Methodenartikel

Poreuze elektroporatie op basis van substraat met transepitheliale elektrische impedantiebewaking

DOI:

10.3791/66971

⸱

27 september 2024

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poreuze substraatelektroporatie (PSEP) combineert een consistente, hoge doorvoer met een hoge cellevensvatbaarheid. De introductie van transepitheliale elektrische impedantiemetingen (TEEI) geeft inzicht in de intermediaire processen van PSEP en maakt labelvrije levering mogelijk. In dit artikel wordt een methode besproken voor het gelijktijdig uitvoeren van PSEP-afgifte-experimenten en TEEI-meetanalyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poreuze substraatelektroporatie (PSEP) is een opkomende methode van elektroporatie die zorgt voor een hoge doorvoer en consistente afgifte. Net als veel andere soorten intracellulaire toediening, vertrouwt PSEP sterk op fluorescerende markers en fluorescerende microscopie om een succesvolle toediening te bepalen. Om inzicht te krijgen in de tussenstappen van het elektroporatieproces werd een PSEP-platform met geïntegreerde transepitheliale elektrische impedantie (TEEI) monitoring ontwikkeld. Cellen worden gekweekt in in de handel verkrijgbare inzetstukken met poreuze membranen. Na een incubatietijd van 12 uur om de vorming van een volledig confluente celmonolaag mogelijk te maken, worden de inzetstukken in transfectiemedia geplaatst die zich in de putjes van het PSEP-apparaat bevinden. De monolagen van de cellen worden vervolgens onderworpen aan een door de gebruiker gedefinieerde golfvorm en de afgifte-efficiëntie wordt bevestigd door middel van fluorescerende microscopie. Deze workflow kan aanzienlijk worden verbeterd met TEEI-metingen tussen pulserende en fluorescerende microscopie om aanvullende gegevens over het PSEP-proces te verzamelen, en deze aanvullende TEEI-gegevens zijn gecorreleerd met leveringsstatistieken zoals leveringsefficiëntie en levensvatbaarheid. In dit artikel wordt een protocol beschreven voor het uitvoeren van PSEP met TEEI-metingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporatie is een techniek waarbij cellen worden blootgesteld aan een elektrisch veld, waardoor tijdelijke poriën in het celmembraan ontstaan waar ladingen, waaronder eiwitten, RNA en DNA, doorheen kunnen gaan 1,2. De meest gebruikte versie is bulkelektroporatie (BEP). BEP wordt uitgevoerd door een cuvet te vullen met een elektrolyt dat miljoenen cellen bevat, de elektrolyt bloot te stellen aan hoge spanning en lading de cellen binnen te laten komen via diffusie of endocytose1. Er zijn veel voordelen aan BEP, waaronder een hoge doorvoer en tal van in de handel verkrijgbare systemen. Er zijn echter beperkingen aan de BEP-levering. Inconsistente positionering van de cellen ten opzichte van de elektroden en afscherming van elektrische velden van aangrenzende cellen veroorzaakt aanzienlijke variabiliteit in blootstelling aan elektrische velden tijdens BEP 3,4. De hoge spanning die nodig is voor BEP heeft ook een aanzienlijke negatieve invloed op de levensvatbaarheid van de cellen5. Sinds de introductie in 20116 is er een groeiende belangstelling voor een elektroporatiemethode die poreuze substraatelektroporatie (PSEP) wordt genoemd, hoewel deze soms met andere namen wordt aangeduid, waaronder gelokaliseerde elektroporatie en nano- of micro-elektroporatie 1,7,8. In tegenstelling tot de celsuspensie van BEP, wordt PSEP uitgevoerd op cellen die hechten aan een poreus substraat. Niet alleen heeft een aanhangende toestand de voorkeur voor de meeste menselijke cellijnen9, maar de poriën in het substraat richten zich ook op de elektrische stroom, waarbij de transmembraan elektrische potentiaal (TMP) wordt gelokaliseerd in specifieke delen van het celmembraan10,11. Deze lokalisatie zorgt voor een aanzienlijke vermindering van de aangelegde spanning, waardoor de schade afneemt en de levensvatbaarheid van de cel toeneemt. Deze combinatie van effecten helpt de ontwikkeling van de celmembraanporiën onder controle te houden, wat resulteert in een consistentere en efficiëntere afgifte 1,5,12.

