Integratie van gedragsbeoordeling van dieren en convolutioneel neuraal netwerk om de smaak-geurinteractie van wasabi en alcohol te bestuderen

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een reeks methoden voor het meten van het onderdrukkende vermogen van het snuiven van alcoholische dranken op het door wasabi opgewekte stekende gevoel.

Samenvatting

De commerciële wasabipasta's die vaak worden gebruikt voor voedselbereiding bevatten een homologe verbinding van chemosensorische isothiocyanaten (ITC's) die bij consumptie een irriterend gevoel opwekken. De impact van het snuiven van alcoholische dieetdranken op het gevoel van wasabi-kruidigheid is nooit onderzocht. Hoewel de meeste sensorische evaluatiestudies zich richten op individuele voedingsmiddelen en dranken afzonderlijk, is er een gebrek aan onderzoek naar de olfactorische studie van het snuiven van sterke drank tijdens het consumeren van wasabi. Hier wordt een methodologie ontwikkeld die het gebruik van een gedragsstudie bij dieren en een convolutioneel neuraal netwerk combineert om de gezichtsuitdrukkingen van muizen te analyseren wanneer ze tegelijkertijd sterke drank snuiven en wasabi consumeren. De resultaten tonen aan dat het getrainde en gevalideerde deep learning-model 29% van de afbeeldingen van gelijktijdige behandeling van wasabi en alcohol herkent die behoren tot de klasse van de wasabi-negatieve drankpositieve groep zonder dat voorafgaand trainingsmateriaal hoeft te worden gefilterd. Statistische analyse van de scores op de grimasschaal van muizen verkregen uit de geselecteerde videoframebeelden onthult een significant verschil (P < 0,01) tussen de aan- en afwezigheid van sterke drank. Deze bevinding suggereert dat alcoholische dranken in de voeding een verminderend effect kunnen hebben op de wasabi-opgewekte reacties bij muizen. Deze combinatorische methodologie biedt in de toekomst het potentieel voor individuele screening van ITC-verbindingen en sensorische analyses van gedistilleerde componenten. Er is echter verder onderzoek nodig om het onderliggende mechanisme van door alcohol geïnduceerde onderdrukking van wasabi-scherpte te onderzoeken.

Inleiding

Wasabia japonica, algemeen bekend als wasabi, heeft erkenning gekregen in de voedselbereiding ^1,2. De intense zintuiglijke ervaring die het oproept bij consumptie, gekenmerkt door tranen, niezen of hoesten, is bekend. Deze kenmerkende scherpte van wasabi kan worden toegeschreven aan een homologe verbinding van chemosensorische isothiocyanaten (ITC's). Het zijn vluchtige organozwavelfytochemicaliën die kunnen worden onderverdeeld in ω-alkenyl- en ω-methylthioalkylisothiocyanaten³. Van deze verbindingen is allylisothiocyanaat (AITC) het meest overheersende natuurlijke ITC-product dat wordt aangetroffen in planten die behoren tot de Cruciferae-familie, zoals mierikswortel en mosterd⁴. Commerciële wasabipasta's worden gewoonlijk bereid uit mierikswortel, waardoor AITC een chemische marker is die wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole van deze commerciële producten⁵.

Het combineren van alcoholische dieetdranken met met wasabi doordrenkte gerechten kan worden beschouwd als een voorbeeld van culturele instelling⁶. Subjectief gezien kan deze combinatie de kruidigheid en hitte tussen wasabi en de geest aanvullen, waardoor de algehele culinaire ervaring wordt verbeterd. Kwalitatieve gedragsbeoordeling bij dieren (QBA) is een uitgebreide methodologische benadering van het hele dier die gedragsveranderingen bij proefpersonen onderzoekt als reactie op externe stimuli op korte of lange termijn met behulp van numerieke termen⁷. Deze methode omvat pijntests, motorische tests, leer- en geheugentests, evenals emotietests die speciaal zijn ontworpen voor knaagdiermodellen⁸. Studies die de synergetische sensorische evaluatie van gustation samen met reukzin onderzoeken, blijven tot nu toe echter schaars in de literatuur ^9,10. De meeste onderzoeken naar chemesthetische sensatie zijn beperkt tot het afzonderlijk onderzoeken van individuele voedsel- en drankconsumptie¹¹. Bijgevolg is er een gebrek aan onderzoek naar de smaak-geurinteractie waarbij sterke drank wordt gesnoven tijdens het consumeren van wasabi.

