Methodenartikel

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67020

⸱

27 september 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Samenvatting

Cellulaire organellen, zoals mitochondriën en lysosomen, vertonen dynamische structuren. Ondanks de hogere resolutie van transmissie-elektronenmicroscopie voor structurele analyse, is lichtmicroscopie essentieel voor de visualisatie van dynamische organellen door doelspecifiek labelen. Het volgende protocol beschrijft een methode die dubbelkleur correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) combineert om de interacties tussen mitochondriën en lysosomen te observeren. In deze studie werden mitochondriën gelabeld met mEosEM (Mito-mEosEM) en lysosomen met TMEM192-V5-APEX2. De resultaten verkregen uit CLEM-beelden stellen ons in staat om de veranderingen in de interacties tussen mitochondriën en lysosomen onder externe stresscondities te observeren. Behandeling met bafilomycine (BFA), dat de lysosomale functie remt, resulteerde in een toename van contact tussen mitochondriën en lysosomen, wat leidde tot de vorming van gefragmenteerde mitochondriën gevangen in lysosomen. Omgekeerd veroorzaakte behandeling met U18666A, dat cholesterolexport uit lysosomen remt, ervoor dat lysosomen werden omringd door mitochondriën, wat een duidelijke vorm van interactie aangeeft. Deze studie presenteert een effectieve methode voor het observeren van de interacties tussen mitochondriën en lysosomen in vaste cellen. Bovendien biedt CLEM-beeldvorming met dubbelkleur sondes een krachtig hulpmiddel voor toekomstige onderzoeken naar organeldynamiek en hun implicaties voor celfunctie en pathologie.

Inleiding

Mitochondria en lysosomen zijn de belangrijkste membraangebonden organellen die essentieel zijn voor het behoud van cellulaire homeostase. Mitochondria zijn zeer dynamische cellulaire organellen die worden gemoduleerd door splijt- en fusiegebeurtenissen1. Over het algemeen worden mitochondriën beschouwd als de krachtcentrale van de cel en staan ze bekend om hun belangrijke rol in oxidatieve fosforylering, ATP-productie en metabolietenopslag zoals calcium2. Naast hun rol in de energiemetabolisme zijn mitochondriën betrokken bij een aantal andere cellulaire signaalprocessen, waaronder apoptose3,4, calciumsignalering5,6 en lipidmetabolisme7,8. Evenzo zijn lysosomen zeer dynamische cellulaire organellen die meerdere rollen spelen als cellulaire recyclingcentra om cellulaire netheid te behouden door eiwitafbraak, autofagie, endocytose en fagocytose9. Afgezien van hun rol in degradie, spelen lysosomen ook een rol in cellulaire fysiologie zoals nutriëntdetectie, homeostase10, lipidmetabolisme11 en cellulaire dedifferentiatie12.

Ondanks het bestaan van talrijke studies over de functies van individuele cellulaire organellen, heeft ons recente onderzoek zich geconcentreerd op de minder begrepen interactie tussen mitochondriën en lysosomen, waarvan is aangetoond dat deze zowel cellulaire fysiologie als pathologie beïnvloedt. Contacten tussen mitochondriën en lysosomen zijn waargenomen in verschillende celtypen, waaronder kankercellen, neuronen en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide cellen13, en ze worden voornamelijk waargenomen onder cellulaire stress of bij neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson13,14 en de ziekte van Charcot-Marie-Tooth15. Het contact tussen mitochondriën en lysosomen speelt een belangrijke rol bij het behoud van metabolische homeostase door de uitwisseling van ionen (bijv. Ca2+)16, cholesterol17 en ijzer18 tussen de twee organellen. Bovendien speelt het contact tussen mitochondriën en lysosomen een cruciale rol bij de kwaliteitscontrole van cellulaire organellen. Bijvoorbeeld, beschadigde mitochondriën kunnen worden aangemerkt voor afbraak door het proces van mitofagie, waarbij ze worden ingeslikt door autofagosomen en naar lysosomen worden geleverd voor afbraak. Bijgevolg kan de verwijdering van disfunctionele mitochondriën worden vergemakkelijkt voordat ze verdere schade aan de cel of aan normale mitochondriën veroorzaken. Deze interactie tussen mitochondriën en lysosomen is cruciaal voor het handhaven van cellulaire homeostase en het voorkomen van de accumulatie van disfunctionele organellen. Daarom worden alleen beschadigde mitochondriën selectief verwijderd, waardoor gezonde mitochondriën optimaal kunnen functioneren binnen de cel.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een beeldvormingstechniek die recent aandacht heeft gekregen als onderzoeksmethode door de voordelen van lichtmicroscopie (LM) en elektronenmicroscopie (EM) te combineren om gedetailleerde structurele informatie op verschillende schalen te verstrekken. In CLEM wordt een monster eerst afgebeeld met behulp van LM om specifieke gebieden van belang te identificeren, gevolgd door EM-monstervoorbereidingsstappen zoals fixatie, dehydratie en inbedding. Hetzelfde monster wordt vervolgens onder een elektronenmicroscoop waargenomen. Hoewel live-cell CLEM-methoden recent zijn gerapporteerd19,20,21,22, blijft het een uitdaging om optische beelden van zeer dynamische biologische monsters nauwkeurig te combineren met elektronenmicroscopiebeelden van gefixeerde cellen in één vlak. Voor zeer dynamische organellen zoals mitochondriën en lysosomen kan hun precieze lokalisatie veranderen terwijl ze worden waargenomen onder de lichtmicroscoop, en ze blijven bewegen, zelfs tijdens de korte vertragingstijd die nodig is voor fixatie.

