Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Methodologie voor het bestuderen van interacties van vitamine A-membraanreceptoren en opsine-eiwit met hun liganden bij het genereren van het retinylideen-eiwit

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67036

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we twee kwantitatieve methoden voor het bestuderen van de eiwit-ligand interacties van vitamine A-membraanreceptoren en fotoreceptoropsine met hun respectievelijke fysiologische liganden.

Samenvatting

De distributie van vitamine A/all-trans retinol (ROL) in de voeding door het lichaam is van cruciaal belang voor het behoud van de retinoïde functie in perifere weefsels en voor het genereren van het retinylideen-eiwit voor de visuele functie. RBP4-ROL is het complex van ROL met retinol-bindend proteïne 4 (RBP4), dat in het bloed aanwezig is. Twee membraanreceptoren, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) in de lever en GESimuleerd door Retinoic Acid 6 Retinol (STRA6) in het oog, binden RBP4 in de bloedsomloop en dit mechanisme is van cruciaal belang voor het internaliseren van ROL in cellen. Het vaststellen van methoden om de kinetiek van receptorligand te onderzoeken is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische functie van vitamine A-receptoren voor retinoïde homeostase. Met behulp van Surface Plasmon Resonance (SPR)-assays kunnen we de bindingsaffiniteiten en kinetische parameters van vitamine A-membraanreceptoren met zijn fysiologische ligand RBP4 analyseren.

Deze methodologieën kunnen nieuwe structurele en biochemische informatie onthullen over RBP4-bindende motieven in RBPR2 en STRA6, die van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van pathologische toestanden van vitamine A-tekort. In het oog wordt geïnternaliseerde ROL gemetaboliseerd tot 11-cis retinaal, de visuele chromofoor die zich bindt aan opsine in fotoreceptoren om het retinylideen-eiwit rodopsine te vormen. De absorptie van licht veroorzaakt de cis-to-trans-isomerisatie van 11-cis retinaal, waardoor conformationele veranderingen in rodopsine worden geïnduceerd en de daaropvolgende activering van de fototransductiecascade. Verlaagde concentraties van serum en oculaire ROL kunnen de vorming van retinylideen-eiwit beïnvloeden, wat op zijn beurt kan leiden tot verkeerde lokalisatie van rodopsine, accumulatie van apoproteïne-opsine, nachtblindheid en degeneratie van het buitenste segment van de fotoreceptor, wat leidt tot retinitis pigmentosa of Leber congenitale amaurosis.

Daarom zijn spectrofotometrische methodologieën om het G-eiwitgekoppelde receptor opsine-11-cis retinale complex in het netvlies te kwantificeren van cruciaal belang voor het begrijpen van mechanismen van retinale celdegeneratie in de bovengenoemde pathologische toestanden. Met deze uitgebreide methodologieën zullen onderzoekers in staat zijn om de vitamine A-toevoer via de voeding beter te beoordelen bij het handhaven van systemische en oculaire retinoïde homeostase, wat van cruciaal belang is voor het genereren en behouden van retinylideen-eiwitconcentraties in fotoreceptoren, wat van cruciaal belang is voor het behoud van de visuele functie bij mensen.

Inleiding

Via de voeding verkregen vitamine A/all-trans retinol/ROL is een belangrijk bestanddeel dat een rol speelt bij de visuele functie 1,2. De chromofoor 11-cis retinal, een metaboliet van vitamine A in de voeding, bindt zich aan de G-eiwitgekoppelde receptor (GPCR) opsine om het retinylideen-eiwit, rodopsine, in de fotoreceptoren te genereren. Wanneer er licht op het oog valt, ondergaat de configuratie van rodopsine een fundamentele verandering via de omzetting van de 11-cis-retinale component naar de all-trans-retinale. Deze configuratieverandering activeert een fototransductiecascade in de fotoreceptoren van de staaf, waarbij licht wordt omgezet in een elektrisch signaal, dat via de oogzenuw wordt doorgegeven aan de visuele cortex in de hersenen 3,4,5,6,7,8,9,10 . Verlaagde concentraties van serum en oculaire ROL kunnen de vorming van retinylideen-eiwit beïnvloeden, wat op zijn beurt leidt tot mislokalisatie van opsine, accumulatie van apoproteïne-opsine, nachtblindheid en degeneratie van fotoreceptor-OS, wat leidt tot retinitis pigmentosa of Leber congenitale amaurosis, die blindheid kan veroorzaken 3,10.

