Dit protocol beschrijft de toepassing van de chirurgische techniek die wordt gebruikt om gekloonde varkensembryo's via laparotomie bij gelten terug te plaatsen.
Methodenartikel
Embryotransferchirurgie via laparotomie bij gelten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol heeft tot doel de chirurgische techniek te demonstreren voor het overbrengen van gekloonde varkensembryo's naar de eileider, een methode die veel wordt gebruikt bij de productie van genetisch gemodificeerde varkens voor biomedisch onderzoek. Negen gelten ondergingen hormonale synchronisatie en laparotomie voor de overdracht van gekloonde embryo's geproduceerd door somatische celkernoverdracht (SCNT) in stadia van maximaal 4 cellen op dag 2 naar de eileider. De zwangerschapsdiagnose werd 30 dagen na de transferoperatie uitgevoerd via echografisch onderzoek. Zes van de negen geopereerde gelten vertoonden bij echografisch onderzoek tekenen van dracht. Omdat er echter geen progressie was in de ontwikkeling van de foetus zoals beoordeeld door echografie, ondergingen de gelten na 60 dagen obductie voor het verzamelen van biologisch materiaal en het beoordelen van het voortplantingssysteem. Verklevingen werden waargenomen in de baarmoederhoorns, eierstokken en eileiders. Uit het baarmoederlumen van twee van de geëuthanaseerde gelten werden één en vier embryonale structuren met een zwangerschapsduur tussen 12 en 20 dagen verkregen. Ondanks de afwezigheid van levende biggen, waarschijnlijk toegeschreven aan de lage efficiëntie van het terugplaatsen van gekloonde varkensembryo's, die wordt beïnvloed door verschillende factoren, waaronder het aantal en de kwaliteit van de teruggeplaatste embryo's, bleek de gepresenteerde chirurgische techniek snel en veilig te zijn.
Inleiding
Varkens zijn een uitstekend experimenteel model voor biomedisch onderzoek vanwege hun anatomische, fysiologische en genetische overeenkomsten met mensen1. Deze dieren zijn vaak gebruikt in onderzoek met betrekking tot xenotransplantatie, met de bedoeling organen, cellen of weefsels te produceren die een laag risico op afstoting bevorderen wanneer ze in mensen worden getransplanteerd. Onderzoek naar xenotransplantatie heeft tot doel het aanbod van organen voor menselijke transplantatie te vergroten, waardoor de wachtlijstvan patiënten wordt verkort.
De productie van varkens voor xenotransplantatie omvat verschillende stappen, waaronder de productie van klonen van genetisch bewerkte varkenscellen. Na de in vitro productie van genetisch gemodificeerde gekloonde embryo's, worden de embryo's overgebracht naar het voortplantingssysteem van een zeug met een gesynchroniseerde oestrische cyclus om de baarmoederfysiologie voor te bereiden op de ontvangst en dracht van de nieuwe conceptus3.
Embryotransfer bij varkens kan worden uitgevoerd met niet-invasieve of invasieve methoden4. Een van de niet-invasieve methoden is transcervicale overdracht, waarvoor geen chirurgische ingreep nodig is. Deze methode is echter beperkt tot het terugplaatsen van embryo's in latere ontwikkelingsstadia (d.w.z. morula- of blastocyststadia) en maakt het niet mogelijk om de inbrengplaats van de katheter of de afzetting van het embryo nauwkeurig te bepalen5. Laparoscopie en laparotomie worden beschouwd als invasieve methoden voor embryotransfer. Laparoscopie is minder invasief, maar vereist specifieke en dure apparatuur, en de efficiëntie varieert aanzienlijk (van minder dan 20% tot meer dan 80%) als gevolg van verschillende factoren, zoals moeilijkheden bij het manipuleren van voortplantingsstructuren en het type katheter dat wordt gebruikt 4,6. Daarom is overdracht via laparoscopie nog steeds minder efficiënt in vergelijking met chirurgische overdrachtsmethoden via laparotomie4.
Embryotransferchirurgie bij zeugen via laparotomie is een relatief eenvoudige en snelle procedure, die doorgaans ongeveer 30 minuten duurt. Het moet echter worden uitgevoerd in een chirurgisch centrum dat is uitgerust met inhalatie-anesthesieapparatuur en een gespecialiseerd team. Voor commerciële varkensstammen (zoals Landras, Large White of hun kruisingen) zijn speciale apparatuur zoals takels voor het heffen van gelten en een brede, stevige operatietafel noodzakelijk vanwege het aanzienlijke gewicht van de dieren (ongeveer 130-150 kg).
Om de operatie te laten slagen, moeten de embryo's vooraf worden beoordeeld op hun ontwikkelingsstadium. Embryo's van maximaal 4 cellen worden aanbevolen om in de baarmoederbuis te worden geplaatst. Embryo's in stadia voorbij 4 cellen, zoals morula's en blastocysten, moeten worden overgebracht naar de baarmoederhoorn 7,8.