Daarom werden in dit protocol twee verschillende moleculaire tags die actief blijven, zelfs binnen fixeeroplossingen, gebruikt om de interactie tussen mitochondriën en lysosomen te visualiseren, die een belangrijke rol spelen bij het handhaven van metabolische homeostase door de uitwisseling van ionen (bijv. Ca2+)16, cholesterol17 en ijzer18 tussen deze organellen. De constructies TMEM192-V5-APEX2 en Mito-mEosEM werden gebruikt om de interacties van mitochondriën en lysosomen in gekweekte cellen te observeren op zowel het EM- als het LM-niveau. Voor mitochondriën werd de mEosEM-tag geselecteerd vanwege zijn vermogen om het fluorescentie signaal te behouden tijdens EM-monstervoorbereiding in een fixeeroplossing en OsO423. Voor lysosomen werd de APEX2-tag, een eiwit van ongeveer 28 kDa, gebruikt om de lokalisatie van een specifiek eiwit op zowel EM- als LM-niveau te bestuderen24. In aanwezigheid van waterstofperoxide, het substraat van APEX2, vormt Amplex-Red een onoplosbaar polymeer dat kan worden waargenomen door confocale microscopie op de locatie van de tag. In dit protocol werd dual-color CLEM gebruikt om de structuur van de interacties tussen lysosomen en mitochondriën in gefixeerde cellen te visualiseren.

Protocol

De stapsgewijze workflow voor monstervoorbereiding is weergegeven in Figuur 1.

1. Celcultuur en transfectie

  1. Kweek HeLa-cellen bij een dichtheid van 1 × 105 cellen in 35 mm glazen rasterbodem-kweekschalen met DMEM met 10% foetaal bovien serum en 100 U/mL penicilline en streptomycine bij 37 °C.
  2. De dag na het zaaien van de cellen, co-transfecteer de cellen bij 30%-40% confluentie met TMEM192-V5-APEX2 en Mito-mEosEM plasmiden met behulp van het transfectiemiddel volgens de instructies van de fabrikant (1 µg van elk van TMEM192-V5-APEX2 en Mito-mEosEM plasmid DNA met 3 µL transfectiemiddel). Behandel de cellen na transfectie met DMSO of U18666A (2 µg/mL) en Bafilomycine A1 (100 nM) gedurende 18 uur.

