Methodenartikel

Optimalisatie van traanverzameling bij muizen voor mRNA- en eiwitanalyse

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

19 juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

In dit artikel

Samenvatting

De identificatie van RNA- en eiwitbiomarkers uit tranen in muismodellen is veelbelovend voor vroege diagnostiek bij verschillende ziekten. Dit manuscript biedt een uitgebreid protocol voor het optimaliseren van de werkzaamheid en efficiëntie van mRNA- en eiwitisolatie uit muizentranen.

Samenvatting

De traanfilm is een zeer dynamische biovloeistof die in staat is om pathologie-geassocieerde moleculaire veranderingen te weerspiegelen, niet alleen in het oogoppervlak, maar ook in andere weefsels en organen. Moleculaire analyse van deze biovloeistof biedt een niet-invasieve manier om ziekten te diagnosticeren of te monitoren, de werkzaamheid van medische behandelingen te beoordelen en mogelijke biomarkers te identificeren. Vanwege het beperkte monstervolume vereist het verzamelen van traanmonsters specifieke vaardigheden en geschikt gereedschap om een hoge kwaliteit en maximale efficiëntie te garanderen. In studies bij mensen zijn verschillende methoden voor het bemonsteren van traanbemonstering beschreven. In dit artikel wordt een uitgebreide beschrijving gegeven van een geoptimaliseerd protocol, specifiek op maat gemaakt voor het extraheren van traangerelateerde eiwitinformatie uit experimentele diermodellen, met name muizen. Deze methode omvat de farmacologische stimulatie van de traanproductie bij muizen van 2 maanden oud, gevolgd door monsterafname met behulp van Schirmer-strips en de evaluatie van de werkzaamheid en efficiëntie van het protocol door middel van standaardprocedures, SDS-PAGE, qPCR en digitale PCR (dPCR). Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het onderzoek naar de traan-eiwitsignatuur in verschillende experimentele paradigma's. Door een betaalbaar, gestandaardiseerd en geoptimaliseerd protocol voor traanbemonstering voor diermodellen op te stellen, was het doel om de kloof tussen menselijk en dieronderzoek te overbruggen, translationele studies te vergemakkelijken en de vooruitgang op het gebied van onderzoek naar oog- en systemische ziekten te versnellen.

Inleiding

Tranen worden beschouwd als een plasma-ultrafiltraat en zijn ook beschreven als een tussenliggende vloeistof tussen plasmaserum en cerebrospinale vloeistof vanwege een aanzienlijke overlap in de biomoleculen die ze delen1. Er is gemeld dat menselijke tranen eiwitten, traanlipiden, metabolieten en elektrolyten bevatten2. Onlangs zijn ook andere biomoleculen zoals mRNA's, miRNA's en extracellulaire blaasjes geïdentificeerd 3,4,5,6,7.

Bij mensen bevinden basale tranen zich in de traanfilm, die uit drie lagen bestaat: de buitenste lipidenlaag, die het traanoppervlak glad houdt om ons in staat te stellen er doorheen te kijken en traanverdamping te voorkomen; de middelste waterige laag, die het oog gehydrateerd houdt, bacteriën afstoot, het hoornvlies beschermt en 90% van de traanfilm uitmaakt; En tot slot de mucinelaag, een familie van eiwitten met een hoog moleculair gewicht die in contact staan met het hoornvlies en ervoor zorgen dat de traan zich aan het oog hecht8. De scheurverdeling over het oogoppervlak begint met afscheiding van de traanklier. Deze vloeistof wordt vervolgens door de traanbuisjes geleid om over het oogoppervlak te gaan en in afvoerkanalen te stromen. Elke knippering zorgt ervoor dat de tranen zich gelijkmatig over het hele oog verspreiden, waardoor het vochtig blijft9.

