Methodenartikel

Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes door meting van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes uit menselijke gezuiverde bloedplaatjes

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 november 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

In dit artikel

Samenvatting

De vorming van procoagulerende bloedplaatjes is gecorreleerd met een verhoogd risico op trombose. Hier wordt een nauwkeurig protocol gepresenteerd voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, bedoeld om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels te kwantificeren, die onderscheidende kenmerken zijn van procoagulerende bloedplaatjes.

Samenvatting

Geactiveerde bloedplaatjes bevorderen de stolling voornamelijk door het procoagulerende fosfolipidefosfatidylserine (PS) bloot te stellen aan hun buitenste membraanoppervlakken en PS-expressieve microvesikels vrij te geven die de oorspronkelijke membraanarchitectuur en cytoplasmatische componenten van hun oorspronkelijke cellen behouden. De toegankelijkheid van fosfatidylserine vergemakkelijkt de binding van belangrijke stollingsfactoren, waardoor de katalytische efficiëntie van stollingsenzymen aanzienlijk wordt versterkt, terwijl de afgifte van microvesikels fungeert als een cruciale bemiddelaar van intercellulaire signalering. Procoagulerende bloedplaatjes spelen een cruciale rol bij de stabilisatie van stolsels tijdens hemostase, en hun verhoogde aandeel in de bloedbaan correleert met een verhoogd risico op trombose. Het is ook aangetoond dat microvesikels van bloedplaatjes rijk zijn aan groeifactoren die wondgenezing en ontstekingsmodulatie bevorderen. Het analyseren van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels met behulp van flowcytometrie brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee vanwege hun kleine omvang en het beperkte aantal positieve gebeurtenissen voor markers van belang. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het afgelopen decennium, blijven methoden voor het beoordelen van de blootstelling aan fosfatidylserine en het vrijkomen van microblaasjes een werk in uitvoering. Helaas bestaat er niet één universeel toepasbaar protocol en moeten verschillende factoren worden geëvalueerd om de meest geschikte methodologie voor elke specifieke toepassing te bepalen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door activering van collageen en/of trombine, om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes te meten die kenmerkend zijn voor procoagulante bloedplaatjes. Dit protocol is ontworpen om de eerste bereiding van bloedplaatjesrijk plasma en de isolatie van gewassen bloedplaatjes te vergemakkelijken. Ten slotte worden de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels gekwantificeerd door middel van flowcytometrie, waardoor prostollingsbloedplaatjes kunnen worden geïdentificeerd.

Inleiding

De vorming van procoagulantia van bloedplaatjes is cruciaal voor het handhaven van hemostase 1,2,3. Dit proces omvat agonist-geïnduceerde expressie van fosfolipiden op het bloedplaatjesmembraan, wat essentieel is voor de assemblage van tenase- en protrombinasecomplexen 1,3,4. Na activering van bloedplaatjes worden ook continu bloedplaatjesmicrovesikels vrijgegeven 5,6. Microvesikels (50 nm tot meer dan 1 μm in diameter) kapselen zowel de membraanstructuur als de cytoplasmatische bestanddelen van de oorspronkelijke cellen in 7,8. Microvesikels zijn belangrijke mediatoren van intercellulaire signalering 9,10 en ook opslagplaatsen van groeifactoren die wondgenezing en ontstekingsmodulatie bevorderen11,12. Er is ook gesuggereerd dat microvesikels 50 tot 100 keer meer procoagulant zijn dan geactiveerde bloedplaatjes13. Met name recent bewijs suggereert dat opgeslagen bloedplaatjes worden geactiveerd, wat leidt tot de productie van microvesikels - dit heeft mogelijke gevolgen voor de praktijk van bloedplaatjestransfusietherapie. De verlengde opslagduur van microvesikels en de verhoogde procoagulerende activiteit maken ze een veelbelovend alternatief voor bloedplaatjes in transfusietoepassingen14.