Hoewel onderzoeksgroepen over de hele wereld de productie en chirurgische overdracht van genetisch gemodificeerde gekloonde varkensembryo's uitvoeren, zijn er nog steeds geen goed gedefinieerde protocollen die deze procedure door middel van video's demonstreren. Deze aanpak is cruciaal voor het succes van de zwangerschap, aangezien de techniek een nauwkeurige afzetting van embryo's op de exacte locatie van de eileider vereist, waarbij de lokalisatie van het ostium van de eileiders en de introductie van de pipet met de embryo's worden ingebracht. Deze techniek kan beter worden begrepen door middel van verklarende video's van de hele procedure. Daarom is dit artikel bedoeld om de laparotomie-operatie aan te tonen voor het overbrengen van gekloonde embryo's naar de eileider van gelten, een essentiële voorwaarde voor de toekomstige productie van genetisch gemodificeerde varkens die worden gebruikt voor xenotransplantatie of andere gerelateerde doeleinden.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor diergebruik in onderzoek van het College of Veterinary Medicine and Animal Science van de Universiteit van São Paulo, protocolnummer 6088030523. Negen zeven maanden oude gelten van de varkenshouderij Água Branca, gelegen in de stad Itu, in de staat São Paulo, Brazilië, werden direct na de tweede oestrusdetectie gebruikt. De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van dieren
- Vast de dieren gedurende 12 uur en beperk de toegang tot water gedurende 4 uur voor de chirurgische ingreep.
- Zuig met een naald van 40 mm x 12 mm 10 mg/kg ketamine en 0,2 mg/kg midazolam op in dezelfde spuit van 50 ml. Bevestig de spuit aan een infuustoedieningsset om de toediening van medicatie te vergemakkelijken, een veilige afstand tot het dier aan te houden en het vrij te laten bewegen.
- Dien de pre-anesthesiemedicatie toe via intramusculaire injectie in de trapeziusspier, caudaal naar de uitwendige gehoorgang.
- Kanuleer de oorader met een katheter van 20 G en sluit deze aan op een macrodruppeltoedieningsset voor intraoperatieve vloeistoftherapie met 0,9% NaCl-oplossing met een snelheid van 10 ml/kg/uur.
- Induceer anesthesie met 4 mg/kg propofol intraveneus (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Voer orotracheale intubatie van het dier uit met behulp van een laryngoscoop en een orotracheale buis van maat 9 met een manchet10.
- Handhaaf de anesthesie met inhalatie van 1,5% tot 2% isofluraan. Controleer bovendien de anesthesie door fysiologische parameters te evalueren, zoals de hartslag, die tussen 100 en 120 slagen per minuut moet worden gehouden, de zuurstofverzadiging, die tussen 99% en 100% moet worden gehouden, spierontspanning, afwezigheid van beweging en evaluatie van reflexen.
OPMERKING: De lichaamstemperatuur moet ook worden gecontroleerd en gecontroleerd, tussen 37,5-38,5 °C. Indien nodig kan naast isofluraan propofol worden gebruikt om de parameters onder controle te houden. Fentanylhydrochloride moet worden toegediend als pijnstiller in een dosis van 0,02 mg/kg elke 20 minuten. Alle parameters moeten elke 5 minuten worden geregistreerd. - Dien perioperatieve analgesie toe met een enkele dosis van 0,002 mg/kg fentanyl intraveneus en 4 mg/kg tramadolhydrochloride intramusculair in de bilspier of trapeziusspier.
- Plaats hartelektroden op het thoracale gebied voor intraoperatieve monitoring van de hartslag. Registreer elke 5 minuten de hartslag, rectale temperatuur en zuurstofverzadiging.
2. Chirurgische ingreep
- Plaats het gelat op de operatietafel in dorsale ligging.
- Bedek de poten van het dier met procedurele handschoenen om besmetting van het operatieveld tot een minimum te beperken.
- Voer ventrale caudale abdominale ontharing uit tussen het voorlaatste paar borstklieren met behulp van een chirurgische tondeuse.
- Voer preoperatieve huidantisepsis uit met een met chloorhexidine geïmpregneerde antiseptische borstel en maak cirkelvormige bewegingen van het navelstrenglittekengebied naar het laatste paar borstklieren. Verwijder chloorhexidine met een schoon, bevochtigd kompres.
- Zorg ervoor dat de chirurg en de assistent chirurgische antisepsis uitvoeren en steriele operatiejassen en handschoenen dragen voor de operatie.
OPMERKING: Het dier moet worden voorbereid op de operatie in een voorbereidingsruimte die gescheiden is van de operatieplaats. - Bereid de operatietafel voor met de juiste en eerder gesteriliseerde instrumenten die worden vermeld in de Materiaaltabel.
- Voer de laatste antisepsis van het chirurgische veld uit met behulp van steriel gaas en chloorhexidine-antisepticum, waarbij het gebied in een visgraatpatroon wordt gereinigd, beginnend op de incisieplaats en lateraal uitbreidend.