2. Confocale microscopische beeldvorming

  1. Na behandeling van de cellen met Bafilomycine en U18666A gedurende 18 uur, verwijder de kweekvloeistof en voeg onmiddellijk 250 µL warme (30 °C-37 °C) fixeervloeistof toe (2,5% glutaraldehyde en 2% paraformaldehyde in 0,1 M natrium cacodylaat-oplossing [pH 7,0]) door voorzichtig te pipetten. Verwijder onmiddellijk het fixeermiddel, vervang het door 1,5 mL verse fixeervloeistof en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Was vervolgens de cellen gedurende 3 x 10 minuten in 1 mL ijskoude 0,1 M natrium cacodylaatbuffer.
    OPMERKING: Aldehyd dampen zijn giftig. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in een geventileerde afzuigingskast.
  2. Voeg 1 mL koude 20 mM glycine-oplossing toe om de aldehyde te blussen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. Was 3 x 10 minuten in koude 0,1 M natrium cacodylaatbuffer.
  3. Bereid een verse oplossing met 300 µM Amplex-Red door 10 mM H2O2 toe te voegen aan een 0,1 M cacodylaat-oplossing. Voeg 500 µL Amplex-Red-oplossing toe aan de monsterbak en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
  4. Verwijder de Amplex-Red-oplossing en spoel 3 x 10 minuten met 0,1 M natrium cacodylaatbuffer.
  5. Na Amplex-Red-kleuring, gebruik een confocale microscoop om het gebied rond de cellen van belang in 3 x 3 rasterscanmodus te beeldvormen. Vang zowel differentieel interferentiecontrast (DIC) als fluorescentiesignaal op om de raster en letters op het rasterschaaltje te identificeren en te registreren met behulp van een 40x (of 60x) objectief.
    OPMERKING: Deze overzichtsafbeeldingen dienen als kaart voor het identificeren van specifieke doelcellen in de plastic-ingebedde specimennen.
  6. Beeld de doelcellen in hoge vergroting af met behulp van een 40x (of 60x) objectief en maak een Z-stack-afbeelding.
    OPMERKING: Deze afbeelding met hoge vergroting wordt gesuperponeerd op een elektronenmicroscoop-afbeelding om een correlatieve afbeelding te maken.

3. Monstervoorbereiding voor EM-blok

  1. Na LM-beeldvorming, voeg 1 mL 1% gereduceerde osmiumtetroside toe (bereide met 3% kaliumferrocyanide in 0,3 M cacodylaatbuffer met een gelijk volume van 2% waterige osmiumtetroside) voor postfixatie bij 4 °C gedurende 1 uur en spoel vervolgens 3 x 10 minuten met gedestilleerd water bij 4 °C.
    OPMERKING: Osmiumtetroside dampen zijn giftig. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in een geventileerde afzuigingskast.
  2. Spoel 3 x 10 minuten met gedestilleerd water bij kamertemperatuur en dehydrateer vervolgens in een gegradueerde ethanolreeks gedurende 15 minuten per keer (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% en 100%) bij kamertemperatuur.
  3. Meng ethanol met epoxyhars in volumeverhoudingen van 3:1, 1:1 en 1:3, en bereid in totaal 300 µL van elk mengsel. Giet elk epoxyhars in de schaal en laat het 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. Gebruik vervolgens de 100% epoxyhars voor overnachtelijke impregnatie.
  4. Bereid de inbeddingscapsule of PCR-buis voor door deze te vullen met verse epoxyhars, plaats de buis of capsule ondersteboven op het gebied van belang en plaats deze in een oven bij 60 °C gedurende 48 uur om te polymeriseren.

4. Snijwerk en TEM-beeldvorming

  1. Nadat de epoxyhars volledig is gepolymeriseerd, scheid het onderste glas van het polymeerblok door het in vloeibare stikstof te dompelen.
  2. Plaats het specimenblok in de monsterhouder van de ultramicrotoom en plaats het in de trimblok. Gebruik een scheermes om de hars in een trapeziumvormige of rechthoekige vorm rond het object van belang te trimmen.
  3. Plaats het getrimde specimenblok in de monsterhouder en pas de diamantschijf aan. Zorg ervoor dat de voorste rand van het specimenblok perfect parallel is aan de rand van de diamantschijf.
  4. Snijd met behulp van een ultramicrotoom ultradunne secties van ongeveer 60-70 nm van de plat-ingebedde cellen. Verzamel de seriële secties op een formvar-gecoate sleufraster en droog ze op een hotplate.
  5. Kleur de sectie met de contrastkleurstof gedurende 2 minuten en loodcitrat gedurende 1 minuut.
  6. Plaats het raster in de TEM-monsterhouder

Resultaten

Om de interacties tussen mitochondriën en lysosomen te visualiseren met dit duaalkleur-CLEM-protocol, hebben we Mito-mEosEM en TMEM192-V5-APEX2 gebruikt. Gefixeerde cellen werden eerst gefotografeerd met een lichtmicroscoop, gevolgd door EM-bemonstering en beeldvorming. De resultaten van de gecorreleerde beelden zijn weergegeven in Figuur 3A,B en Figuur 4A. Volgens het hierboven beschreven protocol hebben we gecontroleerd of we veranderingen in de interactie tussen mitochondriën en lysosomen onder externe stress konden waarnemen.