Aangezien wordt aangenomen dat het door wasabi veroorzaakte prikkende gevoel een vorm van nociceptie^{is 12}, zijn gedragsbeoordelingen bij dieren zeer geschikt voor het evalueren van de nociceptieve sensorische reacties bij knaagdieren ^8,13,14. Een methode voor het beoordelen van nociceptie bij muizen, bekend als de muizengrimasschaal (MGS) score, werd ontwikkeld door Langford et ^al.15,16. Deze gedragsstudiemethode is een pijngerelateerde beoordelingsbenadering, gebaseerd op de analyse van gezichtsuitdrukkingen van de experimentele muizen. De experimentele opzet is eenvoudig, met een transparante kooi en 2 camera's voor video-opname. Door geavanceerde technologieën 17,18,19 voor automatische gegevensvastlegging te integreren, kunnen kwantitatieve en kwalitatieve gedragsmetingen worden verkregen, waardoor het dierenwelzijn tijdens gedragsmonitoring wordt verbeterd ²⁰. Bijgevolg heeft de MGS het potentieel om te worden toegepast bij het bestuderen van de effecten van verschillende externe stimuli op dieren op een ononderbroken en ad libitum manier. Het scoreproces omvat echter alleen het selecteren van een paar (minder dan 10) videoframe-afbeeldingen voor evaluatie door de panelleden, en voorafgaande training is noodzakelijk. Het scoren van een groot aantal voorbeeldafbeeldingen kan arbeidsintensief zijn. Om deze tijdrovende uitdaging te overwinnen, hebben verschillende onderzoeken machine learning-technieken gebruikt om de MGS-score^21,22 te voorspellen. Toch is het belangrijk op te merken dat de MGS een continue meting is. Daarom zou een classificatiemodel met meerdere klassen geschikter zijn voor het evalueren van een logisch en categorisch probleem, zoals het bepalen of de beelden van muizen die tegelijkertijd wasabi innemen en sterke drank snuiven, lijken op die van normale muizen.

In deze studie werd een methodologie voorgesteld voor het onderzoeken van de smaak-geurinteractie bij muizen. Deze methodologie combineert diergedragsstudies met een convolutioneel neuraal netwerk (CNN) om de gezichtsuitdrukkingen van de muisproefpersonen te analyseren. Twee muizen werden driemaal geobserveerd onder normale gedragsomstandigheden, tijdens de ervaring van wasabi-geïnduceerde nociceptie en tijdens het snuiven van sterke drank in een speciaal ontworpen kooi. De gezichtsuitdrukkingen van de muizen werden op video opgenomen en de gegenereerde framebeelden werden gebruikt om de architectuur van een deep learning (DL) model te optimaliseren. Het model werd vervolgens gevalideerd met behulp van een onafhankelijke beelddataset en ingezet om de beelden van de experimentele groep te classificeren. Om de mate van onderdrukking van de wasabi-scherpte te bepalen wanneer de muizen tegelijkertijd sterke drank snoven tijdens de wasabiconsumptie, werden de inzichten van kunstmatige intelligentie verder bevestigd door kruisvalidatie met een andere data-analysemethode, de MGS-score^{van 16}.

Protocol

In deze studie werden twee 7 weken oude ICR-mannelijke muizen met een gewicht tussen 17-25 g gebruikt voor de gedragsbeoordeling van dieren. Alle huisvestings- en experimentele procedures werden goedgekeurd door het Hong Kong Baptist University Committee on the Use of Human and Animal Subjects in Teaching and Research. De dierenkamer werd op een temperatuur van 25 °C en een luchtvochtigheid van 40%-70% gehouden op een licht-donkercyclus van 12 uur.

1. Ontwerp van de kooi

1. Bereid acrylonitril-butadieen-styreenstenen voor in 3 verschillende afmetingen voor de constructie van kooien: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm en 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Bereid een acrylonitril-butadieen-styreenplaat (312 mm x 147 mm x 2 mm) voor als basis van de kooi.
3. Bereid een niet-transparante acrylplaat van 239 mm x 107 mm met een dikte van 2 mm voor om als bodemplaat te gebruiken.
4. Bereid een transparante acrylplaat van 239 mm x 107 mm met een dikte van 5 mm voor om als bovenplaat te gebruiken.
5. Bereid een transparante acrylplaat van 107 mm x 50 mm met een dikte van 7 mm voor om als aansluitplaat te gebruiken.
6. Bouw 2 ondoorzichtige zijmuren door stenen te stapelen tot een hoogte van 54 mm.
7. Plaats de acrylplaten in de kooi op basis van acrylonitril-butadieen-styreen, zoals geïllustreerd in figuur 1A.
8. Bereid een chows' kamer voor die is opgebouwd uit vijf transparante acrylplaten van 90 mm x 50 mm met een dikte van 2 mm, zoals geïllustreerd in figuur 1B. Gebruik van de 5 transparante acrylplaten 2 platen voor de zijkanten, 1 plaat voor de bovenkant, 1 plaat voor de onderkant en 1 plaat voor de terminal.
9. Bereid een transparante acrylplaat van 60 mm x 50 mm van 2 mm voor als een chow-introductieplaat en plaats deze in de kamer van de chow.