Een recente studie introduceerde een PSEP-apparaat met een vergulde elektrode-array met zes putjes voor het vasthouden van in de handel verkrijgbare poreuze membraaninzetstukken13 (Figuur 1A,B), een praktijk die voor het eerst werd geïntroduceerd door Vindis et al.14. Het apparaat kan pulsen toepassen en de elektrische impedantie over de celmonolaag meten, bekend als de transepitheliale elektrische impedantie (TEEI), in realtime13. De gebruikersinterface van het apparaat biedt volledige controle over de elektroporatiegolfvorm en polariteit. Belangrijk is dat real-time impedantiemetingen kunnen worden gebruikt om toedieningsresultaten te voorspellen zonder dat er dure reagentia of fluorescerende markers nodig zijn, een concept dat bekend staat als labelvrije afgifte15.

Het PSEP-platform bestaat uit twee belangrijke op maat gemaakte elektrische componenten: het hoofdgedeelte van het apparaat, waarin de pulsgenerator en TEEI-meetapparatuur zijn ondergebracht, en de elektrode-array, waar de poreuze substraten worden ingebracht en de elektroporatie plaatsvindt. Schema's voor alle aangepaste elektronica en 3D-geprinte componenten zijn te vinden op GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Naast de maatwerk elektronica is er ook een computer nodig om het platform goed te laten functioneren. De aangepaste software vereist MATLAB (versie 2021a of hoger) om te draaien en Microsoft Excel om gegevens op te slaan en te openen voor analyse. Het programma bestuurt de aangepaste elektronica en biedt de grafische gebruikersinterface (GUI) voor het aanpassen van instellingen. Deze programma's werden ook beschikbaar gesteld op GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Voorlopige gegevens suggereren dat dit proces mogelijk is voor verschillende soorten hechtende cellen (Figuur 1C), maar dit artikel zal alleen de voorbereiding van A431-cellen bespreken met behulp van parameters die door Brooks et al. als optimaal werden bevonden voor deze cellijn.13. Omdat de lading propidiumjodide (PI) cytotoxisch is, worden bovendien twee experimenten uitgevoerd, de eerste met een PI-transfectiemedia met een hoge concentratie om de leveringsefficiëntie te kwantificeren, en de tweede met alleen celkweekmedia om TEEI over langere tijdschalen te meten. Deze experimenten maken gebruik van identieke elektroporatiegolfvormen, waardoor de resultaten kunnen worden gecorreleerd (Figuur 1D).

figure-introduction-1
Figuur 1: Assemblageschema van de elektrode-array en basisgegevens. (A) CAD-model van een inzetstuk in een putje van de elektrode-array. (B) CAD-model van de elektrode-array. (C) Impedantieverhoging als gevolg van PSEP voor bepaalde cellijnen, n = 3 per cellijn. Foutbalk: standaardfout van het gemiddelde. (D) Leveringsefficiëntie vs. TEEI verhoogt de correlatiegegevens. De afgifte-efficiëntie werd berekend door het aantal cellen dat in zowel PI- als calceïne-afbeeldingen van toedieningsexperimenten was gelabeld, te delen door het totale aantal cellen dat met Hoechst was geïdentificeerd. Het celgetal werd bepaald met behulp van een aangepaste CellProfiler-pijplijn, n = 6 per spanning. Foutbalk: (x- en y-as) standaardfout van het gemiddelde. Deze figuur is met toestemming overgenomen uit Brooks et al.13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van reagentia en celcultuur

  1. Bereid de celkweekmedia voor door 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml penicilline-streptomycine toe te voegen aan een container van 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Maak elf aliquots van 50 ml om het risico op besmetting te verminderen en zet in de koelkast bij 4 °C.
  2. Maak 1 ml van 25 μg/ml humaan plasma fibronectine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Maak 15 ml propidiumjodide van 0,1 mg/ml in DMEM-voorraadoplossing om experimenten met variërende ladingconcentraties mogelijk te maken.
  4. Kweek A431-cellen in een T75-kolf die 12 ml van de bereide celkweekmedia bevat. Cellen werden elke 1-2 dagen gepasseerd om 50% confluentie te behouden.