De traanfilm is een zeer dynamische biovloeistof die in staat is moleculaire veranderingen te weerspiegelen die niet alleen op het oogoppervlak optreden, maar ook in andere weefsels en organen. De analyse van differentiële expressie in deze biovloeistof vertegenwoordigt een veelbelovende benadering voor de ontdekking van biomarkers bij menselijke ziekten10,11. Het gebruik van traanfilm als bron van biomarkers voor vroege diagnose bij verschillende pathologieën is aanzienlijk vergemakkelijkt door de aanwezigheid van niet-invasieve verzamelmethoden. De meest gebruikelijke methode voor het verzamelen van tranen in klinieken voor mensen en dierenartsen is ondersteuning op basis van membranen (Schirmer's strip), die werkt volgens het principe van capillaire werking, waardoor het water in tranen langs de lengte van een papieren teststrip of capillaire buisjes kan reizen die in de onderste conjunctivale zak van de proefpersoon zijn geplaatst 12,13,14. Ondanks de inherente beperking van het verkrijgen van een klein monstervolume via deze methode, heeft de biochemische analyse van de traansamenstelling met behulp van verschillende gevoelige technieken de identificatie van potentiële biomarkermoleculen vergemakkelijkt11,15. Protocollen voor het optimaliseren en evalueren van de elutie van traaneiwitten uit Schirmer-strips en haarvaten bij menselijke patiënten zijn goed gedocumenteerd16,17. Er zijn echter volledige beschrijvingen beschikbaar van geoptimaliseerde protocollen die specifiek zijn ontworpen om moleculaire informatie met betrekking tot tranen uit experimentele diermodellen te extraheren, maar deze zijn schaars. Bestaande methoden, zoals traaninductie door directe stimulatie van de traanklier18, maken het mogelijk om grotere volumes te verzamelen, maar zijn invasief en kunnen ongemak veroorzaken voor de dieren. Niet-invasieve methoden, zoals het verzamelen van tranen van het oogoppervlak, zijn beschreven als een manier om DNA en miRNA's te isoleren19,21.

Dit protocol heeft tot doel een kosteneffectieve en geoptimaliseerde methode vast te stellen voor het verzamelen en verwerken van tranen bij muizen. De methode geeft prioriteit aan niet-invasieve werking en verkrijgt tegelijkertijd voldoende traanvolumes die geschikt zijn voor moleculaire analyse door middel van technieken zoals SDS-PAGE, qPCR en dPCR. De geëxtraheerde informatie over het eiwit- en mRNA-gehalte kan vervolgens worden gebruikt om potentiële biomarkers in bestaande experimentele ziektemodellen te identificeren.

Protocol

Alle hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dieren van Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). De proefdieren werden behandeld en behandeld in strikte overeenstemming met de richtlijnen voor diergebruik van het tijdschrift en volgens de Verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek. De gezondheid van het oog voor en na de procedures werd geëvalueerd door oogafscheiding, gezwollen oogleden, oogafwijkingen en gedragsveranderingen te beoordelen.

1. Dieren en bereiding van reagens

  1. Gebruik drie 2 maanden oude C57BL/6 mannelijke muizen per replicaat voor de procedure, met een startgewicht van ~25 g (Figuur 1). Verwerk elke muis afzonderlijk en plaats deze op een verwarmingskussen om de warmte vast te houden.
  2. Om traanafscheiding op te wekken, bereidt u een stockoplossing van pilocarpine van 20 mg/ml met steriel water.
  3. Snijd de teststrips van Schirmer op een lengte van 5 mm en buig elke strip bij de inkeping in een hoek van 90°.
  4. Bereid 250 μL steriel water met een proteaseremmer (1 tablet voor 50 ml, volgens de instructies van de fabrikant).

2. Stimulering en verzameling van de traanproductie

  1. Weeg elke muis afzonderlijk om de juiste dosering van behandelingen te berekenen.
  2. Om de traanproductie te stimuleren, dient u 30 mg/kg pilocarpine intraperitoneaal toe met een insulinespuit van 6 mm (Figuur 1B). Wacht 2 minuten na de injectie van het geneesmiddel totdat de effecten zich manifesteren.
    OPMERKING: Gegevens van niet-gestimuleerde dieren konden niet worden verkregen vanwege de beperkte beschikbaarheid van traanvocht.
  3. Verzamel de tranen door het uiteinde van elk Schirmer-stripfragment met een pincet over het midden van het onderste ooglid te plaatsen en het op zijn plaats te houden totdat de scheur de striplimiet bereikt (Figuur 1C). Vervang vervolgens de strip. Plaats achtereenvolgens 2 Schirmer-strips in elk oog, met een interval van 2 minuten tussen de strips voor het verzamelen. Het traanverzamelingsproces vereist ongeveer vier stripfragmenten gedurende 10 minuten per muis.
  4. Plaats de Schirmer-stripfragmenten in steriele buizen op ijs om degradatie van componenten te voorkomen. Zodra de collectie klaar is, begin je met de traanverwerking.