2. Gedragsbeoordeling van dieren

1. Huisnestgenoten van 2 ICR mannetjesmuizen van 7 weken oud samen in een gewone kooi.
2. Geef de nestgenoten van 2 muizen gratis toegang tot voedselkorrels en kraanwater gedurende een aanpassingsperiode van 1 week.
3. Introduceer na 1 week de nestgenoten van 2 muizen met een fles ethanol (~40% v/v).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat ze de meegeleverde waterige ethanol alleen ad libitum mogen snuiven of inademen, terwijl het drinken beperkt is.
4. Voer gedragsexperimenten uit met behulp van het 9-10 weken oude muismodel en de transparante ligboxkooi die is afgebeeld in figuur 1A.
5. Demonteer alle acrylplaten en acrylonitril-butadieen-styreenplaten en maak ze grondig schoon. Begin met ze minstens 3 keer af te spoelen met ultrapuur water en droog ze vervolgens af met keukenpapier. Spuit ze vervolgens in met 75% ethanol en maak ze vervolgens schoon met lenspapier. Laat ze ten slotte minimaal 15 minuten aan de lucht drogen.
6. Weeg de muizen en noteer hun lichaamsgewicht vóór elke replicatie van het gedragsexperiment.
7. Bereid vers een mengsel van wasabi en pindakaas door 1 g commerciële wasabi en 4,5 g pindakaas af te wegen. Meng ze in een plastic zak met ritssluiting.
   OPMERKING: Vanwege de vluchtigheid van de isothiocyanaten in wasabi is het belangrijk om de commerciële wasabi in een vriezer van -20 °C te bewaren.
8. Weeg af en leg twee pasta's van 0,5 g pindakaas of een mengsel van wasabi en pindakaas op het introductiebord van de chow, zoals geïllustreerd in figuur 1B, C.
9. Plaats de voorbereide chow-introductieplaat in de kamer van de chows, zoals geïllustreerd in figuur 1B, C, zodat de 2 muizen tijdens elke video-opnamesessie ad libitum toegang hebben tot voedsel.
10. Vul de groef eronder met 30 ml vloeistof, zuiver water of sterke drank (~42% v/v ethanol), om gelijktijdige inademing te vergemakkelijken, zoals aangegeven in figuur 1B, C.
11. Begin met opnemen met behulp van de camera's op 2 smartphones die op de telefoonstandaards bij elke terminal zijn geplaatst.
    OPMERKING: De specificaties van de video's zijn als volgt: framebreedte, 1920; frame hoogte, 1080; datasnelheid, 20745 kbps; Framesnelheid, 30,00 frames per seconde (fps).
12. Plaats de 2 getrainde nestgenoten van muizen voorzichtig vanaf de bovenkant in het ontworpen platform voor diergedragsonderzoek en zet de kooi onmiddellijk vast met de bovenplaat.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat deze stap binnen 15 s is voltooid.
13. Neem elke video 2-3 minuten op.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de gehele duur van het experiment, van de bereiding van het pindakaas-wasabimengsel tot de voltooiing van de video-opname, beperkt is tot 5 minuten.
14. Herhaal het hele experiment 3 keer.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat elke replicatie van het experiment gedurende ten minste 6 uur gescheiden is.
15. Boots verschillende scenario's na.
    OPMERKING: In dit werk werd bijvoorbeeld een paar muizen gebruikt in 4 groepen met 4 verschillende scenario's die werden nagebootst met behulp van de hierboven beschreven experimentele instelling. Deze scenario's omvatten scenario A voor het achtergrondonderzoek, scenario B voor het onderzoek naar de positieve controle, scenario C voor het onderzoek naar de smaak-geurinteractie tussen wasabi en alcohol en scenario D voor het onderzoek naar de negatieve controle. Tabel 1 geeft een overzicht van deze scenario's.

3. Beeldherkenning

Net als bij veel onderzoeken naar beeldverwerking 23,24,25, werd een classificatiemodel bereikt door een CNN te trainen. Het script voor DL-bewerkingen is geschreven in Python v.3.10 op Jupyter Notebook (anaconda3). Het is beschikbaar op de volgende GitHub-opslagplaats: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Om de CNN te bouwen en te trainen, werden open-source bibliotheken gebruikt, waaronder numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 en keras v.2.11.0. Deze bibliotheken boden de nodige tools en functionaliteit om CNN te ontwikkelen en te trainen voor beeldherkenning.