2. Voorbereiding van het monster

  1. Fibronectine coating
    1. Selecteer twaalf inzetstukken en twee platen met 24 putjes. Plaats de inzetstukken in één putplaat en maak twee rijen van zes. Leg de tweede putplaat opzij tot later.
    2. Maak 1.300 μL 1 μg/ml fibronectine-oplossing door 52 μL fibronectine-stockoplossing en 1.248 μL PBS te mengen in een buisje van 1,5 ml.
    3. Verdeel 100 μL van de fibronectine-oplossing in elke inzetstuk. Incubeer de inzetstukken in de putplaat bij 37 °C gedurende 3 uur.
  2. Aanpassen van de celconcentratie voor een optimale celdichtheid
    1. Ongeveer 1 uur voordat de incubatie van fibronectine is voltooid, verwijdert u de T75-kolf met A431-cellen uit de incubator voor celextractie.
    2. Verwijder het media in de kolf met een aspirator en was met 5 ml PBS. Verwijder de PBS op dezelfde manier en voeg 3 ml trypsine toe. Incubeer 3-4 minuten voordat u op de zijkant van de kolf tikt om de cellen volledig los te maken.
    3. Voeg 6 ml celkweekmedia toe aan de kolf, meng krachtig met een pipet om eventuele resterende cellen los te maken en breng de inhoud over in een centrifugebuisje van 15 ml. Centrifugeer bij 100 x g en 20 °C gedurende 5 min.
    4. Verwijder de celkweekmedia en trypsine uit de centrifugebuis met behulp van een aspirator en zorg ervoor dat u de celpellet niet verstoort. Voeg 1 ml media toe aan de centrifugebuis en pipet heen en weer (zonder belletjes te produceren) om de celpellet te breken en de cellen opnieuw te suspenderen.
    5. Pipetteer 10 μl van de celsuspensie, 40 μl celkweekmedia en 50 μl trypanblauwe kleurstof in een buis van 200 μl en gebruik een pipet om grondig te mengen.
    6. Verwijder 10 μL van het kleurstofmengsel en injecteer het in een hemocytometer. Tel de cellen met behulp van de 10% verdunning van het kleurstofmengsel om het totale celgetal in de centrifugebuis van 15 ml te schatten.
      OPMERKING: Ga voor dit protocol uit van een concentratie van 5.000.000 cellen/ml.
    7. Vermenigvuldig de gewenste zaaidichtheid met het oppervlak van het insertmembraan, deel door het aantal cellen/ml in de suspensie en vermenigvuldig met 1.000 om de vereiste microliter celsuspensie per insert te berekenen.
      1. Om de totale benodigde hoeveelheid benodigde celsuspensie te bepalen, vermenigvuldigt u dit getal met 10 (om voldoende cellen voor 9 monsters te garanderen, aangezien 3 van de 12 inserts celvrije controles zijn) en rondt u af op het dichtstbijzijnde gehele getal. In dit geval is voor dit experiment in totaal 135 μl van de celsuspensie nodig.
    8. Creëer 2.000 μL aangepaste celoplossing door de eerder berekende 135 μL van de celsuspensie te mengen met 1.865 μL celkweekmedia in een aparte centrifugebuis van 15 ml.
  3. Cellen zaaien
    1. Verwijder het teveel aan fibronectine uit elk inzetstuk zodra de incubatie van fibronectine is voltooid.
    2. Was de inzetstukken twee keer door aan elk inzetstuk 100 μL steriel gedestilleerd water toe te voegen. Verwijder het water in dezelfde volgorde als waarin het is toegevoegd om een consistente wastijd tussen de inzetstukken te garanderen.
    3. Was de inzet opnieuw door 100 μL celkweekmedia aan elke inzet toe te voegen. Verwijder het medium in dezelfde volgorde als waarin het is toegevoegd om een consistente wastijd tussen de inzetstukken te garanderen.
    4. Invoegsels voor celmonsters
      1. Zaadcellen door 200 μL aangepaste celoplossing in elke insert te pipetteren. Om een consistente samenvloeiing tussen de inzetstukken te garanderen, mengt u de celoplossing in de centrifugebuis vóór de distributie en mengt u deze na de distributie opnieuw in elke wisselplaat.
    5. Inzetstukken voor negatieve controle
      1. Pipetteer 200 μl celkweekmedia in elke inzetstuk. Om consistent te blijven met de inzetstukken van het celmonster, gebruikt u de pipet om de celkweekmedia in elk inzetstuk te mengen.
  4. Etikettering en incubatie
    1. Trek met een permanente marker een lijn die de plaat van het tweede putje verdeelt in twee kolommen van drie putjes breed (voor omstandigheden die in drievoud worden uitgevoerd). Verdeel elke kolom in rijen. Label elk gebied in het raster met relevante parameters.
    2. Voeg 1 ml celkweekmedia toe aan elk putje om een inzetstuk voor het experiment te ontvangen. Breng de inzetstukken over van de plaat van de voorbereidingsput naar de juiste locatie in de geëtiketteerde plaat van de experimentput en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 12 uur.

