Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Met de hand gemaakt siliconen gecoat filament voor occlusiemodellen van de middelste hersenslagader van muizen

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67002

⸱

9 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Fifth Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Provincial People's Hospital, 2Department of Neurology, Taiyuan Central Hospital, Shan Xi Medical University, 3Experimental Animal Center, Shanxi Medical University, 4Collaborative Innovation Center for Molecular Imaging of Precision Medicine, Shan Xi Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het maken van gecoate filamenten voor het middelste cerebrale arterie-occlusie (MCAO)-model bij muizen met behulp van siliconen, nylon hechtingen en spuitnaalden. Deze methode maakt de productie mogelijk van filamenten met een consistente diameter en verschillende siliconen wikkellengtes die zijn afgestemd op experimentele behoeften.

Samenvatting

Naarmate de wereldbevolking ouder wordt, is ischemische beroerte uitgegroeid tot de op één na belangrijkste oorzaak van invaliditeit en sterfte wereldwijd, wat een enorme last vormt voor zowel de samenleving als gezinnen. Hoewel behandelingen zoals intraveneuze trombolyse en endovasculaire interventies de resultaten voor patiënten met een acute ischemische beroerte aanzienlijk kunnen verbeteren, heeft slechts een klein percentage van de mensen baat bij deze therapieën. Om ons begrip van de ziekte te vergroten en effectievere behandelingen te ontdekken, ontwikkelen en verfijnen onderzoekers voortdurend diermodellen. Hiervan valt het middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO) model op als het meest gebruikte model in onderzoek naar cerebrovasculaire aandoeningen. Het filament dat in dit model wordt gebruikt, is cruciaal voor de ontwikkeling ervan. Dit protocol schetst een methode voor het maken van filamenten met consistente diameters en verschillende lengtes siliconencoating. Het MCAO-model dat met deze methode bij C57-muizen is geproduceerd, heeft een groot succes en consistentie aangetoond en biedt een waardevol hulpmiddel voor op maat gemaakt onderzoek naar ischemische cerebrovasculaire aandoeningen.

Inleiding

Beroerte is wereldwijd een van de meest voorkomende oorzaken van sterfte en invaliditeit. Ischemische en hemorragische beroertes zijn de primaire soorten cerebrovasculaire gebeurtenissen, waarbij ischemische beroertes ongeveer 87% van de gevallen uitmaken 1,2,3. Momenteel zijn er twee behandelingsmodaliteiten voor patiënten met een ischemische beroerte: farmacologische therapie met recombinante weefselplasminogeenactivator (rtPA) en mechanische trombectomie. Het smalle therapeutische venster en de uitgebreide uitsluitingscriteria beperken echter de toepassing van deze behandelingen, waardoor slechts een minderheid van de patiënten ten goede komt. Dit onderstreept de noodzaak van voortdurende inspanningen om therapieën voor ischemische beroertes te verbeteren 4,5. In vitro modellen zijn ontoereikend voor het repliceren van de complexe pathofysiologische reacties na een beroerte, waardoor diermodellen een onmisbaar onderdeel zijn van preklinisch onderzoek naar beroertes. Menselijke focale cerebrale ischemie wordt meestal veroorzaakt door trombotische of embolische occlusie van de middelste hersenslagader (MCA), waardoor knaagdiermodellen die zijn ontworpen om MCA-occlusie (MCAO) te simuleren, zeer relevant zijn6.

Het filament-geïnduceerde MCAO-model, het meest toegepast in onderzoek naar beroertes, vergemakkelijkt occlusie bij het begin van de middelste hersenslagader (MCA) en de daaropvolgende reperfusie, wat leidt tot uitgebreide infarcten in subcorticale en corticale gebieden van de hersenen. Het voordeel van dit model ligt in het vermogen om de bloedstroom te herstellen na het induceren van focale ischemie, waardoor de pathofysiologische processen die worden waargenomen bij een menselijke beroerteparallel lopen 7. Bovendien simuleert het model reperfusieschade, een kritische factor in de omvang van de schade8. Het MCAO-model heeft echter beperkingen, waaronder variabiliteit in infarctvolume, waarbij de standaarddeviatie in sommige onderzoeken mogelijk tot 64% van de gemiddelde waarde kan oplopen9. Ondanks meer dan drie decennia van gebruik zijn er inspanningen geleverd om de betrouwbaarheid van het model te verbeteren, maar er blijven aanzienlijke variaties in het volume van ischemische laesies bestaan in onderzoeken en laboratoria 10,11,12.

