Dit protocol beschrijft de toepassing van de chirurgische techniek die wordt gebruikt om gekloonde varkensembryo's via laparotomie bij gelten terug te plaatsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dit protocol beschrijft de toepassing van de chirurgische techniek die wordt gebruikt om gekloonde varkensembryo's via laparotomie bij gelten terug te plaatsen.
Dit protocol heeft tot doel de chirurgische techniek te demonstreren voor het overbrengen van gekloonde varkensembryo's naar de eileider, een methode die veel wordt gebruikt bij de productie van genetisch gemodificeerde varkens voor biomedisch onderzoek. Negen gelten ondergingen hormonale synchronisatie en laparotomie voor de overdracht van gekloonde embryo's geproduceerd door somatische celkernoverdracht (SCNT) in stadia van maximaal 4 cellen op dag 2 naar de eileider. De zwangerschapsdiagnose werd 30 dagen na de transferoperatie uitgevoerd via echografisch onderzoek. Zes van de negen geopereerde gelten vertoonden bij echografisch onderzoek tekenen van dracht. Omdat er echter geen progressie was in de ontwikkeling van de foetus zoals beoordeeld door echografie, ondergingen de gelten na 60 dagen obductie voor het verzamelen van biologisch materiaal en het beoordelen van het voortplantingssysteem. Verklevingen werden waargenomen in de baarmoederhoorns, eierstokken en eileiders. Uit het baarmoederlumen van twee van de geëuthanaseerde gelten werden één en vier embryonale structuren met een zwangerschapsduur tussen 12 en 20 dagen verkregen. Ondanks de afwezigheid van levende biggen, waarschijnlijk toegeschreven aan de lage efficiëntie van het terugplaatsen van gekloonde varkensembryo's, die wordt beïnvloed door verschillende factoren, waaronder het aantal en de kwaliteit van de teruggeplaatste embryo's, bleek de gepresenteerde chirurgische techniek snel en veilig te zijn.
Varkens zijn een uitstekend experimenteel model voor biomedisch onderzoek vanwege hun anatomische, fysiologische en genetische overeenkomsten met mensen1. Deze dieren zijn vaak gebruikt in onderzoek met betrekking tot xenotransplantatie, met de bedoeling organen, cellen of weefsels te produceren die een laag risico op afstoting bevorderen wanneer ze in mensen worden getransplanteerd. Onderzoek naar xenotransplantatie heeft tot doel het aanbod van organen voor menselijke transplantatie te vergroten, waardoor de wachtlijstvan patiënten wordt verkort.
De productie van varkens voor xenotransplantatie omvat verschillende stappen, waaronder de productie van klonen van genetisch bewerkte varkenscellen. Na de in vitro productie van genetisch gemodificeerde gekloonde embryo's, worden de embryo's overgebracht naar het voortplantingssysteem van een zeug met een gesynchroniseerde oestrische cyclus om de baarmoederfysiologie voor te bereiden op de ontvangst en dracht van de nieuwe conceptus3.
Embryotransfer bij varkens kan worden uitgevoerd met niet-invasieve of invasieve methoden4. Een van de niet-invasieve methoden is transcervicale overdracht, waarvoor geen chirurgische ingreep nodig is. Deze methode is echter beperkt tot het terugplaatsen van embryo's in latere ontwikkelingsstadia (d.w.z. morula- of blastocyststadia) en maakt het niet mogelijk om de inbrengplaats van de katheter of de afzetting van het embryo nauwkeurig te bepalen5. Laparoscopie en laparotomie worden beschouwd als invasieve methoden voor embryotransfer. Laparoscopie is minder invasief, maar vereist specifieke en dure apparatuur, en de efficiëntie varieert aanzienlijk (van minder dan 20% tot meer dan 80%) als gevolg van verschillende factoren, zoals moeilijkheden bij het manipuleren van voortplantingsstructuren en het type katheter dat wordt gebruikt 4,6. Daarom is overdracht via laparoscopie nog steeds minder efficiënt in vergelijking met chirurgische overdrachtsmethoden via laparotomie4.