3. Experimentele procedure

  1. Experiment met levering
    1. Pipetteer 1,5 ml van de 0,1 mg/ml PI-oplossing in elk putje in de elektrode-array. Plaats een inzetstuk in elk putje in de elektrode-array en plaats de voeten van het inzetstuk in de uitlijngroeven zodat het inzetstuk gelijk ligt met het bovenoppervlak van het putje (Figuur 1A,B).
    2. Schroef de printplaat (PCB) van de bovenste elektrode op de bovenkant van de putjes van de elektrode-array en sluit de elektrode-array aan op het PSEP-apparaat.
    3. Plaats de elektrode-array minimaal 1 uur in de incubator van 37 °C om de temperatuur in evenwicht te laten komen.
    4. Klik op de drop-down naast "Membraan" in de linkerbovenhoek van de GUI en klik op 400 nm GBO. Herhaal deze stap voor 'Elektrolyt', 'Cellen', 'Celseedingdichtheid' en 'Celduur' en selecteer respectievelijk DMEM, A431, 200 en 12.
      OPMERKING: Deze waarden zijn alleen bedoeld voor het bijhouden van gegevens en hebben geen invloed op de functie van het apparaat. Zorg ervoor dat u deze waarden indien nodig aanpast voor een correcte gegevenstracering.
    5. Typ 1 in het bewerkingsveld Post-pulstijd (min) aan de rechterkant van de GUI om de standaard post-pulsmeettijd te wijzigen in 1 min. Laat alle andere instellingen in de standaardstatus staan.
      OPMERKING: Standaardpulsparameters creëren een blokgolfvorm met 30 volt, 20 Hz, 1 ms duur en 200 pulsen. Standaard TEEI-meetparameters zijn 0.5 volt en 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz en 100.000 Hz.
    6. Klik op de knop Uitvoeren en voer de juiste namen in voor putten 1-3 en 4-6 wanneer daarom wordt gevraagd. Klik op OK om het experiment te starten.
    7. Verwijder de elektrode-array uit de incubator en plaats de inzetstukken terug op de oorspronkelijke locaties in de plaat van de experimentput wanneer het programma is voltooid.
    8. Meng 2 μl Hoechst 33342 en 5 μl calceïne AM met 123 μl celkweekmedia in een buisje van 200 μl.
    9. Pipetteer voorzichtig 10 μL van de kleuroplossing in elk inzetstuk na de puls en plaats de inzetstukken gedurende 5 minuten terug in de couveuse.
    10. Breng de putplaat over naar de plaathouder van een fluorescentiemicroscoop met een objectief met een vergroting van 5x. Afbeelding met behulp van helderveld en de fluorescentie van elke vlek. Centreer het inzetstuk over het objectief voordat u de camera activeert.
      OPMERKING: De excitatiegolflengten voor PI, calceïne AM en Hoechst 33342 zijn respectievelijk 558 nm, 495 nm en 353 nm. De emissiegolflengten zijn respectievelijk 575 nm, 519 nm en 465 nm.
  2. TEEI-meetexperiment
    1. Pipetteer 1,5 ml van het celkweekmedium in elk putje in de elektrode-array. Plaats de inzetstukken voor celmonsters in de putjes 1-3 en de controle-inzetstukken in de putjes 4-6, en plaats de voeten van de inzet in de uitlijngroeven zodat de inzet gelijk ligt met het bovenoppervlak van de put.
    2. Schroef de printplaat van de bovenste elektrode op de bovenkant van de putjes van de elektrode-array en sluit de elektrode-array aan op het PSEP-apparaat.
    3. Plaats de elektrode-array minimaal 1 uur in de incubator van 37 °C om de temperatuur in evenwicht te laten komen.
    4. Klik op de drop-down naast "Membraan" in de linkerbovenhoek van de GUI en klik op 400 nm GBO. Herhaal deze stap voor 'Elektrolyt', 'Cellen', 'Celseedingdichtheid' en 'Celduur' en selecteer respectievelijk DMEM, A431, 200 en 12.
      OPMERKING: Deze waarden zijn alleen bedoeld voor het bijhouden van gegevens en hebben geen invloed op de functie van het apparaat. Zorg ervoor dat u deze waarden indien nodig aanpast voor een correcte gegevenstracering.
    5. Laat alle overige instellingen in de standaardstatus staan.
      OPMERKING: Standaardpulsparameters creëren een blokgolfvorm met 30 volt, 20 Hz, 1 ms duur en 200 pulsen. Standaard TEEI-meetparameters zijn 0.5 volt en 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz en 100.000 Hz.
    6. Klik op de knop Uitvoeren en voer de juiste namen in voor putten 1-3 en 4-6 wanneer daarom wordt gevraagd. Klik op OK om het experiment te starten.
    7. Verwijder de elektrode-array uit de incubator en plaats de inzetstukken terug op de oorspronkelijke locaties in de plaat van de experimentput wanneer het programma is voltooid.
    8. Meng 2 μl Hoechst 33342, 5 μl calceïne AM en 10 μl PI met 113 μl celkweekmedia in een reactiebuis van 200 μl.
    9. Pipette 10 μL van de kleuroplossing in elke postpulsinzet en plaats de inzetstukken gedurende 5 minuten terug in de incubator.
    10. Breng de putplaat over naar de plaathouder van een fluorescerende beeldmicroscoop met een 5x objectieflens. Afbeelding met behulp van helderveld en de fluorescentie van elke vlek. Centreer het inzetstuk over de lens voordat u de camera activeert.
      OPMERKING: De excitatiegolflengten voor PI, calceïne AM en Hoechst 33342 zijn respectievelijk 558 nm, 495 nm en 353 nm. De emissiegolflengten zijn respectievelijk 575 nm, 519 nm en 465 nm.