Behandeling van cellen met BFA, een lysosomale V-ATPase-remmer, remt autofagie, wat resulteert in een verminderde mitochondriale kwaliteit en toegenomen interacties tussen mitochondria en lysosomen27. In met BFA behandelde cellen observeerden we mitochondria die gevangen waren in lysosomen (Figuur 3B), vergeleken met met DMSO behandelde controlecellen (Figuur 3A). Hoewel het moeilijk is om gefragmenteerde elektronendichte mitochondria en cellulaire compartimenten binnen lysosomen enkel op basis van elektronenmicrografieën te onderscheiden, kunnen ze eenvoudig worden onderscheiden in gecorreleerde beelden (Figuur 3B1,B2). De structuur van mitochondriale disruptie (Figuur 3A1,A2; blauwe pijl) waargenomen in de mitochondria van met DMSO behandelde cellen is niet gerelateerd aan lysosomen, en de structuur in het fluorescentiebeeld die lijkt op een lysosoom dat gevangen is in een groot mitochondrion is een structuur waarbij het mitochondrion het lysosoom omringt (Figuur 3A2; rode pijl).

Vervolgens hebben we de effecten van U18666A (2 µg/mL gedurende 18 h) getest, een bekende remmer van NPC1 die het transport van cholesterol uit lysosomen blokkeert28. Cellen die behandeld waren met U18666A vertoonden een toegenomen directe interactie tussen mitochondriën en lysosomen (Figuur 4). Daarnaast verschilden de contacten tussen mitochondriën en lysosomen in met U18666A behandelde monsters van die in met BFA behandelde monsters. In met BFA behandelde HeLa-cellen is het gefragmenteerde mitochondrion volledig ingesloten in het lysosoom, een eerder beschreven morfologie van mitofagie12,29. Echter, in de met U18666A behandelde groep lijken sommige TMEM192-positieve lysosomen te worden omsloten door het mitochondrion (Figuur 4D,E)30,31.