Embryotransferchirurgie bij zeugen via laparotomie is een relatief eenvoudige en snelle procedure, die doorgaans ongeveer 30 minuten duurt. Het moet echter worden uitgevoerd in een chirurgisch centrum dat is uitgerust met inhalatie-anesthesieapparatuur en een gespecialiseerd team. Voor commerciële varkensstammen (zoals Landras, Large White of hun kruisingen) zijn speciale apparatuur zoals takels voor het heffen van gelten en een brede, stevige operatietafel noodzakelijk vanwege het aanzienlijke gewicht van de dieren (ongeveer 130-150 kg).
Om de operatie te laten slagen, moeten de embryo's vooraf worden beoordeeld op hun ontwikkelingsstadium. Embryo's van maximaal 4 cellen worden aanbevolen om in de baarmoederbuis te worden geplaatst. Embryo's in stadia voorbij 4 cellen, zoals morula's en blastocysten, moeten worden overgebracht naar de baarmoederhoorn 7,8.
Hoewel onderzoeksgroepen over de hele wereld de productie en chirurgische overdracht van genetisch gemodificeerde gekloonde varkensembryo's uitvoeren, zijn er nog steeds geen goed gedefinieerde protocollen die deze procedure door middel van video's demonstreren. Deze aanpak is cruciaal voor het succes van de zwangerschap, aangezien de techniek een nauwkeurige afzetting van embryo's op de exacte locatie van de eileider vereist, waarbij de lokalisatie van het ostium van de eileiders en de introductie van de pipet met de embryo's worden ingebracht. Deze techniek kan beter worden begrepen door middel van verklarende video's van de hele procedure. Daarom is dit artikel bedoeld om de laparotomie-operatie aan te tonen voor het overbrengen van gekloonde embryo's naar de eileider van gelten, een essentiële voorwaarde voor de toekomstige productie van genetisch gemodificeerde varkens die worden gebruikt voor xenotransplantatie of andere gerelateerde doeleinden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor diergebruik in onderzoek van het College of Veterinary Medicine and Animal Science van de Universiteit van São Paulo, protocolnummer 6088030523. Negen zeven maanden oude gelten van de varkenshouderij Água Branca, gelegen in de stad Itu, in de staat São Paulo, Brazilië, werden direct na de tweede oestrusdetectie gebruikt. De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van dieren
2. Chirurgische ingreep
3. Postoperatieve zorg
4. Echografische zwangerschapsdiagnose van zwangerschap
5. Euthanasie van de dieren
OPMERKING: Euthanaseer de gelten die bij het echografisch onderzoek geen foetussen vertoonden van grootte en uiterlijk die overeenkomen met de zwangerschapsduur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is bedoeld om de laparotomie-operatie te demonstreren voor het overbrengen van gekloonde embryo's naar de eileider van gelten. Alle dieren bleven in een adequaat anesthesievlak, zonder enige intraoperatieve incidenten of complicaties tijdens het herstel van de anesthesie. De gelten hadden gemiddeld 2-3 uur nodig om op te staan nadat de operatie was afgelopen.
Alle chirurgische ingrepen duurden gemiddeld 44 minuten. Negen gelten ondergingen een oper...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De beschreven chirurgische methode is eerder uitgevoerd door andere onderzoeksgroepen die werken met de productie van gekloonde varkens of genetisch gemodificeerde gekloonde varkens, met meldingen van geboorten na de implementatie van deze techniek 15,16,17,18,19,20. De zwangerschaps- en gebo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Geen van de auteurs maakt enig belangenconflict bekend
We willen het Equine Veterinary Hospital en het Ruminants Veterinary Hospital van het College of Veterinary Medicine, University of Sao Paulo (FMVZ/USP), Sao Paulo, Brazilië, FAPESP (subsidie 2022/11459-3, Sao Paulo Research Foundation), EMS Pharma, CNPq (subsidie 405254/2022-9) en Água Branca varkenshouderij, Itu, Sao Paulo, Brazilië, bedanken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25 mL rietje | generic | - | Chirurgisch materiaal |
| 1 mL spuit | Descarpack | 341001 | Chirurgisch materiaal |
| 10 mL spuit | Descarpack | 324601 | Chirurgisch materiaal |
| 20 mL spuit | Descarpack | 324801 | Chirurgisch materiaal |
| 3 mL spuit | Descarpack | 324201 | Chirurgisch materiaal |
| 5 mL spuit | Descarpack | 324401 | Chirurgisch materiaal |