4. Gegevensanalyse

  1. Beeldgegevens analyseren met de CellProfiler-pijplijn
    1. Gebruik de aangepaste CellProfiler-werkstroom die wordt aangeboden op GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI om de afbeeldingen van het leverings- en TEEI-meetexperiment te verwerken.
  2. TEEI-analyse
    1. Klik op het tabblad Analyse in de GUI.
    2. Zet de impedantietype-indicator op TEEI onderaan de GUI.
    3. Klik op de pijl in het vak linksboven om alle experimentnamen in het gegevensbestand weer te geven. Selecteer alle gegevens van het TEEI-meetexperiment voor celmonsters .
    4. Klik op de pijl in het volgende vak aan de rechterkant om alle experimentnamen in het gegevensbestand weer te geven. Selecteer alle gegevens van het besturingselement van de TEEI-meting.
    5. Klik op Uitvoeren. Er verschijnt een basisfiguur met geselecteerde celmonstergegevens met de laagste meetfrequentie.
    6. Klik in het vak met voorbeeldopties aan de rechterkant van de GUI op de pijl om alle geselecteerde invoeggegevens weer te geven. Uitschieters kunnen worden verwijderd door de juiste gegevens te selecteren en hieronder op Verwijderen te klikken.
      OPMERKING: Alle gegevens die met de laatste klik op de knop Verwijderen uit de analyse zijn verwijderd, kunnen worden opgehaald met de knop Ongedaan maken .
    7. Klik op Gereed om door te gaan naar de volgende figuur wanneer de gewenste gegevens in de figuur worden weergegeven.
    8. Herhaal stap 4.2.6 en 4.2.7 voor de overige gegevens van het celmonster en de controlegegevens. Wanneer de definitieve dataset is bevestigd door op "Gereed" te klikken, verschijnt het volledige analysecijfer.
    9. Sla de analysefiguur op.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gegeven protocol stelt een methode vast voor het gebruik van TEEI-metingen om de intermediaire processen van elektroporatie te onderzoeken en leveringsvoorspellingen te doen, met name voor de A431-cellijn en PI-lading. Hoewel wijziging van dit protocol verderop in het artikel wordt besproken, is het belangrijk op te merken dat, hoewel de specifieke waarden kunnen veranderen, de algemene trends in de respons consistent blijven. TEEI-gegevens die onder de initiële basislijn duiken, komen bijvoorbeeld overeen met celdood, terwijl de maximale toename van de TEEI-waarde boven het minimum overeenkomt met leveringsefficiëntie13. Deze algemene trends en de implicaties ervan worden hieronder onderzocht.