Workflow voor celvoorbereiding en beeldvorming: transfectie, APEX2-labeling, confocale microscopie, TEM-setup analyse.
Figuur 1: Schematisch overzicht van TEM-gebaseerde CLEM met gebruik van een genetisch getagde fluorescentieprobe. (A) HeLa-cellen werden gekweekt in 35 mm glazen kweekschalen met een grid-bodem. (B) Gefixeerde cellen werden gelabeld met Amplex-Red door het APEX2-eiwit. (C) Fluorescentiebeelden werden vastgelegd met een confocale microscoop. Een gemotoriseerde tafel en een tile-scanfunctie werden gebruikt om een groot overzichtsbeeld en een hoge-resolutiebeeld van de doelcel vast te leggen. Het grote beeld dient als navigatiekaart om de locatie van de doelcel in plastic-ingebedde monsters te identificeren. (D) Vervolg met postfixatie en dehydratie-inbedding. (E) Inbedding werd uitgevoerd met behulp van een PCR-buis of BEEM-capsule gevuld met hars over de doelcel op het dekglas. (F) Na polymerisatie van de hars liet het verwijderen van het dekglas een afgedrukt gridpatroon achter op het bodemoppervlak van het blok. (G) De doelcel werd geïdentificeerd aan de hand van het afgedrukte patroon op het harsoppervlak, en de doelcel werd gesneden met een dikte van ongeveer 60 nm met behulp van een ultramicrotoom. (H) Seriële coupes werden verzameld op een formvar-gecoat koperen slotgrid. (I) De grids werden afgebeeld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Afkortingen: TEM = transmissie-elektronenmicroscopie; CLEM = correlatieve licht- en elektronenmicroscopie; ROI = region of interest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Diagram van beeldverwerking: image stitching, fluorescentie-herdimensionering, landmark-registratie, CLEM-overlay.
Figuur 2: Beeldverwerking en generatie van het CLEM-beeld met behulp van imageJ Fiji. (A1) Hoofd-GUI van Fiji en TrakEM2. (A2) Import van de tile-beeldset verkregen met TEM bij een vergroting van 1.700x. (A3) Uitlijning en voorbeeld van een gesticht beeld met behulp van de beelduitlijningsmethode van TrakeEM2. (B1-B3) Conversie van een kleine lichtmicroscopische opname naar grote beelden van hoge kwaliteit met behulp van software voor fotovergroting. (C1-C3) Workflow voor registratie tussen lichtmicroscopiebeelden en elektronenmicroscopiebeelden met behulp van de Big Wrap plug-in software. (D1-D3) Het proces van het overlayen van een getransformeerd FM-beeld en een EM-beeld om een gecorreleerd microscopiebeeld te synthetiseren. Afkortingen: TEM = transmissie-elektronenmicroscopie; CLEM = correlatieve licht- en elektronenmicroscopie; FM = fluorescentiemicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Confocaal, TEM, CLEM diagram; lokalisatie van mitochondriën en lysosomen; analyse van de cellulaire structuur.
Figuur 3: CLEM-beelden van de contactplaatsen tussen mitochondriën en lysosomen, behandeld met of zonder bafilomycine A1. HeLa-cellen werden co-getransfecteerd met Mito-mEosEM (mitochondriën; groen) en TMEM192-APEX2 (lysosomen; rood) en vervolgens gekleurd met Amplex-Red kleurstof. (A) Onbehandelde HeLa-cellen. Moleculaire informatie uit het fluorescentiesignaal (linkerpaneel) en ultrastructurele informatie verkregen via TEM (middelpaneel) werden over elkaar gelegd (rechterpaneel) op basis van het mitochondriale signaal en de morfologie. (A1,A2) In onbehandelde HeLa-cellen is het binnenmembraan van het mitochondrion verstoord (blauwe pijl), of bevinden de mitochondriën en lysosomen zich zeer dicht bij elkaar (rode pijl). (B1,B2) In HeLa-cellen die 18 h met bafilomycine A1 waren behandeld, werd mitofagie waargenomen, gekenmerkt door het insluiten van onafgebroken mitochondriën in lysosomen (groene pijl). Schaalbalken = 1 µm (A1,A2,B1,B2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Confocale, TEM- en CLEM-microscopiebeelden van mitochondriën (groen) en lysosomen (rood) in cellen.
Figuur 4CLEM-beelden van de mitochondriale en lysosomale contactplaatsen behandeld met U18666A (ATweekleurige CLEM-beelden van HeLa-cellen die Mito-mEosEM en TMEM192-V5-APEX2 (gelabeld met Amplex-Red) tot expressie brengen onder behandeling met U18666A (2 µg/mL gedurende 18 u). (A1, A2) Rode pijlen geven contactplaatsen tussen mitochondriën en lysosomen aan. Schaalbalken = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) De rode pijl geeft het verschijnen van inter-organelfusie tussen mitochondriën en lysosomen aan in seriële beelden. Schaalbalken = 500 nm (B1-B3). Schaalverdelingen = 1 µm (C1-C3). (D,E) TEM-beelden met hoge vergroting van de fusieplaatsen tussen mitochondriën en lysosomen. Pseudokleuren worden gebruikt om onderscheid te maken tussen het mitochondrion (groen) en het lysosoom (rood). Schaalbalken = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft dubbelkleur CLEM om de interactie van mitochondriën en lysosomen in gefixeerde cellen te observeren met behulp van genetisch gecodeerde mEosEM en APEX2-tags. In de afgelopen decennia hebben vooruitgangen in microscopie de mogelijkheid om veranderingen in organellennetwerken te observeren enorm verbeterd32,33, en de studie van organelleninteracties is steeds interessanter geworden. Superresolutiemicroscopie is gebruikt om veranderingen in zeer dynamische contacten tussen mitochondriën en lysosomen te observeren34,35,36. Echter, ondanks het gebruik van superresolutiemicroscopie, is het moeilijk om veranderingen in de dikte van de binnenste en buitenste mitochondriale membranen (ongeveer 22 nm) en cristae-verbindingen (ongeveer 28 nm) te onderscheiden37. Transmissie-elektronenmicroscopie heeft het voordeel dat de structuur van biologische monsters op zeer hoge resolutie kan worden waargenomen, maar heeft het nadeel dat de beelden alleen in zwart-wit kunnen worden bekeken, waardoor het moeilijk wordt om organellen in complexe beelden te onderscheiden. In ons protocol hebben we een CLEM-methode gebruikt die de voordelen van licht- en elektronenmicroscopie combineert om de interactie van twee verschillende organellen te monitoren door ze met verschillende kleuren te kleuren. In het bijzonder is dubbelkleur CLEM een onschatbare tool voor het observeren en analyseren van mitofagie, het proces van mitochondriale degradatie binnen lysosomen, zoals getoond in Figuur 3.