- Herhaal deze procedure drie keer met chloorhexidine-antisepticum en herhaal vervolgens de procedure met alcoholisch chloorhexidine.
- Bedek het dier volledig met een steriel operatielaken en maak met een schaar een rechthoekige opening in het operatielaken, ongeveer 10 x 20 cm², als het laken niet is gefenestratiseerd.
- Plaats het chirurgisch laken over het voorlaatste paar liesachtige borstklieren. Plaats 4 Backhaus-klemmen om het operatielaken over de huid van het dier te bevestigen.
- Snijd de huid in met een scalpel en maak een incisie van ongeveer 10 cm lang.
- Bereik hemostase van onderhuidse bloedvaten met een hemostatische pincet en/of resorbeerbare hechtdraad maat 2.
- Ontleed het onderhuidse weefsel met de vingers of met behulp van een fijnpuntige schaar en verdiep de incisie om de linea alba in de buikspieren te bereiken.
OPMERKING: Palpeer de middellijn van de buik om de linea alba te voelen als een stijver en vezeliger gebied; Let op de scheiding van de spieren van de rectus abdominis en noteer de verandering in weefselconsistentie tijdens het ontleden om de linea alba nauwkeurig te identificeren11. - Pak met een Allis-tang de spier vast en til deze op om met een scalpel een steekincisie in de linea alba te maken.
- Steek de wijsvinger in de incisie om de aanwezigheid van verklevingen te beoordelen. Verleng de incisie caudaal en craniaal over de linea alba met een stompe/stompe of fijne/stompe schaar voorzichtig om te voorkomen dat andere organen en onderliggende structuren beschadigd raken.
- Maak een incisie van voldoende lengte zodat de ene hand van de chirurg in de buikholte kan worden ingebracht om de baarmoederhoorns en/of eierstokken te lokaliseren en naar buiten te brengen. Een Gosset-retractor kan worden gebruikt om het binnendringen in de buikholte en het hechten van de spieren in een enkele laag aan het einde van de procedure te vergemakkelijken.
- Als een van de baarmoederhoorns zich vóór de eierstokken bevindt, volg deze dan voorzichtig totdat u de punt van de baarmoederhoorn en de ipsilaterale eierstok bereikt. Beoordeel tijdens deze procedure de aanwezigheid van vloeistof in de baarmoeder, die de zwangerschap in gevaar kan brengen.
- Nadat u de eierstok hebt gelokaliseerd, trekt u er voorzichtig aan en legt u deze voorzichtig bloot. Beoordeel de aanwezigheid van pre-ovulatoire follikels, hemorragische corpora lutea, cyclische corpora lutea en corpus albicans om te evalueren of de synchronisatie van het gelt is zoals verwacht.
- Verwijder voorzichtig de fimbriae van de baarmoederbuis die de eierstok bedekt, verwijder het slijmvlies en zoek het ostium van de baarmoederbuis.
OPMERKING: Als de chirurg het moeilijk vindt om het ostium van de fimbriae te identificeren, kan een pocket op de ampulla van de eileider worden gedaan met een ronde hechtnaald, waarbij het doorboren van bloedvaten wordt vermeden, om de Tomcat-katheter met de embryo's in te brengen. - Breng voorzichtig een Tomcat-katheter met de embryo's in het ostium van de fimbriae totdat u het ampulla-gebied van de baarmoederbuis bereikt.
- Bevestig een spuit van 1 ml aan de Tomcat-katheter om de embryo-bevattende vloeistof in de baarmoederbuis te duwen. Bedek de eierstok met de fimbriae en plaats deze terug in de buikholte.
- Zoek de contralaterale baarmoederhoorn en eierstok en herhaal stap 2.17-2.21.
- Verplaats de structuren in de buikholte en voeg 1 L zoutoplossing of Ringer's lactaatoplossing verwarmd (39 °C) toe om verklevingen te voorkomen voordat met abdominorraphy wordt begonnen.
- Hecht de buikspieren met resorbeerbare hechtdraad maat 2 in "X" steken (Sultan) onderbroken.
- Benader het onderhuidse weefsel met een doorlopende matrashechting met behulp van resorbeerbare hechtdraad maat 2.
- Sluit de huid met nylon hechtdraad maat 2 in onderbroken eenvoudige hechtingen, chirurgische nietjes of ethylcyanoacrylaatlijm. In deze procedure hebben we gekozen voor het gebruik van lijm.
- Reinig de operatiewond met een gaas gedrenkt in waterstofperoxide en droog af met een kompres om de fixatie van de operatielijm op de operatiewond te verbeteren. Breng rifamycine of Pearson's zalf aan, bedek met gaas en breng ten slotte chirurgische lijm aan.
OPMERKING: De wond moet 5 dagen gesloten blijven met een verband.
