Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel

8.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66977

⸱

19 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De darm is van vitaal belang voor de spijsvertering en opname. Elke regio - twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, dikke darm - vervult verschillende functies vanwege unieke cellulaire structuren. Het bestuderen van darmfysiologie vereist een nauwgezette weefselanalyse. Dit protocol schetst weefselfixatie en -verwerking met behulp van de Swiss roll-techniek, waardoor nauwkeurige immunokleuring wordt gegarandeerd door middel van de juiste weefselconservering en -oriëntatie.

Samenvatting

De darm is een complex orgaan dat bestaat uit de dunne en de dikke darm. De dunne darm kan verder worden onderverdeeld in twaalfvingerige darm, jejunum en ileum. Elk anatomisch gebied van de darm heeft een unieke functie die tot uiting komt in verschillen in de cellulaire structuur. Het onderzoeken van veranderingen in de darm vereist een diepgaande analyse van verschillende weefselregio's en cellulaire veranderingen. Om de darm te bestuderen en grote stukken weefsel te visualiseren, gebruiken onderzoekers vaak een techniek die bekend staat als intestinale Swiss rolls. Bij deze techniek wordt de darm verdeeld in elk anatomisch gebied en in een vlakke richting gefixeerd. Vervolgens wordt het weefsel zorgvuldig opgerold en verwerkt voor paraffine-inbedding. Een goede weefselfixatie en -oriëntatie is een laboratoriumtechniek die vaak over het hoofd wordt gezien, maar is van cruciaal belang voor stroomafwaartse analyse. Bovendien kan onjuist Zwitsers rollen van darmweefsel het fragiele darmepitheel beschadigen, wat leidt tot een slechte weefselkwaliteit voor immunokleuring. Zorgen voor goed gefixeerd en goed georiënteerd weefsel met intacte celstructuren is een cruciale stap die zorgt voor een optimale visualisatie van darmcellen. We presenteren een kosteneffectieve en eenvoudige methode voor het maken van Zwitserse broodjes om alle delen van de darm in een enkel in paraffine ingebed blok op te nemen. We beschrijven ook geoptimaliseerde immunofluorescentiekleuring van darmweefsel om verschillende aspecten van het darmepitheel te bestuderen. Het volgende protocol biedt onderzoekers een uitgebreide gids voor het verkrijgen van immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss-roll-techniek en immunokleuring. Door gebruik te maken van deze verfijnde benaderingen blijft de ingewikkelde morfologie van het darmepitheel behouden en wordt een beter begrip van de darmfysiologie en pathobiologie bevorderd.

Inleiding

De cellulaire architectuur van de darm vormt een unieke uitdaging bij het behouden van de structurele integriteit wanneer darmweefsel wordt bewaard voor immunokleuring. De dunne darm bestaat uit langwerpige vingerachtige structuren die bekend staan als villi1. Deze villi raken vaak misvormd tijdens inbeddingsprocessen. Ervoor zorgen dat onderzoekers technieken hebben om darmen goed in te bedden om dwarsdoorsneden te bereiken, waardoor visualisatie van alle delen van de darm mogelijk is, evenals de lagen waaruit de darm bestaat (d.w.z. muscularis propria, slijmvlies en de serosa), is cruciaal voor robuuste experimentele analyse2. Onvoldoende fixatie, overmatige fixatie en onjuiste weefselbehandeling zullen de weefselintegriteit in gevaar brengen, wat resulteert in onbedoelde schade aan het darmepitheel 3,4. Het beschadigen van het darmepitheel tijdens deze stappen kan de kwaliteit van latere analyses, zoals immunofluorescentie, aanzienlijk verminderen, ongeacht de werkzaamheid van immunohistochemische protocollen en gebruikte antilichamen.

Immunokleuring is, net als een goede weefselfixatie, een belangrijk onderdeel van biomedisch onderzoek. Als het goed wordt gedaan, kan immunokleuring voorheen onbekende aspecten van de cellulaire structuur en functie verlichten. Immunofluorescentiekleuring van paraffinesecties kan een uitdaging zijn vanwege fysisch-chemische veranderingen als gevolg van het fixatie- en paraffine-inbeddingsproces5. Fixatie en inbedding van paraffine resulteren in antigeenmaskering die de immunofluorescentiedetectie van interessante epitopen kan verstoren6. Vertraagde fixatie kan proteolytische degradatie induceren, wat resulteert in een verzwakte of afwezige kleuring van kritieke epitopen7. Bovendien zijn antilichamen vaak onnauwkeurig met een hoge achtergrond. Immunokleuringsprotocollen die consistente en specifieke antilichaambinding en een hoge signaal-ruisverhouding bevorderen, kunnen waardevolle informatie opleveren voor onderzoekers.

