Methodenartikel

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

15 november 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Samenvatting

T-helpercellen die IL-17A produceren, bekend als Th17-cellen, spelen een cruciale rol in de immuunafweer en zijn betrokken bij auto-immuunziekten. CD4 T-cellen kunnen in vitro worden gestimuleerd met antigenen en goed gedefinieerde cytokinecocktails om Th17-celdifferentiatie in vivo na te bootsen. Er is uitgebreid onderzoek gedaan naar de Th17-differentiatieregulatiemechanismen met behulp van de in vitro Th17-polarisatietest.

Conventionele Th17-polarisatiemethoden omvatten doorgaans het verkrijgen van naïeve CD4 T-cellen van genetisch gemodificeerde muizen om de effecten van specifieke genen op Th17-differentiatie en -functie te bestuderen. Deze methoden kunnen tijdrovend en kostbaar zijn en kunnen worden beïnvloed door cel-extrinsieke factoren van de knock-outdieren. Een protocol dat gebruik maakt van retrovirale transductie van gids-RNA om genknock-out te introduceren in CRISPR/Cas9 knockin primaire muizen-T-cellen dient dus als een zeer nuttige alternatieve benadering. Dit artikel presenteert een protocol om naïeve primaire T-cellen te differentiëren tot Th17-cellen na retrovirale gemedieerde gentargeting, evenals de daaropvolgende flowcytometrie-analysemethoden voor het testen van infectie en differentiatie-efficiëntie.

Inleiding

Th17-cellen, een unieke subset van CD4+ T-helpercellen, zijn van vitaal belang voor het uitroeien van extracellulaire bacteriën en schimmels en spelen een belangrijke rol bij verschillende auto-immuunziekten 1,2,3. Opkomend bewijs suggereert dat Th17-cellen heterogeniteit vertonen en functioneren in zowel pathogene als niet-pathogene omstandigheden, beïnvloed door omgevings- en genetische factoren. Het ophelderen van de regulerende processen die de differentiatie van Th17-cellen, plasticiteit en heterogeniteit beheersen, is cruciaal voor de vooruitgang van effectievere immunotherapeutische strategieën.

Genetisch gemodificeerde dieren zijn op grote schaal gebruikt om de belangrijkste regulatoren van Th17-celdifferentiatie en -functies te onthullen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde dieren impliceert volledige manipulatie in vivo, het verstrekken van authenticiteit en systematische studie van zijn rol in fysiologische omstandigheden of ziektemodellen. Desalniettemin is high-throughput screening met deze aanpak grotendeels onpraktisch. In vitro polarisatietesten bieden een alternatief voor het bestuderen van Th17-celdifferentiatie. Van interleukine 6 (IL-6) in combinatie met transformerende groeifactor β1 (TGFβ1) is aangetoond dat het de ontwikkeling van niet-pathogene Th17-cellen bevordert, terwijl IL-6, IL-1β en IL-23 betrokken zijn bij het aansturen van de differentiatie van pathogene Th17-cellen (pTh17)4,5.

De opkomst van CRISPR/Cas9-technologie heeft nauwkeurige genoombewerking op specifieke basen mogelijk gemaakt. In combinatie met retrovirale transductie biedt deze benadering een krachtige, efficiënte en economische genetische methode voor het screenen en functioneel bestuderen van potentiële regulatoren in Th17-cellen 6,7. In deze studie hebben we de procedure voor retrovirale transductie binnen het Th17-polarisatiesysteem verbeterd. Met behulp van een retroviraal systeem infecteerden we vooraf vastgestelde Cas9-expressie geactiveerde naïeve T-cellen van muizen. De cellen werden getransduceerd met gids-RNA (gRNA)-constructies die werden aangestuurd door de U6-promotor, samen met genen die coderen voor fluorescerende reportereiwitten onder controle van de EF1a-promotor om de knock-out van het doelgen te vergemakkelijken. Vervolgens werden de getransduceerde T-cellen gekweekt onder specifieke cytokineomstandigheden om differentiatie in Th17-cellen te induceren. Met name het uitschakelen van RoR ̳t verminderde de IL-17A-productie aanzienlijk in vergelijking met de controlegroep. De effectiviteit van dit systeem hangt af van geoptimaliseerde retrovirusproductie en transductiecondities voor geactiveerde primaire T-cellen, wat een snelle en praktische benadering biedt voor het bestuderen van specifieke genen in Th17-differentiatie en -functie.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Experimental Animal Welfare Ethics Committee, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine en zijn in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

