Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

AAV-systemen en muismodellen voor het onderzoeken van ectopische expressie van neurod1 in getransduceerde cellen op subacute en chronische tijden na ischemische beroerte

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66965

⸱

29 november 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de viraal-gemedieerde ectopische expressie van Neurod1 na corticale ischemische beroerte. Neurod1 wordt toegediend (1) met behulp van het Cre-Flex AAV-systeem bij wildtype muizen tijdens de subacute fase na een beroerte (7 dagen) en (2) met behulp van een enkele AAV-vector in voorwaardelijke reportermuizen tijdens de chronische fase na een beroerte (21 dagen).

Samenvatting

Ectopische expressie van neurogene factoren in vivo is naar voren gekomen als een veelbelovende benadering voor het vervangen van verloren neuronen in ziektemodellen. Het gebruik van neurale basale helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactoren via niet-voortplantende virusachtige deeltjessystemen, waaronder retrovirus, lentivirus en adeno-geassocieerd virus (AAV), is uitgebreid gerapporteerd. Voor in vivo experimenten worden AAV's steeds vaker gebruikt vanwege hun lage pathogeniteit en potentieel voor vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft twee AAV-systemen voor het onderzoeken van de ectopische expressie van transcriptiefactoren in getransduceerde cellen na een ischemische beroerte. In beide systemen wordt de expressie van neurod1 gecontroleerd door de korte GFAP (gfaABC(1)D)-promotor, die wordt opgereguleerd in reactieve astrocyten na een beroerte en in endogene neuronen in combinatie met expressie van neurogene factoren. In het beschreven ischemische beroertemodel wordt focale ischemie geïnduceerd door endotheline-1 (ET-1) in de motorische cortex van muizen te injecteren, waardoor een laesie ontstaat die wordt omringd door reactieve astrocyten die GFAP tot expressie brengen en overlevende neuronen. Intracerebrale injecties van AAV worden uitgevoerd om de expressie van Neurod1 ectopisch te induceren in de subacute (7 dagen) en chronische (21 dagen) fasen na een beroerte. Binnen enkele weken na AAV-injectie wordt een significant hoger aantal neuronen onder getransduceerde cellen geïdentificeerd bij muizen die ectopisch Neurod1 tot expressie brengen in vergelijking met muizen die AAV-controlevirussen krijgen. De op AAV gebaseerde strategieën die werden gebruikt, repliceerden waargenomen resultaten van een verhoogd aantal neuronen die het reportergen tot expressie brachten in een model van milde tot matige corticale beroerte. Dit protocol stelt een standaardplatform vast voor het onderzoeken van de effecten van ectopische expressie van transcriptiefactoren die worden geleverd met op AAV gebaseerde systemen, wat bijdraagt aan het begrip van neurogene factorexpressie in de context van een beroerte.

Inleiding

Beroerte is wereldwijd een belangrijke oorzaak van invaliditeit1. Een beroerte treedt op wanneer de bloedtoevoer naar de hersenen wordt verstoord. Dit kan gebeuren door een hemorragische beroerte (~15% van de gevallen), waarbij een bloedvat in de hersenen barst, of door een ischemische beroerte, waarbij de bloedtoevoer naar de hersenen wordt geblokkeerd1. Ischemische beroertes komen het meest voor en zijn goed voor ~85% van de gevallen van beroertes1. Een beroerte vermindert de afgifte van glucose en zuurstof aan de hersenen, wat leidt tot snelle neuronale celdood en verminderde neurale functie.

Ischemische beroerte leidt binnen enkele minuten tot het verlies van cellen in de kern van de laesie door mechanismen van excitotoxiciteit, oxidatieve en nitrosatieve stress, calciumontregeling, corticale spreiding, depolarisatie, oedeem, verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB) en ontsteking 2,3. Cellen in de peri-infarctgebieden ondergaan apoptotische celdood binnen enkele uren en dagenlang, na een beroerte4. De peri-infarctomgeving wordt blootgesteld aan pro- en ontstekingsremmende signalen die leiden tot de activering van microglia en astrocyten ("reactieve" astrocyten), die verschillende rollen spelen na letsel 5,6,7,8. Reactieve astrocyten ondergaan een aantal fenotypische veranderingen, waaronder de opregulatie van gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) en de vorming van een rand rond de laesie binnen enkele dagen na een beroerte die helpt om de omvang van de laesie te beperken en de neuroplasticiteit in het beschadigde weefsel beïnvloedt 8,9,10.

