Dit protocol toont de combinatie van beeldvorming en elektrofysiologie om betrouwbaar verspreidende depolarisaties in volwassen muizen na een lichte traumatische hersenbeschadiging te detecteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties bij muizen te visualiseren en te registreren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Spreidende Depolarisaties (SD's) zijn enorme gebeurtenissen in de hersenen die vaak onopgemerkt blijven vanwege hun langzame voortplanting door grijze stof. Omdat SD-detectie moeilijk kan zijn, wordt het optimaal bevestigd met behulp van meerdere methoden. Dit protocol beschrijft methoden voor het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om SD's te detecteren op een manier die de meeste laboratoria betrouwbaar en eenvoudig kunnen toepassen. SD's treden op na traumatisch hersenletsel, beroerte, subarachnoïdale bloedingen, ischemie en migraine-aura. Historisch zijn SD's opgenomen met behulp van DC-versterkers, die de langzame extracellulaire verschuiving en de depressie in hogefrequentieactiviteit kunnen oplossen. Echter, DC-versterkers zijn bijna onmogelijk te gebruiken voor chronische in vivo opnames. Dit protocol gebruikt een gewone AC-versterker voor in vivo elektrofysiologische opnames om de depressie met hoge frequentie te bevestigen, samen met niet-invasieve beeldvorming die noodzakelijk is om de voortplantende golf van SD te detecteren. Deze methoden kunnen betrouwbaar worden toegepast en/of aangepast voor de meeste experimentele benaderingen om de aanwezigheid of afwezigheid van SD's na hersenletsel te bevestigen.
Inleiding
Spreading depolarisaties (SD's) worden geassocieerd met verschillende neurologische aandoeningen, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte, subarachnoïdale bloedingen, ischemie en migraine-aura1. SD's zijn betrokken bij de progressie van weefselbeschadiging bij beroertes en TBI's2. Het exacte mechanisme achter de progressie van weefselverlies blijft onduidelijk3,4. Echter, SD's treden op wanneer de metabolische behoeften van neuronen niet worden gedekt door voldoende zuurstof en glucose, omdat de functie van de ATP-afhankelijke natrium-kaliumpomp ontoereikend wordt om ionengradienten te handhaven. Om de rol van SD's bij weefselverlies te begrijpen, zijn precieze technieken nodig om ze te meten en te bestuderen, wat cruciaal is voor het bevorderen van wetenschappelijke kennis. SD's zijn belangrijke neurologische gebeurtenissen die vaak onopgemerkt blijven vanwege beperkingen in experimenteel ontwerp en/of instrumentatie.
De rol van spreading depolarisaties (SD's) bij de progressie van verwondingen wordt momenteel onderzocht, maar hun rol bij milde traumatisch hersenletsel (mTBI's) blijft onduidelijk. Recente studies met behulp van de technieken die in dit manuscript worden beschreven, hebben aangetoond dat SD's worden geïnitieerd in muismodellen met gesloten schedel mTBI, zelfs wanneer er geen overduidelijk weefselbeschadiging of bloeding is5,6. Deze studies suggereren dat SD's kunnen bijdragen aan acute neurologische beperkingen en neuro-ontsteking. Bovendien is de aanwezigheid van mTBI-geïnduceerde SD's nauw verbonden met acute gedragsdeficiënten6,7. Daarom is het waarschijnlijk dat SD's worden geïnitieerd in alle TBI-modellen, maar hun rol blijft moeilijk vast te stellen zonder bevestiging. Het bevestigen van de aanwezigheid van SD's is cruciaal voor het nauwkeurig beoordelen van de uitkomsten van mTBI's.
