state and inflammation. J Immunol. 206 (9), 2061-2074 (2021).
  17. Zhou, C., et al. Transfer of cGAMP into bystander cells via LRRC8 volume-regulated anion channels augments STING-mediated interferon responses and anti-viral immunity. Immunity. 52 (5), 767-781 (2020).
  18. Feustel, P. J., Jin, Y., Kimelberg, H. K. Volume-regulated anion channels are the predominant contributors to release of excitatory amino acids in the ischemic cortical penumbra. Stroke. 35 (5), 1164-1168 (2004).
  19. Mongin, A. A. Volume-regulated anion channel--a frenemy within the brain. Pflügers Arch. 468 (3), 421-441 (2016).
  20. Schober, A. L., Wilson, C. S., Mongin, A. A. Molecular composition and heterogeneity of the LRRC8-containing swelling-activated osmolyte channels in primary rat astrocytes. J Physiol. 595 (22), 6939-6951 (2017).
  21. Lutter, D., Ullrich, F., Lueck, J. C., Kempa, S., Jentsch, T. J. Selective transport of neurotransmitters and modulators by distinct volume-regulated LRRC8 anion channels. J Cell Sci. 130 (6), 1122-1133 (2017).
  22. Yang, J., et al. Glutamate-releasing SWELL1 channel in astrocytes modulates synaptic transmission and promotes brain damage in stroke. Neuron. 102 (4), 813-827 (2019).
  23. Lee, C. C., Freinkman, E., Sabatini, D. M., Ploegh, H. L. The protein synthesis inhibitor blasticidin s enters mammalian cells via leucine-rich repeat-containing protein 8D. J Biol Chem. 289 (24), 17124-17131 (2014).
  24. Planells-Cases, R., et al. Subunit composition of VRAC channels determines substrate specificity and cellular resistance to Pt-based anticancer drugs. EMBO J. 34 (24), 2993-3008 (2015).
  25. Model, M. A., Nia, F. H., Zook, E., Hollembeak, J. E., Stauber, T. Uptake of fluorescein upon osmotic cell swelling is dependent on the volume-regulated anion channel VRAC/LRRC8. Paracelsus Proc Exp Med. 1 (1), 3-14 (2022).
  26. Stauber, T. The volume-regulated anion channel is formed by LRRC8 heteromers - molecular identification and roles in membrane transport and physiology. Biol Chem. 396 (9-10), 975-990 (2015).
  27. Bertelli, S., et al. Mechanisms of activation of LRRC8 volume regulated anion channels. Cell Physiol Biochem. 55 (S1), 41-56 (2021).
  28. Liu, T., Li, Y., Wang, D., Stauber, T., Zhao, J. Trends in volume-regulated anion channel (VRAC) research: visualization and bibliometric analysis from 2014 to 2022. Front Pharmacol. 14, 1234885(2023).
  29. Strange, K., Yamada, T., Denton, J. S. A 30-year journey from volume-regulated anion currents to molecular structure of the LRRC8 channel. J Gen Physiol. 151 (2), 100-117 (2019).
  30. Osei-Owusu, J., Yang, J., Vitery, M. D. C., Qiu, Z. Molecular biology and physiology of volume-regulated anion channel (VRAC). Curr Top Membr. 81, 177-203 (2018).
  31. Friard, J., Laurain, A., Rubera, I., Duranton, C. LRRC8/VRAC channels and the redox balance: A complex Relationship. Cell Physiol Biochem. 55 (S1), 106-118 (2021).
  32. Syeda, R., et al. LRRC8 proteins form volume-regulated anion channels that sense ionic strength. Cell. 164 (3), 499-511 (2016).
  33. Ullrich, F., Reincke, S. M., Voss, F. K., Stauber, T., Jentsch, T. J. Inactivation and anion selectivity of volume-regulated anion channels (VRACs) depend on C-terminal residues of the first extracellular loop. J Biol Chem. 291 (33), 17040-17048 (2016).
  34. König, B., Stauber, T. Biophysics and structure-function relationships of LRRC8-formed volume-regulated anion channels. Biophys J. 116 (7), 1185-1193 (2019).