1. Exporteer een reeks videoframe-afbeeldingen van de verzamelde videoclips om een gegevensset te genereren voor modeltraining met behulp van het meegeleverde Jupyter-notebook, genaamd Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Selecteer de afbeeldingen alleen met minimaal 1 muis die de meegeleverde pasta gebruikt. Voorbeelden van de geselecteerde afbeeldingen zijn te vinden in Aanvullende Afbeelding 1, Aanvullende Figuur 2, Aanvullende Figuur 3, Aanvullende Figuur 4, Aanvullende Figuur 5, Aanvullende Figuur 6 en Aanvullende Figuur 7.
3. Voer gegevensvergroting uit door de gegenereerde afbeeldingen horizontaal om te draaien door het script in het Jupyter-notebook, genaamd Step2_DataAugmentation.ipynb, te implementeren.
4. Bewaar de beeldgegevens van elke tweede replica voor externe, onafhankelijke CNN-modelvalidatie. Gebruik de afbeeldingen van elke eerste en derde replica voor interne modeltraining en testen.
5. Verwerk de afbeeldingsgegevens die worden gebruikt in CNN-modellering vooraf door het script uit te voeren in het Jupyter Notebook, genaamd Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, inclusief het wijzigen van het formaat van afbeeldingen, conversie van zwarte kleuren en normalisatie van beeldsignalen.
6. Splits het trainingsmateriaal willekeurig op in interne trainings- en testdatasets op een 8:2-manier.
7. Initialiseer de architectuur voor CNN. Ontwerp het aantal outputs van CNN op basis van het aantal scenario's dat moet worden onderzocht.
   OPMERKING: In deze studie werd bijvoorbeeld het neurale netwerk aangewezen om 3 klassen te classificeren. Zorg ervoor dat het script voor het omgaan met gegevensonevenwichtigheid op het gewicht van de klasse is samengesteld.
8. Zoek de hyperparametercombinatie die minimaal verlies oplevert op de interne testmonsters voor CNN-constructie.
9. Gebruik de optimale combinatie van hyperparameters voor het bouwen van CNN-architectuur.
10. Open de meegeleverde Jupyter-notebooks Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb en Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Valideer het verkregen model met behulp van de onafhankelijke (originele en gespiegelde) afbeeldingen van de tweede replica van het diergedragsexperiment.
11. Implementeer het behaalde en gevalideerde model voor het classificeren van de videoframe-afbeeldingen die zijn gegenereerd door de experimentele groep met behulp van Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    OPMERKING: Het is bijvoorbeeld scenario C in dit werk.

4. Handmatige score van de münsterassenschaal

OPMERKING: Om de inzichten van de CNN-modelvoorspelling te valideren, werd een andere methode toegepast die eerder was ontwikkeld en gevalideerd door Langford et al.¹⁶. Deze methode omvat het scoren van de MGS op basis van de 5 specifieke gezichtsactie-eenheden (AU's) van muizen: orbitale aanscherping, neusuitstulping, wanguitstulping, oren die naar buiten worden gespannen en verandering van snorharen. Elke AU krijgt een score van 0, 1 of 2, wat respectievelijk de afwezigheid, matige aanwezigheid of duidelijke aanwezigheid van de AU aangeeft. Dit scoresysteem maakt het mogelijk om elke AU te kwantificeren en te schalen om het niveau van nociceptie of ongemak dat de muizen ervaren te beoordelen.

1. Maak 3 videoframe-afbeeldingen van de nestgenoten die de pasta voor elke videoclip inslikken. Zorg ervoor dat elk frame ten minste 3 seconden van elkaar gescheiden is.
2. Blind coderen en afbeeldingen willekeurig opnieuw ordenen uit verschillende klassen van scenario's in volgorde met behulp van het meegeleverde sjabloonbestand met de naam "shuffleSlides.pptm" (aanvullend bestand 1) en het uitvoeren van de ingesloten macrocode.
3. Nodig ten minste 10 panelleden uit om de voorbeeldafbeeldingen te scoren.
4. Train de panelleden om afbeeldingsvoorbeelden te scoren met behulp van de MGS. Voorzie de panelleden van trainingsmateriaal dat het originele artikel over MGS en de bijbehorende handleiding^15,16 bevat.
5. Bereken de MGS-score van elk dier in een vastgelegd frame door het gemiddelde te nemen van alle scorepunten van de overeenkomstige 5 gezichts-AU's. Presenteer de MGS-score als het gemiddelde ± standaard meetfout (SEM).
6. Bepaal of er statistisch significante verschillen bestaan tussen verschillende klassen van scenario's door middel van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) met Bonferroni's meervoudige vergelijking post-hoctest.
   OPMERKING: Een waarde van P < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Het belangrijkste doel van deze studie is om een robuust kader vast te stellen voor het onderzoeken van de smaak-geurinteractie bij muizen. Dit raamwerk omvat het gebruik van kunstmatige intelligentie en QBA om een voorspellend classificatiemodel te ontwikkelen. Bovendien worden de inzichten die uit DL worden verkregen, kruislings gevalideerd met een kwantitatieve MGS-beoordeling voor een interne onafhankelijke analyse. De primaire toepassing van deze methodologie is het onderzoeken van de mate van onderdrukking van de door wasabi aangeroepen nociceptie wanneer muizen alcoholische voedingsdranken snuiven.