Er zijn methodologische innovaties doorgevoerd om, direct en indirect, de vorming van procoagulantia van bloedplaatjes te beoordelen bij zowel gezondheids- als ziektetoestanden 4,14,15. Beoordelingen van blootstelling aan fosfatidylserine en afgifte van microvesikels met behulp van gezuiverde bloedplaatjes hebben nieuwe gegevens opgeleverd over hoe procoagulantiaresponsen van bloedplaatjes worden verstoord bij diverse menselijke ziekten 1,4. Dit groeiende onderzoeksveld opent ook wegen voor therapeutische interventies 1,4. De isolatie en analyse van gezuiverde bloedplaatjes uit bloed zijn echter tijdrovend, vereisen gespecialiseerde laboratoriumapparatuur en zijn daarom momenteel niet aanpasbaar voor routinematige klinische diagnostiek16,17. Het analyseren van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes is ook een uitdaging vanwege hun kleine omvang en het aantal positieve gebeurtenissen voor markers van belang18,19.

Flowcytometrie, waarbij gebruik wordt gemaakt van fluorescerende Annexine-V-binding, is sinds de oprichting twee decennia geleden een hoeksteen geweest in de evaluatie van PS-expressie op bloedplaatjes en microvesikels20. Het is algemeen aanvaard bij het onderzoek van procoagulerende bloedplaatjes en microvesikels 21,22. Daarom wordt hier een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat kan worden gebruikt voor de isolatie van gezuiverde bloedplaatjes uit bloedmonsters met behulp van de techniek die is ontwikkeld door groep23 van Cazenave, en de daaropvolgende karakterisering van blootstelling aan fosfatidylserine en afgifte van microblaasjes door flowcytometrie na activering van bloedplaatjes24. Dit protocol zal verdere studie en diepgaande karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes in klinische populaties van belang vergemakkelijken.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen en is goedgekeurd door de Commissie voor ethiek van menselijk onderzoek van het Universitair Ziekenhuis van Bordeaux. Bloedmonsters werden verkregen van gezonde vrijwilligers die geïnformeerde toestemming gaven, en deze monsters werden verwerkt volgens institutionele protocollen. Donoren die stoffen hadden ingenomen die de bloedplaatjesfunctie konden beïnvloeden, werden uitgesloten als dergelijke stoffen binnen 10 dagen voorafgaand aan de experimenten werden ingenomen. Er werd geïnformeerde toestemming verkregen van gezonde vrijwilligers om hun bloed af te nemen en hun gegevens te publiceren. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bloedafname en bereiding van gewassen bloedplaatjes

  1. Verzamel perifeer veneus bloed in verzamelbuisjes die het actieve antistollingsmiddel Tri-natriumcitraat met citroenzuur en dextrose (ACD) bevatten na het weggooien van de eerste 3 ml.
  2. Keer na het verzamelen de buis voorzichtig om om het bloed met ACD te mengen en laat het mengsel 15 minuten op kamertemperatuur rusten voordat u het centrifugeert.
  3. Tel bloedplaatjes met behulp van een geautomatiseerde cellenteller vóór het centrifugeren om de juiste snelheid voor centrifugeren te bepalen (tabel 1). Bereid bloedplaatjesrijk plasma (PRP) voor door centrifugatie bij 250 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) zonder de rem in te drukken om het herstel van bloedplaatjes te optimaliseren.
    OPMERKING: Deze stap produceert drie lagen in het monster: de bovenste laag bevat plasma, bloedplaatjes en een klein deel van de witte bloedcellen; een middelste laag verrijkt met witte bloedcellen; en een onderlaag bestaande uit rode bloedcellen. Breng de PRP voorzichtig over van de bovenste laag in een nieuw conisch buisje van 50 ml om besmetting met rode en witte bloedcellen te voorkomen.
  4. Voeg aan het PRP 1 ml ACD-A (zie tabel 2) en 6,25 μl apyrase per 9 ml toe.
    OPMERKING: Apyrase, bij een concentratie van 0,02 E/ml, breekt sporen van ATP of ADP af die door de bloedplaatjes worden uitgescheiden, waardoor desensibilisatie van ADP-receptoren voor bloedplaatjes wordt voorkomen en de vorm van bloedplaatjes25 behouden blijft. Een prostacycline PGI2-remmer (0,5 μM) kan ook worden opgenomen in combinatie met apyrase om activering van bloedplaatjes te voorkomen.
  5. Bereid de bloedplaatjespellet voor door centrifugatie bij RT bij 1100 x g gedurende 10 min. Zuig het supernatans bevattende bloedplaatjesarme plasma (PPP) op met behulp van een zachte methode, zoals een pasteurpipet, en resuspendeer de pellet in 1 ml wasbuffer (zie tabel 3 en tabel 4). Homogeniseer voorzichtig met een pipet en voeg vervolgens 3-4 ml extra wasbuffer toe.
    OPMERKING: Het calciumgehalte wordt verlaagd om coagulatie met stollingsfactoren in het plasma te voorkomen. In dit stadium is het bloedplaatjesarme plasma volledig verwijderd, waardoor stolselvorming en activering van bloedplaatjes door trombineproductie wordt voorkomen.
  6. Centrifugeer opnieuw bij RT bij 1100 x g gedurende 10 min. Zuig het bovendrijvende middel op en resuspendeer de pellet in 1 ml wasbuffer. Breng 150 μl van de bloedplaatjessuspensie over in een buisje van 1,5 ml voor het tellen van cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller. Resuspendeer de pellet vervolgens met 3-4 ml wasbuffer.
  7. Voer een laatste centrifugatie uit bij 1100 x g gedurende 10 minuten (bij RT). Zuig het supernatans op en resuspendeer de bloedplaatjespellet in een volume reactiebuffer (zie tabel 5 en tabel 6) om een eindconcentratie van 5 x 1011 bloedplaatjes/l te bereiken.
  8. Laat de gewassen bloedplaatjes ten minste 30 minuten rusten voordat u experimenteert, zodat de resterende remmers kunnen afwerken en de bloedplaatjes kunnen acclimatiseren aan de buffer.