Zoals te zien is in figuur 2A, kan er tijdens het gebruik van het PSEP-platform een reeks trends op het gebied van TEEI-metingen en celbeeldvorming ontstaan. Het ideale resultaat van dit protocol is het produceren van een curve die vergelijkbaar is met de geoptimaliseerde gezonde gegevens die worden weergegeven in figuur 2Ai. Dit wordt gekenmerkt als het ideale resultaat, omdat er geen dip onder de basislijn is, wat wijst op zeer weinig of geen celdood. Bovendien heeft de geoptimaliseerde gezonde curve de grootste toename in TEEI vanaf het minimum, wat wijst op een hoge mate van leveringsefficiëntie13. Deze gevolgtrekkingen worden ondersteund door de post-PSEP-beeldvorming van de celmonolaag, die verwaarloosbare celdood en een gezonde, volledig confluente celmonolaag onthult (Figuur 2Aiii). Bovendien kan een succesvol leveringsexperiment met identieke PSEP-golfvormen worden gekarakteriseerd door de afbeeldingen die worden getoond in figuur 2B. De juiste toepassing van de elektroporatiegolfvorm en de ladingconcentratie resulteren in een hoge mate van leveringsconsistentie en levensvatbaarheid van de cel.

De gezondheid en samenvloeiing van de celmonolaag zijn van cruciaal belang voor de succesvolle toepassing van op TEEI gebaseerde leveringsvoorspellingen16,17. Zelfs met een geoptimaliseerde golfvorm resulteert een ongezonde of onvolledige celmonolaag in een verminderde TEEI-respons, zoals geïllustreerd door de geoptimaliseerde ongezonde gegevens in figuur 2Aii. Merk echter op dat de afbeeldingen voor deze uitkomst (Figuur 2Avi) nog steeds overeenkomen met de interpretatie van de TEEI-respons gegeven door Brooks et al.13. Er is geen dip onder de basislijn, wat wijst op een celdood van bijna nul (Figuur 2C,D). Bovendien komt de verminderde toename ten opzichte van het minimum overeen met een negatief effect op de afgifte-efficiëntie, aangezien minder cellen in de monolaag de totale PI-afgifte verminderen (Figuur 2C,D).

Als een niet-geoptimaliseerde golfvorm wordt toegepast, is het mogelijk om nog meer significante dalingen in de TEEI-respons te zien. Afhankelijk van de totale energie en het tijdsbestek waarin het wordt toegepast, kunnen niet-geoptimaliseerde golfvormen resultaten opleveren die variëren van verminderde efficiëntie tot bijna totale vernietiging van de celmonolaag (Figuur 2Ai,iii,v). Zowel de niet-geoptimaliseerde als de zeer niet-geoptimaliseerde curven laten een significante afname zien ten opzichte van de uitgangswaarde, wat wijst op substantiële celdood. Steeds minder geoptimaliseerde golfvormen belemmeren echter het herstel van cellen, wat resulteert in een verminderde afgifte-efficiëntie.

De afgifte-efficiëntie werd berekend door het aantal cellen dat in zowel PI- als calceïne-afbeeldingen van toedieningsexperimenten was gelabeld, te delen door het totale aantal cellen dat met Hoechst was geïdentificeerd. De dood werd berekend door de cellen die in TEEI-meetexperimenten met PI waren gemarkeerd te nemen en te delen door het totale aantal cellen dat met Hoechst was geïdentificeerd. Het aantal cellen is bepaald met behulp van een aangepaste CellProfiler-pijplijn voor beide metrische gegevens.

figure-results-1
Figuur 2: TEEI-responscurven en beeldvorming voor veelvoorkomende aandoeningen. (A) (i) TEEI-responsgegevens die de procentuele TEEI-verandering illustreren voor geoptimaliseerde en niet-geoptimaliseerde omstandigheden. (ii) TEEI-responsvergelijking tussen gezonde en ongezonde monolagen onder geoptimaliseerde golfvormomstandigheden. (iii-v) Representatieve beeldvorming van mogelijke uitkomsten voor geoptimaliseerde en niet-geoptimaliseerde golfvormcondities, waarbij celdood (rood) en levende cellen (groen) worden getoond. (vi) Representatieve beeldvorming van ongezonde monolaag na toepassing van geoptimaliseerde golfvormcondities die celdood (rood) levende cellen (groen) tonen. (B) Afbeeldingen van succesvolle PI-afgifte (rood), levende cellen (groen) en kernlocaties (blauw). Alle afbeeldingen zijn helderder voor duidelijkheid. Schaalbalken: 1000 μm. (C) TEEI-afname van pre-PSEP-basislijn tot minimum post-PSEP en toename van post-PSEP-minimum tot post-PSEP-piek voor gegeven spanningen. (D) Afgifte-efficiëntie en celdoodpercentages voor bepaalde spanningen. Foutbalken vertegenwoordigen de SEM (n = 6). (C,D) met toestemming overgenomen van Brooks et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2C laat zien dat TEEI-stijgingen ten opzichte van het minimum en dalingen ten opzichte van de basislijn worden uitgezet voor elke PSEP-golfvormspanning. De TEEI-toename creëert een parabolische boog, met een piek van ongeveer 20 volt voordat deze afneemt, terwijl de TEEI-afname ten opzichte van de basislijn exponentieel toeneemt naarmate de spanning toeneemt. De afgifte-efficiëntie en doodspercentages in figuur 2D weerspiegelen deze trends, waarbij de afgifte-efficiëntie parabolisch boog, piekt rond de 30 volt en de dood exponentieel toeneemt naarmate de golfvormspanning wordt verhoogd.