Dit artikel introduceert een zelf vervaardigd filament voor het induceren van modellen die neurologische tekortscores en herseninfarctgebieden evalueren. Het onderzoekt de correlatie tussen filamentlengtes bedekt met siliconen en het succes en de stabiliteit van het MCAO-model. Deze productietechniek levert filamenten op met een lovenswaardige consistentie, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van een relatief stabiel MCAO-model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures voldeden aan de experimentele procedures en normen die zijn goedgekeurd door het Shanxi Provincial People's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer: 2024 Provincial Medical Ethics Committee No. 64). De muizen die in dit experiment werden gebruikt, waren mannelijke C57BL/6-muizen, 8-10 weken oud, met een gewicht van 24-26 g. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Filament voorbereiding

  1. Markeren van het originele filament: Wikkel de 6-0 nylon hechtdraad gelijkmatig om een plastic liniaalplaat. Maak markeringen op 5 mm en 10 mm van de filamentkop (inclusief het markeringspunt voor de coating en het markeringspunt voor de insteekdiepte).
  2. Snijd verticaal naar beneden met een mes om ervoor te zorgen dat beide uiteinden perfect cirkelvormig zijn, wat resulteert in een eerste filament van 2 cm lang (Figuur 1).
  3. Fabricage van het coatingapparaat: Gebruik een hemostatische tang om de naaldkop van een spuit van 26 G af te breken en polijst het naaldgat vervolgens met schuurpapier tot een perfecte cirkel. Zuig 2 ml K-704 siliconenkit op met een spuit van 10 mK en bevestig ten slotte de naaldkop op de spuit.
  4. Coaten van het filament: Steek het eerste filament in het voorbereide naaldgat tot aan de gemarkeerde positie van 5 mm of 10 mm. Duw de spuit langzaam en gestaag in totdat het filament volledig is gecoat onder een stereomicroscoop (Figuur 2).
  5. Instellen van het gecoate filament: Bevestig het gecoate filament rechtop met plakband en wacht ongeveer 20 minuten totdat de siliconen volledig zijn uitgehard.
  6. Sterilisatie en verpakking: Week de voorbereide filamenten in 75% alcohol, veeg ze droog met een wattenstaafje en verpak ze vervolgens in centrifugebuisjes van 5 ml.

2. MCAO-model

OPMERKING: Chirurgische instrumenten werden gesteriliseerd door middel van autoclaveren (121 °C bij 15 psi gedurende 60 minuten). De operatietafel en andere apparatuur werden ontsmet met 75% ethanol. De muizen werden preoperatief 8 uur gevast, maar kregen vrije toegang tot water.