1. Retrovirale productie

  1. Bereiding van retroviraal construct
    1. Gebruik de CRISPick-tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) om het sgRNA te ontwerpen voor RORγt-knock-out8. Specificeer het referentiegenoom als Mouse GRCm38 en kies de PAM-sequentie als NGG (voor SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) op basis van het CRISPRko-gidssysteem. Valideer de naam van het doelgen of andere doelgenformaten en dien de geldige input in om sgRNA-kandidaten te verkrijgen. Stel andere parameters in op standaardwaarden, stel het sgRNA-doel in op RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) om de differentiatie van Th17 te verstoren en selecteer niet-gericht sgRNA (afgekort sgNT, sequentie: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) uit de GeCKO v2-bibliotheken van de muis.
      OPMERKING: Deze tool biedt een reeks klikbare opties voor het ontwerpen van gids-RNA's, waardoor deze gemakkelijk kan worden aangepast aan specifieke vereisten.
      1. Voer de naam van het doelgen in het zoekvak in onder de kolom Snel gen opzoeken. Het systeem geeft de gen-ID en de volledige naam van het doelgen weer om een nauwkeurige selectie te garanderen.
        OPMERKING: Er zijn extra opties beschikbaar voor het valideren van verschillende doelgenformaten.
    2. Kies een sgRNA gericht op Rorc (afgekort sgRorc) sequentie volgens de hoge gecombineerde rang en kiesvolgorde om off-target matches te voorkomen en de on-target werkzaamheid te vergroten (sgRorc-sequentie: GTCATCTGGGATCCACTACG). Synthese van twee oligonucleotiden voor sgRorc en sgNT: voor de voorwaartse oligo, voeg de sequentie "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" toe aan het 5'-einde van elke gidssequentie; Voor de omgekeerde oligo voegt u de sequentie "tttcgtcctttccaagatatataaagc" toe aan het 3'-einde van elke gidssequentie.
      OPMERKING: Meestal bestaan er meerdere opties voor sgRNA-sequenties. Het is essentieel om 2 of 3 sgRNA-sequenties te selecteren die gericht zijn op hetzelfde genotype om hun knock-outefficiëntie te beoordelen. In onze voorlopige experimenten werden twee gRNA's gericht op Rorc geselecteerd voor vergelijking (sgRNA-sequentie1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sgRNA-sequentie2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Experimentele resultaten gaven aan dat het gRNA dat in de huidige methode wordt gepresenteerd (sgRNA-sequentie1) een hogere knock-outefficiëntie vertoont tussen de twee.
    3. Amplificeer de sgRorc- en sgNT-coderende sequenties met behulp van DNA-polymerase in PCR met de bovenstaande primers en kloon ze in pMX-U6-MCS-vector (tussen de regio's van de U6-promotor en de gRNA-steiger) in frame met mCherry fluorescerend eiwit, respectievelijk9. Stel het reactiesysteem (50 μL) in als Tabel 1. Die primers bestaan uit sgRNA-sequentie (3'), die het sgRNA in de vector kan invoegen, en een segment van vectorsequentie (5'), die het vectorfragment van volledige lengte kan versterken. Ontwerp bovendien de voorwaartse en achterwaartse primers met een overlap van ongeveer 18 bp binnen het sgRNA-gebied (maar niet volledig overlappend), waardoor de assemblage van de gelineariseerde kloneringsvector tijdens het ligatieproces wordt vergemakkelijkt.
      OPMERKING: Een gelineariseerd vectorfragment op de plaats van de sgRNA-sequentie met primers door PCR van ongeveer 5.551 kd moet worden verkregen.
    4. Zuiver het construct met behulp van een gelextractiekit en maak het cirkelvormig met behulp van een kloonkit. Gebruik de recombinatieproducten voor transformatietesten.
