Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes door meting van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes uit menselijke gezuiverde bloedplaatjes

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 november 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

In dit artikel

Samenvatting

De vorming van procoagulerende bloedplaatjes is gecorreleerd met een verhoogd risico op trombose. Hier wordt een nauwkeurig protocol gepresenteerd voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, bedoeld om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels te kwantificeren, die onderscheidende kenmerken zijn van procoagulerende bloedplaatjes.

Samenvatting

Geactiveerde bloedplaatjes bevorderen de stolling voornamelijk door het procoagulerende fosfolipidefosfatidylserine (PS) bloot te stellen aan hun buitenste membraanoppervlakken en PS-expressieve microvesikels vrij te geven die de oorspronkelijke membraanarchitectuur en cytoplasmatische componenten van hun oorspronkelijke cellen behouden. De toegankelijkheid van fosfatidylserine vergemakkelijkt de binding van belangrijke stollingsfactoren, waardoor de katalytische efficiëntie van stollingsenzymen aanzienlijk wordt versterkt, terwijl de afgifte van microvesikels fungeert als een cruciale bemiddelaar van intercellulaire signalering. Procoagulerende bloedplaatjes spelen een cruciale rol bij de stabilisatie van stolsels tijdens hemostase, en hun verhoogde aandeel in de bloedbaan correleert met een verhoogd risico op trombose. Het is ook aangetoond dat microvesikels van bloedplaatjes rijk zijn aan groeifactoren die wondgenezing en ontstekingsmodulatie bevorderen. Het analyseren van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels met behulp van flowcytometrie brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee vanwege hun kleine omvang en het beperkte aantal positieve gebeurtenissen voor markers van belang. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in het afgelopen decennium, blijven methoden voor het beoordelen van de blootstelling aan fosfatidylserine en het vrijkomen van microblaasjes een werk in uitvoering. Helaas bestaat er niet één universeel toepasbaar protocol en moeten verschillende factoren worden geëvalueerd om de meest geschikte methodologie voor elke specifieke toepassing te bepalen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door activering van collageen en/of trombine, om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes te meten die kenmerkend zijn voor procoagulante bloedplaatjes. Dit protocol is ontworpen om de eerste bereiding van bloedplaatjesrijk plasma en de isolatie van gewassen bloedplaatjes te vergemakkelijken. Ten slotte worden de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels gekwantificeerd door middel van flowcytometrie, waardoor prostollingsbloedplaatjes kunnen worden geïdentificeerd.

Inleiding

De vorming van procoagulantia van bloedplaatjes is cruciaal voor het handhaven van hemostase 1,2,3. Dit proces omvat agonist-geïnduceerde expressie van fosfolipiden op het bloedplaatjesmembraan, wat essentieel is voor de assemblage van tenase- en protrombinasecomplexen 1,3,4. Na activering van bloedplaatjes worden ook continu bloedplaatjesmicrovesikels vrijgegeven 5,6. Microvesikels (50 nm tot meer dan 1 μm in diameter) kapselen zowel de membraanstructuur als de cytoplasmatische bestanddelen van de oorspronkelijke cellen in 7,8. Microvesikels zijn belangrijke mediatoren van intercellulaire signalering 9,10 en ook opslagplaatsen van groeifactoren die wondgenezing en ontstekingsmodulatie bevorderen11,12. Er is ook gesuggereerd dat microvesikels 50 tot 100 keer meer procoagulant zijn dan geactiveerde bloedplaatjes13. Met name recent bewijs suggereert dat opgeslagen bloedplaatjes worden geactiveerd, wat leidt tot de productie van microvesikels - dit heeft mogelijke gevolgen voor de praktijk van bloedplaatjestransfusietherapie. De verlengde opslagduur van microvesikels en de verhoogde procoagulerende activiteit maken ze een veelbelovend alternatief voor bloedplaatjes in transfusietoepassingen14.