3. Eiwit isolatie

  1. Plaats de stripfragmenten in een microcentrifugebuisje van 600 μl met 20 μl steriel water met een proteaseremmer en centrifugeer gedurende 1 uur bij 600 x g bij 4 °C, zoals eerder getoond17 (figuur 1D).
  2. Maak een punctie met een roestvrijstalen injectornaald van 7,5 cm aan de punt van de buis van 600 μl met het monster (Figuur 1E). Breng deze doorboorde buis vervolgens over in een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml en centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, zoals eerder gemeld17, om het volume verdunde tranen terug te winnen. Het traanfilmvolume (supernatant) bevindt zich op de bodem van de buis.
  3. Creëer een eiwitpool door het supernatans dat uit alle monsters is teruggewonnen, te combineren. In dit experiment werd een totaal volume van ongeveer 200 μL verkregen.
    OPMERKING: De traanproductie kan meer dan 1 uur duren. Gedurende deze tijd kunnen de tranen nog steeds worden opgevangen.
  4. Kwantificeer het totale eiwitgehalte van het traanbad met behulp van de Bradford-standaardmethode22.

4. SDS-PAGE-analyse

  1. Verwarm de eiwitmonsters gedurende 4 minuten op 99 °C om de eiwitten te denatureren. Draai de monsters kort om de componenten te mengen.
  2. Laad 30 μg gekwantificeerd eiwitgehalte van elk monster op een 10% SDS-PAGE-gel (tabel 1) en laat de monsters gedurende 2 uur op 90 V draaien volgens een standaardmethode23.
  3. Bedek de gel na elektroforese met kleuroplossing (tabel 1) en incubeer gedurende 30 minuten om de eiwitten te kleuren.
  4. Spoel de gel met de ontkleuringsoplossing meerdere keren uit totdat de achtergrond helder wordt en eiwitbanden zichtbaar zijn.
  5. Verkrijg afbeeldingen met een geldocumentatiesysteem.