    5. Pak de afzonderlijke klonen van platen en controleer sgRorc- of sgNT-coderende sequenties via sequencing van de eerste generatie, met behulp van U6-promotorprimer (sequentie: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Selecteer de gewenste enkele kloon voor amplificatie in de LB-bouillon. Extraheer hoogwaardig plasmide-DNA uit bacteriële cellen met behulp van een endotoxinevrije plasmidekit.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de plasmide-oplossing van hoge kwaliteit is. We raden aan dat de concentratie van de plasmideoplossing ten minste 1 μg/μl is.
  2. Voorbereiding van verpakkingscellen
    1. Bereid platina-E (Plat-E) cellen met behulp van de volgende procedure: kweek Plat-E-cellen met Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-medium) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/ml penicilline en 0,1 mg/ml streptomycine in een kweekschaaltje van 10 cm. Het zal in het navolgende het celkweekmedium worden genoemd.
      OPMERKING: Om de juiste transfectieefficiency te verkrijgen, raden wij aan cellen in de logaritmische groeifase met minder dan 15 passagenummers te gebruiken.
    2. Splits een volledige plaat van 10 cm Plat-E cellen (~2.6 × 107 cellen) bij een juiste verhouding in een nieuwe 10 cmschotel 1 dag vóór transfectie om een celsamenvloeiing van ongeveer 80% de volgende dag te bereiken, wat de optimale voorwaarde voor transfectie is. Voer celpassage uit voor een nieuwe schaal van 10 cm in een verhouding van 1:3 (zaad ~8 × 106 cellen in een nieuwe schaal van 10 cm de dag vóór transfectie).
      OPMERKING: De gespleten verhouding is afhankelijk van de de groeivoorwaarde van de cellen, met hogere transfectieefficiency haalbaar in cellen die robuuste groei vertonen. We voeren celpassage uit voor een schaaltje van 10 cm in een verhouding van 1:3. Voor verschillende schaaltjes van de celcultuur, zoals een schotel van 6 cm, raden we aan dat 1,5 × 106 Plat-E-cellen de dag vóór transfectie moeten worden gezaaid.
  3. Transfectie
    1. Één uur vóór transfectie, vervang het medium van de celcultuur met 8 ml verminderd serummedium zonder fenolrood met 5% FBS, maar zonder penicilline-streptomycine, omdat het met het transfectiereagens kan interfereren. Verwarm het ingedikte serummedium voor gebruik tot 37 °C.
    2. Bereid het transfectiemengsel voor dat mengsel 1 en mengeling 2 bevat: mengeling 1 omvat 18 μg plasmide-DNA (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) en 6 μg pCL-Ecotropic Retrovirale Vector (pCL-Eco) in 1.000 μL gereduceerd serummedium. Mengsel 2 bevat 48 μL transfectiereagens in 1.000 μL gereduceerd serummedium. Voeg mix 2 druppelsgewijs toe aan mix 1 en meng voorzichtig en grondig. Incubeer het complex gedurende 15-20 minuten bij 20-25 °C.
    3. Druppel het mengsel voorzichtig in de Plat-E-cellen en draai de plaat voorzichtig rond om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Incubeer de cellen bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 6-12 uur.
    4. Vervang het medium door 10 ml vers celkweekmedium en blijf de cellen gedurende 48 uur incuberen bij 37 °C, 5% CO2 .
    5. Beoordeel de transfectieefficiency in Plat-E-cellen door het retrovirale vectormerk te ontdekken, dat als proxy dient, via fluorescentiemicroscopie of stroomcytometrie.
      OPMERKING: Een sterk mCherry-fluorescentie (de fluorescentie positief overschrijdt 80%) signaal werd gedetecteerd in een aanzienlijk deel van de Plat-E-cellen die met de pMX-U6-MCS-vector worden getransfecteerd, wat wijst op succesvolle transfectie.
    6. Oogst het virusbevattende kweeksupernatans en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.500 × g om celfragmenten te verwijderen. Verrijk het virusoverschot 1 ml per injectieflacon en bewaar bij -80 °C.
      OPMERKING: Filtratie is een alternatieve methode voor het verwijderen van celresten. We raden aan om een spuitfilter te gebruiken met een poriegrootte van 0,45 μm en een polyethersulfon (PES)-membraan om de retentie van virale deeltjes op het filtermembraan te minimaliseren.

