Method Article

Retinale organoïden samenstellen met microglia

DOI:

10.3791/67016

⸱

July 26th, 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn unieke residente immuuncellen in het netvlies en spelen een cruciale rol bij verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies. Het genereren van een co-cultuurmodel van retinale organoïden met microglia kan een beter begrip van de pathogenese en ontwikkelingsvoortgang van netvliesaandoeningen vergemakkelijken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege de beperkte toegankelijkheid van het menselijk netvlies zijn retinale organoïden (RO's) het beste model voor het bestuderen van menselijke netvliesaandoeningen, die het mechanisme van netvliesontwikkeling en het optreden van netvliesaandoeningen zouden kunnen onthullen. Microglia (MG) zijn unieke residente macrofagen in het netvlies en het centrale zenuwstelsel (CZS), die cruciale immuniteitsfuncties vervullen. Retinale organoïden missen echter microglia, omdat hun differentiatieoorsprong de dooierzak is. De specifieke pathogenese van microglia bij deze netvliesaandoeningen blijft onduidelijk; Daarom blijkt het opzetten van een microglia-geïncorporeerd retinaal organoïdemodel noodzakelijk te zijn. Hier hebben we met succes een co-gekweekt model van retinale organoïden geconstrueerd met microglia afgeleid van menselijke stamcellen. In dit artikel hebben we microglia gedifferentieerd en vervolgens in een vroeg stadium samen gekweekt tot retinale organoïden. Als de incorporatie van immuuncellen biedt dit model een geoptimaliseerd platform voor modellering van netvliesaandoeningen en screening van geneesmiddelen om diepgaand onderzoek naar de pathogenese en behandeling van netvlies- en CZS-gerelateerde ziekten te vergemakkelijken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als de beperkte bron van het menselijk netvlies, vertegenwoordigt de differentiatie van menselijke stamcellen in driedimensionale (3D) retinale organoïden een veelbelovend in vitro model voor het simuleren van het netvlies1. Het bevat verschillende celtypen in het netvlies, waaronder fotoreceptoren, retinale ganglioncellen, bipolaire cellen, Müller-cellen, horizontale cellen en astrocyten2. Dit model maakt de emulatie en studie mogelijk van zowel de mechanismen van de ontwikkeling van het netvlies als de pathogenese van netvliesaandoeningen. Vanwege de directionele differentiatiemethode werden retinale organoïden echter afgeleid van het neuro-ectoderm3, waarbij veel andere celtypen ontbraken die afkomstig waren van verschillende kiemlagen, zoals microglia uit de dooierzak en perivasculaire cellen uit het mesoderm 4,5,6.

Op dit moment is bewezen dat veel netvliesaandoeningen, zoals retinitis pigmentosa7, glaucoom8 en retinoblastoom9, nauw verwant zijn aan microglia in het netvlies. Door het ontbreken van goede onderzoeksmodellen blijven specifieke mechanismen die de relatie tussen microglia en deze ziekten illustreren echter nog steeds onduidelijk. Hoewel muizen hebben gediend als een gunstig model voor het bestuderen van netvliesaandoeningen, hebben recente studies significante verschillen aangetoond tussen muizen en menselijke microglia in termen van levensduur, proliferatiesnelheid en de afwezigheid van menselijke homologe genen10,11. Deze bevindingen suggereerden dat conclusies uit muismodellen mogelijk niet helemaal betrouwbaar zijn, wat het belang benadrukt van het construeren van menselijke retinale organoïden die microglia bevatten.

In de afgelopen decennia zijn er verschillende methoden ontwikkeld voor de 3D-differentiatie van retinale organoïden12,13. Om de co-cultuur van microglia in retinale organoïden te vergemakkelijken, hebben we gekozen voor een differentiatiemethode met een overgang van hechtende naar suspensiecultuur. Deze aanpak maakt het met succes mogelijk om microglia op te nemen in de organoïden van het netvlies, waardoor ze ten minste 60 dagen behoudenblijven14.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie van het Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. HESC's cellijn H9 was van het WiCell Research Institute. Verwarm het celkweekmedium voor het experiment 30 minuten voor op kamertemperatuur (RT).