3. Postoperatieve zorg
- Evalueer de dieren op tekenen van kenmerkende klinische pijn gedurende ten minste de volgende 3 opeenvolgende dagen, volgens de schaal voorgesteld door Luna et al.12.
OPMERKING: Deze schaal is gebaseerd op verschillende gedragingen die varkens vertonen bij het ervaren van verschillende niveaus van pijn, zoals houding, interactie en interesse in de omgeving, activiteit, eetlust en aandacht voor het getroffen gebied. De score varieert van 0 tot 3, afhankelijk van het type gedrag dat wordt vertoond, voor elke geëvalueerde parameter. Aan het einde van de evaluatie weerspiegelt de som van alle scores de intensiteit van de pijn die het dier ervaart, waarbij 0 staat voor geen pijn en 18 voor zeer intense pijn12. - Dien een enkele dosis van 15 mg/kg amoxicilline en 0,4 mg/kg 2% meloxicam toe, zowel intramusculair (in de bilspier of cervicale spier) eenmaal per dag gedurende 3 dagen als postoperatieve zorg om pijn, ontstekingsprocessen en infectie te voorkomen.
OPMERKING: Als de pijnscore gelijk is aan of groter is dan 6 op de gebruikte pijnschaal (score van 0 tot 18), dien dan eenmaal per dag 5.000 mg/dier natriumdipyron intramusculair (in de bilspier of cervicale spier) toe naast het ontstekingsremmende en antibioticum. U kunt ook analgesie uitvoeren zoals beschreven in de lokale IACUC-richtlijnen. - Verwijder op de 6e dag na de operatie de chirurgische lijm voor wondreiniging met gaas gedrenkt in 2% alcoholische chloorhexidine-oplossing en breng actuele Pearson's zalf aan tot de 10e dag, wanneer het verwijderen van hechtingen of het verwijderen van chirurgische nietjes, indien gebruikt, wordt aanbevolen.
4. Echografische zwangerschapsdiagnose van zwangerschap
- Voer transabdominale zwangerschapsechografische evaluatie uit met een ultrasoon apparaat (frequentiebereik 4.5 tot 8.5 MHz) 30 dagen na de embryotransferoperatie.
- Breng ultrasone gel aan op de sonde en plaats deze in de buurt van de liesstreek, mediaal gericht.
OPMERKING: Visualisatie van afgeronde echovrije embryonale blaasjes, als gevolg van vloeistof in het baarmoederlumen, geeft zwangerschap aan. Niet-visualisatie van intra-uteriene vloeistof, of aanwezigheid van intra-uteriene vloeistof zonder afbakening van embryonale blaasjes, suggereert de afwezigheid van zwangerschap.
5. Euthanasie van de dieren
OPMERKING: Euthanaseer de gelten die bij het echografisch onderzoek geen foetussen vertoonden van grootte en uiterlijk die overeenkomen met de zwangerschapsduur.
- Zuig met een naald van 40 mm x 12 mm 15 mg/kg ketamine en 2 mg/kg midazolam op in dezelfde spuit van 50 ml die is aangesloten op een intraveneuze toedieningsset en dien intramusculair toe in de trapeziusspier in het cervicale gebied caudaal naar de uitwendige gehoorgang, als pre-anesthesie.
- Annuleer de oorader met een katheter van 20 G en induceer anesthesie met 4 mg/kg propofol intraveneus in een bolus totdat bradycardie optreedt (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Dien vervolgens 10 tot 20 ml 19,1% kaliumchloride intraveneus toe. Bevestig cardiopulmonale stilstand door de afwezigheid van ademhalingsbewegingen, bleke slijmvliezen, verlies van hoornvliesreflex en afwezigheid van hartslagen te observeren door een stethoscoop over het hartgebied te plaatsen.
- Verzamel elk type intra-uteriene inhoud (embryonaal weefsel, vloeistof of slijmafscheidingen) van necropsievrouwtjes13 en stuur het door voor microbiologische analyse om mogelijke pathogenen te detecteren en ook voor genotypische karakterisering van de klonen (indien nodig). Controleer visueel de aan- of afwezigheid van corpora lutea, cysten in de eierstokken, abnormale afscheidingen en het optreden van verklevingen in de baarmoeder, eierstokken en eileiders14.
Resultaten
Dit artikel is bedoeld om de laparotomie-operatie te demonstreren voor het overbrengen van gekloonde embryo's naar de eileider van gelten. Alle dieren bleven in een adequaat anesthesievlak, zonder enige intraoperatieve incidenten of complicaties tijdens het herstel van de anesthesie. De gelten hadden gemiddeld 2-3 uur nodig om op te staan nadat de operatie was afgelopen.