2. Retrovirale infectie van geactiveerde CD4 + T-cellen en Th17-differentiatie

  1. Voorbereiden en activeren van primaire naïeve CD4+ T-cellen
    1. Smeer elk putje van een celkweekplaat met 24 putjes in met 2 μg/ml anti-CD3e en 4 μg/ml anti-CD28 in steriel 500 μL PBS, wikkel de plaat in parafilm om verdamping en besmetting te voorkomen, en incubeer de plaat vervolgens een nacht bij 4 °C (of 37 °C gedurende 1-2 uur vóór het plateren van CD4+ T-cellen) op de dag voordat naïeve CD4+ T-cellen worden geïsoleerd.
      OPMERKING: Deze stap is nodig om plaatgebonden stimulatie voor de T-cellen van de muis uit te voeren voordat virale transductie wordt uitgevoerd.
    2. Euthanaseer de volgende dag 6-8 weken oude muizen die Cas9 tot expressie brengen (R26-CAG-Cas9-muizen) door CO 2-verstikking en steriliseer ze met 70% ethanol.
    3. Oogst de muizenmilt en plaats deze in PBS met 2% FBS en 100 μM EDTA (FACS-buffer).
    4. Maal de milt met gesteriliseerd geslepen glas (matte kant) in de FACS-buffer, homogeniseer het weefsel tot een eencellige suspensie en filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 ml.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u het weefsel voorzichtig en consequent maalt om het weefsel vochtig te houden. Het gewelddadig vermalen van het weefsel kan de overleving van cellen dramatisch beïnvloeden.
    5. Draai de miltcelsuspensie gedurende 5 minuten op 800 × g . Verwijder het bovenstaande en suspendeer de celpellet opnieuw in 2 ml lysisbuffer van rode bloedcellen. Laat het 5 minuten op kamertemperatuur staan en voeg dan FACS-buffer toe om een totaal volume van 15 ml te bereiken. Centrifugeer de splenocyten gedurende 5 minuten bij 800 × g .
    6. Resuspendeer de splenocyten en filtreer ze door een celzeef van 40 μm. Stel het uiteindelijke volume in op 1 ml voor de CD4+ T-celisolatie.
    7. Isoleer CD4+ T-cellen met behulp van commerciële reagenskits door de instructies in de handleiding te volgen.
    8. Label de CD4+ T-cellen met een fluorescerend antilichaammengsel (CD4, CD25, CD44 en CD62L) bij 4 °C gedurende 30 minuten, was de cellen met FACS-buffer en isoleer de naïeve CD4+ T-cellen met behulp van een flowcelsorteerder. Dit zal resulteren in het verkrijgen van CD4+CD25-CD62LhogeCD44lage naïeve T-cellen.
    9. Verwijder het plaatgebonden stimulatiesupernatans van de celkweekplaat met 24 putjes (bereid in stap 2.1.1) en spoel elk putje twee keer met 500 μl PBS. Plaat 1 x 106 naïeve CD4+ T-cellen in 1 ml lymfocytenkweekmedium in een putje van de celkweekplaat met 24 putjes. Incubeer de cellen in de celincubator.
      OPMERKING: Lymfocytenkweekmedium bevat 10% FBS, 100 eenheden/ml penicilline en 0,1 mg/ml streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES en 50 μM β-ME in RPMI 1640-medium.
  2. Retrovirale infectie
    1. Verzamel na 18-24 uur elk putje met geactiveerde cellen in de buis van 1,5 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 × g en gooi het bovenstaande weg.
    2. Resuspendeer de celpellet in 1 ml infectiemengsel (10 μg/ml hexadimethrinebromide, 10 mM HEPES in virussupernatant) en voeg 1 ml van het mengsel toe aan een nieuw putje van een celkweekplaat met 48 putjes. Bewaar in de tussentijd voldoende cellen als negatieve (niet-getransduceerde) controle.
      OPMERKING: Het is mogelijk om minder dan 1 x 106 geactiveerde naïeve CD4+ T-cellen per put te hebben, maar het wordt niet aanbevolen om minder dan 0.5 x 106 cellen per put te gebruiken. Bovendien mogen er geen cellen worden gezaaid in de perifere putjes van de kweekplaat met 48 putjes.
    3. Wikkel de plaat in met parafilm en centrifugeer gedurende 90 minuten bij 800 x g bij 32 °C. Stel versnellen en vertragen in op 3. Verwijder na het centrifugeren de parafilm, incubeer de cellen gedurende 4 uur in de incubator en ga verder met de differentiatiestappen.
  3. Differentiatie van geïnfecteerde cellen in Th17-cellen
    1. Bereid de antigeenpresenterende cellen (APC) voor tijdens retrovirale infectie. Verkrijg eerst splenocyten van wildtype muizen volgens de instructies in de stappen 2.1.2 tot en met 2.1.4. Resuspendeer de splenocyten met 1 ml lymfocytenkweekmedium met 50 μg/ml mitomycine in een buisje van 15 ml. Incubeer de splenocyten gedurende 1 uur bij 37 °C onder 5% CO2 .
    2. Voeg een uur later PBS toe tot de 15 ml-markering om de splenocyten te wassen, centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg, suspendeer de splenocyten opnieuw met 1 ml lymfocytenkweekmedium en tel het celaantal. APC-cellen zijn met succes geprepareerd.
    3. Na de 4 uur celincubatie (zoals in stap 2.2.3) worden de getransduceerde CD4+ T-cellen verzameld in buisjes van 1,5 ml en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 800 x g . Gooi het bovenstaande weg en suspendeer geïnfecteerde cellen in 600 μL PBS om te wassen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g en gooi het bovenstaande weg.
    4. Plaats 0,5 × 106 getransduceerde CD4+ T-cellen in 1 ml lymfocytenkweekmedium met 1,5 x 106 APC-cellen in een putje van een celkweekplaat met 24 putjes. Vul aan met 2 μg/ml anti-CD3e, 2 μg/ml anti-CD28 en Th17 celdifferentiatiecocktail, die 10 μg/ml anti-IFNγ, 10 μg/ml anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/ml anti-IL4, 2,5-3 ng/ml hTGF-β en 20-30 ng/ml IL-6 bevat. Kweekcellen gedurende 2 dagen.
    5. Verzamel elk putje met cellen in de buisjes van 1,5 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten op 800 x g en gooi het supernatant weg. Ververs de nieuwe 1 ml van het lymfocytenkweekmedium alleen met 3 ng/ml TGF-β en 30 ng/ml IL-6. Plaats de cellen gedurende een langere kweekperiode in een nieuw putje met een celkweekplaat met 24 putjes. Analyseer de cellen 2 dagen na de mediumverandering.