1. Ontstaan van menselijke microglia

  1. Kweek de hESC's in stamcelmedium totdat de celdichtheid 80%-90% bereikt. Zaai minstens 1 x 106 cellen in elk putje.
  2. Zuig het stamcelmedium op en spoel de cellen af met 1x DPBS (1 ml/putje van een plaat met 6 putjes). De volgende stap vereist 2 x 107-1 x 108 cellen. Als dit niet genoeg is, combineer dan cellen van 2-5 putjes om de volgende stappen uit te voeren.
  3. Dissocieer de stamcelkolonies met behulp van de 0,5 mM EDTA-oplossing gedurende ongeveer 5 minuten in een incubator van 37 °C (1 ml/putje van een plaat met 6 putjes).
  4. Controleer de morfologie van de kolonie na 5 minuten. Wanneer de randen van de kolonie licht zijn opgerold met losse openingen, zijn cellen klaar om te worden gedifferentieerd en de EDTA op te zuigen. Als dit niet het geval is, incubeer de cellen dan nog 1-2 minuten bij 37 °C. Niet langer dan 8 minuten incuberen.
  5. Spoel de cellen in elk putje voorzichtig af met 6 ml medium A (tabel 1) met 6 μl 10 mM ROCK-remmer Y-27632-oplossing. Tik zachtjes op de bodem van de schaal om de cellen te spoelen. Stel de dag in op dag 0.
    OPMERKING: Pipeteer de cellen niet. Cellen zullen de volgende dag embryoïde lichamen (EB's) vormen.
  6. Observeer na 24 uur de cellen onder de microscoop om de EB-vorming te bevestigen. Verzamel de EB's in een centrifugaalbuis van 15 ml met een pipet van 10 ml en wacht tot de EB's in 5 minuten naar de bodem zijn gezakt.
  7. Zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de EB's met 6 ml vers Medium A en breng ze over in een nieuw putje met een lage hechting of een plaat met 6 putjes. Kweken in een incubator van 37 °C.
    OPMERKING: Het doel van het overbrengen van de put op dag 1 is om de invloed van een groot aantal dode cellen tijdens het proces van EB-vorming te verminderen, wat de toestand van celgroei kan beïnvloeden.
  8. Ververs de verse Medium A dagelijks tot dag 4 (6 ml/putje van een bord met 6 putjes).
  9. Bestrijk op dag 4 een schaaltje van 10 cm met 3 ml 0,1% visgelatineoplossing gedurende ten minste 1 uur in een incubator van 5% CO2, 37 °C.
    OPMERKING: Als de coatingtijd minder dan 1 uur is, is het moeilijk om de volgende stappen uit te voeren.
  10. Verzamel de EB's voorzichtig in een centrifugaalbuis van 15 ml met een pipet van 10 ml en wacht tot de EB's binnen 5 minuten naar de bodem zijn gezakt.
  11. Verwijder de 0,1% gelatineoplossing en spoel de schaal van 10 cm één keer af met 5-6 ml 1x DPBS. Verwijder de DPBS.
  12. Resuspendeer de EB's voorzichtig met 15 ml Medium B (tabel 1) in de centrifugaalbuis van 15 ml en breng ze over naar de gecoate schaal van 10 cm. Kweek in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 week.
    NOTITIE: Verplaats de schaal de eerste 7 dagen niet.
  13. Ververs eenmaal per week met verse Medium B tot dag 49 (schaal van 15 ml/10 cm) en onderzoek de cellen eenmaal per week onder de microscoop.
    OPMERKING: Na dag 49 zijn er verschillende secretoire cellen te vinden in het supernatans in het kweekschaaltje.
  14. Centrifugeer de bovendrijvende cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  15. Zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de cellen met 2 ml vers Medium B en breng het over naar een nieuw putje met een lage hechting van een plaat met 6 putjes. Incubeer in een incubator van 5% CO2, 37 °C.
    NOTITIE: Verplaats de plaat de komende 7 dagen niet. De microglia kunnen zich hechten aan de bodem van de put met een lage hechting.
  16. Vervang op dag 56 door Medium C (tabel 1) (2 ml/putje van een plaat met 6 putjes). De microglia hechten zich goed aan de onderkant van de lage hechting en zien er onder de microscoop vertakt uit.
    OPMERKING: Door Medium C elke 3 dagen te veranderen (2 ml/putje van 6-wells plaat), kunnen de microglia ongeveer 15 dagen in Medium C worden gekweekt.