Directe cellulaire herprogrammering maakt de omzetting van het ene volwassen celtype in een ander volwassen celtype mogelijk zonder door een pluripotente toestand te gaan11. Het veranderen van residente hersencellen in nieuwe neuronen ter vervanging van de neuronen die verloren zijn gegaan door verwonding, biedt een aantrekkelijke weg voor hersenherstel. Beroerte is een ideaal doelwit voor celgebaseerde behandelingen, gezien de noodzaak van therapeutische methoden om verloren neuronen te vervangen, het therapeutische tijdsbestek te verbreden en uiteindelijk functioneel herstel te vergemakkelijken. Daartoe zijn er veel artikelen geweest die aantonen dat astrocyt naar neuron (AtN) in vitro en in vivo herprogrammeert, met behulp van een verscheidenheid aan basale helix-loop-helix (bHLH) neurogene transcriptiefactoren, waaronder Ascl1, Neurog2, Neurod1 en meer recentelijk, gemuteerde versies van Ascl1 (Ascl1-SA6) die een verbeterde herprogrammeringswerkzaamheid aantoonden11,12,13,14. Belangrijk om te overwegen zijn de vele experimentele ontwerpfactoren die van invloed kunnen zijn op resultaten, interpretatie en vergelijkingen tussen onderzoeken. Ghazale et al. toonden aan dat de efficiëntie van AtN-herprogrammering varieerde tussen verschillende muizenstammen, AAV-serotypen en promotors bij gebruik van dezelfde bHLH-transcriptiefactor14. Andere overwegingen, zoals het letselmodel, het hersengebied, de virale dosering, de timing van genafgifte, de herprogrammeringsfactor en de wijze van toediening, zullen van invloed zijn op de resultaten. Recente rapporten hebben aangetoond dat reeds bestaande getransduceerde neuronen ten onrechte zijn geïnterpreteerd als geherprogrammeerde neuronen15,16. Hoewel de rapporten niet noodzakelijkerwijs ontkennen dat AtN-conversie plaatsvindt, hebben deze studies het belang van goed gecontroleerde experimenten benadrukt, en verschillende artikelen hebben aanbevelingen gedaan voor de volgende stappen in het veld 15,17,18,19. Wat uit de literatuur blijkt, is dat de ectopische expressie van bHLH-transcriptiefactoren functionele resultaten kan verbeteren in een verscheidenheid aan diermodellen van neurodegeneratieve ziekte/letsel 13,20,21,22,23,24.

Hierin wordt dit protocol Neurod1, een transcriptiefactor van belang, ectopisch tot expressie gebracht in getransduceerde cellen13,22. Het gevestigde endotheline-1 (ET-1) model van ischemische beroerte naar de sensomotorische cortex bij volwassen muizen wordt gebruikt. Injectie van ET-1 leidt tot lokale vasoconstrictie die de pathofysiologie van een ischemische beroerte nabootst, inclusief functionele beperkingen 22,23,25. De veelgebruikte korte-GFAP-promotor (gfaABC(1)D) wordt gebruikt om de ectopische expressie van Neurod1 op de plaats van de verwonding en het perilesionale gebied aan te sturen met behulp van twee virale strategieën: (1) AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre-afgifte bij wildtype muizen en (2) AAV5-GFAP-Neurod1-Cre-afgifte bij tdTom-Cre reporter-muizen. Om het potentieel voor ectopische expressie van Neurod1 in de hersenen met een beroerte beter te begrijpen, werden AAV's toegediend in de subacute fase (7 dagen) of in de chronische fase (21 dagen), na een beroerte. In beide paradigma's werden significant meer gelabelde neuronen gevonden binnen enkele weken na ectopische Neurod1-expressie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Toronto en voldoet aan de Guide to the Care and Use of Experimental Animals (2e editie, Canadian Council on Animal Care, 2017). Voor deze studie werd wild-type (C57BL/6J) en transgene tdTom-Cre reporter (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 muizenstammen werden gebruikt. Muizen waren 7-9 weken oud en omvatten zowel mannetjes als vrouwtjes. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Endotheline-1 beroerte operatie

OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten en materialen worden voorafgaand aan de operatie gesteriliseerd door een autoclaaf. Het stereotactische frame is gesteriliseerd met PREempt. Spuiten worden voorafgaand aan de operatie gesteriliseerd met PREempt, 70% alcohol, en geprimed met steriele PBS. Endotheline-1 (ET-1) wordt tijdens de operatie op ijs bewaard.