5. mRNA-isolatie voor qPCR en digitale PCR

  1. Plaats de strips in een microcentrifugebuisje van 600 μl met 20 μl steriel water. Maak een punctie aan het uiteinde van de buis met het monster, plaats deze in een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml en centrifugeer, zoals eerder gerapporteerd in menselijke tranen3, gedurende 20 minuten bij 2.000 x g bij 4 °C (Figuur 1E-H).
  2. Maak een pool van alle voorbeelden. Het herstelde volume van dit experiment was ongeveer 22 μL supernatans voor elke muis, d.w.z. 66 μL van het totale volume. Plaats de buisjes op droogijs om afbraak van biomoleculen te voorkomen.
  3. Voeg 200 μL monofasische oplossing van fenol en guanidiniumisothiocyanaat toe (commercieel verkregen) en homogeniseer door pipetteren. Laat 5 minuten op kamertemperatuur staan. In deze stap kunnen monsters enkele weken bij -20 °C of enkele maanden bij -70 °C worden bewaard.
  4. Voeg 40 μL chloroform toe en meng in een draaikolk gedurende 15 s. Laat 2 minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 minuten bij 4°C.
  5. Breng de waterige fase voorzichtig over (zonder de interfase te nemen) in een nieuw buisje van 1,5 ml.
  6. Voeg 0,5 μl glycogeen (0,05 μg/μl) toe aan een 100 μl isopropanol en meng door te pipetteren. Glycogeen wordt samen met het RNA neergeslagen en interfereert niet met de volgende stappen.
  7. Laat 10 minuten staan bij -20 °C. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer de supernatant snel.
  8. Voeg 200 μL koude 75% ethanol toe en resuspendeer de RNA-pellet door middel van vortexen. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  9. Decanteer de ethanol. Laat de tube 20-30 minuten aan de lucht drogen zonder deze om te keren. Voeg 20 μL RNasevrij water toe en resuspendeer.
  10. Ga verder met het aflezen van de optische dichtheid in de microvolumespectrofotometer bij 260 nm en 280 nm om de zuiverheid van RNA te beoordelen. Monsters moeten op ijs liggen.
    OPMERKING: Ribosomale banden 28S en 18S kunnen vanwege de aard van het monster niet worden waargenomen met een agarosegel. De aanwezigheid van andere RNA's, zoals miRNA's of mRNA's, kan worden geanalyseerd met behulp van een bioanalyzer, zoals eerder aangetoond18.
  11. Synthese het cDNA uit tranen-RNA met behulp van een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant.
    1. Begin met een input-RNA in een bereik van 10 ng-5000 ng; volgens de gebruikte kit, meng het met 1 μL Oligo (dT) en tot 12 μL RNase-vrij water. Draai het gedurende 30 s op 500 x g en incubeer gedurende 5 minuten bij 65 °C.
    2. Voeg aan de mengbuis 4 μL 5x reactiebuffer, 1 μL RNaseremmer, 2 μL dNTP-mix en 1 μL reverse transcriptase toe.
    3. Draai de buis 30 s rond op 500 x g om het mengsel naar beneden te trekken. Incubeer de buis vervolgens 60 minuten bij 42 °C. Beëindig de reactie door de buis gedurende 10 minuten bij 70 °C te incuberen.
  12. Vanwege de lage concentratie mRNA in tranen wordt aanbevolen om onverdund cDNA te gebruiken voor qPCR24. Voor dit experiment werd 150 ng cDNA gebruikt. Voer qPCR uit met behulp van DNMT3a-primers :
    Vooruit: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Achteruit: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA en GAPDH primers:
    Vooruit: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Achteruit: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC volgens de instructies van fabrikanten en apparatuurprocedures.
    1. Gebruik voor de qPCR-cyclus het volgende programma: Eerste denaturatie: 95 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 45 cycli van C 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s en 72 °C - 30 s, eindigend met een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min.
    2. Voer een smeltcurveanalyse uit om de aanwezigheid van primerdimeren of niet-specifieke amplicons in de reactie te beoordelen. De temperatuurhelling begon van 50 °C tot een uiteindelijke 99 °C, met een initiële hold van 90 s voor de eerste stap en een hold van 5 s tussen elke stap.
    3. Voer voor dPCR25 seriële verdunningen uit om de hoeveelheid cDNA te optimaliseren die nodig is om het betreffende mRNA te detecteren. Gebruik in dit experiment de volgende verdunningen van cDNA in nucleasevrij water: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng en 18,75 ng cDNA. Er werden primers voor DNMT3a gebruikt. Gebruik voor de dPCR-cyclus het volgende programma: initiële denaturatie: 95 °C gedurende 2 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 °C - 15 s en 60 °C - 30 s.

Resultaten

Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, biedt een gemakkelijke en betaalbare methode voor het verkrijgen van moleculaire informatie uit traanvocht met behulp van technieken die algemeen beschikbaar zijn in de meeste moleculair-biologische laboratoria. Bovendien kan het protocol worden opgeschaald door gebruik te maken van zeer gevoelige technieken zoals ELISA voor het detecteren van enzymatische activiteit.

Na deze procedures was de totale eiwitopbrengst ongeveer 3-4 μg/μL. Coomassie-gekleurde SDS-pagina-analyse van totale eiwitextracten onthult patronen van eiwitexpressie in het totale netvlies en tranen (Figuur 2A).

Geïsoleerd RNA had een 260/280 UV-absorptieverhouding tussen 1,9 en 2,0. De gemiddelde opbrengst was 134,8 ng/μl. qPCR werd uitgevoerd met behulp van primersets voor een huishoudgen (glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase, GAPDH)3 en een vermeend biomarkergen (DNA-methyltransferase 3a, DNMT3a)26. Een onverdund cDNA-monster 1:1 (150 ng) werd gebruikt.