Er zijn methodologische innovaties doorgevoerd om, direct en indirect, de vorming van procoagulantia van bloedplaatjes te beoordelen bij zowel gezondheids- als ziektetoestanden 4,14,15. Beoordelingen van blootstelling aan fosfatidylserine en afgifte van microvesikels met behulp van gezuiverde bloedplaatjes hebben nieuwe gegevens opgeleverd over hoe procoagulantiaresponsen van bloedplaatjes worden verstoord bij diverse menselijke ziekten 1,4. Dit groeiende onderzoeksveld opent ook wegen voor therapeutische interventies 1,4. De isolatie en analyse van gezuiverde bloedplaatjes uit bloed zijn echter tijdrovend, vereisen gespecialiseerde laboratoriumapparatuur en zijn daarom momenteel niet aanpasbaar voor routinematige klinische diagnostiek16,17. Het analyseren van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes is ook een uitdaging vanwege hun kleine omvang en het aantal positieve gebeurtenissen voor markers van belang18,19.

Flowcytometrie, waarbij gebruik wordt gemaakt van fluorescerende Annexine-V-binding, is sinds de oprichting twee decennia geleden een hoeksteen geweest in de evaluatie van PS-expressie op bloedplaatjes en microvesikels20. Het is algemeen aanvaard bij het onderzoek van procoagulerende bloedplaatjes en microvesikels 21,22. Daarom wordt hier een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat kan worden gebruikt voor de isolatie van gezuiverde bloedplaatjes uit bloedmonsters met behulp van de techniek die is ontwikkeld door groep23 van Cazenave, en de daaropvolgende karakterisering van blootstelling aan fosfatidylserine en afgifte van microblaasjes door flowcytometrie na activering van bloedplaatjes24. Dit protocol zal verdere studie en diepgaande karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes in klinische populaties van belang vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen en is goedgekeurd door de Commissie voor ethiek van menselijk onderzoek van het Universitair Ziekenhuis van Bordeaux. Bloedmonsters werden verkregen van gezonde vrijwilligers die geïnformeerde toestemming gaven, en deze monsters werden verwerkt volgens institutionele protocollen. Donoren die stoffen hadden ingenomen die de bloedplaatjesfunctie konden beïnvloeden, werden uitgesloten als dergelijke stoffen binnen 10 dagen voorafgaand aan de experimenten werden ingenomen. Er werd geïnformeerde toestemming verkregen van gezonde vrijwilligers om hun bloed af te nemen en hun gegevens te publiceren. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bloedafname en bereiding van gewassen bloedplaatjes