All-trans retinol is de fundamentele transportvorm van vitamine A in de voeding en het is de bron waaruit alle functionele retinoïden en vitamine A-metabolieten in de voeding zijn afgeleid. De lever dient als het primaire orgaan voor de opslag van vitamine A in de voeding. Hepatische retinol wordt via het serum getransporteerd als zijn complex met retinolbindend proteïne 4 (RBP4). RBP4, dat voornamelijk in de lever tot expressie komt, vormt een holocomplex met het retinolsubstraat en transthyretine (TTR), dat in de bloedsomloop komt 11,12,13,14,15,16,17. Het rapport van een celoppervlakreceptor voor RBP4 in de jaren 1970 leidde tot de hypothese dat membraantransporteiwitten het transport van retinoïden in en uit cellen helpen. De receptor op het celoppervlak voor RBP4-gebonden retinol (RBP4-ROL) werd geïdentificeerd als geSTimuleerd door retinoïnezuur 6 retinol (STRA6) in het retinale pigmentepitheel (RPE) van het oog. STRA6 bindt zich aan het circulatoire holo-RBP4-complex en transporteert de RBP4-gebonden retinol over de RPE om te worden gebruikt door fotoreceptoren 18,19. Mutaties in STRA6 kunnen leiden tot een groot aantal ziekten en fenotypes die verband houden met verlaagde oculaire ROL-concentraties. STRA6-mutaties tijdens de ontwikkeling kunnen leiden tot anoftalmie, microftalmie en andere niet-oculaire symptomen die overlappen met fenotypes geassocieerd met het Matthew-Wood-syndroom 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 komt tot expressie in verschillende organen en weefsels, zoals de RPE in het oog, maar niet in alle weefsels26,27. Hoewel de primaire opslagplaats van retinoïden de lever is, komt STRA6 niet tot expressie in de lever.

Alapatt en collega's ontdekten dat de Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) RBP4 met hoge affiniteit bond en verantwoordelijk was voor de opname van RBP4-gebonden retinol in de lever, vergelijkbaar met STRA6 in de RPE28. Van RBPR2 is gemeld dat het structurele homologie deelt met STRA6 29,30,31. RBP4 wordt voorgesteld om te binden aan residuen S294, Y295 en L296 op RBPR2, een aminozuurbindend domein dat gedeeltelijk geconserveerd is tussen RBPR2 en STRA6 enook 29,30,31. Uit deze studies wordt voorgesteld dat vitamine A-membraanreceptoren zoals STRA6 en RBPR2, die een of meer extracellulaire bindingsresiduen/domeinen bevatten, interageren met RBP4-ROL in de bloedsomloop. Membraanreceptoren spelen daarom een belangrijke rol bij de receptorbinding aan RBP4 in de bloedsomloop voor ROL-internalisatie in doelweefsels, zoals de lever en het oog.