2. Voorbereiding van de test

  1. Bereid alle agonisten en fluorochromen in de reactiebuffer voor. Voeg 5 μl trombine toe aan 45 μl buffer (verdunning 1:10) en 5 μl ionofoor aan 495 μl buffer (verdunning 1:500).
    1. Vergelijk voor interne tests niet-geactiveerde bloedplaatjes met die behandeld met enkelvoudige en dubbele agonisten. Voeg in verschillende hoeveelheden 100 μl gewassen bloedplaatjes van 50 x 109 bloedplaatjes/l toe aan: (i) 10 μl reactiebuffer, (ii) 3 μl niet-verdund collageen (eindconcentratie van 30 μg/ml), (iii) 10 μl voorverdund trombine (0,5 IE/ml), (iv) 3 μl niet-verdund collageen + 10 μl voorverdund trombine en (v) 10 μl voorverdunde ionofoor (eindconcentratie van 2 μM), waarvan bekend is dat het de intracellulaire calciumspiegels direct verhoogt, zoals eerder opgemerkt26.
      OPMERKING: Behandeling met een calciumionofoor, zoals A23187 of ionomycine, is van cruciaal belang omdat het uitgebreide fosfolipidemembraanvervorming en verbeterde PS-externalisatie induceert.
    2. Schud elke aliquot voorzichtig met de hand en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Langere agonist-incubatie (30 min) kan een betere differentiatie tussen bloedplaatjespopulaties mogelijk maken tijdens het analyseproces van flowcytometrie.
  2. Voeg 5 μL niet-verdund Annexin-V FITC toe aan elke microbuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
    OPMERKING: Een monoklonaal antilichaam tegen een van de bloedplaatjesspecifieke receptoren, GPIX (CD42b) of αIIb-integrine (CD41, GPIIb), kan ook worden opgenomen om bloedplaatjescellen beter te identificeren.
  3. Voeg 500 μL reactiebuffer toe om het proces te stoppen en ga verder met de analyse van het monster met behulp van een flowcytometer.

3. Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes en microvesikels door middel van flowcytometrie (FC)

OPMERKING: Gebruik voor een betrouwbare analyse van de bloedplaatjesfunctie een flowcytometrie (FC)-instrument dat is geconfigureerd volgens vastgestelde normen27. Het instrument moet in staat zijn om forward scatter (FSC) en ten minste één fluorescentiesignaal te detecteren. Stel de lichtverstrooiings- en fluorescentiedetectoren in op logaritmische versterking. Verdun de monsters op de juiste manier voor FC om ervoor te zorgen dat alleen individuele bloedplaatjes worden geteld met een verminderde gegevensverzamelingssnelheid.