  1. Verzamel perifeer veneus bloed in verzamelbuisjes die het actieve antistollingsmiddel Tri-natriumcitraat met citroenzuur en dextrose (ACD) bevatten na het weggooien van de eerste 3 ml.
  2. Keer na het verzamelen de buis voorzichtig om om het bloed met ACD te mengen en laat het mengsel 15 minuten op kamertemperatuur rusten voordat u het centrifugeert.
  3. Tel bloedplaatjes met behulp van een geautomatiseerde cellenteller vóór het centrifugeren om de juiste snelheid voor centrifugeren te bepalen (tabel 1). Bereid bloedplaatjesrijk plasma (PRP) voor door centrifugatie bij 250 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) zonder de rem in te drukken om het herstel van bloedplaatjes te optimaliseren.
    OPMERKING: Deze stap produceert drie lagen in het monster: de bovenste laag bevat plasma, bloedplaatjes en een klein deel van de witte bloedcellen; een middelste laag verrijkt met witte bloedcellen; en een onderlaag bestaande uit rode bloedcellen. Breng de PRP voorzichtig over van de bovenste laag in een nieuw conisch buisje van 50 ml om besmetting met rode en witte bloedcellen te voorkomen.
  4. Voeg aan het PRP 1 ml ACD-A (zie tabel 2) en 6,25 μl apyrase per 9 ml toe.
    OPMERKING: Apyrase, bij een concentratie van 0,02 E/ml, breekt sporen van ATP of ADP af die door de bloedplaatjes worden uitgescheiden, waardoor desensibilisatie van ADP-receptoren voor bloedplaatjes wordt voorkomen en de vorm van bloedplaatjes25 behouden blijft. Een prostacycline PGI2-remmer (0,5 μM) kan ook worden opgenomen in combinatie met apyrase om activering van bloedplaatjes te voorkomen.
  5. Bereid de bloedplaatjespellet voor door centrifugatie bij RT bij 1100 x g gedurende 10 min. Zuig het supernatans bevattende bloedplaatjesarme plasma (PPP) op met behulp van een zachte methode, zoals een pasteurpipet, en resuspendeer de pellet in 1 ml wasbuffer (zie tabel 3 en tabel 4). Homogeniseer voorzichtig met een pipet en voeg vervolgens 3-4 ml extra wasbuffer toe.
    OPMERKING: Het calciumgehalte wordt verlaagd om coagulatie met stollingsfactoren in het plasma te voorkomen. In dit stadium is het bloedplaatjesarme plasma volledig verwijderd, waardoor stolselvorming en activering van bloedplaatjes door trombineproductie wordt voorkomen.
  6. Centrifugeer opnieuw bij RT bij 1100 x g gedurende 10 min. Zuig het bovendrijvende middel op en resuspendeer de pellet in 1 ml wasbuffer. Breng 150 μl van de bloedplaatjessuspensie over in een buisje van 1,5 ml voor het tellen van cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller. Resuspendeer de pellet vervolgens met 3-4 ml wasbuffer.
  7. Voer een laatste centrifugatie uit bij 1100 x g gedurende 10 minuten (bij RT). Zuig het supernatans op en resuspendeer de bloedplaatjespellet in een volume reactiebuffer (zie tabel 5 en tabel 6) om een eindconcentratie van 5 x 1011 bloedplaatjes/l te bereiken.
  8. Laat de gewassen bloedplaatjes ten minste 30 minuten rusten voordat u experimenteert, zodat de resterende remmers kunnen afwerken en de bloedplaatjes kunnen acclimatiseren aan de buffer.

2. Voorbereiding van de test

  1. Bereid alle agonisten en fluorochromen in de reactiebuffer voor. Voeg 5 μl trombine toe aan 45 μl buffer (verdunning 1:10) en 5 μl ionofoor aan 495 μl buffer (verdunning 1:500).
    1. Vergelijk voor interne tests niet-geactiveerde bloedplaatjes met die behandeld met enkelvoudige en dubbele agonisten. Voeg in verschillende hoeveelheden 100 μl gewassen bloedplaatjes van 50 x 109 bloedplaatjes/l toe aan: (i) 10 μl reactiebuffer, (ii) 3 μl niet-verdund collageen (eindconcentratie van 30 μg/ml), (iii) 10 μl voorverdund trombine (0,5 IE/ml), (iv) 3 μl niet-verdund collageen + 10 μl voorverdund trombine en (v) 10 μl voorverdunde ionofoor (eindconcentratie van 2 μM), waarvan bekend is dat het de intracellulaire calciumspiegels direct verhoogt, zoals eerder opgemerkt26.
      OPMERKING: Behandeling met een calciumionofoor, zoals A23187 of ionomycine, is van cruciaal belang omdat het uitgebreide fosfolipidemembraanvervorming en verbeterde PS-externalisatie induceert.
    2. Schud elke aliquot voorzichtig met de hand en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Langere agonist-incubatie (30 min) kan een betere differentiatie tussen bloedplaatjespopulaties mogelijk maken tijdens het analyseproces van flowcytometrie.
  2. Voeg 5 μL niet-verdund Annexin-V FITC toe aan elke microbuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
    OPMERKING: Een monoklonaal antilichaam tegen een van de bloedplaatjesspecifieke receptoren, GPIX (CD42b) of αIIb-integrine (CD41, GPIIb), kan ook worden opgenomen om bloedplaatjescellen beter te identificeren.
  3. Voeg 500 μL reactiebuffer toe om het proces te stoppen en ga verder met de analyse van het monster met behulp van een flowcytometer.

3. Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes en microvesikels door middel van flowcytometrie (FC)

OPMERKING: Gebruik voor een betrouwbare analyse van de bloedplaatjesfunctie een flowcytometrie (FC)-instrument dat is geconfigureerd volgens vastgestelde normen27. Het instrument moet in staat zijn om forward scatter (FSC) en ten minste één fluorescentiesignaal te detecteren. Stel de lichtverstrooiings- en fluorescentiedetectoren in op logaritmische versterking. Verdun de monsters op de juiste manier voor FC om ervoor te zorgen dat alleen individuele bloedplaatjes worden geteld met een verminderde gegevensverzamelingssnelheid.

  1. Stel de flowcytometer in op een 'langzame' flowsnelheid met een drempel van minimaal 10.000 bloedplaatjes. Bewaak de fluorescentie-emissie met behulp van een doorlaatfilter voor FITC.
  2. Poort de bloedplaatjespopulatie af met behulp van voorwaartse verstrooiing (FSC). Onderzoek bloedplaatjes en vrijgekomen microvesikels op basis van hun grootte. Gebruik dichtheidsdiagrammen om bloedplaatjes en vrijgekomen microvesikels te identificeren voor zowel rustende als gestimuleerde bloedplaatjes; Analyseer elke gated populatie afzonderlijk.
  3. Onderscheid procoagulerende bloedplaatjes volgens de FL1-as. Plaats de negatieve afsnijding uiterst rechts van de bloedplaatjespopulatie in rusttoestand (d.w.z. in aanwezigheid van een reactiebuffer). Classificeer na activering van de bloedplaatjes alle gebeurtenissen die rechts van deze grens zijn gelokaliseerd als bloedplaatjes die fosfatidylserine blootstellen.
  4. Differentieer microvesikels, die kleiner zijn dan bloedplaatjes, door hun unieke lichtverstrooiingseigenschappen. Stel de grenswaarde in op de laagste FSC-waarde die is waargenomen in de bloedplaatjespopulatie in rust. Classificeer na activering alle fosfatidylserine-positieve voorvallen die onder deze drempel vallen als microblaasjes.
    OPMERKING: Houd rekening met individuele variatie in de grootte van de bloedplaatjes door indien nodig de afsnijwaarde aan te passen. Zorg ervoor dat er minder dan 1% van de microvesikels aanwezig is in rusttoestand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantificering van procoagulerende bloedplaatjes en microvesikels wordt bereikt met behulp van Annexin-V-kleuring, waarbij ten minste 50.000 gebeurtenissen per monster worden geregistreerd. Zoals vermeld in stap 2.2, werden bij aanvang bloedplaatjesmetingen uitgevoerd van monsters die waren geïncubeerd met reactiebuffer, zoals weergegeven in figuur 1A. De grootte van bloedplaatjes werd gemeten met behulp van de mediane voorwaartse verstrooiing (FSC) -waarde....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Recente studies over procoagulerende bloedplaatjes hebben hun veranderingen tijdens verschillende ziekten aan het licht gebracht 1,28,29, wat het belang van hun gedetailleerde analyse en karakterisering onderstreept 30,31,32. Hoewel de huidige klinische tests voor het beoordelen van de vorming van proco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict te hebben.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A bloedopnamebuisjesBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumine 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Citroenzuur monohydraatMerck5949-29-1
Collageen Stago86924
Glucose Sigma-AldrichG8270
Hepes Sigma-AldrichH3375
Ionofoor Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
NatriumwaterstofcarbonaatMerck6329NaHCO3
Trombine Hyphen BiomedEZ 006 A
Trinatriumcitraat dihydraat Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
αIIb integrin (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Referenties

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Procoagulerende bloedplaatjesactivering van bloedplaatjesflowcytometriegewassen bloedplaatjesbloedplaatjesrijk plasmaisolatie van bloedplaatjescollageenactivatietrombineactivatie
Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes door meting van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes uit menselijke gezuiverde bloedplaatjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.