Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel

Samenvatting

De darm is van vitaal belang voor de spijsvertering en opname. Elke regio - twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, dikke darm - vervult verschillende functies vanwege unieke cellulaire structuren. Het bestuderen van darmfysiologie vereist een nauwgezette weefselanalyse. Dit protocol schetst weefselfixatie en -verwerking met behulp van de Swiss roll-techniek, waardoor nauwkeurige immunokleuring wordt gegarandeerd door middel van de juiste weefselconservering en -oriëntatie.

Samenvatting

De darm is een complex orgaan dat bestaat uit de dunne en de dikke darm. De dunne darm kan verder worden onderverdeeld in twaalfvingerige darm, jejunum en ileum. Elk anatomisch gebied van de darm heeft een unieke functie die tot uiting komt in verschillen in de cellulaire structuur. Het onderzoeken van veranderingen in de darm vereist een diepgaande analyse van verschillende weefselregio's en cellulaire veranderingen. Om de darm te bestuderen en grote stukken weefsel te visualiseren, gebruiken onderzoekers vaak een techniek die bekend staat als intestinale Swiss rolls. Bij deze techniek wordt de darm verdeeld in elk anatomisch gebied en in een vlakke richting gefixeerd. Vervolgens wordt het weefsel zorgvuldig opgerold en verwerkt voor paraffine-inbedding. Een goede weefselfixatie en -oriëntatie is een laboratoriumtechniek die vaak over het hoofd wordt gezien, maar is van cruciaal belang voor stroomafwaartse analyse. Bovendien kan onjuist Zwitsers rollen van darmweefsel het fragiele darmepitheel beschadigen, wat leidt tot een slechte weefselkwaliteit voor immunokleuring. Zorgen voor goed gefixeerd en goed georiënteerd weefsel met intacte celstructuren is een cruciale stap die zorgt voor een optimale visualisatie van darmcellen. We presenteren een kosteneffectieve en eenvoudige methode voor het maken van Zwitserse broodjes om alle delen van de darm in een enkel in paraffine ingebed blok op te nemen. We beschrijven ook geoptimaliseerde immunofluorescentiekleuring van darmweefsel om verschillende aspecten van het darmepitheel te bestuderen. Het volgende protocol biedt onderzoekers een uitgebreide gids voor het verkrijgen van immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss-roll-techniek en immunokleuring. Door gebruik te maken van deze verfijnde benaderingen blijft de ingewikkelde morfologie van het darmepitheel behouden en wordt een beter begrip van de darmfysiologie en pathobiologie bevorderd.

Inleiding

De cellulaire architectuur van de darm vormt een unieke uitdaging bij het behouden van de structurele integriteit wanneer darmweefsel wordt bewaard voor immunokleuring. De dunne darm bestaat uit langwerpige vingerachtige structuren die bekend staan als villi¹. Deze villi raken vaak misvormd tijdens inbeddingsprocessen. Ervoor zorgen dat onderzoekers technieken hebben om darmen goed in te bedden om dwarsdoorsneden te bereiken, waardoor visualisatie van alle delen van de darm mogelijk is, evenals de lagen waaruit de darm bestaat (d.w.z. muscularis propria, slijmvlies en de serosa), is cruciaal voor robuuste experimentele analyse². Onvoldoende fixatie, overmatige fixatie en onjuiste weefselbehandeling zullen de weefselintegriteit in gevaar brengen, wat resulteert in onbedoelde schade aan het darmepitheel ^3,4. Het beschadigen van het darmepitheel tijdens deze stappen kan de kwaliteit van latere analyses, zoals immunofluorescentie, aanzienlijk verminderen, ongeacht de werkzaamheid van immunohistochemische protocollen en gebruikte antilichamen.

Immunokleuring is, net als een goede weefselfixatie, een belangrijk onderdeel van biomedisch onderzoek. Als het goed wordt gedaan, kan immunokleuring voorheen onbekende aspecten van de cellulaire structuur en functie verlichten. Immunofluorescentiekleuring van paraffinesecties kan een uitdaging zijn vanwege fysisch-chemische veranderingen als gevolg van het fixatie- en paraffine-inbeddingsproces⁵. Fixatie en inbedding van paraffine resulteren in antigeenmaskering die de immunofluorescentiedetectie van interessante epitopen kan verstoren⁶. Vertraagde fixatie kan proteolytische degradatie induceren, wat resulteert in een verzwakte of afwezige kleuring van kritieke epitopen⁷. Bovendien zijn antilichamen vaak onnauwkeurig met een hoge achtergrond. Immunokleuringsprotocollen die consistente en specifieke antilichaambinding en een hoge signaal-ruisverhouding bevorderen, kunnen waardevolle informatie opleveren voor onderzoekers.