Een hypothese voor het onderliggende mechanisme dat de TEEI-toename veroorzaakt, is elektro-osmose door de negatief geladen substraatmicrokanalen, een fenomeen dat wordt veroorzaakt door de toepassing van een elektrisch veld18,19. Of de TEEI-respons nu het gevolg is van mechanische stimulus van celzwelling als gevolg van elektro-osmotische vloeistofstroom, een factor waarvan bekend is dat deze optreedt bij elektroporatie20, of als gevolg van de elektrische stimulus van de golfvorm zelf, het is duidelijk dat de gezondheid en volledigheid van de monolaag van het grootste belang is om de juiste spanningsval over het celmembraan te bereiken die nodig is voor elektroporatie. Om deze reden zijn de meest kritische stappen in deze methode die met betrekking tot het zaaien van cellen en het zorgen voor een goede vorming van de monolaag van de cel. Dit kan worden bevestigd door de monolaag van de cel in beeld te brengen en door de TEEI-waarde bij de basislijn. Voor A431-cellen is de gemiddelde TEEI ongeveer 7 Ω cm², terwijl HEK293T cellen gemiddeld een iets lagere 5 Ω cm² hebben (Figuur 2Aii), waarschijnlijk als gevolg van morfologische verschillen die verschillen in het gebied van de cel-celovergang veroorzaken.

Vanwege het elektrische veld dat nodig is voor elektroporatie van het substraat, zal elektrolyse plaatsvinden, waardoor de elektroden gaan corroderen12,21. Dit was vooral duidelijk voor de onderste elektrode, omdat deze in dit experiment positief geladen was om positief geladen PI af te geven. Door middel van experimenten werd vastgesteld dat de onderste printplaat ongeveer 20 keer kan worden gebruikt voordat significante negatieve effecten moeten worden vervangen13. Om de elektrode-array schoon te maken voor hergebruik, verwijdert u de resterende celcultuur- of transfectiemedia uit de kamers met behulp van een aspirator. Vul elke kamer voor driekwart van de weg met 70% ethanol en plaats de printplaat van de bovenste elektrode op de elektrode-array zodat de bovenste elektroden ondergedompeld zijn. Laat de ethanol ten minste 10 minuten in de elektrode-array zitten voordat u de ethanol verwijdert en de elektrode-array opzij zet om te drogen.

Het is mogelijk om de gekochte inserts opnieuw te gebruiken door de substraten te verwijderen, de inserts te steriliseren en de substraat te vervangen door een substraat uit een andere bron. Wisselplaten met 6 putjes met dezelfde poriedichtheid en diameter zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen worden gebruikt om vier vervangende substraten ter grootte van 24 putjes te oogsten. Zodra de eerder gebruikte inzetstukken zijn gesteriliseerd, voegt u 10 μL ultraviolet licht-uitgeharde epoxy toe aan een verse petrischaal. Dompel de substraatzijde van het inzetstuk in het epoxybad om het bodemoppervlak te coaten en plaats voorzichtig een nieuw substraat over het gat in het inzetstuk. Controleer visueel of de epoxy een volledige ring vormt om er zeker van te zijn dat er geen openingen in de verbinding zijn. Laat 30 s uitharden onder een UV-lamp en bewaar de gereviseerde inzetstukken op een schone plaat met 24 putjes om beschadiging van de nieuwe substraten te voorkomen voordat u ze opnieuw gebruikt.