Hier bieden we een uitgebreid protocol dat is ontworpen om immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit te verkrijgen door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss roll-voorbereiding8 en immunokleuring. Het protocol legt de nadruk op richtlijnen om de integriteit van de darm te behouden en heeft tot doel onderzoekers een robuuste methodologie te bieden om de kwaliteit en betrouwbaarheid van immunofluorescentiebeeldvormingsonderzoeken te verbeteren. We hebben ook geprobeerd kosteneffectieve middelen te gebruiken, waaronder filterpapier en zelfgemaakte antigeenextractie, blokkeringsoplossingen en antilichaamverdunningsmiddelen om het protocol toegankelijker te maken voor laboratoria die mogelijk beperkte middelen hebben. Zoals voor alle experimentele protocollen, moeten onderzoekers het huidige protocol optimaliseren op basis van hun experimentele aanpak en interessegebieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het Institutional Animal Care and Use Committee van de Medical University of South Carolina keurde alle verzorging, onderhoud en behandeling van dieren goed. Darmweefsel werd verzameld van volwassen C57BL/6J-muizen (mannetjes en vrouwtjes van 3-5 maanden oud, met een gewicht van ongeveer 30 g) voor gebruik in de huidige studie.

1. Fixatie van darmweefsel

  1. Ontleed voorzichtig de hele darm van een geëuthanaseerde muis en plaats deze in een weegboot of petrischaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Haal de darmen uit de PBS en gebruik een schaar om overtollig vet en bindweefsel voorzichtig te verwijderen. Door het bindweefsel door te snijden, ligt het weefsel plat tijdens de volgende stappen.
  3. Verdeel de darm met een schaar in afzonderlijke segmenten (d.w.z. twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, blindedarm en dikke darm). Verdeel de segmenten op basis van anatomische kenmerken en/of lengte, waarbij ongeveer 13% van de darmlengte de twaalfvingerige darm is, 58% het jejunum, 8% het ileum, 6% de blindedarm en de dikke darm 15%9. De twaalfvingerige darm volgt de maag en het ileum is het terminale deel van de dunne darm direct voor de blindedarm.
  4. Maak de dikke darm vrij door met een schaar te knippen waar deze samenkomt met de blindedarm. Plaats de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm in de weegboot of petrischaal van PBS. Gooi de blindedarm weg of repareer deze volgens andere gepubliceerde methoden10.
  5. Bevestig een P200-pipetpunt aan een spuit van 10 ml door het grote uiteinde van de punt af te snijden met een scheermesje. Vul de spuit met PBS.
  6. Steek de punt van de spuit met een pincet in de opening van een darmsegment. Gebruik de tang om het darmsegment op de spuit vast te houden en spoel voorzichtig met een snelheid van ~50 μL/s om de darminhoud te verwijderen. Verzamel de darminhoud in een lege weegboot of petrischaaltje.
  7. Leg het natte darmsegment in een rechte lijn op een strook droog geëtiketteerd cellulose filtreerpapier (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat het darmsegment nat genoeg is om goed aan het droge filterpapier te hechten. Label het filtreerpapier met behulp van een potlood met de informatie voor muisnummer, genotype, experimentele groep, enz.
    OPMERKING: Het gebruik van een pen om het filterpapier te labelen kan leiden tot verlies van labels tijdens het fixeren.
  8. Gebruik een dissectieschaar om de darm in de lengterichting langs de mesenteriale lijn open te knippen. Knip ~ 5 mm per keer af en gebruik de onderkant van de schaar of een pincet om het afgeknipte zakdoekje plat op het filtreerpapier te leggen. Ga door totdat het hele deel van de darm is gesneden en plat op het filtreerpapier ligt. Zorg ervoor dat u de darm in een zo recht mogelijke lijn opensnijdt, omdat dit het gemakkelijker maakt om het weefsel te rollen.
    NOTITIE: Een kogelschaar kan tijdens deze stap worden gebruikt om weefselbeschadiging te voorkomen.
  9. Leg nog een stuk filtreerpapier op het darmsegment. Zorg ervoor dat het filtreerpapier het darmsegment omklemt, zodat de darm niet kan krullen of zijn afgeplatte vorm kan verliezen tijdens de fixatie.
  10. Niet de randen van het filtreerpapier om het zakdoekje op zijn plaats te houden. Niet aan het weefsel nieten. Plaats voldoende nietjes rond het weefsel om te voorkomen dat het weefsel tijdens het fixeren losraakt van het filtreerpapier.
  11. Herhaal stap 1.5-1.10 voor elk van de darmsegmenten (twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en dikke darm).
  12. Dompel de weefsels onder in 10% normaal gebufferde formaline (of fixeermiddel naar keuze zoals 4% paraformaldehyde, Carnoy's fixeermiddel, enz.) 's nachts bij 4 °C.
    LET OP: Zorg ervoor dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen, aangezien fixeermiddelen zoals formaline giftig zijn.