Hier bieden we een uitgebreid protocol dat is ontworpen om immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit te verkrijgen door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss roll-voorbereiding⁸ en immunokleuring. Het protocol legt de nadruk op richtlijnen om de integriteit van de darm te behouden en heeft tot doel onderzoekers een robuuste methodologie te bieden om de kwaliteit en betrouwbaarheid van immunofluorescentiebeeldvormingsonderzoeken te verbeteren. We hebben ook geprobeerd kosteneffectieve middelen te gebruiken, waaronder filterpapier en zelfgemaakte antigeenextractie, blokkeringsoplossingen en antilichaamverdunningsmiddelen om het protocol toegankelijker te maken voor laboratoria die mogelijk beperkte middelen hebben. Zoals voor alle experimentele protocollen, moeten onderzoekers het huidige protocol optimaliseren op basis van hun experimentele aanpak en interessegebieden.

Protocol

Het Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical University of South Carolina keurde alle verzorging, onderhoud en behandeling van dieren goed. Darmweefsel werd verzameld van volwassen C57BL/6J-muizen (mannetjes en vrouwtjes van 3-5 maanden oud, met een gewicht van ongeveer 30 g) voor gebruik in de huidige studie.

1. Fixatie van darmweefsel

1. Ontleed voorzichtig de hele darm van een geëuthanaseerde muis en plaats deze in een weegboot of petrischaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Haal de darmen uit de PBS en gebruik een schaar om overtollig vet en bindweefsel voorzichtig te verwijderen. Door het bindweefsel door te snijden, ligt het weefsel plat tijdens de volgende stappen.
3. Verdeel de darm met een schaar in afzonderlijke segmenten (d.w.z. twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, blindedarm en dikke darm). Verdeel de segmenten op basis van anatomische kenmerken en/of lengte, waarbij ongeveer 13% van de darmlengte de twaalfvingerige darm is, 58% het jejunum, 8% het ileum, 6% de blindedarm en de dikke darm 15%⁹. De twaalfvingerige darm volgt de maag en het ileum is het terminale deel van de dunne darm direct voor de blindedarm.
4. Maak de dikke darm vrij door met een schaar te knippen waar deze samenkomt met de blindedarm. Plaats de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm in de weegboot of petrischaal van PBS. Gooi de blindedarm weg of repareer deze volgens andere gepubliceerde methoden¹⁰.
5. Bevestig een P200-pipetpunt aan een spuit van 10 ml door het grote uiteinde van de punt af te snijden met een scheermesje. Vul de spuit met PBS.
6. Steek de punt van de spuit met een pincet in de opening van een darmsegment. Gebruik de tang om het darmsegment op de spuit vast te houden en spoel voorzichtig met een snelheid van ~50 μL/s om de darminhoud te verwijderen. Verzamel de darminhoud in een lege weegboot of petrischaaltje.
7. Leg het natte darmsegment in een rechte lijn op een strook droog geëtiketteerd cellulose filtreerpapier (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat het darmsegment nat genoeg is om goed aan het droge filterpapier te hechten. Label het filtreerpapier met behulp van een potlood met de informatie voor muisnummer, genotype, experimentele groep, enz.
   OPMERKING: Het gebruik van een pen om het filterpapier te labelen kan leiden tot verlies van labels tijdens het fixeren.
8. Gebruik een dissectieschaar om de darm in de lengterichting langs de mesenteriale lijn open te knippen. Knip ~ 5 mm per keer af en gebruik de onderkant van de schaar of een pincet om het afgeknipte zakdoekje plat op het filtreerpapier te leggen. Ga door totdat het hele deel van de darm is gesneden en plat op het filtreerpapier ligt. Zorg ervoor dat u de darm in een zo recht mogelijke lijn opensnijdt, omdat dit het gemakkelijker maakt om het weefsel te rollen.
   NOTITIE: Een kogelschaar kan tijdens deze stap worden gebruikt om weefselbeschadiging te voorkomen.
9. Leg nog een stuk filtreerpapier op het darmsegment. Zorg ervoor dat het filtreerpapier het darmsegment omklemt, zodat de darm niet kan krullen of zijn afgeplatte vorm kan verliezen tijdens de fixatie.
10. Niet de randen van het filtreerpapier om het zakdoekje op zijn plaats te houden. Niet aan het weefsel nieten. Plaats voldoende nietjes rond het weefsel om te voorkomen dat het weefsel tijdens het fixeren losraakt van het filtreerpapier.
11. Herhaal stap 1.5-1.10 voor elk van de darmsegmenten (twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en dikke darm).
12. Dompel de weefsels onder in 10% normaal gebufferde formaline (of fixeermiddel naar keuze zoals 4% paraformaldehyde, Carnoy's fixeermiddel, enz.) 's nachts bij 4 °C.
    LET OP: Zorg ervoor dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen, aangezien fixeermiddelen zoals formaline giftig zijn.