  35. Concepcion, A. R., et al. The volume-regulated anion channel LRRC8C suppresses T cell function by regulating cyclic dinucleotide transport and STING-p53 signaling. Nat Immunol. 23 (2), 287-302 (2022).
  36. Gradogna, A., Gavazzo, P., Boccaccio, A., Pusch, M. Subunit-dependent oxidative stress sensitivity of LRRC8 volume-regulated anion channels. J Physiol. 595 (21), 6719-6733 (2017).
  37. Bertelli, S., Zuccolini, P., Gavazzo, P., Pusch, M. Molecular determinants underlying volume-regulated anion channel subunit-dependent oxidation sensitivity. J Physiol. 600 (17), 3965-3982 (2022).
  38. Deneka, D., Sawicka, M., Lam, A. K. M., Paulino, C., Dutzler, R. Structure of a volume-regulated anion channel of the LRRC8 family. Nature. 558 (7709), 254-259 (2018).
  39. Kasuya, G., et al. Cryo-EM structures of the human volume-regulated anion channel LRRC8. Nat Struct Mol Biol. 25 (9), 797-804 (2018).
  40. Kefauver, J. M., et al. Structure of the human volume regulated anion channel. Elife. 7, e38461(2018).
  41. Takahashi, H., Yamada, T., Denton, J. S., Strange, K., Karakas, E. Cryo-EM structures of an LRRC8 chimera with native functional properties reveal heptameric assembly. Elife. 12, e82431(2023).
  42. Sawicka, M., Dutzler, R. Regulators of cell volume: The structural and functional properties of anion channels of the LRRC8 family. Curr Opin Struct Biol. 74, 102382(2022).
  43. Kasuya, G., Nureki, O. Recent advances in the structural biology of the volume-regulated anion channel LRRC8. Front Pharmacol. 13, 896532(2022).
  44. Deneka, D., et al. Allosteric modulation of LRRC8 channels by targeting their cytoplasmic domains. Nat Commun. 12 (1), 5435(2021).
  45. König, B., Hao, Y., Schwartz, S., Plested, A. J., Stauber, T. A FRET sensor of C-terminal movement reveals VRAC activation by plasma membrane DAG signaling rather than ionic strength. Elife. 8, e45421(2019).
  46. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. 3rd edn. , Sinauer. Sunderland, Massachusetts. (2001).
  47. Pedersen, S. F., Okada, Y., Nilius, B. Biophysics and physiology of the volume-regulated anion channel (VRAC)/volume-sensitive outwardly rectifying anion channel (VSOR). Pflügers Arch. 468 (3), 371-383 (2016).
  48. Kolobkova, Y., Pervaiz, S., Stauber, T. The expanding toolbox to study the LRRC8-formed volume-regulated anion channel VRAC. Curr Top Membr. 88, 119-163 (2021).
  49. Galietta, L. J., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Lett. 499 (3), 220-224 (2001).
  50. Bykova, E. A., Zhang, X. D., Chen, T. Y., Zheng, J. Large movement in the C terminus of CLC-0 chloride channel during slow gating. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1115-1119 (2006).
  51. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  52. Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5217-5222 (2013).
  53. Zachariassen, L. G., et al. Structural rearrangement of the intracellular domains during AMPA receptor activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (27), E3950-E3959 (2016).
  54. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), e17896(2011).
  55. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20 (1), 87-90 (2002).
  56. Chen, L., König, B., Stauber, T. LRRC8 channel activation and reduction in cytosolic chloride concentration during early differentiation of C2C12 myoblasts. Biochem Biophys Res Commun. 532, 482-488 (2020).
  57. Maeno, E., Ishizaki, Y., Kanaseki, T., Hazama, A., Okada, Y. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9487-9492 (2000).
  58. Shimizu, T., Numata, T., Okada, Y. A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume-sensitive Cl- channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (17), 6770-6773 (2004).
  59. Elder, A. D., et al. A quantitative protocol for dynamic measurements of protein interactions by Förster resonance energy transfer-sensitized fluorescence emission. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl 1 S59-S81 (2009).