Herkenning van 29% van de beelden van wasabi-alcohol co-behandeling die behoren tot de klasse van de wasabi-negatieve drank-positieve groep door het deep learning-model
Overreactie van het gezicht kan bij mensen optreden bij commerciële consumptie van wasabipasta. Een soortgelijke ervaring kon ook worden waargenomen bij muizen (aanvullende video 1). Omdat nociceptie sensorisch goed gecorreleerd is met de gezichtsuitdrukkingen bij knaagdieren, werd het gedrag van 2 nestgenoten gevolgd om hun reactie te bepalen wanneer ze werden voorzien van chows die al dan niet commerciële wasabi bevatte. In deze studie werd een CNN getraind met behulp van DL-technieken. Omdat voor elk scenario 3 replicaten werden uitgevoerd, werd het beeldmateriaal van de 1e^en 3e^replica's gebruikt voor het afstemmen en modelleren van CNN-modelhyperparameters en het modelleren van interne training en testen. De evolutie van de CNN-architectuur in deze studie wordt gedetailleerd beschreven in tabel 2. De geoptimaliseerde architectuur van de CNN bestond uit een invoerlaag met een resolutie van 268 x 268 pixels, gevolgd door 4 tweedimensionale convolutielagen, elk met 8 filters. Daarnaast werden 2 poolinglagen, 2 dropout-lagen, een afvlakkende laag en 2 dichte lagen opgenomen voor de classificatietaak van 3 klassen. Raadpleeg aanvullend bestand 2 voor de CNN-architectuur.

Het model in deze studie werd getraind met behulp van een dataset van 35.486 afbeeldingen en getest op 8.872 afbeeldingen gedurende 7 tijdperken. De prestaties van het getrainde model tijdens de training, inclusief metrische gegevens zoals verlies, precisie-herinneringsratio, precisie en gevoeligheid (of terugroepen), op de interne trainings- en testdatasets zijn te zien in aanvullende figuur 8A-D. Het model demonstreerde zijn nauwkeurigheid, precisie en gevoeligheid van 1 voor zowel interne training als testsets. Dit geeft aan dat de voorspellingen van het model zijn afgestemd op de werkelijke klassen van de afbeeldingen in zowel interne trainings- als testdatasets. Na modeltraining werden de beelden van de 2e^{replica gebruikt} om ervoor te zorgen en onafhankelijk te valideren dat overfitting geen probleem was voor het behaalde CNN-model. Het model toonde zijn robuustheid van voorspelling door de waarden van nauwkeurigheid, precisie en gevoeligheid van 1 voor 4.820 afbeeldingen in het achtergrondonderzoek (scenario A), 3.900 afbeeldingen in het positieve controleonderzoek (scenario B) en 2.731 afbeeldingen in het negatieve controleonderzoek (scenario D). Het verkregen voorspellende model werd ingezet om de videoframebeelden van muizen die sterke drank snuiven en wasabi-bevattende pindakaas consumeren (scenario C) te classificeren in verschillende onderzoeksscenario's, d.w.z. scenario's A, B en D. De resultaten laten zien dat respectievelijk 0% en 29% van de afbeeldingen werden gecategoriseerd in de klassen van achtergrondonderzoek (scenario A, zuiver water en wasabivrije pindakaas aanwezig) en negatieve controlestudie (scenario D, Chinese spirit en wasabivrije pindakaas aanwezig), terwijl 71% van de afbeeldingen werd geclassificeerd als de klassen van de positieve controlegroep (scenario C, waar zuiver water en wasabi-pindakaasmengsel aanwezig waren). Deze bevindingen impliceren dat de aanwezigheid van voedingsdrank de wasabi-opgeroepen nociceptie bij muizen zou kunnen verminderen. Om te evalueren wat de machine leerde van het verstrekte trainingsmateriaal, werden functiekaarten gegenereerd voor elke convolutielaag. Zoals afgebeeld in aanvullende figuur 9A-D, werd waargenomen dat de aandacht van de machine gericht was op een verscheidenheid aan gelaatstrekken, zoals de oogkas, de neus, de randen van wang en lichaam, oren en ook op het contactoppervlak van de chows. Voortbouwend op deze waarnemingen werd een andere data-analysemethode, de MGS, uitgevoerd. De MGS richt zich op de gezichts-AU's van muizen, waardoor een statistische beoordeling en verdere validatie van het onderdrukkende vermogen van het presenteren van alcoholische dranken aan wasabi-geïnduceerde nociceptie mogelijk is.