Spreading depolarisaties (SD's) worden geïdentificeerd door een significante daling van het extracellulaire potentieel, bekend als de "DC-verschuiving," en door een onderdrukking van hogefrequentieactiviteit8. De "DC-verschuiving" duurt meestal seconden om zich op te lossen (~10 s)9. Om de "DC-verschuiving" vast te leggen, zijn een DC-versterker en zilverdraadelektroden vereist. Echter, in vivo elektrofysiologie wordt meestal uitgevoerd met AC-versterkers, die zijn ontworpen om laagfrequente gebeurtenissen te filteren om bewegingsartefacten te verminderen. Helaas verwijdert deze laagfrequente filtering ook de "DC-verschuiving." Bovendien is zilver giftig en ongeschikt voor chronische opnames. Gewoonlijk gebruikte AC-versterkers kunnen de onderdrukking van hogefrequentieactiviteit detecteren, maar zonder de bijbehorende "DC-verschuiving," is het bevestigen van de aanwezigheid van een SD een uitdaging.
Spreading depolarisaties (SD's) kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van verschillende beeldvormingstechnieken. Meestal worden SD's beeldvormd met laser speckle contrast beeldvorming, die de cerebrale bloedstroom door de intacte schedel meet10. SD's hebben een significante invloed op de cerebrale vaatbundel en de bloedstroom. Bij de meeste soorten, behalve muizen, induceren SD's een voortplantende golf van hyperperfusie die met de voorste rand van de SD reist11. SD's kunnen ook worden beeldvormd met behulp van calcium- of glutamaatfluorescente indicatoren12, hoewel dit vereist dat weefsel wordt geladen met kleurstoffen of genetisch gecodeerde fluorescente indicatoren12,13. Interessant is dat SD's kunnen worden waargenomen met het blote oog vanwege intrinsieke optische signalen (iOS) die geassocieerd zijn met de SD14. iOS zijn complexe signalen die bestaan uit autofluorescente moleculen zoals NAD(P)H en FADH15,16, weefselzwelling17 en mogelijke veranderingen in de cerebrale bloedstroom. Ondanks hun complexiteit zijn iOS-signalen betrouwbaar en kunnen ze worden vastgelegd bij wild-type muizen18. Dit protocol beschrijft de methode voor het beeldvormen van iOS omdat deze techniek in elk lab kan worden geïmplementeerd zonder de noodzaak van gespecialiseerde virussen of transgene dieren.
Het algemene doel van deze methode is om experimenteel de aanwezigheid of afwezigheid van een spreading depolarisatie (SD) na een mild traumatisch hersenletsel (mTBI) te bevestigen met behulp van gelijktijdige beeldvorming en elektrofysiologie. In vivo elektrofysiologie, vergemakkelijkt door geavanceerde versterkers, is een veelgebruikte techniek. Echter, deze versterkers zijn niet in staat om de karakteristieke "DC-verschuiving" te detecteren. Daarom worden beeldvormingstechnieken, zoals beschreven in dit protocol, gebruikt om met vertrouwen de aanwezigheid of afwezigheid van SD's te bevestigen. Het voordeel van het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie is dat beeldvorming de voortplanting van de SD kan detecteren, terwijl elektrofysiologie de geassocieerde onderdrukking van hogefrequentie kan identificeren.
Over het algemeen is deze methode geschikt voor het onderzoeken van de aanwezigheid van spreading depolarisaties (SD's) na een traumatisch hersenletsel (TBI). De toepassing ervan zou het begrip van de corticale netwerkfunctie na TBI en SD's kunnen verbeteren. Dit protocol kan worden aangepast van een gesloten schedel impactmodel naar andere modellen, zoals gecontroleerde corticale impact, vloeistof per
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institute's Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de University of New Mexico. C57BL/6J muizen werden verkregen van een commerciële bron. Er werden gelijke aantallen van mannelijke en vrouwelijke muizen gebruikt binnen de leeftijdscategorie van 8-14 weken. Alle muizen wogen ongeveer 20 g. Details van de dieren, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Tabel van materialen. Aanvullende bestand 1 bevat de lijst met afkortingen.
1. De schedel voorbereiden voor beeldvorming en elektrofysiologie
- Verdoofd het dier in een isofluraan inductiebox met 2%-3% isofluraan in 100% zuurstof, waarbij u de juiste anesthesiegradiënt controleert zonder dat het dier reageert op een klauwknijpen.