2. Rollen en verwerken van darmweefsel

LET OP: Voer de stappen 2.1-2.6 uit in een geventileerde kap.

  1. Verwijder voorzichtig het bovenste stuk filtreerpapier (het stuk dat de luminale kant van de darm raakt). Gebruik een tang om de darm voorzichtig van het onderste stuk filtreerpapier te trekken. Gooi het filtreerpapier weg.
  2. Vul drie weegboten met PBS. Was de tissue 3x in PBS om formaline uit de tissue te verwijderen.
  3. Gebruik een pincet met omgekeerde werking (zie Tabel met materialen) en pak een stuk darm op langs de korte zijde met de luminale kant naar boven. Draai aan de tang om het zakdoekje op te rollen. Gebruik een gewone pincet om het weefsel te begeleiden terwijl het wordt gerold. Als het weefsel gevouwen raakt, rol het dan uit en probeer het opnieuw.
  4. Leg de tissue in een droge weegboot of petrischaal. Houd het weefsel op zijn plaats met een pincet in één hand. Open voorzichtig de pincet met omgekeerde werking en laat het weefsel los, gebruik de andere pincet om het weefsel los te maken van de pincet met omgekeerde werking.
  5. Steek een ontleedpen of minutienpin van maat 00 in het weefsel (zie Materiaaltabel). Gebruik een draadknipper om de scherpe punt van de pin te verwijderen. Plaats de tissue in een grote cassette en plaats de cassette vervolgens in een container met 70% ethanol tot het klaar is voor verwerking.
  6. Herhaal stap 2.1-2.5 met alle darmsegmenten (de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm) en plaats alle vier de weefselrollen in dezelfde grote cassette (zie Tabel met materialen). Zorg ervoor dat de cassette met een potlood is geëtiketteerd om te voorkomen dat het etiket wegspoelt in de oplossingen voor ethanol en xyleen (zie Materiaaltabel).
  7. Zodra alle monsters zijn gerold, plaatst u de monsters in een weefselprocessor. Gebruik de volgende instellingen voor darmweefsel: 70% ethanol gedurende 35 minuten; 90% ethanol gedurende 35 minuten; 95% ethanol gedurende 35 minuten; 100% ethanol gedurende 35 min, 3x; xyleen gedurende 35 min, 3x; paraffine gedurende 60 min, 3x. Cassettes kunnen gedurende langere tijd in gesmolten paraffinewas worden bewaard.
    LET OP: Zorg ervoor dat de juiste beschermende uitrusting wordt gedragen, aangezien xyleen een giftige chemische stof is.

3. Inbedding van darmweefsel

  1. Verwarm grote inbeddingsvormen voor om de paraffine gesmolten te houden.
  2. Haal de cassettes uit de tissueprocessor en doe ze in een bekerglas met gesmolten paraffine.
  3. Doe bij een inbeddingsstation een kleine hoeveelheid paraffine in een vorm. Haal de vier Zwitserse rollen uit de cassette en leg ze allemaal in één vorm en leg ze zo plat mogelijk. Voeg meer paraffine toe om de vorm te vullen.
  4. Verplaats de vorm naar de koude plaat en zorg ervoor dat alle Zwitserse broodjes plat op de bodem van de vorm liggen. Plaats een gelabelde kleine cassettedop (zie Materiaaltabel) op de mal en voeg indien nodig meer paraffine toe.
  5. Zodra de was is gestold, haal je het blok uit de mal. Het weefsel is nu klaar om in plakjes van 5 μm te worden gesneden en op geladen glasplaatjes te worden gedreven voor immunokleuring11.