  1. Voordat u met de operatie begint, richt u de verkoeverkamer in door een schone kooi op een verwarmingskussen te plaatsen dat is ingesteld op 37 °C. Als er een verwarmingslamp wordt gebruikt, plaatst u ook slechts de helft van de kooi onder de warmte.
    1. Om muizen te verdoven met isofluraan, volgt u het protocol dat is goedgekeurd door het Comité voor Dierenverzorging. Plaats de muis in de anesthesie-inductiekamer en zet de zuurstof aan op 1-1.5 l/min, stel vervolgens de isofluraanverdamper in op 3%-5% om anesthesie te starten.
  2. Haal het dier uit de kamer zodra het op zijn kant ligt en niet meer kan staan, en plaats het op een schoon oppervlak. Zorg ervoor dat het dier voldoende verdoofd is door de afwezigheid van een teenknijpreflex voor en tijdens de operatie te bevestigen.
    1. Zet de neuskegel die uit de anesthesiemachine is uitgeschoven vast op het dier en stel het isofluraan in op 1%-2% voor onderhoud. Minimaliseer de blootstelling aan isofluraan (5 minuten bij 3%-5% voor inductie en de resterende tijd bij 1%-2%), aangezien de procedure tot 40 minuten kan duren.
  3. Gebruik trimmers voor dierenhaar om de vacht van de nek/achter de oren tot aan de neus van het dier te verwijderen om de huid van de schedel bloot te leggen voor een operatie.
  4. Weeg het dier af en dien subcutaan de juiste dosis preoperatieve pijnstiller toe (Meloxicam (2,0 mg/kg)) op basis van het gewicht.
  5. Breng oogsmeerzalf aan op elk oog van de muis om uitdroging van het hoornvlies tijdens de anesthesie te voorkomen.
  6. Steriliseer het met de vacht afgeknipte huidgebied (stap 1.3) met 70% ethanol, gevolgd door tweemaal chloorhexidinealcohol om een chirurgisch veld te vormen.
  7. Breng de muis over op een stereotactisch frame van de muis door eerst zijn neus in de stereotactische neuskegel te plaatsen en vervolgens de schedel te stabiliseren met oorstangen. Houd de muis op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C voor thermische ondersteuning tijdens de operatie. Houd isofluraan op 1%-2%, zodat de muis een ademhalingsfrequentie van 1 ademhaling/s vertoont.
  8. Herhaal indien nodig de toepassing van oogsmering om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen. Breng een steriel chirurgisch laken aan op het lichaam van de muis, onder de oren, om de grootte van het steriele veld te vergroten.
  9. Maak een verticale incisie evenwijdig aan het sagittale vlak van het dier van achter het midden van de ogen tot aan de achterkant van het hoofd (pariëtaal bot) met een #10 scalpelmes. Leg de schedel bloot door de huid voorzichtig naar de zijkanten terug te trekken.
  10. Gebruik een wattenstaafje om de fascia op de schedel te verstoren en laat de schedel drogen om bregma bloot te leggen.
  11. Stel manipulatorarmen in met boorhouder en draag een stereotactische boor met hoge snelheid en een boor van .018 inch.
  12. Boor 3 braamgaten (018 inch diameter) met een stereotactische boor met hoge snelheid op de coördinaten in de rechter sensomotorische cortex op 2,25 mm lateraal van bregma en +0,0 mm rostraal, +1,0 mm rostraal en -1,0 mm caudaal tot bregma.
  13. Vervang de boor door een spuit van 26 G door een naald van 0.375 inch.
  14. Laad 1,5 μl 400 μM ET-1 opgelost in steriel PBS in de spuit. Om een goede doorstroming te garanderen, laat u een klein volume ET-1 los totdat een druppel aan de punt van de naald kan worden waargenomen. Gebruik een steriel wattenstaafje om het overtollige product weg te vegen voordat u een injectie uitvoert.
  15. Laat de punt van de naald langs de schedel zakken in het middelste braamgat (in de rechter sensomotorische cortex op + 0,0 anterieur en 2,25 mm lateraal van bregma) zonder de dura mater te doorboren. Eenmaal uitgelijnd, laat u de naald 1 mm in de hersenen zakken.
  16. Injecteer 1 μL ET-1 door 0,1 μL per keer te doseren. Duw de zuiger van de Hamilton-spuit naar voren om 0,1 μl af te geven en wacht een minuut voordat u de volgende 0,1 μl injecteert, injecteer totdat 1 μl is toegediend.
    1. Nadat de laatste 0,1 μl is toegediend (0,1 μl x 10 injecties = 1 μl in totaal), houdt u de naald 10 minuten op zijn plaats om terugstroming te voorkomen en trekt u deze dan langzaam terug naar boven om de spuit te verwijderen.
  17. Om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt raakt tijdens de injectie, laat u een klein volume van de ET-1 los totdat een druppel aan de punt van de naald kan worden waargenomen. Gebruik een steriel wattenstaafje om het overtollige product weg te vegen voordat u een injectie uitvoert. Steriliseer spuiten voordat u het volgende dier injecteert met PREempt, gevolgd door 70% alcohol en vervolgens steriel PBS.
  18. Om de wond te sluiten, hecht u de bovenliggende huid op de schedel aan elkaar met behulp van een 4-0 polysorb polyester steriele hechtdraad.
  19. Dien antibiotische zalf toe met een wattenstaafje op het gehechte gebied om postoperatieve infectie te voorkomen.
  20. Haal de muis uit het stereotactische frame en breng hem over naar een schone, voorverwarmde dierenkooi in de verkoeverkamer. Schakel de isofluraanverdamper en zuurstof uit.
  21. Houd de kooi op een verwarmingskussen voor de duur van het herstel van de anesthesie. Als u een verwarmingslamp gebruikt, plaatst u de muis ook aan de zijkant van de kooi onder de lamp, zodat de muis naar de koele kant van de kooi kan gaan als hij wakker wordt uit de narcose om oververhitting te voorkomen. Houd de muis in de gaten als deze in de komende 5-10 minuten uit de anesthesie komt.
  22. Monitor de muis gedurende de komende 3 dagen (gewichtscontrole), verleen postoperatieve zorg (vochtig gepureerd voer om hydratatie te garanderen) en pijnstillers (2 mg/kg meloxicam, 2x daags subcutaan, gedurende 2-3 dagen) in overeenstemming met de voorschriften van de plaatselijke commissie voor dierenverzorging.