- Dier vooroperatief pijnstillers toedienen (Slow-release Buprenorfine, 3,25 mg/kg, SQ) voordat het dier in een stereotactische frame wordt geplaatst en de anesthesie wordt gehandhaafd (2% isofluraan).
- Voeg oogzalf toe en houd de lichaamstemperatuur van het dier op peil met een verwarmingskussen dat feedback van de lichaamstemperatuur heeft.
- Scheer het haar boven de schedel waar de snede zal worden gemaakt, langs de middenlijn van de oogfissuur tot lambda.
- Verwijder het geknipte haar voordat de huid wordt gesteriliseerd met een antiseptisch en desinfecterend scrub en oplossing. Eindig met 70% ethanol en herhaal dit drie keer om een steriele chirurgische plaats te garanderen.
- Maak met een #10 scalpelmes een snede langs de middenlijn van rostrale naar caudale, direct gevolgd door het aanbrengen van medisch kwaliteits cyanoacrylaatlijm op de incisie. Spreid de huid lateraal uit om de schedel bloot te leggen.
- Voeg nog een druppel of twee cyanoacrylaatlijm toe over de schedel om extra bescherming aan de schedel toe te voegen.
OPMERKING: De aanbrenging van lijm is tijdsgevoelig omdat de schedel begint te worden ondoorzichtig wanneer deze langer dan 10 s aan de lucht wordt blootgesteld. Dit zal de visualisatie van de SD door beeldvormingsmethoden belemmeren. - Terwijl de lijm aan het drogen is, gebruik steriele chirurgische schaar om de incisiegrootte over de cerebellum te vergroten. Zodra de lijm is uitgehard, begin met de implantatie van schedelschroefelektroden.
- Steriliseer schedelschroeven door een kralensterilisator gedurende 20-30 s voorafgaand aan implantatie.
- Plaats de schedelschroeven in een gebied dat ver verwijderd is van de SD-initiatieplaats om een open visueel venster te behouden.
OPMERKING: Voor chronische opnames in de primaire visuele cortex worden drie schedelschroeven gebruikt. De eerste schroef wordt ongeveer geplaatst op y = -6,00 mm vanaf de bregma, in de cerebellum, dient als referentie-elektrode. De opnameelektroden zijn gepositioneerd op y = -2,79 mm van bregma en x = ±2,5 mm van de middenlijn, binnen de linker en rechter hemisfeer. - Met een boortje van 0,8 mm, boor pilootgaten door de schedel. Om schade aan het onderliggende weefsel te voorkomen, is -0,5 mm in z ideaal. Gebruik #00-90 schroeven die vooraf zijn gesoldeerd aan goudstiften met roestvrijstalen draad.
- Draai de schroeven in de schedel. 1,5-2 volledige draaien zal de schroef door de schedel krijgen en in contact komen met het corticale oppervlak.
- Wind overtollig draad rond de schroef, waarbij wat speling in de draad wordt gelaten voor latere plaatsing van het hoofdstadium.
- Gebruik dezelfde procedures om de andere schedelschroeven te plaatsen.
- Zodra alle schedelschroeven op hun plaats zitten, steek alle goudstiften in de gewenste hoofdstadiumconnector. Houd de connector op zijn plaats met behulp van de stereotactische arm en houd de connectorstiften dicht boven de schroefhoofden terwijl wordt gecontroleerd dat de draden niet raken.
- Verzegeld de hele ruimte met cyanoacrylaatlijm, zorg ervoor dat het beeldvormingsgebied voor de schedelschroeven niet wordt verstoord.
- Bouw tandencement op rond de basis van de goudstiften, zorg ervoor dat de goudstiften van de schedelschroeven niet zijn verbonden met de goudstiften in de hoofdstadium.
- Laat het tandencement uitharden voordat de hoofdstadiumconnector wordt verwijderd.
- Verwijder het dier uit het stereotactische frame en plaats het terug in de thuiscamer om te herstellen. Volg standaard postoperatieve zorg en houd dieren op een verwarmingskussen terwijl ze zich herstellen van anesthesie.