Er werd een smeltcurve-analyse uitgevoerd en Ct-snelheden werden berekend in de qPCR-software. Alle experimenten werden in tweevoud uitgevoerd. Uit de analyse bleek dat Ct-waarden tussen 20 en 24 lagen, wat een geschikt bereik is voor de starthoeveelheid van doel-mRNA in het monster (Figuur 2B). De analyse van de smeltcurve in figuur 2C suggereert echter de lage aanwezigheid van doel-mRNA. Desalniettemin bevestigde de 2% agarosegel de aanwezigheid van amplicons met de verwachte grootte (Figuur 2D).

dPCR werd uitgevoerd met hetzelfde paar primersets voor DNMT3a. De verdunning van de gebruikte cDNA-monsters was 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Alle experimenten werden in tweevoud uitgevoerd. dPCR was in staat om te detecteren van 1,33 kopieën/μl in het onverdunde monster tot 0,45 kopieën/μl in het 8-voudig verdunde monster (figuur 3A,3B). dPCR vertoonde dus een verhoogde gevoeligheid voor het doel-mRNA dat in tranen aanwezig was in vergelijking met qPCR.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van het traanextractieprotocol van muizen. (a) Verzameling van scheuren. Er werden drie 2 maanden oude C57BL/6J-muizen gebruikt. (B) De traanproductie werd farmacologisch geïnduceerd door intraperitoneale toediening van pilocarpine. Foto ter illustratie van de plaatsing van de Schirmer-strip. (c) Verwerking van scheuren. Tranen werden vervolgens gedurende 10 minuten verzameld met behulp van Schirmer-strips en overgebracht naar microcentrifugebuisjes. (D) Tranen verzameld in de Schirmer-strips werden gecentrifugeerd met steriel water en proteaseremmers of gewoon steriel water. (E, F) Deze buisjes werden aan de onderkant geperforeerd en vervolgens overgebracht naar een nieuwe gesteriliseerde buis van 1,5 ml om het ontwijken van vloeistof te vergemakkelijken. (G, H) De tranen worden opgevangen in de 1,5 tube ml. (I) Representatieve foto van de procedure om tranen te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Stroomafwaartse analyse van traanfilm voor moleculaire toepassingen. (A) SDS-PAGE van muizentranen en een retinaal eiwitextract. MW: Marker voor molecuulgewicht.; baan 1: Eiwitprofielen van het netvlies (30 μg); Baan 2: Eiwitprofielen van tranen (30 μg). (B) qPCR voor GAPDH en DNMT3a in muizentranen. De gemiddelde CT en ΔCT worden weergegeven in tabel 2. (C) Analyse van de smeltcurve voor DNMT3a en GAPDH PCR-producten. De y-as vertegenwoordigt de veranderingssnelheid van de fluorescentie in de amplificatiereactie (dF/dT) en de x-as vertegenwoordigt de temperatuur in °C (D) Analyse van het PCR-amplicon in 2% agarosegelelektroforese met 0,5 μg/ml ethidiumbromide. Baan M: 1 kb plus DNA-ladder. Baan 1,2: respectievelijk GAPDH en DNMT3a PCR-amplicon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Digitale PCR (dPCR) voor DNMT3a-expressie in muizentranen. (A) dPCR-resultaten worden weergegeven als een 1D-scatterdiagram dat in blauwe stippen de DNMT3a-transcriptiekopieën weergeeft. Zwarte stippen zijn partities zonder dat de DNMT3a-transcriptiekopieën aanwezig zijn. (B) Een verdunningsreeks van cDNA werd gegenereerd om de optimale concentratie te bepalen voor het kwantificeren van DNMT3a-transcriptiekopieën . Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van het materiaalBeschrijving
10% SDS-gelVoor één scheidingsgel: 3,8 ml gedistilleerd H2O; 2,6 ml Tris; pH 8,8; 1,5 M 3,4 ml acrylamide; 100 μL 10% SDS; 100 μL 10% APS; 4 μL TEMED.
Voor één opvanggel: 2,72 ml gedistilleerd H2O, 0,52 ml Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,68 ml acrylamide, 40 μL 10% SDS, 40 μL 10% APS 4 μL TEMED.
Elektroforese Buffer250 mM Tris-basis, 2 M Glycine, 1% SDS
Kleuring oplossingLos de volgende reagentia op in 43 ml water (bewaren bij kamertemperatuur in een amberkleurige fles): Coomassie 0,25 g; azijnzuur 7 ml; methanol 50 ml
OntkleuringsoplossingLos de volgende reagentia op in 63 ml water (bewaren bij kamertemperatuur): azijnzuur 7 ml; ethanol 30 ml

Tabel 1. Instellen voor SDS-Page.