Handmatige scores op de grimasschaal van de muis valideren statistisch voorspellingen van machine learning.
De intensiteit van de door wasabi opgewekte nociceptie werd geëvalueerd met behulp van de MGS-score, die scores toekent van 0 tot 2, waarbij score 0 staat voor de minst ernstige en score 2 voor de meest ernstige respons. In deze studie werden MGS-scores van 24 muizen (d.w.z. 2 muizen werden gepresenteerd in de 12 geselecteerde afbeeldingen als aanvullende figuur 10, aanvullende figuur 11, aanvullende figuur 12, aanvullende figuur 13 getoond) beoordeeld door 22 getrainde panelleden. Analyse van de nestgenoot van 2 muizen, met drievoudsexperimenten, toonde aan dat de intra-batch precisies en inter-batch precisions een relatieve standaardafleiding hadden, variërend van respectievelijk 0%-25% en 9%-33%. Dit duidt op een goede precisie en consistentie in het MGS-scoreproces. Er werd een significant verschil waargenomen tussen de MGS-scores van de muizen die een pasta van pindakaas kregen (Figuur 3A, 0,73 ± 0,04) en de muizen die een mengsel van wasabi en pindakaas kregen (Figuur 3B, 1,59 ± 0,11). Dit valideert de experimentele opzet voor de gedragsstudie bij dieren en bevestigt de werkzaamheid van wasabi bij het induceren van nociceptieve reacties. Hoewel de alcoholdamp die vrijkomt uit de onderliggende alcoholische drank (~42% v/v van alcohol) irriterend kan zijn, vertoonde de MGS-score (figuur 3D, 0,86 ± 0,16) geen significant verschil in vergelijking met de controlegroep (figuur 3A, 0,73 ± 0,04). Er werd echter een significant verschil waargenomen tussen de MGS-scores van muizen die het wasabi-pindakaasmengsel kregen (Figuur 3B, 1,59 ± 0,11) en muizen die werden blootgesteld aan alcoholdamp tijdens wasabiconsumptie (Figuur 3C, 0,95 ± 0,07) met een P-waarde van <0,05. Deze bevindingen suggereren dat de gelijktijdige toepassing van wasabi en alcoholische dranken de door wasabi veroorzaakte irritatie mogelijk kan verminderen, in lijn met het perspectief van kunstmatige intelligentie. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om het effectieve ingrediënt in de geleverde Chinese drank te onderzoeken dat bijdraagt aan de onderdrukking van wasabi-scherpte, waarschijnlijk toe te schrijven aan de aanwezigheid van ethanol.

Voorbeeld van code die al beschikbaar is. Alle code voor het uitvoeren van afbeeldingsherkenning die is gekoppeld aan de huidige inzending, is beschikbaar op een openbare GitHub-opslagplaats: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Eventuele updates zullen ook worden gepubliceerd op de GitHub Repository met een citaat van de uiteindelijke DOI van dit werk.