2. Toediening van adeno-geassocieerd virus (AAV) (7 dagen - subacuut model of 21 dagen - chronisch model) na een beroerte

LET OP: Raadpleeg de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen voor het werken met AAV's. Volgens de richtlijnen van de Universiteit van Toronto wordt deze operatie uitgevoerd in een inperkingsniveau 2 bioveiligheidskast.

OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten en materialen worden voorafgaand aan de operatie gesteriliseerd door een autoclaaf. Het stereotactische frame is gesteriliseerd met PREempt. Spuiten worden gesteriliseerd met PREempt, 70% alcohol, en geprimed met steriel PBS. AAV's worden tijdens de operatie op ijs bewaard.

  1. Voordat u met de operatie begint, richt u de verkoeverkamer in door een schone kooi op een verwarmingskussen te plaatsen dat is ingesteld op 37 °C. Als er een verwarmingslamp wordt gebruikt, plaatst u ook slechts de helft van de kooi onder de warmte.
    1. Om muizen te verdoven met isofluraan, plaatst u de muis in de anesthesie-inductiekamer en zet u de zuurstof aan op 1-1,5 l/min, en stelt u vervolgens de isofluraanverdamper in op 3%-5% om de anesthesie te starten (volgens de door de instelling goedgekeurde protocollen).
  2. Haal het dier uit de kamer zodra het op zijn zij ligt en niet meer op een schone ondergrond kan staan. Zorg ervoor dat het dier voldoende verdoofd is door de afwezigheid van een teenknijpreflex voor en tijdens de operatie te bevestigen.
    1. Zet de neuskegel die uit de anesthesiemachine is uitgeschoven vast op het dier en stel het isofluraan in op 1%-2% voor onderhoud. Minimaliseer de blootstelling aan isofluraan (5 minuten bij 3%-5% voor inductie en de resterende tijd bij 1%-2%), aangezien de procedure tot 40 minuten kan duren.
  3. Weeg het dier af en dien subcutaan de juiste dosis preoperatieve pijnstiller toe (Meloxicam (2,0 mg/kg)) op basis van het gewicht.
  4. Breng oogsmeerzalf aan op elk oog van de muis om uitdroging van het hoornvlies onder narcose te voorkomen.
  5. Steriliseer het met vacht afgeknipte huidgebied met 70% ethanol, gevolgd door chloorhexidinealcohol twee keer om een chirurgisch veld te vormen.
  6. Breng de muis over op een stereotactisch frame van de muis door eerst zijn neus in de stereotactische neuskegel te plaatsen en vervolgens de schedel te stabiliseren met oorstangen. Houd de muis op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C voor thermische ondersteuning tijdens de operatie. Houd het isofluraan op 1%-2%, zodat de muis de ademhalingsfrequentie van 1 ademhaling/s weergeeft.
  7. Herhaal indien nodig de toepassing van oogsmering om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen. Breng een steriel chirurgisch laken aan op het lichaam van de muis, onder de oren, om de grootte van het steriele veld te vergroten.
  8. Als het nog steeds aanwezig is, knipt u de hechtingen af met een chirurgische schaar en verwijdert u het korstje met een tang. Trek de huid terug om de schedel bloot te leggen.
    OPMERKING: Voor het chronische model kan het nodig zijn om de huid weg te snijden met #10 scalpelmes.
  9. Gebruik een steriel wattenstaafje om de schedel te drogen en braamgaten te lokaliseren.