In het eerste deel van deze studie gebruikten we Surface Plasmon Resonance (SPR) om de interactie van twee vitamine A-membraanreceptoren (RBPR2 en STRA6) met hun fysiologische ligand RBP431 te onderzoeken. De bindingsaffiniteiten en associatie-/dissociatiekinetiek van eiwit aan ligandcomplexen kunnen in realtime worden gemeten met behulp van SPR. Deze methodologie was bedoeld om kritische kinetische, structurele en biochemische informatie te verstrekken over RBP4-bindende motieven in RBPR2 en STRA6, die van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van pathologische toestanden van vitamine A-tekort31,32. Zoals hierboven vermeld, wordt circulatoire ROL via STRA6 geïnternaliseerd in de RPE om de chromofoor 11-cis retinaal te genereren, die bindt aan opsine om het retinylideen-eiwit, rodopsine, in fotoreceptorente genereren 33. We gebruikten spectrofotometriemethodologieën om het GPCR-opsine en zijn ligand 11-cis retinale complex in retinale lysaten van muizen te kwantificeren, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van mechanismen van gereduceerd retinylideeneiwit, rodopsine, in Retinitis Pigmentosa of Leber Congenitale Amaurosis oculaire pathologische toestanden34. Over het algemeen kunnen deze protocollen worden toegepast om in vitro de fysiologische gevolgen van mutant RBP4, STRA6 of RBPR2 te bestuderen bij het beïnvloeden van systemische en oculaire vitamine A-homeostase of de impact van mutant rodopsine of retinoïde cycluseiwitten op de visuele functie35,36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Methodologie voor oppervlakteplasmonresonantie (SPR)