2. Generatie van menselijke RO's en co-cultuur van de RO's met microglia

  1. Kweekte de hESC's in stamcelmedium totdat de celdichtheid 80%-90% bereikt. Zaai minstens 1 x 106 cellen in elk putje.
  2. Voeg Dispase (1 ml/putje van een plaat van 6 putjes) toe aan de kweekcel. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Zuig de Dispase-oplossing uit de put.
  3. Voeg Medium D (tabel 1) (1 ml/putje van een plaat met 6 putjes) toe aan het putje. Snijd de cel in kleine stukjes met een pipet van 10 μL.
  4. Verzamel voorzichtig alle celstukjes en het medium in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
  5. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g en verwijder het supernatant.
  6. Resuspendeer de cellen voorzichtig in 200 μL van een koude matrix. Verplaats de 1,5 microcentrifugebuis gedurende 20 minuten in een incubator. Werk snel omdat de matrix stolt bij kamertemperatuur (RT). Na 20 minuten in de couveuse zal de matrix stollen.
  7. Bereid een schaal van 10 cm voor met 15 ml Medium D. Resuspendeer de Matrix met Medium D en schud de petrischaal voorzichtig.
  8. Zet de schaal vervolgens 5 dagen in een broedmachine. Verplaats de plaat niet. Stel de dag in als dag 0 (RO's). De cellen zullen zich binnen 3 dagen hechten.
  9. Op dag 5 (RO's) en dag 10 (RO's) ververs je het medium met Medium D.
  10. Verwijder op dag 12 (RO's) het medium en voeg 3 ml Dispase toe aan elk gerecht gedurende 5 minuten.
  11. Aspireer de Dispase en voeg 15 ml Medium E toe (tabel 1).
  12. Oogst microglia: Op dag 56 (MGs) zuig de Medium C voorzichtig op, voeg Accutase toe (1 ml/putje van een plaat met 6 putjes) en incubeer bij 37 °C gedurende 3 minuten.
  13. Verzamel de microgliacellen in een centrifugaalbuis van 15 ml met een pipet van 5 ml. Centrifugeer de cellen bij 200 x g bij RT gedurende 5 min.
  14. Zuig het supernatans voorzichtig op en suspendeer de microglia met 1 ml Medium E. Voeg microglia toe aan verteerde RO's op dag 12.
    OPMERKING: Op dag 12 (RO's) zijn de cellen zelfklevend. Op dag 13 (RO's) worden de cellen gevonden die in Medium E zweven. Als het medium geel verandert van dag 12 (RO's) naar dag 19 (RO's), ververs het medium dan met Medium E.
  15. Voeg op dag 19 (RO's) de organoïden samen naar het midden van de schaal door de plaat voorzichtig rond te draaien. Zuig Medium E voorzichtig op en ververs het medium met Medium F.
  16. Breng de organoïden met Medium F over in een nieuw suspensieschaaltje.
  17. Vervang het medium één keer per week en selecteer organoïden voor experimenten.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedure voor het genereren van retinale organoïden wordt beschreven in onze vorige studie15. Hier tonen we de representatieve resultaten van microglia en co-cultuur microglia en retinale organoïden.

Hier demonstreren we elke fase van microgliadifferentiatie (Figuur 1A). Dag 0 vertegenwoordigt het stadium van stamcelcultuur. Vervolgens werden de stamcellen verteerd en gekweekt voor EB-vorming. In de eerste 4 dagen van het proces zullen cellen EB's vormen (Figuur 1B). Vervolgens brengen we de hangende EB's over naar aanhangende schalen van 10 cm. Na ongeveer 7 dagen zijn de cellen vergelijkbaar met die in figuur 1C. Naarmate de cultuur vordert, scheiden aanhangende cellen hematopoëtische voorlopercellen af in het supernatans (Figuur 1D). Dit proces duurt ongeveer 45 dagen. Op dit punt kunnen cellen uit het supernatans worden geoogst en overgebracht naar platen met 6 putjes. In de komende 7 dagen zullen de microglia volwassen worden (Figuur 1E) en klaar zijn voor verder experiment.

Op dag 12 van de differentiatie van retinale organoïden worden aanhangende cellen verteerd tot suspensiecultuur en wordt Medium E met microglia toegevoegd aan de retinale organoïden. Microglia zullen migreren naar retinale organoïden. Om de morfologie van microglia duidelijk waar te nemen, voegden we EGFP-lentivirustransfectie toe aan de hESC's, waardoor de gedifferentieerde microglia express GFP autofluorescentie kreeg (groen) (Figuur 2A-C). We onderzochten ook de weefselstructuur van retinale organoïden die samen met microglia waren gekweekt met behulp van fotoreceptorcelmarker CRX en microgliacelmarker IBA1 door middel van immunofluorescentietest in microglia co-gekweekte retinale organoïden na differentiatie gedurende 50 dagen (Figuur 2D).