  10. Stel manipulatorarmen van het stereotactische apparaat in met een naaldhouder met een spuit van 26 G met een naald van 0.375 inch.
  11. Laad 3,4 μL AAV (1 x 10 9 Genoom Copies (GC)/μL voor acuut onderzoek; 1 x 1010 GC/μL voor chronisch onderzoek) in de spuit. Om ervoor te zorgen dat de doorstroming goed is, laat u een klein volume AAV los totdat een druppel aan de punt van de naald kan worden waargenomen. Gebruik een steriel wattenstaafje om het overtollige product weg te vegen voordat u een injectie uitvoert.
  12. Laat de punt van de naald langs de schedel zakken in het eerste braamgat dat wordt gebruikt voor ET-1 (in de rechter sensomotorische cortex op + 0,0 anterieur en 2,25 mm lateraal van bregma) zonder de dura mater te doorboren. Eenmaal uitgelijnd, laat u de naald 1 mm in de hersenen zakken. (0 AP, +2,25 ML, -1,0 DV van bregma).
  13. Injecteer 1 μL AAV (1 x 109 GC/μL voor acuut onderzoek; 1 x 1010 GC/μL voor chronisch onderzoek) door 0,1 μL per keer toe te dienen. Duw de zuiger van de Hamilton-spuit naar voren om 0,1 μl af te geven en wacht een minuut voordat u de volgende 0,1 μl injecteert; injecteer totdat 1 μL is afgegeven. Nadat de laatste 0,1 μl is toegediend (0,1 μl x 10 injecties = 1 μl in totaal), houdt u de naald 10 minuten op zijn plaats om terugstroming te voorkomen en trekt u deze dan langzaam terug naar boven om de spuit te verwijderen.
  14. Om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt raakt tijdens de injectie, laat u een klein volume van de AAV los totdat een druppel aan de punt van de naald kan worden waargenomen. Gebruik een steriel wattenstaafje om het overtollige product weg te vegen voordat u een injectie uitvoert.
  15. Herhaal stap 2.11-2.14 voor de AAV-injecties in de twee resterende braamgaten (in de rechter sensomotorische cortex bij +1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV; en -1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV mm vanaf bregma. Steriliseer spuiten voordat u het volgende dier injecteert met PREempt, gevolgd door 70% alcohol en ten slotte steriel PBS.
  16. Om de wond te sluiten, hecht u de bovenliggende huid op de schedel aan elkaar met behulp van een 4-0 polysorb polyester steriele hechtdraad.
  17. Dien antibiotische zalf toe met een wattenstaafje op het gehechte gebied om postoperatieve infectie te voorkomen.
  18. Haal de muis uit het stereotactische frame en breng hem over naar een schone, voorverwarmde dierenkooi in de verkoeverkamer. Schakel de isofluraanverdamper en zuurstof uit.
  19. Houd de muis in de kooi en steriliseer de buitenkant van de kooi met PREempt en 70% alcohol voordat u hem op een verwarmingskussen plaatst voor herstel van anesthesie.
    1. Als u een verwarmingslamp gebruikt, plaatst u de muis ook aan de zijkant van de kooi onder de lamp, zodat de muis naar de koele kant van de kooi kan gaan als hij wakker wordt uit de narcose om oververhitting te voorkomen. Houd de muis in de gaten als deze in de komende 5-10 minuten uit de anesthesie komt.
  20. Houd de muis de komende 3 dagen in de gaten (gewichtsmeting), zorg na de operatie (vochtig gepureerd voer om hydratatie te garanderen) en pijnstillers (2 mg/kg meloxicam, 2x daags subcutaan, gedurende 2-3 dagen) in overeenstemming met de voorschriften van de plaatselijke commissie voor dierenverzorging.