3. Evaluatie van de transductie-efficiëntie en differentiatieresultaten

  1. Verzamel na twee dagen van mediumverandering cellen en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 800 × g en gooi het bovenstaande weg. Behandel gedifferentieerde cellen met 50 ng/ml phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), 500 ng/ml ionomycine en 5 μg/ml brefeldin A in 500 μl lymfocytenkweekmedium in een nieuw putje met 24 putjes celkweekplaat bij 37 °C incubator gedurende 4 uur. Oogst de helft van de cellen voor flowcytometrie-analyse en lyseer de andere helft van de cellen met RNA-extractiebuffer voor qPCR-analyse.
  2. Voor flowcytometrie-analyse
    1. Verzamel de cellen in buisjes van 1,5 ml. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan buisjes en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 × g om de cellen te wassen.
    2. Resuspendeer de celpellet met een mengsel van fluorescerende antilichamen (CD4 en fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof in 100 μl PBS) en kleur de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    3. Was de cellen met 300 μL PBS en fixeer ze met 300 μL 2% fosfaatgebufferd formaldehyde (FA) bij 4 °C gedurende minimaal 60 min.
    4. Was een uur later de cellen met PBS, suspendeer ze opnieuw met 600 μL 1x permeabilisatiebuffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 × g .
    5. Gooi het bovenstaande weg en kleur met anti-IL-17A in 100 μL 1x permeabilisatiebuffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur of 4 °C gedurende een nacht.
    6. Was de cellen de volgende dag met 1x permeabilisatiebuffer en suspendeer ze opnieuw in 200 μL PBS. Analyseer de cellen door middel van flowcytometrie10. Zie de sectie Representatieve resultaten.
  3. Extraheer voor qPCR-analyse RNA volgens de instructies van de RNA-extractiekit. Reverse-transcriptie van het RNA in cDNA voor opslag of daaropvolgende qPCR-analyse. Het ontwerp van deze primers moet voldoen aan de algemene ontwerpprincipes van qPCR-primers, terwijl het ook specifiek gericht is op het gebied dat zich uitstrekt over de verwachte indel-locatie, waar gRNA-gemedieerde splitsing heeft plaatsgevonden. Elke vermindering van de versterkingsefficiëntie of signaalverlies op deze locatie kan dienen als een indicator van een succesvolle knock-out. De qPCR-primers zijn als volgt:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Resultaten

In de studie hebben we het sgRNA-doelwit gekloond naar Rorc- en sgRNA-niet-targeting-coderende sequenties in pMX-U6-MCS-vector met mCherry fluorescerend eiwit (Figuur 1A,B). De productie van retrovirussen werd uitgevoerd volgens het protocol dat wordt beschreven in figuur 2. De transfectie werd geïnitieerd op dag 0, en de retrovirale oogst vond op dag 2 plaats. De efficiëntie van de transfectie kan worden getest door de mCherry-fluorescentie-intensiteit (Figuur 1C). Voordat het virus werd geoogst, werden naïeve CD4+ T-cellen gesorteerd en geactiveerd. Deze geactiveerde CD4+ T-cellen werden vervolgens geïnfecteerd met behulp van spin-infectie, gevolgd door voortzetting van de differentiatiestappen zoals beschreven. Ten slotte werden de efficiëntie van transductie en de resultaten van differentiatie geëvalueerd met behulp van flowcytometrie-analyse en qPCR-analyse.

Figuur 3 illustreert de poortstrategie die wordt toegepast voor het sorteren van naïeve CD4+ T-cellen. Na het selecteren van de hoofdcelpopulatie en singletcellen (zoals weergegeven in de eerste twee poorten van figuur 3), werden FVD-CD4+-cellen afgeschermd om CD4 T-cellen in gepolariseerde tot Th17-cellen te onderscheiden van die in APC's. Ten slotte vertegenwoordigt IL-17A geproduceerd door CD4 T-cellen de Th17-differentiatie-efficiëntie, wat de knock-outefficiëntie aangaf. Het percentage mCherry-positieve cellen weerspiegelt de efficiëntie van retrovirale infectie, terwijl de knock-outefficiëntie wordt aangegeven door het percentage IL-17A-positieve cellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren en de sorteerduur te minimaliseren, werden splenocyten verrijkt met behulp van een CD4+ T-celisolatiekit voor muizen, wat resulteerde in een verrijkingsefficiëntie van meer dan 90%.