  1. Bereiding en zuivering van RBP4-eiwit in muizen
    1. Ontwerp primers om muis RBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI-referentiesequentie: NM_001159487.1) over de volledige lengte te genereren. Kloon het msRBP4 cDNA in een pET28a His-tag Kanamycine-resistente expressievector en breng het tot expressie in BL-21 DE3-cellen (Materiaaltabel).
    2. Transformeer de BL-21 DE3-competente cellen (volgens het protocol van de fabrikant) met een geligeerde msRBP4-pET28a-vector en plaats ze vervolgens op Luria-Bertani (LB) bouillon-agarplaten die Kanamycine 50 μg/ml30,37 bevatten. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C in een broedmachine en zeef de volgende dag op positieve kolonies.
    3. Pluk een enkele kolonie en broed een nacht bij 37 °C in 5 ml LB-bouillon met Kanamycine 50 μg/ml.
    4. Voor secundaire cultuur in 500 ml LB-bouillon die Kanamycine 50 μg/ml bevat, 1% volume primaire cultuur gebruiken (uit stap 1.1.3.) en gedurende 3-4 uur bij 37 °C incuberen; Controleer de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer. In het ideale geval gaat u te werk als de OD-waarde tussen 0,6 en 1 ligt om eiwitexpressie te induceren met 0,5 mM IPTG bij 24 °C 's nachts.
    5. Gebruik meerdere IPTG-concentraties van 0,1-1 mM en een temperatuurbereik van 16-30 °C om de expressie en stabiliteit van msRBP4 te optimaliseren.
    6. Centrifugeer de cultuur (vanaf stap 1.1.5.) bij 16.000 × g gedurende 10 min, gooi het supernatant weg en bewaar de pellet op het ijs.
    7. Homogeniseer de pellet met lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Triton X-100, 10% glycerol, 0,5 mM PMSF en proteaseremmers [pH 8,0]). Sonificeer het lysaat gedurende 15 s AAN- en 30 s UIT-cyclus met behulp van een homogenisator met een output van 250 Watt en een uitgangsfrequentie van 40-50% 20 kHz. Herhaal 5x.
    8. Verwijder de celresten en niet-gelyseerde cellen door centrifugeren bij 16.000 × g gedurende 20 minuten. Leid het supernatans van het lysaat door een buffer-gebalanceerde nikkel NTA-kolom.
    9. Was de kolom met lysisbuffer (uit stap 1.1.8) met 30 mM imidazool.
    10. Elueer in fracties het gebonden msRBP4-eiwit met behulp van een buffer die 250 mM imidazool bevat. Voer de geëlueerde fracties uit en controleer de eiwithoeveelheid visueel met een 12% SDS-polyacrylamidegel, gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 in methanol:water:azijnzuur (45:45:10) oplossing en ontkleurd met oplossing zonder Coomassie kleuring methanol:water:azijnzuur (45:45:10).
    11. Pool de ongebruikte fracties en dialyseer de gepoolde fracties met een 10K dialysecassette van 10 kDa MWCO.
    12. Evalueer de kwaliteit van de gedialyseerde fractie op een 12% SDS-PAGE-gel en kwantificeer de eiwitconcentratie.
      OPMERKING: Apo-RBP4-eiwit werd gebruikt in de SPR-analyse. Voor het genereren van holo-RBP4 (RBP4-retinol), zie gedetailleerde protocollen die elders zijn gepubliceerd 36,37.