  1. Dien 5 mg/kg meloxicam subcutaan toe voor analgesie 60 minuten voorafgaand aan de operatie. Sluit een warmtedeken aan om de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de narcose op 37 °C te houden.
  2. Induceer anesthesie met 4% isofluraan totdat spontane bewegingen en snorharen niet meer trillen, en houd vervolgens de anesthesie op 1,5% (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Breng oogzalf aan op beide ogen.
  3. Plaats de muis in rugligging, zet zijn hoofd en ledematen vast, scheer het haar in zijn nek en bovenborst en desinfecteer de huid met 75% ethanol van binnenuit.
  4. Maak een 2,5 cm lange huidincisie langs de middellijn van de nek, van de onderkaak tot aan het borstbeen.
  5. Ontleed botweg de rechter nekspieren om de halsslagaderschede bloot te leggen. Gebruik een oogheelkundige tang om de schede te openen en de gemeenschappelijke halsslagader (CCA), de externe halsslagader (ECA) en de interne halsslagader (ICA) te scheiden, waarbij u ervoor zorgt dat de nervus vagus niet wordt verstoord.
  6. Ligate de CCA tijdelijk met een schuifknoop voor de bifurcatie en klem de ICA vast met een microchirurgische slagaderklem.
  7. Schroei de superieure schildklierslagader van de ECA met behulp van een bipolaire stollingspen.
  8. Laat twee draden op de ECA zitten voor ligatie: één aan het distale uiteinde voor permanente ligatie en één aan het proximale uiteinde met een losse knoop voor toekomstig gebruik. Maak een incisie van ongeveer 0,5 mm tussen de twee ligaturen op de ECA met behulp van een oogheelkundige schaar om het filament in te brengen.
  9. Steek het 5 mm of 10 mm siliconen gecoate filament via de incisie in de CCA en zet het vervolgens vast door de losse knoop vast te draaien.
  10. Nadat u het distale uiteinde van de ECA hebt afgesneden en de klem van de ICA hebt verwijderd, trekt u het filament terug tot aan de CCA-bifurcatie. Draai vervolgens het filament om en breng het naar voren in de diepe ICA totdat men weerstand voelt. Trek het filament iets terug en zet het vast door de knoop aan te trekken.
  11. Hecht de huid van het dier vast met 3-0 hechting en desinfecteer de wond met jodium. Plaats de muis 1 uur in een herstelkamer.
  12. Verdoof de muis opnieuw, verwijder voorzichtig het filament, bind de ECA-ligatiedraad af waarmee het filament is bevestigd en laat de CCA-schuifknoop los om de bloedstroom te herstellen en de middelste hersenslagader te herstellen.
  13. Knip de overtollige draden af, hecht de nekhuid en desinfecteer het gebied nog een keer.

3. Schijnvertoning

  1. Voor schijnoperaties brengt u een 7 mm met siliconen gecoat filament in om de rechter middelste hersenslagader af te sluiten en trekt u deze vervolgens onmiddellijk terug om onmiddellijke reperfusie mogelijk te maken.
    OPMERKING: De volgende procedure is identiek aan die welke wordt uitgevoerd bij dieren die cerebrale ischemie ondergaan.

4. Neuroscore

  1. Plaats proefdieren uit elke groep in een open veld en voer postoperatieve gedragsscores uit 4 uur na cerebrale ischemie-reperfusie.
  2. Overweeg voor succesvol modelleren scores tussen 1 en 3. De beoordelingscriteria zijn gebaseerd op de Longa-scoremethode10, zoals beschreven in Tabel 1.
  3. Beoordeel neurologische defecten volgens de Modified Neurologic Severity Scores (mNSS)13, met evaluaties uitgevoerd 24 uur en 72 uur na reperfusie (zie Tabel 2).

5. Transcardiale perfusie

  1. Verdoof de muis met 1,5% pentobarbital-natrium (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Plaats de muis terug in zijn kooi en wacht 10 minuten. Knijp vervolgens in de tenen van de muis om te testen op de afwezigheid van reflexen en zorg voor diepe anesthesie.
  2. Plaats de muis in rugligging op een schuimrubberen standaard en zet zijn ledematen vast.
  3. Knip de punt van een naald van 25 G af om deze bot te maken en te voorkomen dat de aortawand wordt doorboord. Sluit de naald aan op een spuit gevuld met 20 ml zoutoplossing.
  4. Til de vacht van de thorax op en gebruik een schaar om de huid weg te knippen om het xiphoid-proces bloot te leggen. Pak het xiphoid-proces vast en snijd er horizontaal onder om het middenrif bloot te leggen door de spierlaag te openen. Knip het middenrif voorzichtig af met een schaar en vermijd schade aan het hart.
  5. Snijd langs de buitenkant van het borstbeen om de ribbenkast aan beide kanten te openen, draai de voorwand van de thorax om en zet deze vast met hemostaten.
  6. Gebruik een wattenstaafje om het vet aan de basis van het hart te verwijderen, waardoor de wortel van de aorta bloot komt te liggen.
  7. Zet het hart vast met een tang, steek de naald in aan de top van het hart en beweeg schuin omhoog totdat de naald zichtbaar is door de aortawand. Klem de naald op zijn plaats.
  8. Maak een kleine snee in het rechter atrium om de bloedstroom te observeren. Doordrenk de zoutoplossing gestaag met de spuit en kijk of het bloed het rechter atrium verlaat. Zodra het effluent helder is, stopt u de perfusie14.
  9. Onthoofd de muis na perfusie om de hersenen te oogsten15 en plaats deze in een vriezer van -20 °C voor verdere verwerking.