2. Rollen en verwerken van darmweefsel

LET OP: Voer de stappen 2.1-2.6 uit in een geventileerde kap.

1. Verwijder voorzichtig het bovenste stuk filtreerpapier (het stuk dat de luminale kant van de darm raakt). Gebruik een tang om de darm voorzichtig van het onderste stuk filtreerpapier te trekken. Gooi het filtreerpapier weg.
2. Vul drie weegboten met PBS. Was de tissue 3x in PBS om formaline uit de tissue te verwijderen.
3. Gebruik een pincet met omgekeerde werking (zie Tabel met materialen) en pak een stuk darm op langs de korte zijde met de luminale kant naar boven. Draai aan de tang om het zakdoekje op te rollen. Gebruik een gewone pincet om het weefsel te begeleiden terwijl het wordt gerold. Als het weefsel gevouwen raakt, rol het dan uit en probeer het opnieuw.
4. Leg de tissue in een droge weegboot of petrischaal. Houd het weefsel op zijn plaats met een pincet in één hand. Open voorzichtig de pincet met omgekeerde werking en laat het weefsel los, gebruik de andere pincet om het weefsel los te maken van de pincet met omgekeerde werking.
5. Steek een ontleedpen of minutienpin van maat 00 in het weefsel (zie Materiaaltabel). Gebruik een draadknipper om de scherpe punt van de pin te verwijderen. Plaats de tissue in een grote cassette en plaats de cassette vervolgens in een container met 70% ethanol tot het klaar is voor verwerking.
6. Herhaal stap 2.1-2.5 met alle darmsegmenten (de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm) en plaats alle vier de weefselrollen in dezelfde grote cassette (zie Tabel met materialen). Zorg ervoor dat de cassette met een potlood is geëtiketteerd om te voorkomen dat het etiket wegspoelt in de oplossingen voor ethanol en xyleen (zie Materiaaltabel).
7. Zodra alle monsters zijn gerold, plaatst u de monsters in een weefselprocessor. Gebruik de volgende instellingen voor darmweefsel: 70% ethanol gedurende 35 minuten; 90% ethanol gedurende 35 minuten; 95% ethanol gedurende 35 minuten; 100% ethanol gedurende 35 min, 3x; xyleen gedurende 35 min, 3x; paraffine gedurende 60 min, 3x. Cassettes kunnen gedurende langere tijd in gesmolten paraffinewas worden bewaard.
   LET OP: Zorg ervoor dat de juiste beschermende uitrusting wordt gedragen, aangezien xyleen een giftige chemische stof is.

3. Inbedding van darmweefsel

1. Verwarm grote inbeddingsvormen voor om de paraffine gesmolten te houden.
2. Haal de cassettes uit de tissueprocessor en doe ze in een bekerglas met gesmolten paraffine.
3. Doe bij een inbeddingsstation een kleine hoeveelheid paraffine in een vorm. Haal de vier Zwitserse rollen uit de cassette en leg ze allemaal in één vorm en leg ze zo plat mogelijk. Voeg meer paraffine toe om de vorm te vullen.
4. Verplaats de vorm naar de koude plaat en zorg ervoor dat alle Zwitserse broodjes plat op de bodem van de vorm liggen. Plaats een gelabelde kleine cassettedop (zie Materiaaltabel) op de mal en voeg indien nodig meer paraffine toe.
5. Zodra de was is gestold, haal je het blok uit de mal. Het weefsel is nu klaar om in plakjes van 5 μm te worden gesneden en op geladen glasplaatjes te worden gedreven voor immunokleuring¹¹.

4. Weefselhechting en voorbereiding van objectglaasjes

1. Om ervoor te zorgen dat het voorbereide paraffineweefselgedeelte van 5 μm aan het objectglaasje hecht, wordt het glas op een diawarmer of warmteblok dat gedurende 15-30 minuten op 60 °C is ingesteld, heatglass glaasjes op 60 °C geplaatst. Glijbanen kunnen ook langer blijven verwarmen; Deze stap is niet tijdgevoelig.
2. Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur (~15 min).

5. Deparaffinisatie

1. Zorg er bij het begin van de deparaffinisatie van objectglaasjes voor dat het weefsel in een oplossing blijft en niet uitdroogt gedurende het gehele verloop van immunokleuring.
2. Gebruik een rek met objectglaasjes (zie Tabel met materialen) om de glasplaatjes vast te houden en plaats ze in een oplosmiddelbestendige schaal (zie Tabel met materialen) die is gevuld met een clearing/deparaffinisatiereagens (zie Tabel met materialen). Zorg ervoor dat het reagens het weefsel op elk glaasje volledig bedekt. Voordat u de objectglaasjes volledig onderdompelt in het klaringsreagens, dompelt of duwt u het objectglaasjesrek meerdere keren in de reinigingsoplossing. Laat de dia's 10 minuten of langer ondergedompeld.
   NOTITIE: Deze stap moet mogelijk worden uitgevoerd in een geventileerde afzuigkap vanwege gevaarlijke dampen, afhankelijk van het gekozen klaringsmiddel. Deparaffinisatie van het weefsel in deze stap is niet tijdgevoelig, als een niet-toxisch klaringsmiddel wordt gebruikt.
3. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollig klaringsreagens te verwijderen. Herhaal stap 5.2 in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal.
4. Herhaal stap 5.3 in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal. Laat de dia's 15 minuten of langer ondergedompeld staan. Deze stap is niet tijdgevoelig.