De efficiëntie van retrovirusinfectie, aangegeven door de aanwezigheid van mCherry-positieve cellen, ligt doorgaans rond de 40% (Figuur 4A). Hoewel de infectie-efficiëntie kan worden verhoogd door virusconcentratie, gaat deze aanpak ten koste van een langere experimentele duur en hogere kosten. In onze experimenten dienden geïnfecteerde cellen gekweekt zonder de Th17-celdifferentiatiecocktail als de Th17-differentiatie-negatieve controle, aangeduid als Th0. Een niet-gericht sgRNA werd gebruikt als positieve controle, sgNT genoemd. Voor genbewerking gebruikten we gRNA gericht op het RORγt-gen (sgRNA-Rorc), dat de Th17-differentiatie-efficiëntie aanzienlijk verminderde (Figuur 4A). Deze interventie leidde ook tot een substantiële afname van de expressieniveaus van Rorc en IL-17a (Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 1: Voorbeeld van sgRNA dat is gesubkloond tot een retrovirale vector en transfectie-efficiëntie. De pMX-U6-MCS-vector werd gebruikt als de initiële constructie. De gRNA-steiger, samen met de sgRNA-sequenties (het oranje deel) gericht op de (A) vervormde plaats en (B) Rorc, werden stroomafwaarts van de U6-promotor ingebracht (het groene deel als een sectie voor sequencing met U6-primers). De locaties van de sgRNA-bevattende primers en sequencing primer sites zijn aangegeven onder de cirkelvormige vector De volledige namen van de afkortingen op het plasmide zijn als volgt. Afkortingen: AmpR = resistentie tegen ampicilline, carbenicilline en verwante antibiotica; LTR = lange terminale herhaling; MMLVψ = verpakkingssignaal van het Moloney muizenleukemievirus; gag = afgekapt Moloney muizenleukemievirus (MMLV) gag-gen zonder het startcodon. (C) Microscopische beeldvorming van mCherry in plasmide-DNA-getransfecteerde Plat-E-cellen. Schaal balk: 500 px. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schematische illustratie van het protocol. De dag vóór transfectie moet de dichtheid van de Plat-E-cellen worden aangepast aan een juiste waaier. De volgende dag (dag 0), voer transfectie uit en vervang het medium 12 uur later. Sorteer en activeer op dag 1 de naïeve T-cellen van muizen die Cas9 tot expressie brengen. Oogst vervolgens (dag 2) het virusbevattende kweeksupernatans en combineer met de geactiveerde T-cellen voor retrovirale transductie. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens gedurende 3-4 dagen gedifferentieerd tot Th17-cellen en geanalyseerd met behulp van FACS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Gating strategie voor het sorteren van de CD4 naïeve T cellen. Oppervlaktekleuring werd uitgevoerd op de verrijkte CD4 T-cellen om CD4, CD25, CD44 en CD62L te labelen. De gebruikte poortstrategie was als volgt: aanvankelijk werden lymfocyten afgeschermd op basis van parameters voor voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing. Vervolgens werden afzonderlijke cellen geïdentificeerd met behulp van FSC-H en FSC-W. CD4+CD25-cellen werden vervolgens afgeschermd om regulerende T-cellen (Tregs) uit te sluiten. Ten slotte werden CD44lageCD62Lhoge naïeve T-cellen geïdentificeerd. De geïsoleerde CD4+ naïeve T-cellen werden verzameld voor latere experimenten. Afkortingen: FSC = voorwaartse verstrooiing; SSC = zijverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Voorbeeld van succesvolle transductie van geactiveerde T-cellen en Th17-differentiatie. (A) De differentiatie-efficiëntie van Th17 wordt aanzienlijk verminderd, wat wordt bewerkt door RORγt gRNA (gating op mCherry+ IL-17a+populatie). (B) Rorγt en IL-17a relatieve mRNA-expressie in Th0 (geïnfecteerde cellen gekweekt zonder Th17-celdifferentiatiecocktail), sgNT (niet-gericht sgRNA) en sgRNA-Rorc (sgRNA gericht op het RORγt-gen ). p < 0,001 (ongepaarde tweezijdige student-t-toets; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PCR-reactie componentenPCR-programma
BestanddeelInhoud (μL)StapTemp.TijdCyclus
2 × Phanta Mix (Dye Plus)25195 ºC3 minuten1
ddH2020295 ºC15 s
Primer-F (10 μM)2356 ºC15 s
Primer-R (10 μM)2472 ºC5 min 30 sGa naar stap 2
35 ×
Sjabloon (~30 ng)1572 ºC5 minuten1
612 ºC∞

Tabel 1: PCR-reactiecomponenten en PCR-programma voor de constructie van gRNA-vectoren.