6. Beoordeling van het infarctvolume door TTC-kleuring

  1. Vries het verkregen hersenweefsel snel in een vriezer van -20 °C gedurende 20 minuten in, plaats ze vervolgens op een voorgekoelde hersensnijvorm en verdeel ze in plakjes van 1 mm dik.
  2. Dompel de verkregen hersensecties onder in 2% TTC-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  3. Dompel de hersenplakjes 's nachts onder in 4% paraformaldehyde en maak de volgende dag foto's.
  4. Meet het infarctgebied voor elke plak en het totale hersengebied met behulp van ImageJ. Bereken de volumeverhouding van het infarct met behulp van de formule: Infarctvolume % = (som van infarctgebieden / som van totale hersengebieden) × 100%.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij het maken van het MCAO-model worden de primaire gereedschappen die zijn gebruikt voor het vervaardigen van de filamenten en de afgewerkte filamenten weergegeven in figuur 3. Na de productie van het filament wordt het MCAO-model tot stand gebracht door het filament door de externe halsslagader in te brengen, waarbij de duur van de operatie wordt geregistreerd. Succesvolle modellering wordt bepaald door een Longa-score van 1-3 4 uur na het terugtrekken van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie demonstreert een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het fabriceren van filament en bevestigt de haalbaarheid ervan bij het maken van een MCAO-model. De lengte van de siliconenlaag van het filament kan worden aangepast aan de experimentele behoeften, wat extra flexibiliteit biedt. De bereiding van een 5 mm filamentembolie leverde een slagingspercentage van 100% op zonder enig optreden van subarachnoïdale bloeding (SAB) bij muizen. In de groep die 10 mm filamentembolie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Wu Jieping Medical Foundation (320.6750.161290).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL SyringeHaidike Medical Products Co., Ltd.Instrument voor het maken van filamenten
2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC)Sigma-AldrichG3005Kleurstof voor TTC-kleuring
24-well kweekplaatCorning CLS3527Vat voor TTC-kleuring
26 G spuitnaaldHaidike Medical Products Co., Ltd.Instrument voor het maken van filamenten
4% paraformaldehydeServicebioG1101Weefselfixatie
6-0 nylon hechtdraadHaidike Medical Products Co., Ltd.Materialen voor het maken van filamenten
Anesthesiesysteem voor isofluraanRwd Life Science Co., Ltd.R610 Verdoving voor dieren
Bipolare elektrocoagulatiegeneratorYirun Medical Instrument Co., Ltd.ZG300Apparatuur voor chirurgie
Waterbad met constante temperatuurSpring  Instrument Co., Ltd.HH-M6TTC-kleuring
OogzalfGuangzhou PharmaceuticalH44023098Materiaal voor chirurgie
VerwarmingsdekenZH Biomedical Instrument Co., Ltd.Lijktemperatuur handhaven 
IsofluaanRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10Verdoving voor dieren
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesie voor dieren
Microchirurgische arteriële klemShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. W40130Instrument voor chirurgie
Microchirurgische hemostatische klemtangShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. M-W-0022Instrument voor chirurgie
Set microchirurgische instrumentenRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-RApparatuur voor chirurgie
MuisthermometerHubei Dasjiaer BiotechnologyFT3400Intraoperatieve temperatuurbewaking
Pentobarbital natriumSigma-AldrichP3761Verdoving voor dieren
ShaverJoyu Electrical AppliancesPHC-920Apparatuur voor chirurgie
SiliconenkitKafuterK-704Materialen voor het maken van filamenten
StereomicroscoopRwd Life Science Co., Ltd.77001SApparatuur voor chirurgie
Hechtdraad met naald (3-0)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. F404SUS302Apparatuur voor chirurgie