OPMERKING: Na de operatie werden de dieren alleen gehuisvest en dagelijks gecontroleerd op pijn. Volg de lokale institutionele richtlijnen voor pijnstilling. Als u een slow-release buprenorfine gebruikt, controleer op pijn en geef mogelijk een extra dosis na 72 uur.
- Verwijder alle objecten die zich kunnen verstrikken in de elektroden, inclusief huisvesting en verrijking. Gebruik standaard beddengoed met ad libium toegang tot voedsel en water.
OPMERKING: Laat een herstelperiode van twee dagen tussen operatie en opname.
2. Het detecteren van verspreidende depolarisaties met intrinsieke optische signaal (iOS) beeldvorming en AC- elektrofysiologie
- Verdoofd de dieren met 2% isofluraan in 100% zuurstof.
OPMERKING: Het beeldvormingsgedeelte van deze procedure duurt ongeveer 5 min en de hoeveelheid isofluraanblootstelling moet consistent zijn. - Plaats het dier in een stereotactisch frame. Via de neuskoker, handhaaf 1%-2% isofluraan in zuurstof.
OPMERKING: Het is
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 illustreert een grafische weergave van de experimentele opstelling. De schedelvijzen voor registratie zijn gepositioneerd in de primaire visuele cortex, waarbij één schedelvijze-elektrode in de cerebellaire vermis is geplaatst als geelektrode. De schedelvijzen en gouden pinnen zijn met cyanoacrylaatlijm en tandcement aan de schedel bevestigd. Het is cruciaal om het tandcement te beperken tot het caudale deel van de schedel om ruimte over te laten voor de impact en beeldvorming. De i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Spreidende depolarisaties zijn cruciaal in verschillende ziektemodellen, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte en migraine1. Nauwkeurige detectie van SD's is essentieel voor het begrijpen van hun rol bij acute gedragsstoornissen en/of de activering van het neuro-immuunsysteem na mild traumatisch hersenletsel (mTBI's)23,24. Om het risico van het missen van SD's bij gebruik van een enkele methode te beperken, is een multi-method...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIGMS P20GM109089 en Department of Defense PR200891 subsidies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #00-90 x.118 Machine Screw | US Micro Screw | 00.90-118-M-SS-P, Amazon | |
| 0.8 mm diameter drill bit | PCB Drill Bit | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2.1 mm Burrs micro drill bit | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| AC amplifier | Intan | RHD recording system | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Jax#000664 | |
| CCD camera | Mightex | TCE-1304-U | |
| Extension lens | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (slow release Buprenorphine) | Midwest Veterinary Supply | Product Number 267.10000.3 | |
| Gold connector pin (female) | A-M Systems | 520100 | |
| Gold connector pin (male) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| LED panel board | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Institutional or individual activation code | |
| Medical grade cyanoacrylate glue | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Camera Software | Image J | NA | |
| Nail drill/polisher | Makartt Nail Drill Electric Nail File | JD700 | |
| Omnetic connectors | Omnetics | A79014-001 | |
| RHX Data Acquisition Software | Intan | NA | |
| Stainless Steel uncoated wire (0.005") | A-M Systems | 792800 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Teets 'cold cure' dental cement | A-M systems | 525000, 526000 | |
| XLR camera lens | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Referenties
- Pietrobon, D., Moskowitz, M. Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).
- Hartings, J. A., et al. Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma. Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).
- Andrew, R. D., et al. Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization. Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).
- Andrew, R. D., et al. Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).
- Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. eNeuro. 6 (6), (2019).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).
- Pinkowski, N. J., et al. Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice. J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).
- Dreier, J. P., et al. Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).
- Herreras, O., Somjen, G. G. Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats. Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).
- Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).
- Hadjikhani, N., et al. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).
- Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury. J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).
- Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations. Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).
- Mané, M., Müller, M. Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function. J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).
- Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices. J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).
- Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).
- Chung, D. Y., et al. Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice. J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).
- Soldozy, S., et al. Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury. World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).
- Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications. J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).
- Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. Chronic imaging through "transparent skull" in mice. PLoS One. 12 (8), (2017).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats. Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).
- Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues. J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