Live-cell beeldvorming wordt typisch uitgevoerd onder fysiologische omstandigheden, waardoor onderzoekers dynamische cellulaire processen in realtime kunnen observeren. Elektronenmicroscopietechnieken vereisen echter vaak tijdrovende monstervoorbereidingsprocedures, inclusief fixatie en kleuring. De tijdsvertraging tussen live-cell CLEM en monstervoorbereiding voor elektronenmicroscopie beperkt de temporele resolutie van de techniek en kan resulteren in mogelijk gemiste dynamische cellulaire gebeurtenissen. Om de beperking van live-cell CLEM te overwinnen, hebben we een dubbelkleur CLEM-methode ontwikkeld waarbij de mEosEM-sonde23 en chemisch kleurstof (Amplex-Red) worden gekleurd door het APEX2-proximiteitslabelenzym38 zonder verlies van fluorescentiesignaal, zelfs in agressieve fixatie-omgevingen. In een eerder live-cell CLEM-onderzoek39 werden discrepanties gevonden tussen fluorescentiesignalen en EM-beelden vanwege kwesties met de temporele resolutie in TEM-bemonstering na live-cell beeldvorming en technische beperkingen in monstervoorbereiding. Door echter fluorescentiebeelden van gefixeerde cellen gedurende voldoende tijd te verkrijgen (z-stack beeldvorming van hele cellen op hoge vergroting), kunnen we het probleem met de temporele resolutie oplossen en de correlatie tussen LM- en EM-beelden verbeteren (Figuur 3 en Figuur 4).

Een andere belangrijke factor voor succesvolle CLEM-resultaten is hoe de LM-afbeelding nauwkeurig kan worden geregistreerd met de EM-afbeelding. Om dit te doen, gebruikten we eerst een combinatie van DIC en fluorescentie beeldvormingsmodi tijdens lichtmicroscoop beeldvorming om een navigatiemap rond de doelcellen te maken. Met behulp van deze navigatiemap konden we de cellen van belang gemakkelijk identificeren op de ultramicrotoom en TEM. Ten tweede, door TEM-tegelbeelden van hele cellen op hoge vergroting te verkrijgen, konden we veel herkenningspunten verkrijgen die konden worden gebruikt voor beeldregistratie. In onze ervaring, hoe hoger het aantal herkenningspunten, hoe beter de uitlijningsnauwkeurigheid van LM en EM beelden in de Big Warp-plug-in.