De naam van het genCT1CT2Gemiddeld met SDΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17 Overige
DNMT3a24.5924.9724.78±0.07 Overige4.35

Tabel 2. Ct-waarden van DNMT3a en GAPDH in tranen van muizen.

Discussie

Traanvocht is gemakkelijk toegankelijk en de bepaling van biomarkers in tranen kan worden gebruikt als een succesvolle aanvullende techniek voor de vroege diagnose van verschillende ziekten bij de mens. Hoewel de biochemische analyse van de traansamenstelling in experimentele diermodellen deze benadering aanvult en aanzienlijke vooruitgang belooft in het begrijpen van de moleculaire basis van ziekten, is er een schaarste aan beschikbare gegevens en protocollen, wat ons ertoe heeft gebracht er een te ontwikkelen. De methode die in dit rapport wordt beschreven, is technisch eenvoudig uit te voeren en maakt de voorlopige identificatie van de differentiële expressie van verschillende ziekte-geassocieerde kandidaat-moleculen mogelijk.

Het verzamelen van scheuren kan worden bereikt door middel van verschillende methoden, zoals capillaire buisjes en Schirmer-strips16,17, wattenstaafjes28en sponzen29. De Schirmer-stripmethode kreeg de voorkeur vanwege de gemakkelijke toegang, de kwantitatieve mogelijkheden, het aanpassingsvermogen tijdens de monsterverzameling, de kosten en de eenvoud bij het extraheren van scheurcomponenten voor laboratoriumverwerking. Bovendien is deze methode kosteneffectief, minimaal invasief en vormt ze geen risico op letsel of schade aan het hoornvlies, dankzij de samenstelling van de papieren filterstrip16,17. Kritieke stappen van dit protocol zijn onder meer de noodzaak van farmacologische stimulatie van de traanproductie met behulp van pilocarpine en de selectie van een geschikte elutiebuffer.

Pilocarpine is een cholinerge agonist die zich bindt aan M3-muscarinereceptoren en farmacologische stimulatie van exocriene klieren kan veroorzaken, waardoor de traanproductie, speekselafscheiding en urineren worden verbeterd. Hoewel studies bij mensen hebben aangetoond dat traanstimulatie de osmolariteit van de verzamelde vloeistof niet verandert30, heeft het wel een duidelijke invloed op eiwitprofielen31. Het gebruik van pilocarpine als cholinerge farmacologische stimulator van exocriene klieren en traansecretieversterker is met succes gerapporteerd bij konijnen en muizen 19,32,33, maar het effect van stimulatie op het eiwitgehalte is niet geëvalueerd. Om deze beperking te vermijden en een nauwkeurige vergelijking van traanprofielen tussen experimentele omstandigheden mogelijk te maken, is het van cruciaal belang om rekening te houden met de specifieke collectie-instellingen. Evenzo kan de introductie van een spoelstap voorafgaand aan het verzamelen van tranen nuttig zijn om eerdere besmetting van het oogoppervlak te voorkomen. In dit protocol werd een concentratie van 30 mg/kg pilocarpine gehanteerd13. Omdat de muizen onbeweeglijk en kalm bleven na de injectie van dit medicijn, werden de tranen zonder enige verdoving verzameld, waardoor het verzamelen van monsters gemakkelijk werd.

De keuze van een geschikte elutiebuffer hangt nauw samen met de geselecteerde methode voor het analyseren van de biochemische samenstelling van een traanmonster en de herstelsnelheid van biologisch materiaal uit de strip. In een vergelijkende studie gericht op eiwitretentie uit Schirmer's strips bij patiënten, werd bijvoorbeeld vastgesteld dat een buffer bestaande uit 100 mM ammoniumbicarbonaat samen met 0,25% Nonidet P40 (NP40) superieure resultaten opleverde voor proteomics of multiplex ELISA-analysetoepassingen17. In onze handen bleek het gebruik van steriel water voldoende om de totale eiwitextracten in SDS-PAGE te visualiseren en om het mRNA van de betreffende genen te detecteren door middel van PCR.