6. Rehydratatie

1. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollig klaringsreagens te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 100% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig. Herhaal 2x.
2. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 100% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 95% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig. Herhaal 1x.
3. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 95% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 70% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig.
4. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 70% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 50% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig.
5. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 50% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met gedeïoniseerd (DI) water, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig.
   1. Om hier te pauzeren, plaatst u de objectglaasjes in een bak met PBS totdat de immunokleuring kan worden hervat na de waterrehydratatiestap van 5 minuten.

7. Antigeen ophalen

1. Vul een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal met een geschikte buffer voor het ophalen van antigeen. Breng het glaasjesrek direct over naar deze oplossing. Zorg ervoor dat de objectglaasjes volledig zijn ondergedompeld in de oplossing voor het ophalen van antigeen, waardoor het weefsel volledig wordt bedekt.
   OPMERKING: Optimale oplossingen voor het ophalen van antigeen kunnen variëren, afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt. Het antigeenherstel dat nodig is voor individuele antilichamen moet mogelijk door de onderzoeker worden bepaald.
   1. Om 1x citraatantigeenophaalbuffer te maken, voegt u 2,94 g natriumcitraatdihydraat (zie materiaaltabel) toe per 1 l gedeïoniseerd water. Zodra het natriumcitraatdihydraat is opgelost, voegt u waterstofchloride toe (zie Materiaaltabel) totdat de oplossing een pH van 6 bereikt. Voeg ten slotte 500 μL Tween20 (zie Materiaaltabel) toe per 1 L gedeïoniseerd water.
   2. Om 1x Tris-EDTA-antigeenophaalbuffer te maken, voegt u 1,211 g Tris Base en 0,292 g EDTA toe aan 1 L gedeïoniseerd water. Eenmaal opgelost, aanpassen aan pH 9.
2. Dek de oplosmiddelbestendige schaal met de antigeenextractieoplossing af en schuif het af met een deksel en zet het deksel vast met elastiekjes.
3. Plaats de veilige, oplosmiddelbestendige schaal in een snelkookpan (zie Materiaaltabel) op het metalen rek of de onderzetter. Zorg ervoor dat er voldoende water in de snelkookpan zit om het metalen rek of de onderzetter te bereiken, zodat de druk kan toenemen.
4. Plaats het deksel op de snelkookpan en draai met de klok mee om het deksel op zijn plaats te vergrendelen. Draai het drukbegrenzingsventiel dat op het deksel zit naar de drukinstelling.
5. Selecteer onder de menu-instelling hoge druk op de snelkookpan en stel vervolgens onder de tijdinstelling de snelkookpan in op 30 min. Selecteer Start.
6. Na 30 minuten piept de snelkookpan en wordt deze automatisch ingesteld op de warmhoudstand. Wacht tot de druk op natuurlijke wijze is verdwenen en het deksel vrij kan worden losgeschroefd.
7. Gebruik hittebestendige handschoenen (zie Materiaaltabel) om de oplosmiddelbestendige schaal uit de snelkookpan te halen en verwijder de rubberen band en het deksel. Plaats de schaal ~30 minuten in een ijsbad om de glaasjes af te laten koelen tot kamertemperatuur. Deze stap is niet tijdgevoelig.
8. Eenmaal afgekoeld tot kamertemperatuur, verwijdert u het schuifrek van de oplosmiddelbestendige schaal en plaatst u het in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met DI-water om de resterende antigeenophaaloplossing te verwijderen. Zorg ervoor dat de dia's volledig zijn ondergedompeld.
9. Haal het schuifrek uit het DI-water en plaats het gedurende 5 minuten in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met PBS. Zorg ervoor dat de dia's volledig zijn ondergedompeld. Deze stap is niet tijdgevoelig.