In deze studie toonden we de interactiedomeinen van lysosomen en mitochondriën met hoog-resolutie CLEM-resultaten. Bovendien maakte de dubbelkleur sonde een nauwkeurig onderscheid mogelijk tussen mitochondriën en lysosomen. Deze methode heeft echter enkele beperkingen. Ten eerste, als de reactietijd tijdens de proximale labelering van Amplex-Red door het APEX2-enzym te lang is, zal de Amplex-Red diffuseren en breder kleuren dan de locatie van het doelwitproteïne38. Ten tweede is de dikte (z-as volume) van het gebied waar het lysosome in de mitochondriën is ingesloten vrij klein, zodat de fusie van de twee orgaanmembraan niet kan worden bepaald in een serieel sectie van 50 nm dik. Verder is het een aanzienlijke uitdaging om de z-as van een optisch sectie door lichtmicroscoop en een mechanisch sectie door ultramicrotoom nauwkeurig uit te lijnen. Om deze beperkingen te overwinnen, kan dubbelkleur CLEM worden gebruikt in combinatie met conventionele elektronentomografie40 of serieel sectie volume-CLEM41.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het KBRI basisonderzoeksprogramma via Korea Brain Research Institute gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap en ICT (24-BR-01-03). TMEM192-V5-APEX2 plasmiden werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). TEM-gegevens werden verkregen bij Brain Research Core Facilities in KBRI.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals and reagents
25% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16200Aldehyd dampen zijn extreem giftig. Gebruik alleen in een afzuigkast.
30% Waterstofperoxide-oplossingMerck107210
4% Paraformaldehyde-oplossingBiosesangPC2031-100-00Aldehyd dampen zijn extreem giftig. Gebruik alleen in een afzuigkast.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Electron Microscopy Sciences14120
EthanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Plasmid transfectie
GlycineSIGMAG8898
Lead Citrate 3%Electron Microscopy Sciences22410
Osmium tetroxide 4 % waterige oplossingElectron Microscopy Sciences16320Zeer giftig. Gebruik alleen in een afzuigkast.
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate SIGMAP3289
Sodium cacodylaat trihydraatSigma-AldrichC0250-500G
Uranyl acetaatElectron Microscopy Sciences22400
UranyLess EM-kleuringElectron Microscopy Sciences22409
Plasmidconstructie
Mito-mEosEMaddgene132706DOI: 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI: 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Gereedschappen
0,22 um spuitfilterSartorius16534
35 mm Gridded dekglasschaalMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM Inbedding CapsulesTed Pella130
Formvar Ondersteunde Enkele sleuf koperen roosterTed Pella01705
Diamant mesDiATOMEDU4530
Ultra-microtoomLeicaARTOS 3D
Microscopen
Omgekeerde confocale microscopieNikonA1 Rsi/Ti-E
Transmissie-elektronenmicroscopieFEITecnai G2
Software en algoritmen
Fiji/Image JNIH / open sourcehttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp softwarepakketNIH / open sourcehttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Alternatieve software
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 resize : https://www.on1.com/products/resize-ai/

Referenties

  1. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  2. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).
  3. Lopez, J., Tait, S. W. G. Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within. Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).
  4. Wang, C., Youle, R. J. The role of mitochondria in apoptosis*. Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).
  5. Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).
  6. Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).
  7. Talari, N. K., et al. Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats. Nat Commun. 14 (1), 766(2023).
  8. Enkler, L., et al. Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).
  9. Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 9 (5), 1131(2020).
  10. Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. A lysosome-centered view of nutrient homeostasis. Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).
  11. Thelen, A. M., Zoncu, R. Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism. Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).
  12. Ma, X., et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).
  13. Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease. Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).
  14. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  15. Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2. Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).
  16. Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).
  17. Juhl, A. D., et al. Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells. Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).
  18. Khalil, S., et al. A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2. Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).
  19. Russell, M. R., et al. 3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).
  20. Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  21. Loginov, S. V., et al. Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes. Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).
  22. De Beer, M., et al. Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM. Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).
  23. Fu, Z., et al. Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  24. Lam, S. S., et al. Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Cardona, A., et al. Trakem2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), e38011(2012).
  27. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biol. 11, 73-81 (2017).
  28. Lu, F., et al. Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection. eLife. 4, e12177(2015).
  29. Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. The autophagy research in electron microscopy. Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).
  30. Hao, T., et al. Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion. Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).
  31. Hoglinger, D., et al. Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress. Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).
  32. Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy. J Vis Exp. (149), e59750(2019).
  33. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem. Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).
  34. Wang, H., et al. Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction. Front Pharmacol. 13, 865173(2022).
  35. Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. bioRxiv. , (2018).
  36. Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis. Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).
  37. Perkins, G., et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).
  38. Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase. Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).
  39. Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell. Materials (Basel). 13 (19), (2020).
  40. Mourik, M. J., et al. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).
  41. Hegermann, J., et al. Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).

Herprints en machtigingen

Tags

Correlatieve lichtmicroscopieinteractie tussen mitochondri n en lysosomentweekleurige CLEMorganeldynamicaconfocale microscopietransmissie elektronenmicroscopieHeLa cellenmitochondriale kwaliteitscontroleorganelmarkering
Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.