  2. Initiële validatie van RBPR2- en STRA6-peptiden met RBP4 voor structuur en interactie door middel van tryptofaanfluorescentietest en circulair dichroïsme (CD) spectroscopie
    1. Tryptofaan fluorescentie test
      1. Gebruik de online analysetool voor de eiwitsamenstelling (https://web.expasy.org/protparam/) en plak de aminozuursequentie in een code van één letter om de structurele samenstelling van het recombinante RBP4-eiwit en de individuele peptiden van RBPR2 en STRA6 te beoordelen om de tryptofaan-aminozuurresiduen in de afzonderlijke peptiden en eiwitten te bepalen (Materiaaltabel).
      2. Klik op de knop voor het berekenen van parameters en evalueer de aminozuursamenstelling voor tryptofaan (Trp) residuen.
        OPMERKING: Tryptofaanresiduen moeten aanwezig zijn in de afzonderlijke peptiden of eiwitten die worden geanalyseerd.
      3. Verdun de afzonderlijke RBPR2- en STRA6-peptiden in verschillende micromolaire concentraties en incubeer afzonderlijk met 3 μg msRBP4 in een plaat met 96 putjes bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Prikkel de mix bij 290 nm en scan de emissie van 300 nm tot 400 nm golflengte.
      4. Normaliseer de gegevens met de Blank (alleen buffer, geen peptide en geen eiwit) en peptidecontroleconditie (geen eiwit) en plot.
        OPMERKING: De toename van tryptofaanfluorescentie bij blootstelling aan een lage tot hoge peptideconcentratie suggereert een positieve interactie tussen de twee individuele peptiden en het RBP4-eiwit.
    2. Circulair dichroïsme (CD) spectroscopie
      1. Verdun de afzonderlijke peptiden en het recombinante RBP4-eiwit in 1x PBS-buffer, pH 7,0. Gebruik verschillende concentraties RBPR2- en STRA6-peptiden en RBP4-eiwit van 0,1 tot 10 μg/ml voor een kwaliteitscontrole, zoals hieronder beschreven.
      2. Voeg individuele verdunde peptiden en eiwitten toe in een cuvet met een weglengte van 0,1 cm en meet de CD-absorptie/ellipticiteit met behulp van een CD-spectrofotometer (195-250 nm). Gebruik de onderstaande formule om de gemiddelde ellipticiteit van het residu (θ) te berekenen.
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S staat voor het CD-signaal in mθ; mRw vertegenwoordigt de gemiddelde residumassa; c vertegenwoordigt de concentratie van het eiwit in mg/ml; en L staat voor de weglengte in cm.
      3. Bereken de procentuele verandering in molecuulstructuur met behulp van BeStSel Secondary Structure Analysis to Protein Fold Prediction by CD Spectroscopy (https://bestsel.elte.hu).
        OPMERKING: De secundaire structuur geeft de juiste vouw- en conserveringsbevestigingen aan die cruciaal zijn voor de interactiestudie en de uitkomst van de interacties. Inspecteer de voorspelde structuur van het domein en ga verder met het interactieonderzoek.

2. SPR-analyse om de bindingsaffiniteiten en kinetische parameters van vitamine A-membraanreceptoren (RBPR2 en STRA6) met hun fysiologische ligand RBP4 te bepalen