Om de aanwezigheid van DNMT3a- en GAPDH-mRNA in muizentranen te beoordelen, hebben we de prestaties van qPCR en dPCR vergeleken. De aanwezigheid van primerdimeren waargenomen in de qPCR-smeltcurve wordt toegeschreven aan de lage abundantie van het DNMT3a-transcript . Zoals aangetoond, heeft dPCR een aanzienlijk grotere gevoeligheid en werkzaamheid bij het detecteren van het doel-mRNA in deze monsters in onverdunde en verdunde monsters. Dit nauwkeurige detectievermogen maakt dPCR de voorkeursmethode voor traananalyse bij muizen en biedt onderzoekers en clinici een betrouwbaar hulpmiddel voor toekomstige studies en mogelijke klinische toepassingen.

De ontwikkeling van een gestandaardiseerd protocol voor het verzamelen van traanmonsters in diermodellen betekent een aanzienlijke vooruitgang in het onderzoek. Dit protocol vergemakkelijkt niet alleen de systematische en nauwkeurige verzameling van traanmonsters, maar opent ook een breed scala aan mogelijkheden voor hun toepassing in verschillende studiegebieden. De mogelijkheid om traanmonsters van diermodellen te verkrijgen, maakt het mogelijk om een breed spectrum van ziekten en aandoeningen te onderzoeken, evenals de verkenning van nieuwe biomarkers en mogelijke therapieën. Door een gestandaardiseerd protocol op te stellen, wordt bovendien de reproduceerbaarheid van resultaten in verschillende onderzoeken en laboratoria bevorderd, wat bijdraagt aan de validiteit en betrouwbaarheid van onderzoek. Uiteindelijk heeft deze vooruitgang in de methodologie voor het verzamelen van traanmonsters in diermodellen het potentieel om belangrijke ontdekkingen te doen en het begrip van de pathofysiologie van verschillende ziekten te verbeteren, waardoor nieuwe wegen worden geopend voor diagnose, behandeling en preventie.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de VELUX STIFTUNG [project 1852] aan M.L. en postdoctorale beurzen van CONAHCYT aan M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) en A.M.F (CVU 1317418). Oprechte dank aan alle leden van het laboratorium, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento en Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) voor hun bijdragen aan de stimulerende discussies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanolGibco1985023
2x Laemmli bufferBio-Rad16-0737
AzijnzuurQuimica Meyer64-19-7
AcrylamidSigma-AldrichA4058
Bradford ReagensSigma-AldrichB6916
ChloroformSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Blauw R 250US Biological6104-59-2
EthanolQuimica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA LadderThermofisher scientificSM1331
GlycerolUS BiologicalG8145
GlycineSANTA CRUZSC- 29096
GlycogenRoche10901393001
HClQuimica Rique7647-01-0
Isopropyl alcoholQuimica Rique67-63-0
MethanolQuimica Meyer67-56-1
Micro tubes 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Micro tubes 600 µlAxygenMCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014
PCR tubes & stripsNovasbioPCR 0104
PilocarpineSigma-AldrichP6503-10g
Protease inhibitorRoche11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)Qiagen250001
Real qPlus 2x Master Mix GreenAmpliqonA323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis KitThermofisher scientificK1622
Schirmer's test stripsLaboratorio SantgarSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma aldrich102560430
TRI reagentSigma-AldrichT9424-200MLmonofasische oplossing van fenol en guanidiniumisothiocyanaat
TrisUS BiologicalT8650
Tris baseChem Cruzsc-3715A

Referenties

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Tranenafname bij muizenanalyse van traaneiwittenmRNA analyseSchirmer stripsfarmacologische stimulatieSDS PAGEdigitale PCRtraanbiomarkersmodellen voor oogziekten
Optimalisatie van traanverzameling bij muizen voor mRNA- en eiwitanalyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.