Figuur 1: Experimentele opstelling voor het pijngerelateerde gedragsonderzoek bij dieren. (A) De hele opstelling voor het opnemen van de gezichtsuitdrukkingen van 2 muizen met behulp van de camera's op 2 smartphones die op de telefoon zijn geplaatst, staat op elke terminal. (B) De kamer van de chows werd gebruikt om twee pasta's van 0,5 g pindakaas of een mengsel van wasabi en pindakaas ad libitum te verstrekken aan 2 muizen, en 30 ml vloeistof (water of ~42% v/v likeur) werd gevuld in de groef onder de pasta's voor gelijktijdige inhalatie. (C) Een nadere blik op de groef die was gevuld met 30 ml vloeistof en 2 pasta's van wasabi-pindakaasmengsel bevatte. Het mengsel werd bereid door 1 g commerciële wasabi te mengen in 4,5 g pindakaas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De architectuur van het convolutionele neurale netwerkmodel en de input en output ervan. Afbeeldingen van 3 verschillende scenario's werden gebruikt voor de training, waaronder scenario A voor het achtergrondonderzoek, scenario B voor het positieve controleonderzoek en scenario D voor het negatieve controleonderzoek. De beelden van scenario C voor het onderzoek naar de smaak-geurinteractie van wasabi-alcohol werden na modeltraining geclassificeerd in scenario's A, B of D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De muizengrimasschaal (MGS) scores van de muizen die verschillende chows kregen. De MGS-score loopt van 0 tot 2, waarbij de score 0 staat voor de minst ernstige en de score 2 voor de meest ernstige. De MGS-referentieschaal is aangepast van Langford et al. (2010)¹⁶. De grimas van muizen die (A) pindakaas kregen om te consumeren, scoorde 0,73 ± 0,04; (B) een mengsel van wasabi en pindakaas (1 g commerciële wasabi in 4,5 g pindakaas) voor inname scoorde 1,59 ± 0,11; (C) een mengsel van wasabi en pindakaas voor inname, terwijl de inhalatie van alcohol beschikbaar was uit de onderliggende toegediende drank (~ 42% v/v van alcohol), scoorde 0,95 ± 0,07; (D) pindakaas voor consumptie terwijl de inhalatie van alcohol beschikbaar was van de onderkant verstrekte spiritus scoorde 0,86 ± 0,16. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ns, geen significant verschil via eenrichtingsanalyse van variantie met Bonferroni's meervoudige vergelijking post-hoctest onder een betrouwbaarheidsinterval van 95%. Foutbalken vertegenwoordigden de standaardfout van metingen (SEM). Drievoudige metingen werden uitgevoerd voor 2 muizen in elk scenario. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenvatting van de vier scenario's die zijn nagebootst in de gedragsbeoordeling van dieren. Opmerkingen: ^a Het mengsel werd bereid door 1 g commerciële wasabi te mengen in 4,5 g pindakaas. ^b Chinese gedistilleerde drank die ~42% v/v alcohol bevat. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Samenvatting van de prestaties van het model. De hyperparameters van een batchgrootte van 64, filternummer van de 1e 2D-convolutielaag van 8 zonder volgende dropout, filternummer van de 2e 2D-convolutielaag van 8, filternummer van de 3e^{2D-convolutielaag} van 8 met 0,1 dropout, filternummer van de 4e^{2D-convolutielaag} van 8, en het filternummer van de dichte laag van 64 met 0,5 dropout leverde het laagste verlies op voor de interne split-testset. Deze hyperparameters werden vervolgens gebruikt om een classificatiemodel met 3 groepen (scenario A, B en D) te trainen voor het voorspellen van de beelden van scenario C. Scenario A was voor de achtergrondstudie. Scenario B was voor de positieve controlestudie. Scenario D was voor de negatieve controlestudie. Scenario C was voor het onderzoek naar de smaak-geurinteractie tussen wasabi en alcohol. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Voorbeeld van trainingsmateriaal voor deep learning van de klasse van scenario A (achtergrondstudie). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Voorbeeld van trainingsmateriaal voor deep learning van de klasse van scenario B (onderzoek naar positieve controle). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Voorbeeld van trainingsmateriaal voor deep learning van de klasse van scenario D (onderzoek naar negatieve controles). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Voorspellingen en voorbeeldonafhankelijke materialen van de klasse van scenario A (achtergrondstudie) voor modelvalidatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Voorspellingen en voorbeeldonafhankelijke materialen van de klasse van scenario B (positieve controlestudie) voor modelvalidatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Voorspellingen en voorbeeldonafhankelijke materialen van de klasse van scenario D (negatieve controlestudie) voor modelvalidatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Voorspellingen en voorbeeldmateriaal van de klasse van scenario C (wasabi-alcohol smaak-geur interactiestudie) voor modeltoepassing. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Voorspellende prestaties van het optimale deep learning-model. (A) Verlies van opleiding en verlies van interne validatie gedurende 7 tijdperken; (B) Precisie-recall-curves, (C) Precisie, en (D) Recall van training en interne validatie langs 7 epochs. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 9: Functiekaarten van elke convolutielaag. Functiekaarten van de (A) eerste, (B) tweede, (C) derde en (D) laatste convolutielaag in scenario's A, B en D, gesorteerd van boven naar beneden. Scenario A was voor het achtergrondonderzoek. Scenario B was voor de positieve controlestudie. Scenario D was voor de negatieve controlestudie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 10: Geselecteerde afbeeldingen voor het scoren van handmatige muizengrimassen op de schaal voor scenario A (achtergrondonderzoek). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 11: Geselecteerde afbeeldingen voor het scoren van handmatige muizengrimassen op de schaal voor scenario B (onderzoek naar positieve controle). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 12: Geselecteerde afbeeldingen voor handmatige muizengrimasschaalscore voor scenario C (onderzoek naar de smaak-geurinteractie van wasabi-alcohol). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 13: Geselecteerde afbeeldingen voor handmatige score op de grimasschaal van de muis voor scenario D (onderzoek naar negatieve controle). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: Grimassen van muizen na wasabi-consumptie met de aan- of afwezigheid van onder de verstrekte alcoholische dranken. Van 0 s tot 8 s presenteerde de videoclip de normale gezichtsuitdrukkingen van muizen bij het consumeren van pindakaas. Van 8 s tot 17 s illustreerde het de grimassen van muizen bij inname van wasabi. De muizen vertoonden orbitale verstrakking, neusuitstulping, wanguitstulping, oren die naar buiten werden gespannen en verandering van snorharen. Van 17 s tot 29 s presenteerde het dat de wasabi-geïnduceerde nociceptie kon worden onderdrukt wanneer de geest eronder beschikbaar was. Van 29 s tot het einde toonde het een verzameling grimassen in verschillende scenario's die hierboven zijn beschreven. Houd er rekening mee dat de meegeleverde video alleen ter illustratie wordt gebruikt. De kwaliteit wijkt af van de beschreven kwaliteitseis voor beeldherkenning en modellering. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: shuffleSlides.pptm. Aanvullende Microsoft PowerPoint-presentatie met macro's, genaamd 'shuffleSlides.pptm'. Dit bestand is voorbereid voor het in willekeurige volgorde afspelen van afbeeldingen voor de blinde test van het scoren van de grimassenschaal van muizen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: De CNN-architectuur. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De voorgestelde methode voor het bestuderen van de smaak-geurinteractie in dit werk is gebaseerd op de oorspronkelijke methode van gedragscodering voor gezichtsuitdrukking van pijn bij muizen, die werd ontwikkeld door Langford et ^al.16. Verschillende recent gepubliceerde artikelen hebben CNN geïntroduceerd voor het automatisch volgen van muisgezichten en de daaropvolgende MGS-score^van 21,26,27,28. Het toepassen van CNN's biedt een voordeel ten opzichte van de uitsluitend originele methode, zoals volgt voor het genereren van een reeks videoframe-afbeeldingen die kunnen worden gebruikt om een voorspellingsmodel te trainen. Daarentegen vereiste de oorspronkelijke methode een voorselectie van een beperkt aantal afbeeldingen voor MGS, wat subjectiviteit en vooringenomenheid kan introduceren.