Discussie

CRISPR/Cas9-genoombewerking via retrovirale toediening is een robuuste methode om de rol van helper-T-cellen te onderzoeken. Dit protocol biedt een snelle en effectieve benadering voor het onderzoeken van specifieke genen die betrokken zijn bij Th17-differentiatie en -functie. Verschillende cruciale stappen moeten zorgvuldig worden gevolgd om optimale resultaten te bereiken. Ten eerste moeten gRNA's zorgvuldig worden geselecteerd voor een betere efficiëntie van genknock-out. Gezien het risico van off-target effecten bij het bewerken van CRISPR/Cas9-genen, is het verstandig om 2-3 gRNA's met hoge scores te kiezen, zoals geïdentificeerd in protocolsectie 1.1.1, voor verdere experimenten11,12. Ten tweede is een hoge virale titer essentieel voor een succesvolle infectie. Een goed onderhoud van de Plat-E verpakkingscellijn is cruciaal. De cellen zouden ongeveer 80% samenvloeiing op de dag van transfectie moeten bereiken, aangezien zowel ontoereikende als buitensporige celaantallen virustiters in gevaar zullen brengen. Als Plat-E-cellen niet beschikbaar zijn, kan het co-transfecteren van menselijke embryonale nier 293T-cellen met de pCL-Eco-vector ook hoge virale titers produceren13,14. Het handhaven van een hoge plasmideconcentratie van ten minste 1 μg/μL is belangrijk voor het bereiken van een hoge virustiter. Het is essentieel om de virussuspensie te oogsten voordat deze citroengeel wordt, omdat het virus gevoelig is voor pH-verandering. Daarom moet de pH van het kweekmedium zorgvuldig worden geregeld binnen een geschikt bereik. Het virus moet worden bewaard bij -80 ºC om zijn integriteit te behouden en te beschermen tegen herhaalde vries-dooicycli15.

Ten derde moeten primaire cellen adequaat worden geactiveerd om een hoge infectie-efficiëntie te bereiken. Ontoereikende cellulaire activering brengt de efficiëntie van virale infecties aanzienlijk in gevaar16. Vóór virale infectie moet de activeringsstatus van T-cellen microscopisch worden bevestigd, aangezien geactiveerde cellen een aanzienlijk grotere omvang vertonen dan geïnactiveerde cellen. Het is vermeldenswaard dat ons Th17-differentiatieprotocol speciaal is geoptimaliseerd voor C57BL/6-muizen, dus aanpassingen kunnen nodig zijn voor andere muizenstammen. Ten vierde is het handhaven van optimale cellulaire omstandigheden cruciaal om de gewenste Th17-differentiatieresultaten te bereiken. Tijdens spin-infectie is het belangrijk om de cellen in de putjes in de buurt van het midden te plaatsen om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Na een spininfectie is het incuberen van de cellen gedurende 4 uur (protocolstap 2.2.4) cruciaal voor hun herstel. Bovendien is bij het overbrengen van cellen voorzichtig pipetteren belangrijk om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Verschillende stimulatiecondities kunnen van invloed zijn op de Th17-differentiatie. In dit experiment verbeterde het opnemen van antigeenpresenterende cellen in het differentiatiesysteem de differentiatie-efficiëntie aanzienlijk in vergelijking met anti-CD3e en anti-CD28 plaatgebonden stimulatie. Ten slotte is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat alle gebruikte cytokines functioneel blijven tijdens transport en opslag. Cytokinen kunnen snel hun stabiliteit verliezen bij herhaalde vries-dooicycli of ongeschikte reconstitutieoplossingen. Koudebehandeling en gelijke aliquots zijn nodig voor cytokines om functies te behouden tijdens de procedures.

Dit protocol voor het genereren van specifieke gen knock-out Th17-cellen heeft verschillende beperkingen. Ten eerste is het moeilijk om volledige transductie-efficiëntie te bereiken in primaire T-cellen van muizen. Sommige cellen ondergaan mogelijk niet de beoogde genknock-out tijdens Th17-differentiatie. Ten tweede hebben primaire T-cellen in vitro een beperkte levensduur. Na ongeveer een week hebben deze cellen de neiging om af te sterven, wat een uitdaging vormt voor latere experimenten. Ten derde is ons protocol gebaseerd op Cas9 transgene muizen en toen we probeerden de Cas9-sequentie in het kernplasmide op te nemen, resulteerde dit in een significante vermindering van virale titers. Ten slotte merken we op dat dit protocol niet geschikt is voor het analyseren van functies van genen die betrokken zijn bij de vroege stadia van naïeve CD4+ T-celactivering, aangezien die cellen moeten worden geactiveerd voorafgaand aan retrovirale transductie.