4. Weefselhechting en voorbereiding van objectglaasjes

  1. Om ervoor te zorgen dat het voorbereide paraffineweefselgedeelte van 5 μm aan het objectglaasje hecht, wordt het glas op een diawarmer of warmteblok dat gedurende 15-30 minuten op 60 °C is ingesteld, heatglass glaasjes op 60 °C geplaatst. Glijbanen kunnen ook langer blijven verwarmen; Deze stap is niet tijdgevoelig.
  2. Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur (~15 min).

5. Deparaffinisatie

  1. Zorg er bij het begin van de deparaffinisatie van objectglaasjes voor dat het weefsel in een oplossing blijft en niet uitdroogt gedurende het gehele verloop van immunokleuring.
  2. Gebruik een rek met objectglaasjes (zie Tabel met materialen) om de glasplaatjes vast te houden en plaats ze in een oplosmiddelbestendige schaal (zie Tabel met materialen) die is gevuld met een clearing/deparaffinisatiereagens (zie Tabel met materialen). Zorg ervoor dat het reagens het weefsel op elk glaasje volledig bedekt. Voordat u de objectglaasjes volledig onderdompelt in het klaringsreagens, dompelt of duwt u het objectglaasjesrek meerdere keren in de reinigingsoplossing. Laat de dia's 10 minuten of langer ondergedompeld.
    NOTITIE: Deze stap moet mogelijk worden uitgevoerd in een geventileerde afzuigkap vanwege gevaarlijke dampen, afhankelijk van het gekozen klaringsmiddel. Deparaffinisatie van het weefsel in deze stap is niet tijdgevoelig, als een niet-toxisch klaringsmiddel wordt gebruikt.
  3. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollig klaringsreagens te verwijderen. Herhaal stap 5.2 in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal.
  4. Herhaal stap 5.3 in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal. Laat de dia's 15 minuten of langer ondergedompeld staan. Deze stap is niet tijdgevoelig.

6. Rehydratatie

  1. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollig klaringsreagens te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 100% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig. Herhaal 2x.
  2. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 100% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 95% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig. Herhaal 1x.
  3. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 95% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 70% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig.
  4. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 70% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met 50% ethanol, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig.
  5. Verwijder en schud het glaasjesrek om overtollige 50% ethanol te verwijderen. In een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met gedeïoniseerd (DI) water, dompelt of duwt u het glaasjesrek meerdere keren en laat u de glaasjes 5 minuten ondergedompeld. Deze stap is tijdgevoelig.
    1. Om hier te pauzeren, plaatst u de objectglaasjes in een bak met PBS totdat de immunokleuring kan worden hervat na de waterrehydratatiestap van 5 minuten.

7. Antigeen ophalen

  1. Vul een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal met een geschikte buffer voor het ophalen van antigeen. Breng het glaasjesrek direct over naar deze oplossing. Zorg ervoor dat de objectglaasjes volledig zijn ondergedompeld in de oplossing voor het ophalen van antigeen, waardoor het weefsel volledig wordt bedekt.
    OPMERKING: Optimale oplossingen voor het ophalen van antigeen kunnen variëren, afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt. Het antigeenherstel dat nodig is voor individuele antilichamen moet mogelijk door de onderzoeker worden bepaald.
    1. Om 1x citraatantigeenophaalbuffer te maken, voegt u 2,94 g natriumcitraatdihydraat (zie materiaaltabel) toe per 1 l gedeïoniseerd water. Zodra het natriumcitraatdihydraat is opgelost, voegt u waterstofchloride toe (zie Materiaaltabel) totdat de oplossing een pH van 6 bereikt. Voeg ten slotte 500 μL Tween20 (zie Materiaaltabel) toe per 1 L gedeïoniseerd water.
    2. Om 1x Tris-EDTA-antigeenophaalbuffer te maken, voegt u 1,211 g Tris Base en 0,292 g EDTA toe aan 1 L gedeïoniseerd water. Eenmaal opgelost, aanpassen aan pH 9.
  2. Dek de oplosmiddelbestendige schaal met de antigeenextractieoplossing af en schuif het af met een deksel en zet het deksel vast met elastiekjes.
  3. Plaats de veilige, oplosmiddelbestendige schaal in een snelkookpan (zie Materiaaltabel) op het metalen rek of de onderzetter. Zorg ervoor dat er voldoende water in de snelkookpan zit om het metalen rek of de onderzetter te bereiken, zodat de druk kan toenemen.
  4. Plaats het deksel op de snelkookpan en draai met de klok mee om het deksel op zijn plaats te vergrendelen. Draai het drukbegrenzingsventiel dat op het deksel zit naar de drukinstelling.
  5. Selecteer onder de menu-instelling hoge druk op de snelkookpan en stel vervolgens onder de tijdinstelling de snelkookpan in op 30 min. Selecteer Start.
  6. Na 30 minuten piept de snelkookpan en wordt deze automatisch ingesteld op de warmhoudstand. Wacht tot de druk op natuurlijke wijze is verdwenen en het deksel vrij kan worden losgeschroefd.
  7. Gebruik hittebestendige handschoenen (zie Materiaaltabel) om de oplosmiddelbestendige schaal uit de snelkookpan te halen en verwijder de rubberen band en het deksel. Plaats de schaal ~30 minuten in een ijsbad om de glaasjes af te laten koelen tot kamertemperatuur. Deze stap is niet tijdgevoelig.
  8. Eenmaal afgekoeld tot kamertemperatuur, verwijdert u het schuifrek van de oplosmiddelbestendige schaal en plaatst u het in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met DI-water om de resterende antigeenophaaloplossing te verwijderen. Zorg ervoor dat de dia's volledig zijn ondergedompeld.
  9. Haal het schuifrek uit het DI-water en plaats het gedurende 5 minuten in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met PBS. Zorg ervoor dat de dia's volledig zijn ondergedompeld. Deze stap is niet tijdgevoelig.