| 60 mL spuit | Descarpack | 323201 | Chirurgisch materiaal |
| 9 mm endotracheale tube | Rusch | 112482-000090 | Chirurgisch materiaal |
| Allis pincet | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Amox LA | JA Saúde Animal | MAPA registratie: 8.781/2004 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Bakhaus pincet | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Catheter 20G | Descarpack | 362401 | Catheter voor intraveneuze toegang |
| Cetamin | Agener União | MAPA registratie: SP-000292-5.000011 | Anesthetisch middel |
| Geleidend klinisch gel | RMC | ANVISA registratie: 80122200013 | Chirurgisch materiaal |
| Dipyrone D-500 | Zoetis | MAPA registratie: SP0000728-46 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Vaste scalpel nr. 22 | Wiltex | ANVISA registratie: 10150470565 | Chirurgisch instrument |
| Vaste steriele spons-kwast | Rioquimica | 7.89778E+12 | Chirurgische asepsis |
| Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | Echografie |
| Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Detergent voor chirurgische instrumenten |
| Fentanil (Fentanest) | Cristália | ANVISA registratie: 1029800810159 | Anesthetisch middel |
| Gosset retractor | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Halstead-mosquito hemostatisch pincet | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Genezende zalf - Unguento Pearson | Pearson SA | MAPA registratie: SP0000094-16 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Waterstofperoxide-oplossing | Rioquimica | ANVISA registratie: 218690015 | Chirurgisch materiaal |
| Isofluraan | Biochimico | ANVISA registratie: 100630222 | Anesthetisch middel |
| IV-druppelset verlengstuk | generic | - | Vloeistoftherapie |
| IV Macro druppelset | Descarpack | 410301 | Vloeistoftherapie |
| Lactofur (ceftiofur) | Ourofino SA | MAPA registratie: SP0000051-50 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Larnygoscope | - | - | Chirurgisch instrument |
| Maxicam 2% | Ourofino SA | MAPA registratie: SP0000051-69 | Farmaceutisch geneesmiddel |
| Micropore kleefstof 5 cm x 10 cm | generic | 1530 | Chirurgisch materiaal |
| Midazolam | Hipolabor | ANVISA registratie: 1134301430035 | Anesthetisch middel |
| Multi-Way IV-infusieset | Descarpack | 413201 | Vloeistoftherapie |
| Naald 40 mm x 1,2 mm | Descarpack | 353601 | Steriele naald voor het toedienen van geneesmiddelen en anesthetica. |
| Naald 40 mm x 1,6 mm | Wiltex | ANVISA registratie: 10150470664 | Steriele naald voor het toedienen van geneesmiddelen en anesthetica. |
| Naaldhaakje | generic | - | Chirurgisch instrument |
| Nylon 2-naaddraad | Shalon Medical | N502CTI40 | Chirurgisch materiaal |
| Gewone pen | generic | - | Normale pen voor het maken van aantekeningen |
| Fysiologische oplossing 0,9% 500 mL zak | JP Farma | MS:1.0491.0070 | Vloeistoftherapie |
| Polyglycolzuur 2-naaddraad | Atramat | G4099-75H | Chirurgisch materiaal |
| Kaliumchloride | Samtec | ANVISA registratie: 1559200010139 | Parenteraal geneesmiddel |
| Procedurehandschoenen | Descarpack | 122401 | Persoonlijk beschermingsmiddel (PBM) |
| Propofol (Provive) | União Química | ANVISA registratie: 1049714490057 | Anesthetisch middel |
| Ringer-lactaat-oplossing 500 mL zak | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Vloeistoftherapie |
| Riohex 0,5% clorexidino alcoholoplossing | Rioquimica | 218690356 | Chirurgische asepsis |
| Riohex 2% clorexidino-oplossing met oppervlakte-actieve stof | Rioquimica | 218690356 | Chirurgische asepsis |
| Scalp 21 G | Descarpack | 421201 | Chirurgisch materiaal |
| Schoenenovertrekken | generic | - | Persoonlijk beschermingsmiddel (PBM) |
| Steriele kompressen | Cremer | ANVISA registratie: 10071150065 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele gaaspad | Procitex | ANVISA registratie: 80245210083 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele chirurgische drapen 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele chirurgische drapen 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | Chirurgisch materiaal |
| Steriele chirurgische handschoenen | Mucambo | CA: 39.317 | Persoonlijk beschermingsmiddel (PBM) |
| Stethoscoop | generic | - | Chirurgisch materiaal |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.