Alle chirurgische ingrepen duurden gemiddeld 44 minuten. Negen gelten ondergingen een operatie, met een gemiddelde van 185 gekloonde embryo's per gelt, wat neerkomt op een totaal van 1.664 embryo's die bilateraal werden teruggeplaatst (tabel 1). De lokalisatie van de eierstokken, hun exteriorisatie en de introductie van de Tomcat-katheter met de embryo's in het ostium van de eileider kwamen overeen met de meest delicate momenten van de operatie. De eierstokken van alle gelten werden tijdens de operatie geïnspecteerd en vertoonden allemaal recent ovuleerde hemorragische follikels, in overeenstemming met wat werd verwacht voor het uitgevoerde oestrussynchronisatieprotocol, dat gericht was op het uitvoeren van embryotransfers kort na het voorvallen van de eisprong. Alle procedures verliepen zonder intraoperatieve incidenten.
Geen enkel dier vertoonde tekenen van intense pijn na de operatie, met een gemiddelde pijnscore van 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 en 0,33 op de pijnschaal (variërend van 0 tot 18) uitgevoerd gedurende de 3 postoperatieve dagen voor elk van de geopereerde gelten (tabel 2). Slechts 1 van de geopereerde gelten vertoonde op de 12edag na de operatie subcutane vochtophoping (seroom), met tekenen van infectie en ontsteking gelokaliseerd in de buurt van de operatiewond. Na het aftappen van de vloeistof met een naald van 40 mm x 1,6 mm geleid door echografie, het aanbrengen van koude kompressen op het ontstoken gebied gedurende 30 minuten per dag gedurende 7 dagen, toediening van ceftiofur (3 intramusculaire injecties, met een interval van 72 uur tussen de injecties) en 2% meloxicam (0,4 mg/kg SID, intramusculair, gedurende 3 dagen), fistelde de wond en draineerde de resterende mucopurulente inhoud, met als resultaat een volledige verbetering van het dier. De andere geopereerde gelten bleven 5 dagen bij het operatieverband zonder dat het hoefde te worden vervangen of verwijderd voor wondreiniging, wat pas werd uitgevoerd van de6e tot de 10edag na de operatie.
Bij de gelten 2, 8 en 9 werd geen vochtophoping en embryonale blaasjesvorming in het baarmoederlumen waargenomen (figuur 1A). Daarom werd de zwangerschapsdiagnose van deze dieren als negatief beschouwd. De andere gelten vertoonden intra-uteriene vochtophoping en de vorming van embryonale blaasjes, gevisualiseerd als goed gedefinieerde echovrije afgeronde structuren (Figuur 1B-D). Het was mogelijk om in twee van de ontvangende gelten een hyperechoïsch gebied te identificeren ten opzichte van de embryonale structuur in de vroege ontwikkelingsfase in de embryonale blaasjes op de 32edag van de dracht (figuur 1E,F).
Na een negatieve zwangerschapsdiagnose of niet-progressie van de zwangerschap, werden de gelten geëuthanaseerd en werd het voortplantingssysteem geanalyseerd. Verklevingen in meer of mindere mate in gebieden van eierstokken, eileiders en baarmoederhoorns werden waargenomen bij gelten 1, 2, 3 en 4, en cysten in de eierstokken werden waargenomen bij gilt 8 (figuur 2). Vier embryonale structuren, met een zwangerschapsduur die compatibel is met ongeveer 12 tot 20 dagen zwangerschap, werden verkregen uit de baarmoeder van verguld 3 en één structuur werd verkregen uit gilt 7 (figuur 3). De analyse van embryonale weefselfragmenten resulteerde in negatief voor de detectie van Parvovirus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae en Porcine Circovirus typen 2 en 3 (PCV2/PCV3), die embryonale dood of abortussen kunnen veroorzaken.
Figuur 1: Echografische beelden van de baarmoeder van embryo-ontvangende gelten 30 dagen na de chirurgische ingreep. (A) De baarmoeder van gelt 2 zonder de aanwezigheid van vloeistof erin, wat een negatieve zwangerschapsdiagnose kenmerkt. De zwangere baarmoeder van gelt 1 (B), gilt 3 (C) en gelt 4 (D) met embryonale blaasjes met vloeistof erin (sterretjes). De zwangere baarmoeder van verguld 3 (E) en verguld 7 (F) met een hyperechoïsche structuur (pijl) in het embryonale blaasje, wat wijst op foetale vorming in de vroege fase na 32 dagen zwangerschap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van het voortplantingssysteem. Afbeeldingen van baarmoeder, eierstokken en eileiders na obductie van vergulde gel 1 (A), gelt 2 (B), gelt 3 (C), gelt 4 (D), gilt 5 (E), gilt 6 (F), gilt 7 (G), gilt 8 (H) en gilt 9 (I). Pijlen markeren verklevingen in baarmoederhoorns, eierstokken en eileiders, en pijlpunten markeren cysten in de eierstokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zwangerschapsdiagnose. Embryo's in een vroeg stadium verwijderd uit gilt 3 (A-D) en gilt 7 (E) vertonen een positieve zwangerschapsdiagnose en hyperechoïsche structuren in embryonale blaasjes bij echografisch onderzoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Aantal en type embryo's dat per gelt wordt teruggeplaatst, gediagnosticeerde zwangerschappen en aantal embryo's dat is verkregen na obductie van de geopereerde gelten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Waarden toegekend aan elk van de geopereerde gelten met betrekking tot de presentatie van pijnsymptomen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussie
De beschreven chirurgische methode is eerder uitgevoerd door andere onderzoeksgroepen die werken met de productie van gekloonde varkens of genetisch gemodificeerde gekloonde varkens, met meldingen van geboorten na de implementatie van deze techniek 15,16,17,18,19,20. De zwangerschaps- en geboortecijfers van SCNT-embryo's geproduceerd uit verschillende cellijnen variëren rond de 20%-30% (van de 264 transfers sinds 2017), met een gemiddelde van 3,2 ± 0,4 biggen geboren per worp 3,21. Verschillende factoren houden verband met de lage efficiëntie van deze techniek, waaronder het synchronisatieprotocol dat wordt gebruikt voor ontvangende zeugen, synchronisatie tussen de ontvangende zeug en het stadium van teruggeplaatste embryo's, de plaats van embryo-afzetting, de kwaliteit van de eicellen die worden gebruikt voor SCNT en geproduceerde embryo's, de kwaliteit en het cellulaire stadium van somatische cellen van de kerndonor en het aantal teruggeplaatste embryo's21.