  1. Voor de immobilisatie van RBP4 op CM5 Chip-oppervlakte-opstelling gebruiken we de SPR-sensorchip, die een carboxymethyldexan-linker draagt die is verlengd tot een grootte van ~100 nm die covalent is bevestigd op een gouden oppervlak. In aanwezigheid van 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC), zet N-hydroxysuccinimide (NHS) de carboxylgroepen op het oppervlak van de chip om in N-hydroxysuccinimide-esters, die spontaan reageren met de aminegroepen van aminozuren en eiwitten, waardoor het ligand gedwongen wordt zich covalent aan het oppervlak van de chip te hechten (Materiaaltabel).
    1. Immobiliseer het gezuiverde msRBP4-eiwit op de sensorchip (Figuur 1 en Figuur 2). Kies in het menu Uitvoeren van de software de wizard en ga verder met de immobilisatieoptie . Verdun het ligand (msRBP4-eiwit verkregen uit stap 1.1) in immobilisatiebuffer (10 mM natriumacetaatbuffer, pH 5.0) tot 10 μg/ml (4 μL ligand + 396 μL buffer) en aliquot de koppelingsreagentia in injectieflacons. Open het venster van de wizard voor het instellen van immobilisatie vanuit de softwarebediening, selecteer CM5-chip en optie Immobilize flowcel 2 en doelniveau van 1,200 Response Unit (RU) voor het bereiken van een Rmax van 30 RU in de kinetische studie en wasoplossing: ethanolamine. Voer de naam RBP4 in en klik op Volgende.
      OPMERKING: Optioneel: Het dialoogvenster Systeemvoorbereidingen voor de optie Primen vóór uitvoering is niet vereist als eerder is geprimed met running buffer PBST (fosfaatgebufferde zoutoplossing met een 0,05% Tween 20-wasmiddeloplossing).
    2. Klik in het dialoogvenster Rekpositie op Rek uitwerpen. Neem het rek en plaats de injectieflacons met toegewezen volumes voor elk reagens: 156 μL msRBP4, 177 μL ethanolamine, 89 μL EDC, 89 μL NHS en een lege injectieflacon. Plaats het rek met monsterflacons en klik op OK en Volgende.
    3. Klik in het dialoogvenster Run Protocol voorbereiden op Start en Opslaan.
  2. RBPR2 en STRA6 peptiden kinetische assay opstelling
    1. Serieel verdunnen van de muis RBPR2, mutant RBPR2 en STRA6-peptiden (chemisch gesynthetiseerdeerder 31 en vermeld in de materiaaltabel) in lopende buffer in een bereik van 0,8-26,6 μM.
    2. Open de besturingssoftware en selecteer wizard Kinetiek/Affiniteit. Klik op Bestand | Open de sjabloon en selecteer Kinetiek/Affiniteit. Voer het stroompad 2-1 van het dialoogvenster voor de injectiesequentie in (Stroomcel 2 als actief en Stroomcel 1 als referentie), controleer het chiptype CM5 en klik op Volgende. Vink in het installatiedialoogvenster de optie Opstartcycli uitvoeren aan, voer Oplossing: buffer en cycli in en klik op Volgende.
    3. Voer in het dialoogvenster met injectieparameters de waarden voor monsterparameters in: contacttijd: 120 s, debiet 30 μL/min, dissociatietijd 300 s; voor regeneratieparameters : voer de naam van de regeneratieoplossing in: Glycine-HCl (pH 2,5), contacttijd: 30 s, debiet: 30 μL/min en klik op Volgende.
    4. Voer in het dialoogvenster Voorbeelden de naam van de peptiden, het molecuulgewicht en de concentraties in en klik op volgende. Wijs in het dialoogvenster Rackpositie de verdunde peptiden toe als individuele monsters van ~120 μL van verschillende concentraties 1 tot 100 μM en ~230 μL Buffer, ~120 μL Buffer en ~1.000 μL Glycine, pH 2.5, aan de posities op het Rack. Klik op Rek uitwerpen en plaats alle injectieflacons. Klik op Volgende en klik in het dialoogvenster Protocol voor uitvoeren voorbereiden op Start, voer een bestandsnaam in en Opslaan (Afbeelding 2).
    5. Klik in de software op het menu Start en selecteer Evaluatie. Kies open het bestand in de software en kies in het vervolgkeuzemenu Fc2-1 om het referentiecel Leeg-afgetrokken actieve sensorgram te analyseren voor de associatie- en dissociatiefasen van de msRBP4 en mutante msRBPR2- en msSTRA6-peptiden.
    6. Klik op de dropdown Kinetics/Affinity knop en kies Surface bound; Als u het dialoogvenster Curven selecteren wilt openen, schakelt u Kolom opnemen in de tabel in en klikt u op Volgende. Selecteer het dialoogvenster Gegevens om lege afgetrokken sensorgrammen weer te geven; klik op Kinetiek en Affiniteit, behoud de standaardparameters en klik op Optie Aanpassen voor curveaanpassing. Inspecteer het tabblad Rapport op evenwichtsdissociatieconstante Kd en Ka of Kop associatiesnelheid en Kd of Kop dissociatiesnelheid. Sla het Kinetics-gegevenssensorgram op in .txt door tabs gescheiden formaat en gebruik de waarden om grafieken te plotten (Afbeelding 3).
    7. Om de affiniteitskinetiekconstante Kd (ligandconcentratie die in evenwicht aan de helft van de receptoren bindt) te bepalen, kopieert en plakt u de gegevenskolommen in het bestand in .txt formaat dat is gegenereerd op basis van de plot Evaluatie naar XY die in de software wordt gebruikt. Klik op Analyseren en niet-lineaire regressie (curve fit), controleer de gegevenskolom en klik op OK. Klik in het parameterdialoogvenster op Bindingsverzadiging en One site Specific binding fitting model met de formule van:
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Waarbij Bmax het maximale aantal bindingsplaatsen is (Response Unit), X de concentratie van de peptiden en Y de binding (Response unit) (Figuur 3).