8. Blokkeren van niet-specifieke achtergrondkleuring

1. Bereid een bevochtigde kamer voor door een grote diadoos te nemen en het kartonnen deksel dat op het deksel is bevestigd te verwijderen. Leg aan de onderkant van de glaasjesdoos vochtige papieren handdoeken verticaal naar beneden. Zorg ervoor dat de vochtige papieren handdoeken plat liggen.
2. Verwijder een objectglaasje één voor één uit het rek voor objectglaasjes dat is ondergedompeld in PBS. Veeg overtollig PBS voorzichtig weg op het glasplaatje en vermijd het tissue.
3. Vorm met een hydrofobe pen (zie Materiaaltabel) een barrière die het weefsel omringt door met de hydrofobe pen een doos rond het weefsel te trekken. Zorg ervoor dat u het weefsel vermijdt en gebruik de hydrofobe pen niet te dicht bij het weefsel.
4. Plaats de omlijnde dia horizontaal over de vochtige papieren handdoeken. Voeg een blokkeerbuffer toe om het weefsel te bedekken (~100 μL).
   1. Om een blokkerende buffer te maken, voegt u 100 μL koudwatergelatine van vishuid (Teleostein Gelatine; zie Materiaaltabel) toe aan 9,85 ml PBS. Voeg ten slotte 50 μL 20% Triton X-100 toe (zie Materiaaltabel) en meng tot het is opgelost.
5. Herhaal stap 8.2-8.4 voor elk objectglaasje. Sluit de bevochtigde kamer en incubeer de objectglaasjes bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten.

9. Muis op muis blokkeren

1. Wanneer u een primair muisantilichaam gebruikt voor immunokleuring van muizenweefsel, voert u een extra blokkeringsstap uit. Muis-op-muisblokkerende reagentia (muis-op-muisblok; zie Materiaaltabel) zijn in de handel verkrijgbaar; Volg de commerciële instructies bij het voorbereiden van het muis-op-muisblok.
2. Tik de blokkeringsoplossing voorzichtig af en voeg onmiddellijk het voorbereide muis-op-muisblok toe om het weefsel te bedekken (~100 μL). Herhaal dit voor elk objectglaasje dat muizenweefsel bevat, dat wordt gekleurd met behulp van een primair antilichaam dat bij muizen is opgewekt.
3. Incubeer weefselsecties in de bevochtigde kamerdoos bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
4. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer en plaats ze direct in een objectglaasjesrek ondergedompeld in PBS. Laat de dia's 5 minuten in PBS staan om het muis-op-muisblok af te wassen.

10. Primaire antilichamen

1. Selecteer voor elk objectglaasje primaire antilichamen die van belang zijn voor verschillende soorten. Verdun primaire antilichamen in antilichaamverdunningsmiddel volgens de instructies van de fabrikant. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATENIN (1:200) en LAMP1 (1:50).
   OPMERKING: Als de fabrikant geen aanbevolen verdunningen geeft, is een verdunning van 1:100 een goed uitgangspunt. Als het primaire antilichaam van belang is geconjugeerd aan een fluorofoor, zie stap 12.2.
   1. Om het antilichaamverdunningsmiddel te maken, voegt u blokkeerbuffer 1:20 toe aan PBS, als u de hierboven beschreven visgelatineblokkeringsbuffer gebruikt.
2. Verwijder de objectglaasjes van PBS of van de bevochtigde kamer, klop voorzichtig de overtollige blokkeeroplossing of PBS af en plaats ze horizontaal terug in de bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat de barrière die in stap 8.3 met de hydrofobe pen is gecreëerd, behouden blijft; Maak indien nodig een nieuwe schets van het weefsel.
3. Voeg op de juiste manier verdunde primaire antilichamen toe die van belang zijn om het weefsel te bedekken (~100 μL).
4. Sluit de bevochtigde kamer en incubeer de objectglaasjes op een vlakke ondergrond bij 4 °C in het donker 's nachts.

11. Wassen van de dia's

1. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer, klop de primaire antilichamen voorzichtig af en plaats de objectglaasjes in een objectglaasjesrek ondergedompeld in PBS gedurende 5 minuten.
2. Verwijder het schuifrek en plaats het gedurende 5 minuten in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met PBS. Herhaal stap 1x.

12. Secundaire antilichamen en kernen tegenkleuring

1. Selecteer voor elk objectglaasje secundaire antilichaamfluoroforen die zijn ontworpen om te binden aan de primaire antilichaamsoort. Verdun secundaire antilichaamfluoroforen of geconjugeerde primaire antilichamen in secundair antilichaamverdunningsmiddel. De secundaire antilichamen die werden gebruikt waren ezel anti-geit 488 (1:200), ezel anti-konijn cy3 (1:200), ezel anti-muis 647 (1:200), ezel anti-konijn 647 (1:200) en ezel anti-rat cy3 (1:200). Het primaire antilichaam γ-ACTIN geconjugeerd aan fluorofoor 647 werd gebruikt in een verdunning van 1:100.
   1. Om secundair antilichaamverdunningsmiddel te maken, voegt u blokkeerbuffer 1:100 toe aan PBS, als u een visgelatineblokkerende buffer gebruikt zoals hierboven beschreven.
2. Verwijder de objectglaasjes van PBS, tik overtollig PBS voorzichtig af en plaats ze horizontaal terug in de bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat de barrière die in stap 8.3 met de hydrofobe pen is gecreëerd, behouden blijft; Maak indien nodig een nieuwe schets van het weefsel.
3. Voeg op de juiste manier verdunde secundaire antilichaamfluoroforen of geconjugeerde primaire antilichamen toe om het weefsel te bedekken (~100 μL).
4. Sluit de bevochtigde kamer en incubeer de objectglaasjes bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
5. Verdun 10 mg/ml Hoechst (zie materiaaltabel) of DAPI met PBS voor een eindconcentratie van 1 μg/ml Hoechst of DAPI met PBS en voeg direct toe aan het weefsel (~100 μl). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
6. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer en plaats ze in een glaasjesrek dat 5 minuten in het donker in PBS is ondergedompeld.
7. Verwijder het schuifrek en plaats het in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met PBS gedurende 5 minuten in het donker. Herhaal stap 1x.