  60. Glauner, K. S., Mannuzzu, L. M., Gandhi, C. S., Isacoff, E. Y. Spectroscopic mapping of voltage sensor movement in the Shaker potassium channel. Nature. 402 (6763), 813-817 (1999).
  61. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 686-694 (2019).
  62. Renart, M. L., et al. Conformational plasticity in the KcsA potassium channel pore helix revealed by homo-FRET studies. Sci Rep. 9 (1), 6215(2019).
  63. Wang, S., et al. Potassium channel selectivity filter dynamics revealed by single-molecule FRET. Nat Chem Biol. 15 (4), 377-383 (2019).
  64. Harley, C. A., et al. Conformation-sensitive antibody reveals an altered cytosolic PAS/CNBh assembly during hERG channel gating. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (44), e2108796118(2021).
  65. Han, S., et al. Structural dynamics determine voltage and pH gating in human voltage-gated proton channel. Elife. 11, e73093(2022).
  66. Cullinan, M. M., Klipp, R. C., Camenisch, A., Bankston, J. R. Dynamic landscape of the intracellular termini of acid-sensing ion channel 1a. Elife. 12, e90755(2023).
  67. Kim, J., Won, J., Chung, D. K., Lee, H. H. FRET analysis of the temperature-induced structural changes in human TRPV3. Sci Rep. 13 (1), 10108(2023).
  68. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Sci STKE. (176), PL7(2003).
  69. Kusch, J., Zifarelli, G. Patch-clamp fluorometry: electrophysiology meets fluorescence. Biophys J. 106 (6), 1250-1257 (2014).
  70. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. J Gen Physiol. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  71. Bhat, S., Blunck, R. Characterising ion channel structure and dynamics using fluorescence spectroscopy techniques. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1427-1445 (2022).
  72. Yamada, T., Figueroa, E. E., Denton, J. S., Strange, K. LRRC8A homohexameric channels poorly recapitulate VRAC regulation and pharmacology. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (3), C293-C303 (2021).
  73. Yamada, T., Wondergem, R., Morrison, R., Yin, V. P., Strange, K. Leucine-rich repeat containing protein LRRC8A is essential for swelling-activated Cl- currents and embryonic development in zebrafish. Physiol Rep. 4 (19), e12940(2016).
  74. Pervaiz, S., Kopp, A., von Kleist, L., Stauber, T. Absolute protein amounts and relative abundance of volume-regulated anion channel (VRAC) LRRC8 subunits in cells and tissues revealed by quantitative immunoblotting. Int J Mol Sci. 20 (23), 5879(2019).
  75. Kern, D. M., et al. Structural basis for assembly and lipid-mediated gating of LRRC8A:C volume-regulated anion channels. Nat Struct Mol Biol. 30 (6), 841-852 (2023).
  76. Rutz, S., Deneka, D., Dittmann, A., Sawicka, M., Dutzler, R. Structure of a volume-regulated heteromeric LRRC8A/C channel. Nat Struct Mol Biol. 30 (1), 52-61 (2023).
  77. Li, P., et al. LRRC8 family proteins within lysosomes regulate cellular osmoregulation and enhance cell survival to multiple physiological stresses. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (46), 29155-29165 (2020).
  78. Kashyap, P., et al. An optogenetic method for the controlled release of single molecules. Nat Methods. 21 (4), 666-672 (2024).
  79. Liu, T., Stauber, T. The volume-regulated anion channel LRRC8/VRAC is dispensable for cell proliferation and migration. Int J Mol Sci. 20 (11), e2663(2019).
  80. Zhang, Y., et al. Polarized NHE1 and SWELL1 regulate migration direction, efficiency and metastasis. Nat Commun. 13 (1), 6128(2022).

Herprints en machtigingen

Tags

LRRC8 kanalenvolumegereguleerd anionkanaalosmotische stimulatieionentransportHeLa cellenkanaalactivatiehypotone buffertime lapse imagingapoptose inductie
Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.