Volgens de huidige studie bleek de beschreven operatie effectief, snel en veilig te zijn voor het uitvoeren van chirurgische overdracht van gekloonde embryo's (tot 4-cellig stadium) bij gelten, wat resulteerde in positieve echografische zwangerschapsdiagnoses en visualisatie van embryonale structuren in het baarmoederlumen na autopsie, met een zwangerschapsduur ongeveer tussen 12-20 dagen van de zwangerschap22. Een andere, minder invasieve methode voor het overbrengen van SCNT-embryo's naar de eileider van zeugen is laparoscopie. De efficiëntie van deze techniek varieert echter aanzienlijk van minder dan 20% tot meer dan 80% als gevolg van verschillende factoren, zoals de anatomie van de structuren, het type katheter dat wordt gebruikt en de plaats van embryo-afzetting 4,6,23,24,25,26,27. Bij het terugplaatsen van 2-4 blastomeervarkensembryo's door laparoscopie via het infundibulum naar 6 zeugen, bereikten Wieczorek et al.4 28-31 dagen na de procedure geen positieve zwangerschappen, en dit resultaat hield verband met moeilijkheden bij het inbrengen van de katheter in de eileider, het inbrengen van een ondiepe katheter in de eileider en het optreden van infundibulumperforatie met de katheter. Daarom lijkt de methode van embryotransfer via laparotomie naar de eileider van zeugen nog steeds het meest efficiënt.
Het chirurgische risico dat gepaard gaat met de laparotomieprocedure voor embryotransfer bij zeugen is klein; het is echter belangrijk om de mogelijkheid van kwaadaardige hyperthermie tijdens anesthesie op te merken, die vaak wordt gezien bij commerciële varkens van de rassen Landras en Large White28. In dit geval vertoonde geen van de geopereerde gelten klinische tekenen van maligne hyperthermie tijdens de anesthesie. Er is ook een risico op kleine lokale bloedingen van grotere bloedvaten in het onderhuidse gebied, die gemakkelijk kunnen worden gestopt met een hemostatische pincet of hechten met resorbeerbare hechtdraad. De mogelijkheid om per ongeluk een orgaan van de buikholte, zoals de blaas of darmlussen, in te snijden tijdens de incisie met de scalpel in de steek en extensie-incisie in de linea alba met een schaar kan ook voorkomen. In dit geval moet de chirurg goed opletten tijdens de incisie van de linea alba en het hechten van de buikspieren om te voorkomen dat onderliggende structuren worden gesneden of gescheurd.
De handvaardigheid van de chirurg is essentieel voor een goede manipulatie van de eierstokken en een zorgvuldige exteriorisatie, waarbij scheuring van de bloedvaten van de eierstoksteel wordt voorkomen. Wanneer het moeilijk is om de eierstok(en) te lokaliseren, is het mogelijk om de procedure te starten door een van de baarmoederhoorns te lokaliseren en de verlenging ervan te volgen tot het bereiken van de punt van de baarmoederhoorn bij de baarmoeder-eileidersovergang nabij de eierstok. Er moet voor worden gezorgd dat verklevingen van de eierstokken en de baarmoeder als gevolg van overmatige manipulatie van deze organen worden voorkomen. Het hydrateren van deze structuren met Ringer-lactaatoplossing of zoutoplossing bij 39 °C tijdens de operatie kan de vorming van verklevingen helpen voorkomen. Manipulatie van de baarmoederbuis, vooral in het gebied van de fimbriae, moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd om uitrekken en scheuren te voorkomen. Hoewel eenzijdige embryotransfer, alleen naar een van de baarmoederbuizen, kan worden uitgevoerd om overmatige manipulatie van de baarmoeder te voorkomen en de operatietijd te verkorten, kan bilaterale overdracht veiliger en voordeliger zijn, vooral in gevallen waarin er per ongeluk een van de baarmoederbuizen wordt gescheurd of twijfels over embryo-afzetting op de juiste locatie. Bovendien wordt bilaterale overdracht meer aanbevolen omdat het hogere drachtpercentages en het aantal geboren biggen bevordert in vergelijking met eenzijdige overdracht 16,30. De aanwezigheid van cysten wordt geassocieerd met regelmatige of onregelmatige terugkeer naar oestrus, waarbij tot 10% van de vrouwen met cysten in de eierstokken in anestrus blijft. Het is gerelateerd aan verschillende oorzaken, zoals stress, gebruik van hormonale protocollen of genetische overerving31,32. In ons geval traden folliculaire cysten op ondanks het volgen van de dosis en toedieningstijd die door de hormoonfabrikant worden aanbevolen voor warmtesynchronisatie.