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch diagram en tijdlijn van microgliacellen afgeleid van hESC. (A) Het protocol begint met het ontdooien en passeren van hESC's in een plaat met 6 putjes. (B) De homogene EB's gevormd die medium A bevatten. (C) EB's worden overgebracht naar een gecoate schaal en hematopoëtische voorlopercellen worden gevormd op dag 4-56. (D,E) Op dag 56 wordt het supernatans met cellen verzameld (D) en overgebracht naar een plaat met 6 putjes met lage hechting om op dag 63 microglia te vormen (E). Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve beelden langs de tijdlijn tijdens co-cultuur van microglia en retinale organoïden. (A) Representatieve beelden van microgliacellen afgeleid van EGFP-hESC. (B) Co-cultuur van EGFP+ microglia met retinale organoïden na differentiatie gedurende 18 dagen. (C) Co-cultuur van EGFP+ microglia met retinale organoïden na differentiatie gedurende 30 dagen. Schaalbalk: 300 μm. (D) CRX (fotoreceptorcelmarker; rood) en IBA1 (microgliamarker; groen) werden gebruikt om de weefselstructuur te detecteren van retinale organoïden die samen met microglia waren gekweekt na 50 dagen differentiatie. DAPI (blauw) kleurt de kern. Schaalbalk: 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van de media die in dit onderzoek zijn gebruikt. De componenten die nodig zijn om een volume van 500 ml van elk medium te bereiden, staan vermeld in de tabel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege de beperkte beschikbaarheid van het menselijk netvlies is ons huidige begrip van ontstekingsreacties op het netvlies bijna afkomstig van diermodellen. Om deze beperking te overwinnen, werden retinale organoïden gedifferentieerd. De ontwikkeling van retinale organoïdemodellen is een actief onderzoeksgebied geweest, met als doel de complexiteit van het menselijk netvlies voor ziektemodellering en therapeutische ontwikkeling samen te vatten. Verschillende onderzoeken hebben gerapporteerd dat ze met succes retinale organoïden hebben gegenereerd uit menselijke pluripotente stamcellen 1,2,12,13. De meeste van deze modellen missen echter de aanwezigheid van microglia, waarvan bekend is dat ze een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van het netvlies en de pathogenese van de ziekte. Recente studies hebben geprobeerd microglia te integreren in retinale organoïden of hersenorganoïdemodellen 16,17,18, maar de gedetailleerde methode is onduidelijk. Hier bieden we een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor het co-kweken van microglia met retinale organoïden in een vroeg stadium, beide afgeleid van dezelfde hESC-lijn. Hoewel sommige studies de rol van microglia bij netvliesaandoeningen hebben onderzocht met behulp van diermodellen of celkweeksystemen 7,8,9, biedt het hier gepresenteerde co-cultuurmodel een meer fysiologisch relevant op mens gebaseerd systeem voor het bestuderen van microglia-retina-interacties en hun implicaties voor de pathogenese van ziekten.

De kritieke stappen zijn de celtoestand van menselijke stamcellen en de differentiatie van microglia en retinale organoïden. Microglia en RO's moeten stap voor stap worden onderscheiden en de juiste reagentia en schaal (in weefsel gekweekte behandelde schaal of suspensieschaal) moeten in verschillende stadia worden gebruikt. Dit model kan ons helpen het proces te begrijpen van hoe microglia bijdragen aan het optreden van netvliesaandoeningen. Het heeft belangrijke implicaties voor toekomstige screening van geneesmiddelen en onderzoeken naar ziektemechanismen. De methoden die we momenteel publiceren, hebben echter nog enkele beperkingen. Vanwege de verlengde differentiatieperiode van microglia en het ontbreken van geschikte cryopreservatiemethoden, moeten we onze tijd verstandig plannen voor differentiatie van microglia en retinale organoïden voor co-cultuur.

Naast retinale organoïden geloven wij dat het integreren van immuuncellen in andere organoïdemodellen ook de ontwikkeling van organoïden kan bevorderen. Daarom is het testen van andere organoïde systemen cruciaal. De integratie van verschillende celtypen en organoïden tot complete organen is een veelbelovend model voor de toekomst.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn niet op de hoogte van enige affiliaties, lidmaatschappen, beurzen of financiële belangen die de objectiviteit van deze studie zouden kunnen beïnvloeden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82101145) en de Beijing Natural Science Foundation (Z200014).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02Antibody; verdunning volgens de instructies van de fabrikant
Anti-IBA1Abcamab5076Antibody; verdunning volgens de instructies van de fabrikant
B27Life Technologies17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiological Industry04-002-1A
GelatinSigmaG7041-100GSolid
GlutamaxGibco35050-061
H9 cell lineWiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrixCorning356231
M-CSFRD Systems 216-MC-500 
MEM Non-essential Amino Acid SolutionSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pen/strepGibco15140-122
Stem cell medium Stemcell Technologies5990
TaurineSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-mercaptoethanolLife Technologies21985-023

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
  2. Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298(2021).
  3. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  4. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  5. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  6. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  7. O'koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
  8. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
  9. Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
  10. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222(2017).
  11. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  12. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  13. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  14. Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
  15. Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629(2022).
  16. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  17. Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
  18. Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal OrganoidsMicroglia IncorporationHuman Stem CellsCo Culture ModelRetinal Disease ModelingMicroglia DifferentiationImmunofluorescence AnalysisPhotoreceptor MarkerMicroglial MarkerCentral Nervous System

Related Articles