Zoals eerder vermeld, wordt weliswaar verondersteld dat de waargenomen TEEI-toename in meerdere celtypen zal optreden, maar is dit alleen aangetoond met de A431- en HEK293T-cellijnen13 (Figuur 1C), die beide hechtende cellen zijn. De methode kan worden gewijzigd door verschillende cellijnen te selecteren door membranen met verschillende poriekenmerken te selecteren, de fibronectinecoating te vervangen door een ander extracellulair matrixeiwit door de concentratie aan te passen of door de lading te veranderen. Als er echter wijzigingen worden aangebracht in de opzet van het experiment, kan het nodig zijn om de golfvorm opnieuw te optimaliseren. Om de golfvorm te optimaliseren, kan een TEEI-meetexperiment worden uitgevoerd waarbij slechts één golfvormparameter, zoals spanning, wordt gewijzigd tussen elke groep van drie monsters. Selecteer de optimale spanning door de grootste toename van TEEI te identificeren over ten minste negen gezonde monsters. Herhaal dit proces voor elke golfvormparameter en gebruik de nieuw geoptimaliseerde waarden wanneer u naar de volgende gaat. Onthoud dat er meerdere lokale optima kunnen zijn voor golfvormparameters (d.w.z. de optimale spanning voor de ene pulsduur is mogelijk niet de optimale spanning voor een andere pulsduur, enzovoort).

De voordelen van elektroporatie van poreuze substraten zijn verstrekkend. Hoewel er al geruime tijd andere methoden voor intracellulaire toediening bestaan, zijn er maar weinig die een hoge doorvoer hebben gecombineerd met een hoge mate van controle die PSEP bezit 1,13. Bovendien biedt het gebruik van TEEI-metingen door het platform een kijkje in de tussenstappen van het elektroporatieproces. De TEEI-metingen vertellen de toestand van de cellen, begeleiden de selectie van elektroporatieparameters en geven meer inzicht in specifiek celgedrag en -mechanismen13,17. Door de TEEI-metingen is het platform ook in staat tot labelvrije levering13, wat een snelle optimalisatie mogelijk maakt met een verminderde behoefte aan dure biomarkers en reagentia telkens wanneer een experiment wordt uitgevoerd. Deze bijdragen op het gebied van intracellulaire toediening maken dit een uitstekende kandidaat als toedieningsplatform voor fundamenteel biologisch onderzoek en biomedische toepassingen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de financiële steun van de NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), de NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) en P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), het Nebraska Collaborative Initiative en de Voelte-Keegan Bioengineering Support. Het apparaat werd vervaardigd in de NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), die gedeeltelijk wordt gefinancierd door het Nebraska Research Initiative.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Conical Centrifuge TubeThermo Scientific339651
2-Chip Disposable HemocytometerBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Tissue Culture FlaskfisherbrandFB012937
A431 CellsATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Class II Type A2 Biosafety CabinetLabgardNU-543-600
Custom ComponentsYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibcoA5670401
Fluid Aspiration Systemvacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Human Plasma FibronectinSigma-AldrichFIBRP-RO
Inverted Fluorescent MicroscopeZeiss491916-0001-000
Inverted MicroscopeLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
PCR Tube 200 µLSarstedt72.737
Penicillin / StreptomycinGibco15140148
Pipette (0.2-2 µL)fisherbrand EliteFBE00002
Pipette (100-1000 µL)fisherbrand EliteFBE01000
Pipette (20-200 µL)fisherbrand EliteFBE00200
Pipette (2-20 µL)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
Reaction Tube 1.5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917(2020).
  2. Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts. Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).
  3. Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability. Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).
  4. Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments. Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).
  5. Pan, J., et al. Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation. Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).
  6. Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).
  7. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  8. Patino, C. A., et al. Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering. Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).
  9. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).
  10. Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells. Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).
  11. Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling. ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).
  12. Brooks, J. R., et al. An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates. Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).
  13. Brooks, J. R., et al. Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery. Small. 20 (25), 2310221(2023).
  14. Vindiš, T., et al. Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate. Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).
  15. Ye, Y., et al. Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel. Micromachines. 11 (9), 856(2020).
  16. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).
  17. Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).
  18. Hunter, R. J. Zeta potential in colloid science: Principles and applications. 2, Academic Press. (2013).
  19. Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications. IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).
  20. Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation. Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).
  21. Fox, M. B., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: A review. Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Elektroporatie op poreus substraatmonitoring van elektroporatiefluorescentiemicroscopiecelmonolaagafleveringseffici ntiecelviabiliteitgolfvormparameterselektrode arraycelkweekinserts

Gerelateerde artikelen