Weten hoe het ostium van de baarmoederbuis kan worden gelokaliseerd door het openen van de fimbriae is van fundamenteel belang voor de juiste afzetting van embryo's op de juiste locatie. Om vergissingen met betrekking tot de locatie van de afzetting van het embryo te voorkomen, wordt aanbevolen om vooraf te trainen in de doorgang van de Tomcat-katheter gevuld met oplossing (bijv. water) door het ostium van de baarmoederbuis in slachthuismonsters. Wanneer de pipet op de juiste plaats wordt ingebracht, is het mogelijk om een toename van het volume van de baarmoederbuis waar te nemen bij het injecteren van de oplossing. Het is vermeldenswaard dat hoe kleiner de hoeveelheid vloeistof die samen met de embryo's wordt overgedragen, hoe groter de kans op zwangerschap33. Als de chirurg het erg moeilijk vindt om het ostium van de baarmoederbuis te vinden, is het mogelijk om een zak op de eileider te maken en de katheter er doorheen te brengen. Hoewel deze laatste methode sneller is en minder manipulatie van de eileider met zich meebrengt, moet de chirurg bloedvaten vermijden en er zeker van zijn dat de katheter correct in het lumen van de eileider is ingebracht.
Hoewel het risico op postoperatieve infecties door deze chirurgische ingreep laag is, kan dit optreden als gevolg van factoren zoals de reinheid van het gebied waar de dieren zijn gehuisvest, de duur van de chirurgische ingreep, het onderhoud van het verband gedurende voldoende tijd en het juiste voorschrijven van medicijnen, zoals preventieve antibioticatherapie en ontstekingsremmers. De meest plausibele hypothese voor het optreden van de infectie die bij een van de geopereerde gelten is waargenomen, houdt verband met het afvallen van het verband kort nadat het dier na de narcose is opgestaan. Hoewel de dagelijkse reiniging van de chirurgische wond van dit gelt werd uitgevoerd met gaas gedrenkt in een zoutoplossing en plaatselijke toepassing van Pearson's zalf, was een dergelijke procedure niet voldoende om oplopende besmetting te voorkomen, waarvoor toepassing met koud water op de plaats, drainage, systemische antibioticatherapie en een extra 3 dagen ontstekingsremmende behandeling nodig was. Zelfs met het optreden van een onderhuidse infectie vertoonde dit gilt tekenen van zwangerschap bij echografisch onderzoek.