  1. Stel de flowcytometer in op een 'langzame' flowsnelheid met een drempel van minimaal 10.000 bloedplaatjes. Bewaak de fluorescentie-emissie met behulp van een doorlaatfilter voor FITC.
  2. Poort de bloedplaatjespopulatie af met behulp van voorwaartse verstrooiing (FSC). Onderzoek bloedplaatjes en vrijgekomen microvesikels op basis van hun grootte. Gebruik dichtheidsdiagrammen om bloedplaatjes en vrijgekomen microvesikels te identificeren voor zowel rustende als gestimuleerde bloedplaatjes; Analyseer elke gated populatie afzonderlijk.
  3. Onderscheid procoagulerende bloedplaatjes volgens de FL1-as. Plaats de negatieve afsnijding uiterst rechts van de bloedplaatjespopulatie in rusttoestand (d.w.z. in aanwezigheid van een reactiebuffer). Classificeer na activering van de bloedplaatjes alle gebeurtenissen die rechts van deze grens zijn gelokaliseerd als bloedplaatjes die fosfatidylserine blootstellen.
  4. Differentieer microvesikels, die kleiner zijn dan bloedplaatjes, door hun unieke lichtverstrooiingseigenschappen. Stel de grenswaarde in op de laagste FSC-waarde die is waargenomen in de bloedplaatjespopulatie in rust. Classificeer na activering alle fosfatidylserine-positieve voorvallen die onder deze drempel vallen als microblaasjes.
    OPMERKING: Houd rekening met individuele variatie in de grootte van de bloedplaatjes door indien nodig de afsnijwaarde aan te passen. Zorg ervoor dat er minder dan 1% van de microvesikels aanwezig is in rusttoestand.

Resultaten

Kwantificering van procoagulerende bloedplaatjes en microvesikels wordt bereikt met behulp van Annexin-V-kleuring, waarbij ten minste 50.000 gebeurtenissen per monster worden geregistreerd. Zoals vermeld in stap 2.2, werden bij aanvang bloedplaatjesmetingen uitgevoerd van monsters die waren geïncubeerd met reactiebuffer, zoals weergegeven in figuur 1A. De grootte van bloedplaatjes werd gemeten met behulp van de mediane voorwaartse verstrooiing (FSC) -waarde. Hoewel FSC wordt beïnvloed door verschillende factoren, blijft het een veelgebruikte proxy voor het schatten van de celgrootte, inclusief die van bloedplaatjes. Dichtheidsgrafieken van het gebied (figuur 1A) werden gebruikt om rustende bloedplaatjes en vrijgekomen microvesikels te identificeren en te poorten.

In het geval van niet-geactiveerde bloedplaatjes vertoonde minder dan 2,9% fosfatidylserine (PS) zoals bepaald door Annexin-V-kleuring. Na activering van gewassen bloedplaatjes met alleen collageen of in combinatie met trombine of calciumionofoor, was er een waarneembare toename van de blootstelling aan PS. Collageen alleen veroorzaakte een toename van 26,7% in PS-positieve bloedplaatjes. Trombine had minimale effecten op de blootstelling aan PS (9,1%), maar in combinatie met collageen verhoogde het het percentage PS-blootgestelde bloedplaatjes tot 36,2%. Ter referentie: behandeling met 2 μM ionofoor resulteerde in 49,6% van de bloedplaatjes die procoagulant werden.

Figuur 1 illustreert dat het basisaandeel microvesikels van gewassen bloedplaatjes bij een gezond individu minimaal was (0,3%). Hoewel trombine en collageen de vorming van microvesikel minimaal verhoogden, was het alleen met de combinatie van collageen en trombine dat de vorming van microvesikel significant toenam (Figuur 1D; 11,4%). Het toevoegen van 2 μM ionofoor resulteerde in 44,0% van de microvesikels gevormd door controlebloedplaatjes die PS-exposerend waren.

Figuur 2 geeft informatie over de variatie, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid die van dit proces kunnen worden verwacht.