3. Spectrofotometrie methodologie om het GPCR-11-cis retinale eiwitcomplex (retinylideeneiwit rhodopsine) in retinale lysaten te kwantificeren

  1. Verplaats de vooraf bepaalde groep muizen, bestaande uit volwassen WT-C57BL/6J-muizen, naar de donkere kamer.
  2. Pas de muizen een nacht aan gedurende 12-16 uur, en plaats de muis onder rood licht in een euthanasiekamer en open de CO2 -gasklep op de regelaar tot 5 l/min gedurende ~5 minuten. Zorg voor de dood door druk uit te oefenen op de nek en staart die naar achteren worden getrokken (cervicale dislocatie).
  3. Ontnucleer de oogbollen en homogeniseer de ogen in een ijskoude buffer die 20 mM bis-tris propaan (1,3-bis (tris(hydroxymethyl)methylamino)propaan bevat; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en met proteaseremmer (Materiaaltabel).
  4. Centrifugeer het homogenaat gedurende 15 minuten bij 16000 x g bij 4 °C, gooi het supernatans met in water oplosbare cytosolische eiwitten weg. Re-suspendeer en solubiliseer de gepelleteerde membraan- en membraaneiwitten in een buffer met 20 mM n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM), 20 mM bis-tris propaan (BTP) pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA en met proteaseremmer gedurende 1 uur bij 4 °C op een roterend platform.
  5. Centrifugeer de opnieuw oplosbare membraanfractie gedurende 1 uur bij 16000 x g, 4 °C. Meng het supernatans met 30 μL Rho 1D4-antilichaamkorrels en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C op een roterend platform.
  6. Gebruik een magnetische standaard om de pulldown te scheiden met behulp van kralen, gooi de supernatant weg en was de kralen met buffer 20 mM bis-tris propaan (BTP) pH 7.4, 500 mM NaCl en 2 mM DDM.
  7. Eluleer het rodopsine-eiwit door 5-10 minuten te incuberen bij kamertemperatuur met buffer 20 mM bis-tris propaan (BTP) pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DDM met 0,2 mg/ml 1D4-peptide (-TETSQVAPA) (Figuur 4 en Figuur 5).
  8. Analyseer de eluet op absorptie van 200 nm tot 800 nm met behulp van een rechthoekige, submicro, kwarts, 2 mm opening, 10 mm padlengte, 50 μL cuvet in een snelle scaninstelling met een spectrofotometer.
    NOTITIE: Gebruik alleen kwartscuvetten van hoge kwaliteit (Figuur 4).
  9. Om de kwaliteit te valideren en te bepalen, controleert u de elu en stelt u deze gedurende 1 minuut bloot aan fel licht, en herhaalt u stap 3.8.
  10. Trek de Blank-absorptie af en bereken de verhouding van de geanalyseerde absorptiespectra met absorptie bij 500 nm voor 11-cis retinaal gebonden opsine, 380 nm voor aan licht blootgestelde all-trans retinale gebonden opsine en 280 nm voor ligandvrij Apo-Opsin-eiwit (Figuur 6). De vrije opsine zonder ligand retinal geeft een basislijn absorptie bij 500 nm.
  11. Gebruik de wet van Beer-Lambert om de rhodopsineconcentratie te kwantificeren:
    A=ε· C·l of C=A/ε·l
    Waarbij A de extinctiecoëfficiënt is, ε de molaire extinctiecoëfficiënt (rodopsine ε500 = 40.600 M−1 cm−1 cm−1 cm−1 cm−1) de concentratie is, en l padlengte.
  12. Gebruik voor het kwantificeren van liganded-Opsin in percentages een verhouding van A280/A500.
  13. Plot de Blank-afgetrokken absorptiespectra en bereken de vrije opsin-waarde32.
  14. Bereken de concentratie rodopsine met behulp van de extinctiecoëfficiënt ε500 = 40600 M−1 cm−1. De concentratie van ligandvrij opsine wordt berekend met de wet van Beer-Lambert met behulp van de extinctiecoëfficiënt ε280 = 81.200 M−1 cm−1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantitatieve methoden worden beschreven om eiwit-ligand interacties van vitamine A-membraanreceptoren en fotoreceptoropsine met hun respectievelijke fysiologische liganden te bestuderen. De recombinante muis RBP4 moet tot expressie worden gebracht in E. coli en het gezuiverde eiwit moet worden gebruikt als een geconjugeerde ligand op een SPR-chip. De chemisch gesynthetiseerde RBPR2, STRA6 en mutant S294A RBPR2 "SYL-motief RBP4 interagerende extracellulaire site" van een ~40 ami...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cruciale stappen in het protocol
SPR Methodologie
In silico modellering en dockinganalyse: De voorspelde structuur van RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) en STRA6, en de bekende structuur voor msRBP4 PDB-database (RSCB PDB ID: 2wqa), moeten worden gebruikt voor dockingstudie29,31. Bovendien moeten in-vitromethoden (celcultuur) worden gebruikt om de i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript, of bij de beslissing om de resultaten te publiceren.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Dr. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, OH) voor haar advies over het rodopsine-absorptieprotocol. Dit werk werd ondersteund door een NIH-NEI-subsidie (EY030889 en 3R01EY030889-03S1) en, gedeeltelijk, door de startfondsen van de Universiteit van Minnesota aan G.P.L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine Coupling KitCytivaBR100050
Biacore evaluatiesoftwareBiacore S200Versie 1.1
Biacore Sensor chip CM5CytivaBR100530
Bis tris propaanSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 competente cellenThermo ScientificEC0114
CD-spectrofotometerJascoJ-815 Spectropolarimeter
Glycine HClFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism Modelaanpassing, data-analyse
LB-brothFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistente expressievector Addgene69864-3
Plasmid-zuiveringskitQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysecassetteThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis-spectrofotometerAgilent Cary 60 UV-Vis
PeptidnaamPeptidsequentieHPLC-zuiverheidMassaspectrometrie
Muis Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%Komt overeen
Muis Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%Komt overeen
Muis Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%Komt overeen

Referenties

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Vitamine A-receptorenretinolbindend proteïneoppervlakteplasmonresonantieligandbindingskinetiekrhodopsinkwantificeringfototransductiecascadespectrofotometrische analyseretinoïdehomeostaseopsine-ligandinteractie
Methodologie voor het bestuderen van interacties van vitamine A-membraanreceptoren en opsine-eiwit met hun liganden bij het genereren van het retinylideen-eiwit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.