13. Montage en voorbereiding voor microscopie

1. Verwijder één dia tegelijk uit het rek met objectglaasjes ondergedompeld in PBS en houd de resterende dia's ondergedompeld in PBS in het donker. Klop overtollig PBS voorzichtig weg en gebruik indien nodig een pluisvrij doekje om overtollig PBS op het glasplaatje voorzichtig weg te vegen, vermijd het tissue.
2. Voeg een tot twee druppels antifade montagemedium (zie Materiaaltabel) toe aan het midden van het weefsel.
3. Houd een schoon dekglaasje (zie Materiaaltabel ) bij de randen vast en laat het langzaam in een hoek van 45° op het glaasje zakken. Zorg ervoor dat het montagemedium zich gelijkmatig over het weefsel verspreidt.
4. Begin in het midden van het weefsel en druk voorzichtig met twee vingers op het dekglaasje om luchtbellen en overtollig montagemedium te verwijderen. Blijf indien nodig naar de randen drukken en houd de hele tijd lichte druk aan.
5. Snijd het kleine uiteinde van een niet-gefilterde P200-pipet af en bevestig deze aan de punt van een serologische pipet die is aangesloten op een vacuüm.
6. Volg de randen van het dekglaasje en gebruik de stofzuiger om het overtollige montagemedium te verwijderen.
7. Leg de glaasje in een nieuwe glaasjesdoos horizontaal plat en laat de glaasje in het donker bij kamertemperatuur drogen.
8. Herhaal dit proces voor elke dia.

Resultaten

Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring werd uitgevoerd, zoals eerder beschreven¹². Met behulp van de geoptimaliseerde methode bevatten intestinale Zwitserse broodjes alle drie de segmenten van de dunne darm en de dikke darm op één objectglaasje. Door de hele darm op een objectglaasje te plaatsen, kunnen onderzoekers veranderingen in alle delen van de darm analyseren en besparen ze kosten op het doorsnijden en kleuren van reagentia (Figuur 1). Ook helpt het gelijktijdig blootstellen van alle darmsegmenten aan dezelfde oplossingen bij immunokleuring om nauwkeurige resultaten te garanderen. De H&E-microfoto toont de bewaarde darmarchitectuur van alle delen van de dunne darm en de dikke darm (figuur 2). Meting van duodenale villi toonde geen significant verschil in villi-hoogte in ongeopend darmweefsel in vergelijking met deze Zwitserse rolmethode, wat suggereert dat het openen van de darm de weefselarchitectuur niet verstoort (Figuur 2D). Immunokleuring van intestinale Zwitserse rolletjes toont de verschillende lagen van de darm en de gehele villeuze crypte-as. De fluorescerende beelden tonen lage achtergrondniveaus van de primaire en secundaire antilichaamkleuring en geven duidelijk de individuele cellen weer die in het epitheel aanwezig zijn. Figuur 3 toont de morfologie van verschillende darmsegmenten en kleuring voor bekercellen (MUC2-positieve cellen)¹³, het apicale membraan (γ-ACTINE)¹⁴, het laterale membraan van epitheelcellen (E-CADHERIN)¹⁵ en kernen. Dit protocol is geschikt voor het identificeren van veel verschillende cellulaire compartimenten, waaronder proliferatieve cellen (PCNA)¹⁶, interstitium (LAMININ; Figuur 4A) ¹⁷, het lysosomale domein (LAMP1)¹⁴ en het epitheel (β-CATENINE; Figuur 4B) ¹⁸. okt.