figure-results-1
Figuur 1: Blootstelling aan PS en vorming van microblaasjes in rustende en geactiveerde controleplaatjes. Bloedplaatjes waren geactiveerd of niet-geactiveerd (rust) (A), met 30 μg/ml collageen (B), met 0,5 E/ml trombine (C), met combinaties van collageen en trombine (D) met 2 μM ionofoor. Representatieve dotplots geven de bloedplaatjesgrootte weer (voorwaartse verstrooiing (FSC-log)) versus Annexin-V-binding. Horizontale en verticale lijnen (E) geven de bloedplaatjes-negatieve populatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van blootstelling aan PS en vorming van microblaasjes na incubatie met ionofoor. Analyse van blootstelling aan PS en vorming van microblaasjes na incubatie met 2 μM of 5 μM ionofoor in gewassen bloedplaatjes, behandeld of onbehandeld met citraat (een calciumchelator): (A) van 4 verschillende gezonde controles; (B) van één gezonde controlegroep, 5 keer herhaald; en (C) van twee gezonde controles die zijn voorbereid door twee verschillende technici. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aantal bloedplaatjes in volbloed (10,9 per ml)Relatieve middelpuntvliedende krachten (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tabel 1: Relatieve middelpuntvliedende krachten voor de bereiding van bloedplaatjesrijk plasma in relatie tot het aantal bloedplaatjes in volbloed.

ReagensAantal
Citroenzuurmonohydraat (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 gr
Trinatriumcitraatdihydraat (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)180 gr
glucose (C6H12O6, 136 mM)24,6 gr
De pH van de oplossing mag niet worden aangepast. Houd de oplossing op 4 °C.

Tabel 2: Bereiding van een 1 L waterige oplossing van zuur-citraat-dextrose (ACD).

ReagensAantal
Citroenzuurmonohydraat (C6H8O7. H2O, 36 mM)7,56 gr
NaCl (103 mM)6 gr
NaOH4 gr
MgCl2,6 uur2O (1 mM)0,203 gr
Stel de pH in op 6,5. Houd de oplossing op 4 °C.

Tabel 3: Bereiding van de voorraadoplossing van de wasbuffer.

ReagensAantal
30% runderserumalbumine (BSA)583 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glucose40 mg
Apyrase31,5 μL

Tabel 4: Bereiding van een 50 ml tijdelijke oplossing van wasbuffer uit de voorraadoplossing.

ReagensAantal
NaCl (137 mM)8 gr
KCl (2,7 mM)0,2 gr
MgCl2,6 uur2O (1 mM)0,203 gr
HEPES (5 mM)1,19 gr
NaHCO3 (12 mM)1 gr
NaH2PO4,2H 2O; 0,3 mM0,05 gr
Stel de pH in op 7,4. Houd de oplossing op 4 °C.

Tabel 5: Bereiding van een voorraadoplossing van de reactiebuffer.

ReagensAantal
30% runderserumalbumine (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glucose50 mg

Tabel 6: Bereiding van een 50 ml tijdelijke oplossing van reactiebuffer uit de voorraadoplossing.

Discussie

Recente studies over procoagulerende bloedplaatjes hebben hun veranderingen tijdens verschillende ziekten aan het licht gebracht 1,28,29, wat het belang van hun gedetailleerde analyse en karakterisering onderstreept 30,31,32. Hoewel de huidige klinische tests voor het beoordelen van de vorming van procoagulantia van bloedplaatjes beperkt zijn, is de klinische belangstelling de afgelopen twee decennia aanzienlijk toegenomen. Het calciumafhankelijke scramblase TMEM16F (ANO6) is bijvoorbeeld betrokken bij blootstelling aan procoagulans fosfatidylserine (PS)33. Varianten van TMEM16F zijn geassocieerd met het syndroom van Scott 33,34,35, een zeldzame bloedingsstoornis die wordt gekenmerkt door verminderde fosfolipidenvervorming en verminderde trombinevorming in geactiveerde bloedplaatjes 36. Bovendien worden verhoogde procoagulerende bloedplaatjesspiegels in verband gebracht met trombotische beroertes en coronaire hartziekte, wat interesse wekt in therapieën om de procoagulantie-activiteit van bloedplaatjes te beteugelen37. Van de methoden die momenteel beschikbaar zijn om de vorming van procoagulerende bloedplaatjes te evalueren, is de beoordeling van de blootstelling aan PS door Annexin-V-binding en het vrijkomen van microvesikels een van de meest gebruikte38,39.

Het hier beschreven protocol maakt de isolatie van door mensen gezuiverde bloedplaatjes en de karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes mogelijk door de blootstelling aan PS en de afgifte van microblaasjes te meten met behulp van flowcytometrie. Het is van cruciaal belang om gezonde vrijwilligers te adviseren zich gedurende ten minste 10 dagen vóór bloedafname te onthouden van medicijnen die de bloedplaatjesfunctie kunnen beïnvloeden. Bloedafname vereist zorg om adertrauma of een te trage doorstroming te voorkomen, omdat deze de aanmaak van trombine en de activering van bloedplaatjes kunnen induceren. Natriumcitraat-antigecoaguleerd bloed wordt niet aanbevolen voor het bereiden van gewassen bloedplaatjes, omdat restcalcium de aanmaak van trombine en activering van bloedplaatjes tijdens centrifugatie mogelijk kan maken17. ACD-antigecoaguleerd bloed heeft een pH van 6,5 en een hogere citraatconcentratie van 22 mmol/L in vergelijking met de pH van citraat-antigecoaguleerd bloed van 7,5 en een citraatconcentratie van 13 mmol/Lcitraatconcentratie 17. De zure pH en de verlaagde extracellulaire calciumconcentratie in ACD-geanticoaguleerd bloed voorkomen aggregatie van bloedplaatjes24. Het minimaliseren van de trombinevorming tijdens het verzamelproces is essentieel. Een niet-traumatische venapunctie met ten minste een naald van 21 G wordt aanbevolen om veneuze stasis of overmatige druk te voorkomen. Bovendien moeten de eerste paar milliliter bloed worden weggegooid om besmetting met weefselfactoren en sporen van trombine te voorkomen. Het minimaliseren van de tijd tussen venapunctie en monsterverwerking is ook essentieel, aangezien langdurige bloedopslag kan leiden tot activering van bloedplaatjes, waardoor de blootstelling aan PS en de afgifte van microblaasjes toeneemt40. Tijdens de gehele bereidingsprocedure van bloedplaatjes moet specifieke aandacht worden besteed aan het voorkomen van spontane preactivering van de bloedplaatjes, die tijdens het bereidingsproces zelf kan optreden41,17. Bovendien vereist het isoleren van gezuiverde bloedplaatjes een zorgvuldige vermijding van besmetting door andere bloedcellen17. Dit houdt in dat het supernatans na het centrifugeren van de bloedplaatjes grondig wordt opgezogen om een schone bereiding te garanderen. Omdat de pellet meestal zichtbaar is en stevig aan de buiswand vastzit, kan het supernatans gemakkelijk worden opgezogen met behulp van een pipetpunt.

Tijdens centrifugatiespoelstappen worden bloedplaatjes geresuspendeerd in een buffer die fysiologische omstandigheden simuleert. Door gewassen bloedplaatjes in een fysiologische buffer te gebruiken, worden ze geïsoleerd van anticoagulantia en plasma, waardoor door trombine gemedieerde artefacten worden voorkomen. Hoewel bloedplaatjesrijk plasma (PRP) een snelle methode is om hoge bloedplaatjesconcentraties te verkrijgen, wordt het gebruik ervan voor functionele studies beperkt door door anticoagulantia geïnduceerde pH-veranderingen en het extracellulaire calcium- en eiwitgehalte van het plasma, die de activering van bloedplaatjes kunnen beïnvloeden17. Bovendien zouden hoge niveaus van PS die worden gegenereerd tijdens de activering van bloedplaatjes voldoende zijn om de assemblage van plasmastollingscomplexen, de daaropvolgende trombine-uitbarsting en de vorming van stolsels bij PRP te bevorderen, waardoor experimentele resultaten niet kunnen worden geïnterpreteerd. Daarentegen wordt resuspensie in een buffer die apyrase bevat aanbevolen om de bloedplaatjesfunctionaliteit te behouden door desensibilisatie van purinerge receptoren door de afbraak van ATP en ADPte voorkomen 42,43. Hoewel herhaalde centrifugeer- en wasstappen meer tijd vergen, bieden suspensies van gewassen bloedplaatjes die volgens deze methode zijn bereid het voordeel van een grotere stabiliteit (5-8 uur) in vergelijking met gecitreerde PRP-preparaten, die niet langer dan 1-3 uur23 stabiel zijn.

Deze studie toont de haalbaarheid en eenvoud aan van het kwantificeren van microvesikels door middel van flowcytometrie. De productie van microblaasjes kan echter verloren gaan in het puin en het geluid van de machine. Daarom is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de flowcytometer uitgebreid is gereinigd en dat de gebruikte buffers geen verontreinigende deeltjes bevatten die kunnen leiden tot een hoge achtergrond tijdens flowcytometrieanalyse. Als alternatief kunnen gespecialiseerde flowcytometers met detectiemogelijkheden voor kleine deeltjes worden gebruikt om de vorming van microblaasjes te identificeren. De binding van fluoresceïne-gelabeld Annexin-V als functie van het PS-membraangehalte werd ook bestudeerd, waarbij de cruciale rol van voldoende calciumconcentraties in de buffer voor Annexin-V-binding en procoagulerende bloedplaatjesrespons werd benadrukt44.

Gegevens die de stabiliteit van bloedplaatjesmonsters in de loop van de tijd ondersteunen, zijn momenteel schaars. Verschillende laboratoria hebben dit probleem aangepakt door monsters te stabiliseren door toevoeging van een fixeeroplossing, zoals een formaldehydehoudende buffer. Het toevoegen van een fixeermiddel aan vers verzamelde bloedplaatjesmonsters heeft het voordeel dat monsters worden bewaard voor latere analyse. Niettemin kan formaldehydefixatie een kunstmatig verhoogde Annexin-V-binding veroorzaken. Rochat et al. toonden aan dat fixatie van bloedplaatjes met een lageconcentratie, calciumvrije formaldehyde-oplossing het aandeel Annexin-V-positieve bloedplaatjes niet verandert45. Onderzoekers die fixatie nodig hebben, moeten echter hun specifieke protocol optimaliseren om ervoor te zorgen dat het geen kunstmatig veranderde resultaten veroorzaakt. Anders moeten de monsters onmiddellijk worden verwerkt.

Een andere route die ook kan leiden tot blootstelling aan PS is intrinsieke apoptose, een proces waarvan bekend is dat het de levensduur van bloedplaatjes in de bloedsomloop reguleert46. Het activeren van pro-apoptotische BAK- en BAX-eiwitten resulteert in caspase-activering, wat de externalisatie van PS bevordert, wat leidt tot de in vivo klaring van bloedplaatjes. Onlangs is gesuggereerd dat een andere bloedplaatjesoppervlaktemarker, P-selectine/CD62P, naast Annexin-V, wordt gebruikt om procoagulantia te onderscheiden van apoptotische bloedplaatjes47. Procoagulerende bloedplaatjes zullen naar verwachting positief zijn voor zowel PS- als P-selectine-markers, terwijl apoptotische bloedplaatjes positief zijn voor Annexin-V maar negatief voor P-selectine. Tijd is echter ook een onderscheidende factor tussen procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes47. Het genereren van procoagulerende bloedplaatjes in vitro is een snel proces, terwijl intrinsieke apoptose een langzamer proces is en uren duurt48. In deze context is het gebruik van extra markers om procoagulerende bloedplaatjes te beoordelen niet nodig, wat de methode vereenvoudigt. Aanhoudende verhogingen van intracellulaire Ca2+ en procoagulante bloedplaatjesvorming treden binnen enkele minuten op met zeer sterke agonisten, zoals ionofoor of gecombineerde activering met collageen en trombine, terwijl een BCL-XL-remmer (of BH3-mimeticum) de vorming van apoptotische bloedplaatjes op gang brengt door pro-apoptotische BAK en BAX te activeren, waardoor mitochondriale permeabilisatie van het buitenmembraan, cytochroom C-afgifte ontstaat, en caspase activering49.

Concluderend vergemakkelijkt het hier beschreven protocol de isolatie van gezuiverde bloedplaatjes en hun daaropvolgende karakterisering voor procoagulerende activiteit met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en flowcytometrie. Deze procedure maakt de weg vrij voor toekomstig onderzoek naar procoagulerende bloedplaatjes in bloedmonsters van patiënten, met mogelijke toepassingen in de klinische praktijk, zoals de diagnose van het zeldzame Scott-syndroom50.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict te hebben.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A bloedopnamebuisjesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumine 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citroenzuur monohydraatMerck5949-29-1
Collageen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionofoor Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
NatriumwaterstofcarbonaatMerck6329NaHCO3
Trombine Hyphen BiomedEZ 006 A
Trinatriumcitraat dihydraat Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Referenties

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Procoagulerende bloedplaatjesactivering van bloedplaatjesflowcytometriegewassen bloedplaatjesbloedplaatjesrijk plasmaisolatie van bloedplaatjescollageenactivatietrombineactivatie

Gerelateerde artikelen