Ondanks zijn beperkingen is dit protocol met succes toegepast in verschillende onderzoeken, waardoor de exploratie van de belangrijkste genetische regulatoren die betrokken zijn bij Th17-differentiatie is vergemakkelijkt. Het maakt de beoordeling mogelijk van veranderingen in de efficiëntie van Th17-differentiatie na de knock-out van doelgenen in geactiveerde T-cellen. Bovendien is dit protocol geschikt voor het evalueren van andere aspecten van de Th17-celfunctie, waaronder celproliferatie, overleving, stabiliteit van de transcriptiefactor, cytokinesecretie en immuunresponsen. Bovendien heeft ons lab zijn effectiviteit aangetoond bij de retrovirale transductie en differentiatie van geïnduceerde regulerende T-cellen (iTregs). Hoewel niet alle soorten T-cellen zijn getest, kan dit protocol ook van toepassing zijn op andere subsets, zoals Th1-, Th2- en CD8+ T-cellen. Over het algemeen dient deze techniek als een waardevol hulpmiddel voor het uitvoeren van genknock-outs in immuuncellen, wat een aanzienlijk potentieel biedt voor het blootleggen van kritieke genetische signalen die immuunfuncties reguleren.

Openbaarmakingen

De auteurs stellen dat er geen sprake is van belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken Dou Liu, Dongliang Xu en Pinpin Hou van de kernfaciliteit van het Shanghai Immune Therapy Institute voor hun ondersteuning bij het gebruik van de instrumenten. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 en 32350007(aan Linrong Lu); 32100718 (naar Xuexiao Jin); Innovatief onderzoeksteam van lokale universiteiten op hoog niveau in Shanghai SHSMU-ZLCX 20211600 (naar Linrong Lu); Intern incubatieprogramma RJTJ24-QN-076 (naar Zejin Cui). Figuur 2 is voorbereid met Figdraw.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA (pH 8.0)SolarbioE1170
100 mm cel- en weefselkweekbakjeBIOFILTCD010100
1 M Hepes (vrij zuur, sterieel)SolarbioH1090
24-well cel- en weefselkweekplaatNEST702002
48-well cel- en weefselkweekplaatNEST748002
Brefeldin A oplossing (1.000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 anti-muis CD4 antilichaam (RM4-5)BioLegend100546
CD3e monoklonaal antilichaam (145-2C11), functionele graad, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 monoklonaal antilichaam (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) monoklonaal antilichaam (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
CeltellerNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Celzevener (40 μm)biosharpBS-40-CS
Celzevener (70 μm)biosharpBS-70-CS
Centrifuge eppendorf5425 R
Centrifuge eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II One Step Cloning KitVazymeC112
DH5α Competent CellsSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation KitSTEMCELL19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit IITIANGENDP118-02
ExFect Transfectie ReagensVazymeT101-01
Fetaal bovien serum, Premium PlusGibcoA5669701
FITC anti-muis IL-17A antilichaam (TC11-18H10.1)BioLegend506907
Formaldehyde oplossingMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix voor qPCR?+gDNA wiper?VazymeR423-01
IonomycinBeyotimeS1672
Mitomycin CMaokang Biotechnology7/7/1950
Muis GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Reduced Serum MediumGibco31985070reduced serum medium
Pacific Blue anti-muis CD4 antilichaam (RM4-5)BioLegend100531
PE/Cyanine7 anti-muis CD25 antilichaam (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 anti-muis CD4 antilichaam (GK1.5)BioLegend100422
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 muizen Shanghai Model Organisms CenterCat. NO. NM-KI-00120
Recombinant Human TGF-beta 1 (CHO-Expressed) Proteïne, CFR&D Systems11409-BH
Recombinant Muis IL-6PeproTech216-16
Research Cell AnalyzerBD BiosciencesBD LSRFortessa
Research Cell SorterSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler PCR SysteemApplied BiosystemsA24811
Natriumpyruvaat oplossing (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis CD28 antilichaam (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis IFN-γ antilichaam (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis IL-4 antilichaam (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis IL-12/IL-23 p40 antilichaam (C17.8)BioLegend505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)SolarbioM8211
```

Referenties

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Retrovirale TransductieCD4 T cellenFlowcytometrieIn Vitro PolarisatieROR Gamma TSingle Guide RNAImmuunregulatie
Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.