8. Blokkeren van niet-specifieke achtergrondkleuring

  1. Bereid een bevochtigde kamer voor door een grote diadoos te nemen en het kartonnen deksel dat op het deksel is bevestigd te verwijderen. Leg aan de onderkant van de glaasjesdoos vochtige papieren handdoeken verticaal naar beneden. Zorg ervoor dat de vochtige papieren handdoeken plat liggen.
  2. Verwijder een objectglaasje één voor één uit het rek voor objectglaasjes dat is ondergedompeld in PBS. Veeg overtollig PBS voorzichtig weg op het glasplaatje en vermijd het tissue.
  3. Vorm met een hydrofobe pen (zie Materiaaltabel) een barrière die het weefsel omringt door met de hydrofobe pen een doos rond het weefsel te trekken. Zorg ervoor dat u het weefsel vermijdt en gebruik de hydrofobe pen niet te dicht bij het weefsel.
  4. Plaats de omlijnde dia horizontaal over de vochtige papieren handdoeken. Voeg een blokkeerbuffer toe om het weefsel te bedekken (~100 μL).
    1. Om een blokkerende buffer te maken, voegt u 100 μL koudwatergelatine van vishuid (Teleostein Gelatine; zie Materiaaltabel) toe aan 9,85 ml PBS. Voeg ten slotte 50 μL 20% Triton X-100 toe (zie Materiaaltabel) en meng tot het is opgelost.
  5. Herhaal stap 8.2-8.4 voor elk objectglaasje. Sluit de bevochtigde kamer en incubeer de objectglaasjes bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten.

9. Muis op muis blokkeren

  1. Wanneer u een primair muisantilichaam gebruikt voor immunokleuring van muizenweefsel, voert u een extra blokkeringsstap uit. Muis-op-muisblokkerende reagentia (muis-op-muisblok; zie Materiaaltabel) zijn in de handel verkrijgbaar; Volg de commerciële instructies bij het voorbereiden van het muis-op-muisblok.
  2. Tik de blokkeringsoplossing voorzichtig af en voeg onmiddellijk het voorbereide muis-op-muisblok toe om het weefsel te bedekken (~100 μL). Herhaal dit voor elk objectglaasje dat muizenweefsel bevat, dat wordt gekleurd met behulp van een primair antilichaam dat bij muizen is opgewekt.
  3. Incubeer weefselsecties in de bevochtigde kamerdoos bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  4. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer en plaats ze direct in een objectglaasjesrek ondergedompeld in PBS. Laat de dia's 5 minuten in PBS staan om het muis-op-muisblok af te wassen.