Van de eerder gepubliceerde op CNN gebaseerde methoden zijn ze allemaal ontwikkeld voor het beoordelen van de mate van angst of ongemak bij een directe injectie van pijnverwekkende middelen in de bloedsomloop^26,28. Een nadeel van deze benadering van medicijnintroductie is dat er een aanzienlijke hoeveelheid inspanning nodig is om videoframebeelden uit te filteren die het gezichtsprofiel van de muis niet vastleggen. In deze studie wordt het nociceptie-veroorzakende middel commerciële wasabi op ad-libitumbasis verstrekt. Naast het maskeren van het vluchtige ingrediënt AITC, is pindakaas ook in staat om muisonderwerpen aan te trekken om een duidelijk vooraanzichtgebaar te presenteren, waardoor het vastleggen van hun gezichtsprofielen tijdens video-opname wordt vergemakkelijkt. Bovendien elimineert deze aanpak elke mogelijke interferentie van pijn veroorzaakt door het inbrengen van de naald. Het is echter belangrijk op te merken dat de innemende beweging van de muizen de MGS-score voor neusuitstulping en wanguitstulping kan verstoren. Om dit aan te pakken, moet een basiscontrole-experiment worden uitgevoerd door de muizen pure pindakaas te geven.

In bepaalde op CNN gebaseerde algoritmen voor gedragsonderzoek bij dieren wordt slechts een subset van gezichtsactie-eenheden van muizen geselecteerd uit trainingsbeelden en geprogrammeerd om te worden vastgelegd^21,22. Deze computationele methoden zijn gebaseerd op vooraf gedefinieerde kenmerken die verband houden met nociceptiesensatie, terwijl andere belangrijke kenmerken die specifiek zijn voor individuele muisproefpersonen mogelijk worden verwaarloosd. Als gevolg hiervan kan dit leiden tot verlies van informatie. Daarentegen kiest deze studie voor een andere benadering door het hele beeld van het gezicht van de muis te gebruiken om een CNN-model te trainen. Het is aangetoond dat deze op basis van alleen beeldgebruik (IOU) efficiënter is voor beeldclassificatie²⁵. Daarom is de voorgestelde CNN-modelleringsbenadering in de huidige studie vergelijkbaar met sommige voorgestelde methoden die eerst een CNN-model trainen door de hele afbeelding te gebruiken zonder regio-annotatie en vervolgens het model valideren door middel van handmatige menselijke evaluatie^27,29. Deze aanpak kan meer informatie in de afbeeldingen behouden en de introductie van subjectiviteit voorkomen.

Een beperking van de experimentele opzet in dit werk is echter dat muisproefpersonen werden gehuisvest als nestgenoten van 2 in plaats van in individuele habitats. Deze beslissing was opzettelijk, aangezien muizen sociale dieren zijn en doorgaans gedijen in groepsverband. Een interessante bevinding is dat tijdens de trainingsperiode van de dieren slechts 2 nestgenoten in 1 kooi van de 3 kooien werden getraind om aangepast te zijn aan de aanwezigheid van de Chinese geest. Als gevolg hiervan werden uitsluitend drievoudsexperimenten uitgevoerd op deze 2 nestgenoten. Voor het trainingsmateriaal voor CNN-modellering werd ook een individuele afbeelding van beide 2 nestgenoten als individuele steekproef genomen zonder enige segmentatie uit te voeren. Deze aanpak stelde ons in staat om de interactie tussen de nestgenoten vast te leggen en hun gedrag samen met gezichtsuitdrukkingen collectief te analyseren.

Net als bij de op afbeeldingen gebaseerde MGS-scoremethode, wordt verwacht dat de voorgestelde methode in deze studie overdraagbaar kan zijn op andere soorten dieren, zoals katachtigen en paarden ^30,31. Door de voorgestelde methodologie toe te passen, zou een voedselinducerende chows-introductiemethode met de toepassing van computervisie een benadering kunnen zijn voor het faciliteren van diergedragsonderzoek, specifiek voor de smaak-geurinteractie bij verschillende dieren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Absolute ethanol (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Acrylonitrile butadiene styrene bricks	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Acrylonitrile butadiene styrene plates	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Allyl isothiocyanate (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Anhydrous dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Chinese spirit	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Commercial wasabi	S&B FOODS INC.	https://www.sbfoods-worldwide.com
Formic acid (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC-grade acetonitrile (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC-grade methanol (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	N/A
Peanut butter	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Transparent acrylic plates	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU