Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen

6.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67038

⸱

16 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales, 3Lucid Scientific, 4Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 5Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We introduceren een nieuw apparaat voor het meten van zuurstofverbruik (OCR) in retinale pigmentepitheliale (RPE) culturen. Het apparaat kan OCR wekenlang meten op RPE die is gekweekt op standaard celkweekplaten met standaardmedia, terwijl de platen zich in een standaard celcultuurincubator bevinden.

Samenvatting

Het mitochondriale metabolisme is van cruciaal belang voor de normale functie van het retinale pigmentepitheel (RPE), een monolaag van cellen in het netvlies die belangrijk is voor de overleving van fotoreceptoren. RPE mitochondriale disfunctie is een kenmerk van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld, en proliferatieve vitreoretinopathie (PVR), een verblindende complicatie van netvliesloslatingen. RPE-degeneratieve aandoeningen zijn goed gemodelleerd door RPE-cultuursystemen die sterk gedifferentieerd en gepolariseerd zijn om in vivo RPE na te bootsen. Het monitoren van zuurstofverbruikssnelheden (OCR), een proxy voor de mitochondriale functie, was echter moeilijk in dergelijke kweeksystemen omdat de omstandigheden die ideale RPE-polarisatie en differentiatie bevorderen, geen gemakkelijke OCR-metingen mogelijk maken.

Hier introduceren we een nieuw systeem, Resipher, om OCR wekenlang te monitoren in goed gedifferentieerde RPE-culturen, terwijl de RPE op optimale groeisubstraten en fysiologische kweekmedia wordt gehandhaafd in een standaard celcultuurincubator. Dit systeem berekent OCR door de zuurstofconcentratiegradiënt te meten die aanwezig is in de media boven de cellen. We bespreken de voordelen van dit systeem ten opzichte van andere methoden voor het detecteren van OCR en hoe het systeem voor het meten van OCR in RPE-culturen kan worden opgezet. We behandelen belangrijke tips en trucs voor het gebruik van het systeem, voorzichtigheid bij het interpreteren van de gegevens en richtlijnen voor het oplossen van onverwachte resultaten.

We bieden ook een online rekenmachine voor het extrapoleren van het niveau van hypoxie, normoxie of hyperoxie RPE-culturen op basis van de zuurstofgradiënt in de media boven cellen die door het systeem worden gedetecteerd. Ten slotte bespreken we twee toepassingen van het systeem, het meten van de metabolische toestand van RPE-cellen in een PVR-model en het begrijpen hoe de RPE zich metabolisch aanpast aan hypoxie. We verwachten dat het gebruik van dit systeem op sterk gepolariseerde en gedifferentieerde RPE-culturen ons begrip van het mitochondriale metabolisme van RPE zal vergroten, zowel onder fysiologische als onder ziektetoestanden.

Inleiding

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van functioneel postmitotische, sterk gepolariseerde epitheelcellen die een barrière vormen tussen lichtgevoelige fotoreceptoren in het netvlies en hun bloedcirculatie, een capillair bed dat de choriocapillaris wordt genoemd. Net als de rol van glia-ondersteunende neuronen, voert de RPE talloze functies uit om fotoreceptoren te ondersteunen, waaronder fagocytose van de buitenste segmenten van fotoreceptoren, transport van voedingsstoffen en metabole ondersteuning voor fotoreceptoren, en afscheiding van essentiële groeifactoren, allemaal cruciaal voor het behoud van de visuele functie.

Degeneratie van de RPE ligt ten grondslag aan verschillende veel voorkomende degeneratieve aandoeningen van het gezichtsvermogen. Bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een van de meest voorkomende oorzaken van ongeneeslijk verlies van het gezichtsvermogen in de wereld, sterft de RPE af en lijden bovenliggende fotoreceptoren daarom aan een secundaire degeneratie. Bij proliferatieve vitreoretinopathie (PVR) verlaat de RPE in plaats daarvan zijn normaal rustige postmitotische toestand, prolifereert en dedifferentieert in een mesenchymale toestand (een zogenaamde epitheel-naar-mesenchymale overgang [EMT]) met veranderingen in het metabolisme. RPE-dedifferentiatie veroorzaakt een verlies van RPE-ondersteuning aan fotoreceptoren, terwijl het ook een meer fibrotische toestand veroorzaakt. Dit resulteert in zowel fotoreceptordegeneratie als RPE-geïnduceerde littekens, die beide verlies van het gezichtsvermogen veroorzaken 1,2.

Een groot deel van de ondersteuning van de RPE aan fotoreceptoren is metabolisch, en metabole ontregeling is een kritieke factor bij tal van netvliesaandoeningen, waaronder AMD en PVR. De RPE dient als een regulerende barrière tussen fotoreceptoren en hun bron van zuurstof en voedingsstoffen, de choriocapillaris. Dus wat de RPE kiest om te metaboliseren versus wat de RPE kiest om door te gaan van de choriocapillaris naar de fotoreceptoren, bepaalt sterk het metabolisme en de overleving van fotoreceptoren. Talrijke studies hebben aangetoond dat de RPE voor zijn normale gezondheid sterk afhankelijk is van het mitochondriale metabolisme, en dat fotoreceptoren in plaats daarvan sterk afhankelijk zijn van glycolyse3. Dit heeft het concept geïntroduceerd van complementaire, met elkaar verweven metabolische toestanden tussen fotoreceptoren en de RPE. In het bijzonder vermindert de RPE het metabolisme van geprefereerde fotoreceptormetabole substraten en gebruikt in plaats daarvan de bijproducten van het fotoreceptormetabolisme in combinatie met de metabolieten die fotoreceptoren niet consumeren. Bij ziekten zoals PVR en AMD zijn er sterke aanwijzingen dat de RPE meer glycolytisch wordt en minder afhankelijk is van het mitochondriale metabolisme; deze verschuiving naar RPE-glycolyse kan fotoreceptoren van metabolieten die het nodig heeft uithongeren, wat degeneratie veroorzaakt 4,5,6. Gezien hoe onderling afhankelijk RPE en fotoreceptormetabolisme zijn en hoeveel veranderd metabolisme ten grondslag ligt aan netvliesaandoeningen, is er grote belangstelling voor het modelleren en manipuleren van RPE-metabolisme voor therapeutische doeleinden.

Hoewel het bestuderen van het mitochondriaal metabolisme van RPE in vivo ideaal is, kunnen veel aspecten van het mitochondriaal metabolisme van RPE alleen praktisch worden onderzocht in een in vitro kweeksysteem. In de afgelopen decennia is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de richting van high-fidelity RPE-culturen, tot het punt dat de meest zorgvuldig verzorgde RPE-culturen nu worden gebruikt voor celvervangingstherapie in klinische onderzoeken bij mensen7. Om dergelijke high-fidelity culturen te behouden, moet de RPE maandenlang voorafgaand aan het experimenteren op bepaalde substraten in bepaalde media worden gekweekt. Onder deze omstandigheden zijn RPE-culturen maximaal gedifferentieerd en gepolariseerd, waarbij RPE in vivo wordt benaderd. Helaas is er momenteel geen apparatuur beschikbaar die het mitochondriaal metabolisme specifiek van de RPE in vivo kan meten. Hoewel zuurstofmonitoring van het capillaire netwerk van het netvlies in vivo is bereikt met behulp van elektronenparamagnetische resonantie (EPR) oximetrie8, is dit niet mogelijk voor RPE-analyse. Verschillen tussen RPE-metabolisme in vivo en in vitro zijn niet goed beschreven, maar van RPE-culturen is aangetoond dat ze een hoge mitochondriale activiteit hebben, vergelijkbaar met RPE in vivo 3,9, wat suggereert dat significant inzicht in het mitochondriale metabolisme van RPE kan worden verkregen met behulp van high-fidelity RPE-culturen.

Aangezien al het mitochondriale metabolisme leidt tot zuurstofverbruik, is het meten van RPE-zuurstofverbruikssnelheden (OCR) een getrouwe proxy voor het mitochondriaal metabolisme. Het meten van OCR in RPE-culturen was moeilijk, omdat de omstandigheden die maximale RPE-polarisatie en differentiatie bevorderen, vaak nauwkeurige OCR-metingen op lange termijn uitsluiten met de momenteel beschikbare technieken, zoals de Seahorse Analyzer. In dit methodedocument wordt een nieuw apparaat geïntroduceerd, de Resipher genoemd (hierna "het systeem" genoemd), dat continue meting van OCR gedurende weken mogelijk maakt in RPE gekweekt onder omstandigheden die polarisatie en differentiatie maximaal bevorderen. Het gemak waarmee OCR door dit systeem kan worden gemeten in RPE-cultuuromstandigheden die RPE-differentiatie en polarisatie maximaal bevorderen, is uniek onder bestaande OCR-meetapparatuur.

Dit document geeft tips en trucs voor het gebruik van het systeem met RPE-culturen, gevolgd door een demonstratie van twee specifieke toepassingen. Ten eerste wordt RPE EMT, dat PVR nabootst, geactiveerd door blootstelling aan transformerende groeifactor-bèta (TGFβ)1,10,11,12. Het systeem wordt gebruikt om te monitoren hoe het RPE-metabolisme evolueert tijdens het EMT-proces. Ten tweede wordt de rol van hypoxie in het RPE-metabolisme onderzocht met behulp van dit systeem. Hypoxie levert een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van AMD, aangezien de choriocapillaris dunner wordt met de leeftijd van 13,14 jaar. Door dit systeem te combineren met hypoxiekamers kan men het veranderde RPE-mitochondriale metabolisme modelleren met de subtiele hypoxie die gepaard gaat met veroudering. Ten slotte wordt een online rekenmachine geïntroduceerd die gebruikmaakt van Resipher-gegevens om te kunnen bepalen of RPE-culturen zich in hypoxische, normoxische of hyperoxische omstandigheden bevinden. Dergelijke informatie is van cruciaal belang voor het trekken van conclusies over het RPE-metabolisme uit in vitro RPE-cultuurstudies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor protocollen om menselijke primaire of iPSC-RPE-culturen tot stand te brengen, zie de volgende referenties 15,16,17,18. De verwerving en het gebruik van menselijk weefsel voor deze protocollen werden beoordeeld en toegestaan door de Institutional Review Board (HUM00105486) van de Universiteit van Michigan.

1. Algemene toepassing van het systeem op de RPE-cultuur

  1. Plaat humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide-RPE of primaire menselijke RPE-cellen in systeem-compatibele 96-well platen.
    1. Uitgaande van reeds bestaande rijpe culturen die zijn gekweekt op celkweekplaten met 24 putjes, wast u de cellen eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voegt u vervolgens 500 μl 0,25% trypsine-EDTA toe (materiaaltabel). Incubeer gedurende 10-40 minuten in een celcultuurincubator en controleer elke 5-10 minuten totdat de cellen afgerond zijn en bijna klaar om los te komen.
    2. Pipeteer het medium voorzichtig over de cellen om ze los te maken van het celkweekplastic, gevolgd door het overbrengen naar 3x het volume celkweekmedia (1.500 μl per 24-putje), en draai het 5 minuten bij kamertemperatuur in een centrifuge bij 250 × g .
      OPMERKING: Het recept voor RPE-celkweekmedia wordt gedetailleerd beschreven in Tabel 1 en is beschikbaar in eerder gepubliceerde referenties 9,15,16,17,18.
    3. Resuspendeer cellen in RPE-celkweekmedia met 15% foetaal runderserum (FBS) en tel de cellen met een hemocytometer.
    4. Zaai 74.000 cellen voor elk putje van een plaat met 96 putjes (meestal 225-300 × 105 cellen/cm2), na het coaten met zeer gespecialiseerde extracellulaire matrixcoatingsubstraten (Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Zaadcellen alleen op een Resipher-compatibele plaat (Tabel met materialen) en alleen in putjes die overeenkomen met de sonde-array op het sensordeksel (kolommen 3, 4, 9 en 10 voor het 32-kanaals deksel; zie Tabel met materialen). Het sensordeksel van het systeem is verkrijgbaar met sensoren met 4, 32 of 96 kanalen (zie sensorlocaties in afbeelding 1A-D) en een reeks standaard celkweekplaten is compatibel.
    5. Aangezien randputten gevoelig zijn voor verdamping, wat een dramatische invloed heeft op de beschikbaarheid van zuurstof, en dus op OCR-metingen, moet u het zaaien van cellen op alle randputten vermijden (rijen A en H van een plaat met 96 putjes). Voeg bovendien 200 μL steriel water toe aan elk van de lege putjes van de plaat met 96 putjes om verdampingseffecten te verminderen.
    6. Houd de plaat 10 minuten op een stabiel tafeloppervlak om de cellen te laten bezinken; Doe het dan terug in de couveuse. Vervang de media na 24-72 uur en vervang ze door standaard RPE-cultuurmedia met 5% FBS. Minimaal 4 weken kweken, 2x per week van media wisselen.
      OPMERKING: Cellen zijn klaar om te experimenteren wanneer ze gepigmenteerd, geplaveid en zeer compact zijn (Figuur 1E).
  2. Instellen en verwerven van gegevens met het systeem
    1. Plaats het sensordeksel op een lege ontvangerplaat met 96 putjes en plaats deze vervolgens terug in de celcultuurincubator. Lijn het apparaat uit en monteer het op het sensordeksel en sluit het aan op de hub via de meegeleverde USB-kabel. Hierdoor ontstaat een Resipher "sandwich." (Figuur 2A).
    2. Ga naar de Lucid Lab-websitetoepassing (https://lab.lucidsci.com/) en klik op de knop Nieuw experiment in de rechterbovenhoek om een nieuw experiment te maken.
    3. Noem de titel van het experiment en voer eventuele relevante experimentele notities voor het specifieke onderzoek in (bijv. passagenummer van de iPSC-RPE die men gebruikt).
    4. Creëer putcondities en behandelgroepen. Als u bijvoorbeeld de effecten van verschillende serumconcentraties in de media op OCR test, selecteert u Serum in groepsnaam en voert u vervolgens de te gebruiken mediaserumconcentraties in en voegt u meer serumpercentagewaarden toe door op de knop + te klikken. Wijs toe welke putjes een bepaald serumpercentage krijgen en selecteer een kleurenpatroon voor die putjes. Voeg indien nodig meer groepen toe (bijvoorbeeld een andere experimentele variabele om te testen) door op de knop groep toevoegen te klikken.
    5. Definieer de plaatopstelling en selecteer het bijbehorende apparaat en de plaatstijl. Klik op de knop Plaat toevoegen en kies Apparaat; Selecteer het plaattype. Selecteer de behandeling en klik op het bijbehorende putje.
    6. Klik op de knop Nu starten om het experiment te starten. Controleer of de indicator op de website en de LED op de Hub continu groen branden.
    7. Laat het systeem 15-60 minuten draaien om ervoor te zorgen dat elke sensor goed is gekalibreerd en atmosferische zuurstof nauwkeurig detecteert, die een concentratie van ~200 μM moet hebben in een volledig bevochtigde celcultuurincubator met 5% CO2 (Figuur 2Bi).
      OPMERKING: Als een van de sensoren meer dan 20% afwijkt van het gemiddelde van de andere sensoren in een standaard celcultuurincubatoropstelling, overweeg dan om dat goed uit te sluiten in de gegevensanalyse, aangezien de sensor defect is (Afbeelding 2Bii).
      OPMERKING: Als alle sensoren meer dan 20% afwijken van het gemiddelde van de andere sensoren en van de verwachte atmosferische O2 gerapporteerd als 200 μM in een standaard celcultuurincubatoropstelling, is het sensordeksel te vaak gebruikt; vervang deze door een nieuw sensordeksel (Figuur 2Biii).
      OPMERKING: Het verkrijgen van de O2-metingen in de lucht voordat een experiment wordt gestart, verbetert het oplossen van problemen achteraf aanzienlijk. Als een bepaald putje als een uitbijter verschijnt nadat een experiment is uitgevoerd en dat putje had een sensor die niet gekalibreerd was, kan het probleem bij de sensor liggen, niet bij de biologische replicatie.
    8. Verwijder het apparaat van het sensordeksel (maar koppel de USB-kabel niet los van het apparaat). Plaats het apparaat ondersteboven in de couveuse zodat de motor op het apparaat kan resetten. Gebruik het apparaat pas opnieuw als alle motorgeluiden zijn gestopt (ongeveer 20-30 s).
      NOTITIE: Het is belangrijk om het apparaat tijdens een experiment te allen tijde via de USB-kabel verbonden te houden met de hub, zelfs als het apparaat van het sensordeksel is. Hierdoor kan het apparaat de omgeving van de celcultuurincubator continu bewaken en rapporteren.
    9. Plaats de plaat met het sensordeksel terug in de kap van de celcultuur, samen met een plaat met 96 putjes met de RPE-culturen. Vervang de media in de plaat met RPE-culturen met dezelfde media en hetzelfde volume voor alle putjes om basislijn OCR-waarden voor elk putje te verkrijgen. Zorg ervoor dat u alle putten zonder RPE vult met steriel water om verdamping te voorkomen.
      OPMERKING: Over het algemeen raden we 60-100 μL RPE-kweekmedia per 96-put aan, op basis van gegevens die aantonen dat lagere mediavolumes leiden tot snelle uitputting van voedingsstoffen, maar hogere mediavolumes leiden tot onbedoelde hypoxie9.
    10. Breng het sensordeksel over naar de plaat met celculturen en het standaard (niet-Resipher) deksel op de plaat met celculturen naar de lege ontvangerplaat met 96 putjes om de steriliteit van het standaarddeksel te behouden, die op verschillende punten tijdens het experimenteren nodig zal zijn.
    11. Plaats de plaat met celculturen en het sensordeksel terug in de celcultuurincubator. Nogmaals, lijn het apparaat uit en monteer het op het sensordeksel en sluit het aan op de hub via de meegeleverde USB-kabel (montage van de "sandwich"). Controleer of de indicatoren op de website-interface en de Hub allemaal continu groen branden.
      OPMERKING: O2-concentratiegegevens worden meteen weergegeven, terwijl OCR-gegevens pas verschijnen nadat voldoende O2-gegevens zijn verzameld, ongeveer 1 uur.
    12. Laat het apparaat OCR op elk putje meten gedurende ten minste 12-24 uur om een basis-OCR vast te leggen.
      OPMERKING: Baseline OCR zal verschillen afhankelijk van vele factoren, waaronder het type media dat op cellen wordt toegepast. In figuur 2C hebben standaard RPE-kweekmedia met verschillende hoeveelheden FBS (0%, 5%, 15%) iets andere OCR-waarden. Verder kunnen culturen met meer FBS de mitochondriale activiteit langer volhouden nadat media op cellen zijn aangebracht voordat de OCR daalt als gevolg van uitputting van mitochondriale metabolieten (rechterkant van de curve).
    13. Zodra een basislijn OCR is verkregen, herhaalt u stap 1.2.8-1.2.12, maar verandert u de media op de plaat met RPE-culturen naar de experimentele omstandigheden (meestal ± een medicijn of een vergelijking van verschillende mediaomstandigheden).
      OPMERKING: Routinematige mediawijzigingen kunnen ook op dezelfde manier worden afgehandeld. Telkens wanneer de celcultuurincubator wordt geopend, kunt u een aanzienlijke verstoring van de OCR-metingen verwachten, aangezien deze afhankelijk zijn van temperatuur, vochtigheid, CO2 - concentraties en andere factoren die allemaal tijdelijk worden verstoord door het openen van de couveusedeur. Wanneer het apparaat uit het sensordeksel wordt verwijderd, is het niet nodig om het experiment online te pauzeren. Nadat de deur van de celcultuurincubator is geopend of de media op de plaat die wordt gesondeerd is verwisseld, duurt het over het algemeen 2-4 uur om de zuurstofgradiënt te herstellen en te beginnen met het meten van een nauwkeurige OCR.
    14. Nadat gegevens zijn verkregen, trekt u de basislijn-OCR voor elke put af van de OCR nadat de experimentele voorwaarde is toegepast, om de Delta-OCR te bepalen die door de behandeling wordt geactiveerd.
    15. Nadat het experiment is voltooid, steriliseert en gebruikt u het sensordeksel opnieuw (dat 3-5x kan worden hergebruikt, hoewel de prestaties afnemen bij herhaald gebruik). Om het sensordeksel te steriliseren, dompelt u het hele deksel gedurende 10 minuten onder in 70% ethanol in een celcultuurkap, haalt u het vervolgens uit de onderdompeling en rust u het in de sonde naar boven (vermijd het aanraken van de delicate sondepunten) en laat u ethanol en water volledig verdampen voordat u het sensordeksel op een nieuwe ontvangerplaat met 96 putjes plaatst.
  3. Maak helderveldfoto's om OCR-waarden te normaliseren naar het celnummer.
    OPMERKING: Melanine-accumulatie in RPE vergemakkelijkt de normalisatie van OCR op basis van een eenvoudige telling van celnummers in levende culturen met behulp van een helderveldmicroscoop.
    1. Verwijder het apparaat en plaats het ondersteboven, zoals in stap 1.2.8. Verwissel in de kap van de celcultuur het sensordeksel op de RPE-kweekplaat voor een standaard deksel met 96 putjes.
    2. Maak met een standaard omgekeerde microscoop helderveldfoto's van elk putje.
      OPMERKING: Houd de afbeelding van het gebied één consistent tussen de putten (relatieve locatie in de put en objectiefvergroting).
    3. Plaats in de celcultuurkap het standaard deksel met 96 putjes op de RPE-kweekplaat terug door het sensordeksel en plaats het terug in de incubator voor verdere bewaking.
    4. Tel het celnummer in elk vakje met ImageJ of andere software.
    5. Normaliseer OCR naar celnummer in de verschillende experimentele groepen. Het systeem rapporteert OCR in eenheden van fmol∙(mm2)-1∙s-1-het verbruik per dwarsdoorsnede-eenheidsgebied. Om de OCR per cel te normaliseren, deelt u daarom de OCR door het aantal cellen per mm2 (in plaats van het aantal cellen per putje). Vermenigvuldig op dezelfde manier de OCR die door het systeem wordt gerapporteerd met de dwarsdoorsnede van de put (ongeveer 31mm2 voor een standaardplaat met 96 putjes) om OCR te verkrijgen in eenheden van fmol∙s-1∙well-1.
  4. Controles voor het bepalen van RPE bio-energetische parameters.
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het systeem en de RPE-culturen op voorspelbare manieren reageren op mitochondriale manipulaties, kan men bepaalde kleine moleculen testen die goed ingeburgerd zijn om bepaalde stappen van mitochondriale oxidatieve fosforylering aan te pakken. Deze tests zijn analoog aan de stappen die worden uitgevoerd in een mitochondriale stresstest met behulp van de Seahorse Analyzer10 en bieden een bio-energetisch profiel voor RPE-culturen.
    1. Kweek RPE-cellen in 65 μL standaard RPE-kweekmedia met 5% FBS en meet OCR gedurende 24 uur om een basislijn vast te stellen.
    2. Zuig gekweekte media op en voeg 65 μL standaard RPE-kweekmedia toe met 5% FBS en met mitochondriale ontkoppelaars (3 μM carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon [FCCP] of 500 nM Bam15, Tabel met materialen). 's Nachts incuberen.
      OPMERKING: Mitochondriale ontkoppelaars zouden de OCR aanzienlijk moeten verhogen. Zorg ervoor dat de verhoogde OCR niet gelijk is aan of in de buurt komt van de theoretische maximale diffusiebeperkte OCR van ongeveer 275 fmol∙(mm2)-1∙s-1 voor 65 μL media in standaardkweekomstandigheden. De maximale OCR voor verschillende veelgebruikte mediavolumes is beschikbaar in de sectie Discussie.
    3. Na een nacht incubatie de media opzuigen met mitochondriale ontkoppelaars en vervangen door 65 μL standaard RPE-kweekmedia met 5% FBS. Observeer de plaat nog 24 uur om het herstel van RPE OCR te bepalen na verwijdering van de medicijnen.
    4. Bereken de effecten van ontkoppelaars op OCR door de OCR verkregen na behandeling af te trekken van de OCR verkregen vóór de behandeling (Figuur 3).
      OPMERKING: De toename van OCR met de toevoeging van mitochondriale ontkoppelaars betekent de reserve mitochondriale ademhalingscapaciteit van de cel19.
    5. Om andere mitochondriale parameters te meten die doorgaans worden vastgelegd tijdens de mitochondriale stresstest met een Seahorse Analyzer, voert u dezelfde stappen hierboven uit met de volgende verbindingen (Figuur 4).
      1. Gebruik oligomycine op 1 μM om te beoordelen op ATP-gekoppelde ademhaling.
      2. Gebruik antimycine A en rotenon op 1 μM om te beoordelen op niet-mitochondriale ademhaling.
        OPMERKING: FCCP, oligomycine, antimycine A en rotenon kunnen giftig zijn voor RPE. Als ze significante celdood induceren, zijn OCR-metingen niet nauwkeurig. OCR-metingen mogen dus alleen worden verkregen op een tijdstip waarop er geen duidelijke celdood is, meestal binnen de eerste paar uur nadat de geneesmiddelen zijn toegevoegd (Figuur 4).

2. Het meten van veranderingen in het mitochondriaal metabolisme bij RPE die EMT ondergaat

  1. Volg hetzelfde protocol als beschreven in paragraaf 1.2.
  2. Om EMT te induceren na het verkrijgen van baseline OCR-metingen, voegt u TGF-β2 (10 ng/ml) toe aan RPE-culturen en controleert u OCR gedurende 3 weken. Ververs media elke 2-3 dagen met verse TGFβ2 (Afbeelding 5).
  3. Maak ten minste 2x per week helderveldopnamen zoals in paragraaf 1.3 om er zeker van te zijn dat het celgetal niet verandert. Als de telling verandert, normaliseert u de OCR-waarden naar het celnummer in elk putje.
    OPMERKING: Hetzelfde protocol kan worden gebruikt voor andere inductoren van EMT om OCR-veranderingen op lange termijn gedurende de kweekperiode te volgen terwijl de cellen zich in de incubator bevinden.

3. Het meten van veranderingen in het mitochondriaal metabolisme bij hypoxische RPE

OPMERKING: De toepassing van het systeem onder hypoxische, normoxische of hyperoxische omstandigheden is hetzelfde als sectie 1.2, behalve voor het bewaren van de "sandwich" in een hypoxiekamer (Tabel met materialen) die in een standaard celcultuurincubator is geplaatst.

  1. Boor een gat in het deksel van de hypoxiekamer om de USB type-c-kabel door te monteren en dicht deze af met siliconen of stopverf (Figuur 6A).
  2. Monteer het sensordeksel met de celkweekplaat in de kap en breng ze over naar de hypoxiekamer.
  3. Plaats de "sandwich" (bord, sensordeksel, apparaat) in de hypoxiekamer. Plaats ook in de hypoxiekamer een petrischaal met steriel water om de luchtvochtigheid op peil te houden. Plaats ten slotte een draagbare O2-sensor in de hypoxiekamer (Tabel met materialen). De instelling wordt weergegeven in afbeelding 6A.
  4. Sluit de kamer af en sluit deze aan op een gasfles met een hypoxische concentratie van O2 en een standaard celcultuurconcentratie van CO2 (bijv. 1% O2 en 5% CO2 ).
  5. Ververs de lucht in de hypoxiekamer langzaam met de 1% O2/5% CO2 -lucht in de cilinder totdat de zuurstofsensor de gewenste O2-concentratie aangeeft, meestal ergens tussen 1% en 10%.
    NOTITIE: De draagbare O2-sensor heeft tijd nodig om in evenwicht te komen, dus gas uit de cilinder moet langzaam in de hypoxiekamer worden toegevoegd.
  6. Sluit de inlaat- en uitlaatkleppen van de hypoxiekamer en breng de hele kamer over in de couveuse.
  7. Stel het experiment in en start het zoals in paragraaf 1.2.
    OPMERKING: Het vooraf in evenwicht brengen van media in de hypoxiekamer voordat ze aan cellen worden toegevoegd, kan de tijd verkorten die de celmonolaag nodig heeft om echte hypoxie te ervaren (Figuur 6B).

4. Berekening van deO2-concentratie in de RPE-monolaag om te bepalen of cellen zich in hypoxische, normoxicale of hyperoxische omstandigheden bevinden

OPMERKING: Het systeem meet standaard de O2-concentratie tussen ongeveer 1 en 1.5 mm boven de bodem van de put, ervan uitgaande dat een standaardplaat wordt gebruikt met het bijbehorende aanbevolen sensordeksel voor monolaagcultuur (zie https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Hoewel deO2-concentratie in de monolaag van de cel niet direct wordt gemeten, kunnen gegevens van het systeem worden gebruikt om deO2-concentratie op het niveau van de RPE te schatten. In het bijzonder, wetende dat er een zuurstofgradiënt bestaat tussen de bovenkant van de mediakolom, waar O2 beschikbaar is, en de onderkant van de mediakolom, waar O2 wordt verbruikt, kunnen de diffusiewetten van Fick worden gecombineerd met de gemeten OCR-snelheid om O2-niveaus te extrapoleren op de celmonolaag. Een rekenmachine voor deze schatting is online beschikbaar: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (en in de vorm van een open-source interactief notitieboekje op https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, de broncode van deze rekenmachine is te vinden op https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Zodra de rekenmachine is geopend, voert u het mediavolume in microliters in (bijv. 100 μL).
  2. Voer de verzadigde zuurstofconcentratie in op de lucht-vloeistofinterface (de bovenkant van de mediakolom boven de cellen). Deze waarde is ~185 μM bij standaard atmosferische druk met 5% O2 en 95% luchtvochtigheid.
    OPMERKING: Dit kan ook worden bepaald aan de hand van O2-metingen door systeemsondes in putten die alleen media hebben (zonder cellen op de bodem van de put).
  3. Voer in de Flux-invoer de Flux/OCR in die door het systeem wordt gerapporteerd.
  4. Op basis van deze waarden wordt de steady-state zuurstofconcentratie op elke hoogte in de mediakolom berekend en weergegeven in de grafiek (figuur 7). De x-as van de plot is de hoogte in mm boven de bodem van de put. De y-as is de berekende O2-concentratie op die hoogte (in μM).
  5. De O2-concentratie op de bodem van de put (waar de cellen zich bevinden) wordt gerapporteerd in de regel onder de grafiek.
    OPMERKING: Over het algemeen wordt geschat dat RPE in vivo eenO2-concentratie van 4-9% ziet. Elke 10 μM O2 bij standaard atmosferische omstandigheden komt overeen met ongeveer 1% O2. Normoxie op celniveau is dus ongeveer 40-90 μM van O2. Hoe hoger de mediakolom, hoe lager de O2 zal zijn op het niveau van de RPE monolaag9. Dus als cellen zich in hypoxische omstandigheden lijken te bevinden, kan het mediavolume worden verminderd. Als cellen zich in hyperoxische omstandigheden lijken te bevinden, kan het mediavolume worden verhoogd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De "sandwich"-opstelling voor het Resipher-experiment wordt gedemonstreerd in figuur 2A. Detectiedeksels met 32 sondes die overeenkomen met kolommen 3, 4, 9 en 10 op de plaat met 96 putjes zitten tussen de celplaat en het apparaat. Nadat het apparaat is aangesloten op de hub, activeert het motoren om het sensordeksel op en neer te bewegen, waarbij de O2-concentratie in de mediakolom wordt gemeten op verschillende hoogtes boven de monolaag van de cel (meestal 1-1,5 mm). De O2<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het mitochondriale metabolisme van de RPE speelt een cruciale rol in de pathogenese van veel voorkomende verblindende netvliesaandoeningen, waaronder AMD en PVR. Door het mitochondriaal metabolisme van RPE in vitro te modelleren, kan men de metabolische toestand isoleren van die van de omliggende weefsels, en het weefsel op een gecontroleerde manier onderwerpen aan verschillende ziekte-simulerende beledigingen. Een dergelijke in vitro modellering van het mitochondriale metabolisme van RPE is mogelijk ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Richard A. Bryan en Kin Lo zijn werknemers van Lucid Scientific, dat het Resipher-systeem produceert.

Dankbetuigingen

We danken Drs. Daniel Hass en Jim Hurley voor het idee om de oplosbaarheid van O2 te testen in nieuwe versus geconditioneerde media als controle. We danken Dr. Magali Saint-Geniez voor de redactionele input op het manuscript. We danken Scott Szalay van Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, voor het achteraf uitrusten van de hypoxiekamer met de Resipher USB-kabel. Er werden geen federale fondsen gebruikt voor HFT-onderzoek. De Electronic Services Core wordt ondersteund door P30 EY007003 van het National Eye Institute. Dit werk wordt ondersteund door een onbeperkte afdelingssubsidie van Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. wordt ondersteund door het James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, de E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, een Eversight eye-bank grant, een K08EY033420 grant van het National Eye Institute en steun van Dee en Dickson Brown, evenals de David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. wordt ondersteund door het UNSW Scientia-programma. L.A.K. wordt ondersteund door de Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, een R01EY027739 beurs van het National Eye Institute en het Department of Defense Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium saltSigmaT5516
32-channel Resipher lidLucid ScientificNS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor van Complex III van de elektronentransportketen
BAM15SigmaSML1760-5MGOntkoppelingsmiddel om mitochondriale ademhaling te verhogen
DMSO, celkweekkwaliteitSigma-aldrichD4540-100MLDrager voor het reconstitueren van mitochondriale geneesmiddelen
Extracellulaire matrix coating substrates:
Synthemax II-SC		Corning#3535Extracellulaire matrix voor hfRPE
Extracellulaire matrix coating substrates: VitronectinGibcoA14700Extracellulaire matrix voor iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGOntkoppelingsmiddel om mitochondriale ademhaling te verhogen
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hydrocortison-CyclodextrineSigmaH0396
Hypoxia kamerEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
O2 sensorSensit technology of Forensics DetectorsP100 of FD-90A-O2
Penicilline-StreptomycineGibco15140-122
Recombinant human TGFβ2Peprotech100-35BTransformatiegroeifactor beta-2 om epitheliale-mesenchymale overgang te induceren
RotenonSigmaR8875-1GRemmer van Complex I van de elektronentransportketen
Systeem-compatibele plaatCorning#353072
TaurineSigmaT8691
αMEM (Alpha Modificatie van Eagle's Media)Corning15-012-CV

Referenties

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213(2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922(2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213(2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355(2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Retinaal pigmentepitheelmitochondriële functieRPE-culturencelcultuurincubatorhypoxiekamerbio-energetische profileringRPE-polarisatiezuurstofgradiëntmeting
Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.