Na het gebruik van nylondraden en chirurgische nietjes om de huid te sluiten bij eerdere operaties, hebben we ervoor gekozen om ethylcyanoacrylaatlijm te gebruiken om de spanning bij het verwijderen van de hechtingen te verminderen en eventuele resterende draden of nietjes te voorkomen. De aanwezigheid van draden of nietjes bevordert kleine lokale ontstekingen met puistvorming. De ethylcyanoacrylaatlijm is al veilig gebruikt bij chirurgische ingrepen en blijkt effectief, niet-toxisch en bacteriedodend te zijn34,35. Alle dieren vertoonden een uitstekende wondgenezing, zonder complicaties, met uitzondering van het gelt, waarvan het verband kort na de chirurgische ingreep afviel.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs maakt enig belangenconflict bekend
Dankbetuigingen
We willen het Equine Veterinary Hospital en het Ruminants Veterinary Hospital van het College of Veterinary Medicine, University of Sao Paulo (FMVZ/USP), Sao Paulo, Brazilië, FAPESP (subsidie 2022/11459-3, Sao Paulo Research Foundation), EMS Pharma, CNPq (subsidie 405254/2022-9) en Água Branca varkenshouderij, Itu, Sao Paulo, Brazilië, bedanken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25 mL rietje | generic | - | Chirurgisch materiaal |
| 1 mL spuit | Descarpack | 341001 | Chirurgisch materiaal |
| 10 mL spuit | Descarpack | 324601 | Chirurgisch materiaal |
| 20 mL spuit | Descarpack | 324801 | Chirurgisch materiaal |
| 3 mL spuit | Descarpack | 324201 | Chirurgisch materiaal |
| 5 mL spuit | Descarpack | 324401 | Chirurgisch materiaal |
| 60 mL spuit | Descarpack | 323201 | Chirurgisch materiaal |
| 9 mm endotracheale tube | Rusch | 112482-000090 | Chirurgisch materiaal |
| Allis pincet | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Amox LA | JA Saúde Animal | MAPA registratie: 8.781/2004 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Bakhaus pincet | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Catheter 20G | Descarpack | 362401 | Catheter voor intraveneuze toegang |
| Cetamin | Agener União | MAPA registratie: SP-000292-5.000011 | Anesthetisch middel |
| Geleidend klinisch gel | RMC | ANVISA registratie: 80122200013 | Chirurgisch materiaal |
| Dipyrone D-500 | Zoetis | MAPA registratie: SP0000728-46 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Vaste scalpel nr. 22 | Wiltex | ANVISA registratie: 10150470565 | Chirurgisch instrument |
| Vaste steriele spons-kwast | Rioquimica | 7.89778E+12 | Chirurgische asepsis |
| Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | Echografie |
| Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Detergent voor chirurgische instrumenten |
| Fentanil (Fentanest) | Cristália | ANVISA registratie: 1029800810159 | Anesthetisch middel |
| Gosset retractor | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Halstead-mosquito hemostatisch pincet | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Genezende zalf - Unguento Pearson | Pearson SA | MAPA registratie: SP0000094-16 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Waterstofperoxide-oplossing | Rioquimica | ANVISA registratie: 218690015 | Chirurgisch materiaal |
| Isofluraan | Biochimico | ANVISA registratie: 100630222 | Anesthetisch middel |
| IV-druppelset verlengstuk | generic | - | Vloeistoftherapie |
| IV Macro druppelset | Descarpack | 410301 | Vloeistoftherapie |
| Lactofur (ceftiofur) | Ourofino SA | MAPA registratie: SP0000051-50 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Larnygoscope | - | - | Chirurgisch instrument |
| Maxicam 2% | Ourofino SA | MAPA registratie: SP0000051-69 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Micropore kleefstof 5 cm x 10 cm | generic | 1530 | Chirurgisch materiaal |
| Midazolam | Hipolabor | ANVISA registratie: 1134301430035 | Anesthetisch middel |
| Multi-Way IV-infusieset | Descarpack | 413201 | Vloeistoftherapie |
| Naald 40 mm x 1,2 mm | Descarpack | 353601 | Steriele naald voor het toedienen van geneesmiddelen en anesthetica. |
| Naald 40 mm x 1,6 mm | Wiltex | ANVISA registratie: 10150470664 | Steriele naald voor het toedienen van geneesmiddelen en anesthetica. |
| Naaldhaakje | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Nylon 2-naaddraad | Shalon Medical | N502CTI40 | Chirurgisch materiaal |
| Gewone pen | generic | - | Normale pen voor het maken van aantekeningen |
| Fysiologische oplossing 0,9% 500 mL zak | JP Farma | MS:1.0491.0070 | Vloeistoftherapie |
| Polyglycolzuur 2-naaddraad | Atramat | G4099-75H | Chirurgisch materiaal |
| Kaliumchloride | Samtec | ANVISA registratie: 1559200010139 | Parenteraal geneesmiddel |
| Procedurehandschoenen | Descarpack | 122401 | Persoonlijk beschermingsmiddel (PBM) |
| Propofol (Provive) | União Química | ANVISA registratie: 1049714490057 | Anesthetisch middel |
| Ringer-lactaat-oplossing 500 mL zak | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Vloeistoftherapie |
| Riohex 0,5% clorexidino alcoholoplossing | Rioquimica | 218690356 | Chirurgische asepsis |
| Riohex 2% clorexidino-oplossing met oppervlakte-actieve stof | Rioquimica | 218690356 | Chirurgische asepsis |
| Scalp 21 G | Descarpack | 421201 | Chirurgisch materiaal |
| Schoenenovertrekken | generic | - | Persoonlijk beschermingsmiddel (PBM) |
| Steriele kompressen | Cremer | ANVISA registratie: 10071150065 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele gaaspad | Procitex | ANVISA registratie: 80245210083 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele chirurgische drapen 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele chirurgische drapen 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele chirurgische handschoenen | Mucambo | CA: 39.317 | Persoonlijk beschermingsmiddel (PBM) |
| Stethoscoop | generic | - | Chirurgisch materiaal |
Referenties
- Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
- Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
- Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
- Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
- Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
- Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
- Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
- Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
- Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
- Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
- Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
- Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
- Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
- Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
- Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
- Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
- Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
- Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
- Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
- Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
- Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
- Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
- Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
- Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
- Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
- Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
- Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
- Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
- Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
- Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
- Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
- Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
- Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).
Herprints en machtigingen