3. Weefselpreparatie en dissectie

  1. Om de muis te euthanaseren, injecteert u de muis intraperitoneaal met tribroomethanol (Avertin) (conc. 12,5 mg/ml, 250 mg/BW(kg)) en wacht u 2-3 minuten voor volledige inductie. Zorg ervoor dat het dier voldoende verdoofd is door de muis uit de kooi te halen en te bevestigen dat er geen teenknijpreflex is.
  2. Voer in een zuurkast transcardiale perfusie26 uit met zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde. Spuit de kop van het geëuthanaseerde dier met 70% ethanol tot het doorweekt is.
  3. Knip het hoofd aan de basis van de schedel af met een grote schaar. Knip de huid langs de middellijn van de hele schedel open met een rechte 4-1 / 2 "irisschaar. Trek de huid terug om de schedel bloot te leggen.
  4. Vanuit de opening van de ruggenmergholte in de nek, steek de irisschaar in en knip door de schedel langs de sagittale en interfrontale hechting.
  5. Steek vervolgens een schaar in de twee oogkassen en knip de frontale-neushechting door.
  6. Zorg er vooral voor dat u de hersenen niet beschadigt. Wrik de schedelplaten links en rechts open totdat de hersenen bloot komen te liggen.
  7. Breng de hersenen over in een scintillatieflesje met 4% paraformaldehyde. Houd de hersenen gedurende 4 uur in 4% paraformaldehyde bij 4 °C.
  8. De hersenen worden vervolgens cryobeschermd door 4% paraformaldehyde te vervangen door 30% sucrose. Houd de hersenen voor 30% sucrose bij 4 °C totdat de hersenen naar de bodem van de injectieflacon zinken (~12 uur).

4. Bevroren hersenen in secties snijden

  1. Stel de temperatuur van de cryostaatkamer in tussen -20 °C en -26 °C.
  2. Maak een coronale snede door het cerebellum en bevestig het platte, caudale deel van de hersenen op een cryostaathouder met een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT).
  3. Plaats de boorkop met de hersenen in de schijfhouder en lijn de bulbus olfactorius uit met het mes.
  4. Verdeel de hersenen in coronale plakjes met een dikte van 20 μm. Om strepen of kraslijnen op doorgesneden hersenplakjes te voorkomen, plaatst u een stuk tape op het snijplatform om een kleine opening te creëren tussen de anti-rolplaat en het platform. Een penseel kan worden gebruikt om de oriëntatie van de sectie aan te passen voordat deze op een positief geladen glasplaat wordt vastgelegd.
  5. Bewaar objectglaasjes met hersensecties bij -20 °C.