Referenties

  1. Collaborators GBDS. Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: A systematic analysis for the global burden of disease study 2019. Lancet Neurol. 20 (10), 795-820 (2021).
  2. Kleindorfer, D. O., et al. Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  3. Saini, V., Guada, L., Yavagal, D. R. Global epidemiology of stroke and access to acute ischemic stroke interventions. Neurology. 97 (20 Suppl 2), S6-S16 (2021).
  4. Hill, M. D., Coutts, S. B. Alteplase in acute ischaemic stroke: The need for speed. Lancet. 384 (9958), 1904-1906 (2014).
  5. Asif, K. S., et al. Mechanical thrombectomy global access for stroke (mt-glass): A mission thrombectomy (mt-2020 plus) study. Circulation. 147 (16), 1208-1220 (2023).
  6. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  7. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  8. Shaik, N. F., Regan, R. F., Naik, U. P. Platelets as drivers of ischemia/reperfusion injury after stroke. Blood Adv. 5 (5), 1576-1584 (2021).
  9. Zhang, S. R., et al. Large-scale multivariate analysis to interrogate an animal model of stroke: Novel insights into poststroke pathology. Stroke. 52 (11), 3661-3669 (2021).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  11. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174 (1), 18-24 (2008).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in c57bl/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Bieber, M., et al. Validity and reliability of neurological scores in mice exposed to middle cerebral artery occlusion. Stroke. 50 (10), 2875-2882 (2019).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  15. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  16. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  17. Mccoll, B. W., Carswell, H. V., Mcculloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond mca territory after intraluminal filament occlusion in c57bl/6j mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  18. Liu, Z., et al. Optimisation of a mouse model of cerebral ischemia-reperfusion to address issues of survival and model reproducibility and consistency. Comput Intell Neurosci. 2022, 7594969(2022).
  19. Ward, R., Collins, R. L., Tanguay, G., Miceli, D. A quantitative study of cerebrovascular variation in inbred mice. J Anat. 173, 87-95 (1990).
  20. Hanna, K. L., Hepworth, L. R., Rowe, F. Screening methods for post-stroke visual impairment: A systematic review. Disabil Rehabil. 39 (25), 2531-2543 (2017).
  21. Rowe, F. J. Stroke survivors' views and experiences on impact of visual impairment. Brain Behav. 7 (9), e00778(2017).
  22. Scoles, D., Mcgeehan, B., Vanderbeek, B. L. The association of stroke with central and branch retinal arterial occlusion. Eye (Lond). 36 (4), 835-843 (2022).
  23. Kim, Y. D., et al. Cerebral magnetic resonance imaging of coincidental infarction and small vessel disease in retinal artery occlusion. Sci Rep. 11 (1), 864(2021).
  24. Emiroglu, M. Y., et al. Effects of obstructive carotid artery disease on ocular circulation and the safety of carotid artery stenting. Heart Lung Circ. 26 (10), 1069-1078 (2017).
  25. Cotofana, S., Lachman, N. Arteries of the face and their relevance for minimally invasive facial procedures: An anatomical review. Plast Reconstr Surg. 143 (2), 416-426 (2019).
  26. Xu, X., et al. Dibazol-induced relaxation of ophthalmic artery in C57bl/6J mice is correlated with the potency to inhibit voltage-gated ca(2+) channels. Exp Eye Res. 231, 109468(2023).
  27. Justic, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

MCAO-modelischemische beroertediermodel voor beroerteC57-muizencerebrovasculaire ziektefilamentvoorbereidingberoerteonderzoekexperimenteel beroertemodel

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.