Figuur 1: Workflow voor de bereiding en verwerking van intestinale Swiss rolls. (A) Darmsegmenten worden gespoeld met een spuit met PBS en vervolgens gewassen in PBS. (B) Nat darmweefsel wordt vervolgens op droog filtreerpapier gelegd. (C) De darm wordt in de lengterichting opengesneden op filtreerpapier en (D) voorzichtig gespreid. (E) Een stuk filtreerpapier wordt op de geopende darm gelegd en de darm wordt voorzichtig tussen het filtreerpapier geklemd en geniet. De darmsegmenten worden 's nachts gefixeerd en (F) wordt met een tang gerold. (G) De darm wordt voorzichtig losgemaakt van de pincet met omgekeerde werking en (H) heeft het uiterlijk van een rozet. (Ik, J) Darmweefsel wordt vastgezet en in een grote cassette geplaatst. (K) Alle vier de darmsegmenten worden in dezelfde cassette geplaatst voor weefselverwerking en inbedding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Hematoxyline- en eosinekleuring van alle vier de segmenten van de darm. (A) Tegelscannen demonstreert het vermogen om de hele darm in een enkel objectglaasje te visualiseren met individuele Zwitserse rollen van de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm. (B) Microfoto van een inwendige Zwitserse rol en (C) hogere vergroting inzet om villi en crypte-architectuur te tonen. (D) Kwantificering van de lengte van de dunne darmvlokken in de toont geen significant verschil tussen Zwitsers opgerold weefsel en ongeopend weefsel. Schaalbalken = 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Immunofluorescentiekleuring van alle vier de segmenten van de darm. Volwassen C57BL/6J-controlemuizen werden immunogekleurd voor kernen (cyaan), de laterale membraanmarker, E-CADHERIN (groen), bekercellen geïdentificeerd door MUC2 (geel) en de apicale borstelgrensmarkering, γ-ACTIN, (magenta). Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Immunofluorescentiekleuring van de darm. (A) Een representatieve microfoto van immunofluorescentiekleuring van de muizendarm benadrukt kernen (cyaan), proliferatieve cellen, PCNA (groen) en lamina propria, LAMININ (magenta). (B) Immunofluorescentiebeeld dat kernen (cyaan), de celmembraanmarker β-CATENIN (groen) en de lysosoommarker LAMP1 (magenta) in de darm identificeert. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor weefselfixatie met behulp van de Swiss roll-techniek om de darmarchitectuur te behouden en nauwkeurige immunokleuring te bevorderen. Eenmaal onder de knie kan deze techniek worden gebruikt om een breed scala aan onderzoeksvragen op het gebied van darmfysiologie en celbiologie te onderzoeken¹⁹. Er zijn verschillende geoptimaliseerde Zwitserse walsmethoden gepubliceerd die zeer nuttig zijn^20,21. Een voordeel van deze techniek is het gemak van het nauwkeurig openen van de darm op filtreerpapier. Hierdoor kan het weefsel plat worden gefixeerd, waardoor wordt voorkomen dat het weefsel tijdens het rollen naar binnen krult, wat vooral handig is bij het analyseren van ontstoken weefsel met verdikte spieren. Daarnaast is het essentieel om de cruciale rol van weefselsecties bij het bereiken van betrouwbare resultaten te benadrukken. Een goede doorsnede zorgt voor het behoud van de weefselarchitectuur en vergemakkelijkt een nauwkeurige immunokleuring, wat uiteindelijk bijdraagt aan het succes van stroomafwaartse analyses¹¹. De geoptimaliseerde aanpak is minder moeilijk in vergelijking met andere protocollen en levert consistente resultaten op bij verschillende individuen. De techniek die in dit artikel naar voren wordt gebracht, biedt ook goed bewaarde weefselarchitectuur, veelzijdigheid en zeer reproduceerbare immunokleuring met behulp van diverse antilichamen.

Een cruciaal aspect van dit protocol is de fixatie- en verwerkingstijd. Onjuiste weefselfixatie en -verwerking kan histochemische analyses belemmeren. Weefsel dat te vast is, wordt broos, terwijl te weinig gefixeerd weefsel te zacht blijft. Zowel over- als ondergefixeerde weefsels zijn moeilijk te doorsnijden en brengen de immunokleuring in gevaar. Eenmaal ontleed op filtreerpapier, moet het weefsel onmiddellijk in formaline worden geplaatst om postmortale veranderingen te verminderen²². In dit protocol wordt muizenweefsel 's nachts in formaline gefixeerd. Verschillende studies hebben deze fixatietijd 20,23,24 gebruikt. Boenisch et al. toonden echter aan dat immunokleuring consistent is in weefsel dat tot 4 dagen in formaline is gefixeerd²⁵. Optimalisatie van de fixatietijd en het fixeermiddel is vereist, afhankelijk van de gewenste analyses. Het fixeermiddel van Carnoy heeft bijvoorbeeld vaak de voorkeur voor slijmkleuring²⁶. De keuze van fixeermiddelen en de duur van de fixatietijd moeten door elke onderzoeker worden geoptimaliseerd, afhankelijk van hun experimentele aanpak. Het gebruik van een geautomatiseerde tissueverwerker wordt aanbevolen om nauwkeurige en consistente verwerkingstijden te garanderen. Ons laboratorium gebruikt kleine pinnen om darmweefsel op zijn plaats te houden als rollen. Zonder pinnen kan het weefsel tijdens de verwerking loskomen. Omdat deze pinnen vrij klein en scherp zijn, moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen. We raden aan om een draadknipper te gebruiken om het scherpe uiteinde van de pin te verwijderen voordat u het weefsel verwerkt. Sommige histologiekernen accepteren geen weefsel met pinnen; Daarom is het het beste om dit voor gebruik te controleren. Een alternatieve benadering is om agar te gebruiken om weefsel te verankeren voordat²⁷ wordt verwerkt, of cassettesponzen kunnen in cassettes worden gebruikt om rollen te helpen onderhouden.