10. Primaire antilichamen

  1. Selecteer voor elk objectglaasje primaire antilichamen die van belang zijn voor verschillende soorten. Verdun primaire antilichamen in antilichaamverdunningsmiddel volgens de instructies van de fabrikant. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATENIN (1:200) en LAMP1 (1:50).
    OPMERKING: Als de fabrikant geen aanbevolen verdunningen geeft, is een verdunning van 1:100 een goed uitgangspunt. Als het primaire antilichaam van belang is geconjugeerd aan een fluorofoor, zie stap 12.2.
    1. Om het antilichaamverdunningsmiddel te maken, voegt u blokkeerbuffer 1:20 toe aan PBS, als u de hierboven beschreven visgelatineblokkeringsbuffer gebruikt.
  2. Verwijder de objectglaasjes van PBS of van de bevochtigde kamer, klop voorzichtig de overtollige blokkeeroplossing of PBS af en plaats ze horizontaal terug in de bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat de barrière die in stap 8.3 met de hydrofobe pen is gecreëerd, behouden blijft; Maak indien nodig een nieuwe schets van het weefsel.
  3. Voeg op de juiste manier verdunde primaire antilichamen toe die van belang zijn om het weefsel te bedekken (~100 μL).
  4. Sluit de bevochtigde kamer en incubeer de objectglaasjes op een vlakke ondergrond bij 4 °C in het donker 's nachts.

11. Wassen van de dia's

  1. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer, klop de primaire antilichamen voorzichtig af en plaats de objectglaasjes in een objectglaasjesrek ondergedompeld in PBS gedurende 5 minuten.
  2. Verwijder het schuifrek en plaats het gedurende 5 minuten in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met PBS. Herhaal stap 1x.

12. Secundaire antilichamen en kernen tegenkleuring

  1. Selecteer voor elk objectglaasje secundaire antilichaamfluoroforen die zijn ontworpen om te binden aan de primaire antilichaamsoort. Verdun secundaire antilichaamfluoroforen of geconjugeerde primaire antilichamen in secundair antilichaamverdunningsmiddel. De secundaire antilichamen die werden gebruikt waren ezel anti-geit 488 (1:200), ezel anti-konijn cy3 (1:200), ezel anti-muis 647 (1:200), ezel anti-konijn 647 (1:200) en ezel anti-rat cy3 (1:200). Het primaire antilichaam γ-ACTIN geconjugeerd aan fluorofoor 647 werd gebruikt in een verdunning van 1:100.
    1. Om secundair antilichaamverdunningsmiddel te maken, voegt u blokkeerbuffer 1:100 toe aan PBS, als u een visgelatineblokkerende buffer gebruikt zoals hierboven beschreven.
  2. Verwijder de objectglaasjes van PBS, tik overtollig PBS voorzichtig af en plaats ze horizontaal terug in de bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat de barrière die in stap 8.3 met de hydrofobe pen is gecreëerd, behouden blijft; Maak indien nodig een nieuwe schets van het weefsel.
  3. Voeg op de juiste manier verdunde secundaire antilichaamfluoroforen of geconjugeerde primaire antilichamen toe om het weefsel te bedekken (~100 μL).
  4. Sluit de bevochtigde kamer en incubeer de objectglaasjes bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
  5. Verdun 10 mg/ml Hoechst (zie materiaaltabel) of DAPI met PBS voor een eindconcentratie van 1 μg/ml Hoechst of DAPI met PBS en voeg direct toe aan het weefsel (~100 μl). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  6. Verwijder de objectglaasjes uit de bevochtigde kamer en plaats ze in een glaasjesrek dat 5 minuten in het donker in PBS is ondergedompeld.
  7. Verwijder het schuifrek en plaats het in een nieuwe oplosmiddelbestendige schaal gevuld met PBS gedurende 5 minuten in het donker. Herhaal stap 1x.