5. Immunohistochemie en kwantificering

  1. Verwerk de secties voor immunohistochemie met behulp van een primair antilichaam tegen NeuN, een pan-neuronale marker, volgens standaardprotocollen 22,26.
  2. Ontdooi gecryopreserveerde hersensecties gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de secties drie keer met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende elk 5 minuten.
  3. Incubeer de secties in 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om te permeabiliseren.
  4. Bereid de blokkeeroplossing (5% normaal geitenserum en 0,3% Triton X-100 in PBS) en incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de blokkeeroplossing.
  5. Verdun het primaire antilichaam, konijn anti-NeuN, in een verhouding van 1:500 in de blokkerende oplossing. Incubeer de coupes een nacht met de primaire antilichaamoplossing bij 4 °C.
  6. Was de secties drie keer met 0,3% Triton X-100 in PBS, gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  7. Verdun het secundaire antilichaam, geitenanti-konijn 568 of 488, in een verhouding van 1:1000 in PBS. Incubeer de secties met de secundaire antilichaamoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  8. Voer drie wasbeurten uit met 0,3% Triton X-100 in PBS, elk gedurende 5 minuten. Incubeer de secties met DAPI (1:10.000 in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Was de secties nog drie keer met PBS, elk gedurende 5 minuten. Monteer de gebeitste delen op een glazen dia met een fluorescentie-montagemedium en een glazen dekglaasje. Laat de gemonteerde objectglaasjes een nacht drogen.
  10. Beeld gekleurde dia's af met behulp van een 20x objectief met een confocale microscoop om beelden te verkrijgen van Reporter+-cellen rond de beroertelaesie in 3 verschillende coronale secties (tussen de anatomische gebieden van de kruising van het corpus callosum anterieur en de kruising van de anterieure commissuur posterieur) voor elk dier.
    OPMERKING: De afstand van de AAV-spreiding varieert binnen het halfrond. Op basis van onze ervaring en analyse van Reporter+-cellen na weefselverwerking, beslaat de AAV-spreiding echter over het algemeen ongeveer +3 mm tot -3 mm vanaf bregma. Reporter+-cellen rond de beroertelaesie (zoals geïdentificeerd door de afwezigheid/schaarse kleuring van NeuN) in het gebied tussen waar het corpus callosum de middellijn kruist en de voorste commissuur aansluit, moeten worden gekwantificeerd.
  11. Voer voor kwantificering van getransduceerde neuronen een colokalisatieanalyse uit. Tel handmatig het aantal dubbelpositieve cellen (Reporter+NeuN+) en het totale aantal getransduceerde (Reporter+) cellen in hersenplakjes. Voor de resultaten hierin werden >3 gezichtsvelden geteld rond de laesie (mediaal, lateraal en inferieur) van 3 coronale secties per muis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de cellulaire resultaten te onderzoeken van korte GFAP (gfaABC(1)D) promotorgestuurde, ectopische Neurod1-expressie in wildtype (C57BL/6J) en in transgene tdTom-Cre-reporterstammen (met name B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 twee op AAV5 gebaseerde systemen werden gebruikt bij muizen met een ET-1-beroerte (Figuur 1A-C). In een subacuut model van een beroerte werd

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft twee AAV-systemen en muismodellen voor het onderzoeken van de ectopische expressie van Neurod1 in de context van een mild-matig ET-1 corticale beroertemodel. Een aantal kritieke stappen met betrekking tot de ET-1-beroerte zijn belangrijk om te overwegen voor de reproduceerbaarheid en consistentie van de verwonding. Braamgaten moeten zorgvuldig worden geboord zonder de dura mater te doorboren om onbedoeld chirurgisch letsel te voorkomen. Het is belangrijk ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Heart and Stroke Foundation, Ontario Institute of Regenerative Medicine, Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) en Connaught Innovation Award (Universiteit van Toronto).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#77 Drill Bit (.018”)David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb™ Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Needle Size 4 - 0 BraidedCovidienGL-881
Anti-NeuN Antibody (rabbit) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 MiceCharles River027
Chlorhexidine SolutionPartnarPCH-020
Contec™ PREempt™ RTU Disinfectant SolutionFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Safety Razor Microtome BladesFeather12-631P
Fisherbrand Cover Glasses: RectanglesFisher Scientific12-545M 
Fluorescence Mounting MediumAgilent TechnologiesS3023 
Hamilton SyringeHamilton Company7634-01
High Speed Stereotaxic DrillDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Polyderm Ointment USPTARO2181908
SOMNI Scientific™ The Animal Temperature Heating PadFisher Scientific04-777-177
Stereotaxic InstrumentsDavid Kopf InstrumentsModel 902
Superfrost Plus Microscope Slides, whiteFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice The Jackson Laboratory007914
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901806
```

Referenties

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Neurod1-expressieischemisch slagchermodelGFAP-promotorherprogrammering van astrocytenstereotactische injectieendotheline-1-injectiegetransduceerde neuronenmuizenmodel voor beroerte
AAV-systemen en muismodellen voor het onderzoeken van ectopische expressie van neurod1 in getransduceerde cellen op subacute en chronische tijden na ischemische beroerte
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.