Immunokleuring is een protocol dat optimalisatie vereist voor elk antilichaam. Het gebruik van knock-out-gevalideerde antilichamen wordt waar mogelijk aanbevolen. Deze methode voor weefselfixatie en -verwerking resulteert in heldere kleuring, waardoor een gemakkelijke identificatie van antilichaambinding mogelijk is in vergelijking met het achtergrondsignaal wanneer niet-gevalideerde antilichamen worden gebruikt. Fixatieve keuze, het ophalen van antigeen en verdunning van antilichamen kunnen de specificiteit van het antilichaam beïnvloeden. We raden onderzoekers aan het protocol zorgvuldig te beoordelen en te optimaliseren door de fixatie, het ophalen van antigeen en de incubatietijd voor elk antilichaam aan te passen. Om de beste resultaten te verkrijgen, moeten antilichamen worden getest in verschillende verdunningen om de optimale concentratie te bepalen en in verschillende buffers voor het ophalen van antigeen. Epitoopextractie verbetert de immunokleuring door methyleenbruggen te verbreken die tijdens fixatie zijn gevormd. In dit protocol wordt door warmte geïnduceerde epitoopextractie gebruikt in plaats van proteolytisch-geïnduceerde epitoopextractie, omdat enzymvertering waarschijnlijk de weefselmorfologie verstoort²⁸. De meest voorkomende door warmte geïnduceerde buffers voor het ophalen van epitoop zijn citraatbuffer, tris-HCl en tris-EDTA, waarbij citraatbuffer het zachtst is voor weefselmorfologie²⁹. De keuze van de buffer varieert en moet voor elk antilichaam worden bepaald. Veel buffers voor het ophalen van antigeen, blokkeringsoplossingen en verdunningsmiddelen tegen antilichamen zijn in de handel verkrijgbaar. Deze oplossingen kunnen echter extreem duur en onbetaalbaar zijn. We leverden recepten van veelgebruikte oplossingen voor het ophalen van antigeen en blokkerings- en antilichaamverdunningsoplossingen om kosteneffectiviteit te garanderen.

Een beperking van deze methode is dat fixatie en verwerking weefsel kunnen veranderen en epitopen kunnen maskeren. Een alternatieve benadering is om vers ingevroren weefsel te immunokleuren. Vers ingevroren weefsel wordt snel ingevroren, waardoor blootstelling aan toxische fixeermiddelen wordt vermeden, de eiwitstructuur behouden blijft en de toegankelijkheid van sommige epitopen wordt verbeterd. De weefselarchitectuur en morfologie zijn echter slechter dan die van gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel. Verdere uitdagingen van vers ingevroren weefsel zijn onder meer de materialen en logistiek die nodig zijn om bevroren blokken en dia's te verdelen en op te slaan. Analyse van Zwitserse rollen versus stroken darmweefsel toont verschillen in hoogte en breedte van villi en verschillen in immuuncellen in de lamina propria, zoals beschreven in een eerder rapport³⁰. Deze resultaten suggereren dat intestinale Zwitserse broodjes sommige darmkenmerken veranderen, waarmee rekening moet worden gehouden bij het plannen van experimenten. Bovendien is hervalidatie van antilichamen vereist, omdat veel antilichamen die specifiek binden aan in formaline gefixeerd paraffine ingebed weefsel niet goed kleuren in vers ingevroren weefsel³¹.

Immunokleuring van darmweefsel kan worden gebruikt om een breed scala aan vragen over gastro-intestinale celbiologie en fysiologie te beantwoorden. Deze techniek wordt veel gebruikt om epitheliale veranderingen te identificeren in de setting van darmontsteking, na bacteriële infectie en tijdens kankerprogressie. De hier gepresenteerde methode is ideaal voor het behoud van darmweefsel, omdat deze kosteneffectief, technisch niet uitdagend en zeer reproduceerbaar is. Om de beste resultaten te garanderen, moedigen we optimalisatie van de stappen die in dit protocol worden beschreven aan op basis van het experimentele ontwerp en de hypothese die wordt getest.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Dikt Whatman papier
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638