13. Montage en voorbereiding voor microscopie

  1. Verwijder één dia tegelijk uit het rek met objectglaasjes ondergedompeld in PBS en houd de resterende dia's ondergedompeld in PBS in het donker. Klop overtollig PBS voorzichtig weg en gebruik indien nodig een pluisvrij doekje om overtollig PBS op het glasplaatje voorzichtig weg te vegen, vermijd het tissue.
  2. Voeg een tot twee druppels antifade montagemedium (zie Materiaaltabel) toe aan het midden van het weefsel.
  3. Houd een schoon dekglaasje (zie Materiaaltabel ) bij de randen vast en laat het langzaam in een hoek van 45° op het glaasje zakken. Zorg ervoor dat het montagemedium zich gelijkmatig over het weefsel verspreidt.
  4. Begin in het midden van het weefsel en druk voorzichtig met twee vingers op het dekglaasje om luchtbellen en overtollig montagemedium te verwijderen. Blijf indien nodig naar de randen drukken en houd de hele tijd lichte druk aan.
  5. Snijd het kleine uiteinde van een niet-gefilterde P200-pipet af en bevestig deze aan de punt van een serologische pipet die is aangesloten op een vacuüm.
  6. Volg de randen van het dekglaasje en gebruik de stofzuiger om het overtollige montagemedium te verwijderen.
  7. Leg de glaasje in een nieuwe glaasjesdoos horizontaal plat en laat de glaasje in het donker bij kamertemperatuur drogen.
  8. Herhaal dit proces voor elke dia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring werd uitgevoerd, zoals eerder beschreven12. Met behulp van de geoptimaliseerde methode bevatten intestinale Zwitserse broodjes alle drie de segmenten van de dunne darm en de dikke darm op één objectglaasje. Door de hele darm op een objectglaasje te plaatsen, kunnen onderzoekers veranderingen in alle delen van de darm analyseren en besparen ze kosten op het doorsnijden en kleuren van reagentia (Figuur 1). Ook helpt het gelijktijdig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor weefselfixatie met behulp van de Swiss roll-techniek om de darmarchitectuur te behouden en nauwkeurige immunokleuring te bevorderen. Eenmaal onder de knie kan deze techniek worden gebruikt om een breed scala aan onderzoeksvragen op het gebied van darmfysiologie en celbiologie te onderzoeken19. Er zijn verschillende geoptimaliseerde Zwitserse walsmethoden gepubliceerd die zeer nuttig zijn20,21...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies K01 DK121869 aan ACE en deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) en de HCS-hoeksteensubsidies aan SAD en RS. Dit werk werd ondersteund door startup-fondsen van de Medical University of South Carolina (MUSC) tot ACE en werd ondersteund door het MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) en de COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de cel- en moleculaire beeldvormingskern bij MUSC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
β-CATENINGeneTexGTX101435
Cellulose filter paperCytiva10427804Dikt Whatman papier
Charged glass slidesThermo Fisher Scientific23888114
CoverslipEpredia152440
Dissecting pins size 00PhusisB082DH4TZF
E-CADHERINR&D SystemsAF748
Freezer glovesTempshieldUX-09113-02
Heating blockPremiereXH-2001Slide Warmer
Histo-Clear IIElectron Microscopy Sciences64111-04Clearing reagent
HoeschtThermo Fisher Scientific62249
Hydrochloric AcidSigma Aldrich320331
Hydrophobic penMillipore402176
LAMININGeneTexGTX27463
LAMP1Santa CruzSC-19992
Large cassettesTissue-Tek4173
Minutien pinsFine Science ToolsNC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagentVector LaboratoriesMKB-2213Mouse-on-mouse block
MUC2GeneTexGTX100664
PCNACell Signaling Technology2586S
Pressure CookerCuisinartB000MPA044
ProLong gold antifadeThermo Fisher ScientificP36934Mounting medium
Reverse action forcepsDumont5748
Slide RackTissue-Tek62543-06
Slide Staining SetTissue-Tek62540-01Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettesFisherbrand15-200-403B
Sodium citrate dihydrateFisher BioreagentsBP327-1
Teleostein GelatinSigmaG7765Blocking buffer
Triton X-100Thermo Fisher ScientificA16046
Tween 20Thermo Fisher ScientificJ20605-AP
WipesKimTech34155
XylenesFisher Chemical1330-20-7
γ-ACTINSanta CruzSC-65638

Referenties

  1. Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
  2. Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , Springer US. New York, NY. (2021).
  3. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
  4. Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
  5. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  6. Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
  7. Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
  8. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  9. Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
  10. Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).
  11. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288(2018).
  12. Feldman, A. T., Wolfe, D. Histopathology: Methods and protocols. , Springer New York. New York, NY. (2014).
  13. Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883(2023).
  14. Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
  15. Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).
  16. Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
  17. Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747(2021).
  18. Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).
  19. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652(2010).
  20. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  21. Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630(2022).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).
  23. Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).
  24. Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
  25. Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
  26. Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).
  27. Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
  28. Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
  29. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
  30. Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).
  31. Bolognesi, M. aO., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Weefselfixatiedarmepitheelweefselconserveringantilichaamspecificiteitmuizendarmweefselroltechniekcellulaire morfologie
Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.