Methodenartikel

Radiosynthese, kwaliteitscontrole en positronemissietomografie bij kleine dieren Beeldvorming van 68Ga-gelabelde nanomoleculen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67048

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de radiosynthese, formulering, kwaliteitscontrole van een nieuwe radioactief gelabelde sonde (d.w.z. 68Ga-gelabelde nanobody NM-02) en het gebruik ervan voor PET/CT-beeldvorming bij kleine dieren in een xenotransplantaatmodel.

Samenvatting

Positronemissietomografie (PET) en Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) beeldvormingstechnieken bij kleine dieren zijn cruciaal in preklinisch kankeronderzoek, waardoor nauwgezette aandacht nodig is voor radiotracersynthese, kwaliteitsborging en in vivo injectieprotocollen. Deze studie presenteert een uitgebreide workflow die is afgestemd op het verbeteren van de robuustheid en reproduceerbaarheid van PET-experimenten met kleine dieren. Het syntheseproces in het radiochemisch laboratorium met behulp van 68Ga is gedetailleerd en benadrukt strenge kwaliteitscontrole- en borgingsprotocollen voor elke radiotracerproductie. Parameters zoals concentratie, molaire activiteit, pH en zuiverheid worden streng gecontroleerd, in overeenstemming met de normen die van toepassing zijn op studies bij mensen. Deze methodologie introduceert een gestroomlijnde spuitvoorbereiding en een op maat ontworpen 30G-canule voor nauwkeurige intraveneuze injecties bij muizen. Monitoring van de gezondheid van de dieren tijdens het scannen, inclusief temperatuur en hartslag, zorgt voor hun welzijn tijdens de procedure. Doseringen voor PET- en SPECT-scans zijn vooraf bepaald om gegevensverzameling in evenwicht te brengen met het minimaliseren van de blootstelling aan straling voor dieren en onderzoekers. Evenzo maken CT-scans gebruik van voorgeprogrammeerde instellingen om de blootstelling aan straling te beperken, vooral relevant in langetermijnstudies die de behandelingseffecten beoordelen. Door deze stappen te optimaliseren, is de workflow gericht op het standaardiseren van procedures, het verminderen van variabiliteit en het verbeteren van de kwaliteit van PET/SPECT/CT-beeldvorming bij kleine dieren. Deze bron biedt waardevolle inzichten voor onderzoekers die de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van preklinisch onderzoek op het gebied van moleculaire beeldvorming willen verbeteren, en uiteindelijk het veld vooruit willen helpen.

Inleiding

Een onderwerp dat van het grootste belang is, is onderzoek op het gebied van borstkanker. Borstkanker blijft een veel voorkomende vorm van kanker, goed voor ongeveer 1/3van alle vormen van kanker bij vrouwen. De behandeling is afgestemd op de biologische en histologische kenmerken van de tumor en op het stadium van de ziekte. De overlevingskans is over het algemeen goed, tenzij de tumor al is uitgezaaid, in welk geval de 5-jaarsoverleving slechts ongeveer 30%1 is. Andere gynaecologische kankers ondergaan een soortgelijk lot, waarbij eierstokkanker bijvoorbeeld > 5-jaarsoverleving vertoont voor stadium 1-tumoren, maar slechts 15% voor uitgezaaide stadium 4-tumoren 2,3.

Niet-invasieve beeldvorming, met name positronemissietomografie (PET), heeft het kankeronderzoek getransformeerd omdat het ongeëvenaarde inzichten biedt in moleculaire aspecten van tumoren, zoals metabolisme, receptorexpressie en therapeutische respons 4,5,6. Het maakt zowel visualisatie als kwantificering van specifieke metabolische gebieden mogelijk - waardoor niet alleen een nauwkeurige diagnose kan worden gesteld, maar ook het effect van (nieuwe) therapieën op zeer korte tijdstippen kan worden gevolgd. PET maakt het inderdaad mogelijk om respons versus non-respons te evalueren na 1-3 therapiecycli en doet dit beter en sneller in vergelijking met morfologische veranderingen zoals waargenomen door klassieke computertomografie (CT) beeldvorming7. Het niet-invasieve karakter van PET maakt ook longitudinale studies mogelijk.

Elk diermodel vereist maximale standaardisatie om de therapeutische capaciteit van nieuwe (radioactieve) geneesmiddelen grondig te beoordelen, dus de nadruk moet hierop worden gelegd - zowel bij het genereren van het tumormodel als bij de PET-beeldvorming/data-analyse van kleine dieren. Men zou kunnen discussiëren over het beste tumormodel bij dieren (subcutane inoculatie of orthotope implantatie, muizen, menselijke of syngene tumoren, al dan niet vergezeld van routinematige klinische zorg), maar dat zou het doel van deze publicatie te buiten gaan. Verschillende modellen worden door ons gebruikt voor kankerstudies, en het model dat hier wordt beschreven is een relatief eenvoudig subcutaan model.

Kwaliteitscontrole in de radiochemie is van het grootste belang voor de veiligheid van dieren en de doeltreffendheid van de behandeling. Dit heeft niet alleen invloed op het radiofarmacon zelf, maar ook op de productformulering. Er is uitgebreide wetgeving over de productie van radiofarmaca voor klinische toepassingen 8,9 (zie 10 voor een uitgebreid overzicht van de huidige wetgeving en richtlijnen), en verschillende richtlijnen over de eigenschappen van radiofarmaceutica voor preklinisch onderzoek (zie 11 voor een uitgebreid overzicht). We produceren radiofarmaceutica voor zowel klinische als preklinische toepassingen, waardoor de vertaling wordt vereenvoudigd van hoogwaardige kwaliteitscontrole zoals te vinden in syntheses voor klinische toepassingen naar die voor preklinische toepassingen.

Onze onderzoeksfocus ligt op gerichte theranostica, in het bijzonder op humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-positieve kankers. Daarom ontwikkelen we nieuwe radiofarmaceutica om kanker tijdens de behandeling te diagnosticeren en te monitoren. Succesvolle diagnostische radiofarmaca worden ook geëvalueerd als therapeutische verbindingen met behulp van verschillende radio-isotopen. De evaluatie van deze radiofarmaceutica wordt in eerste instantie uitgevoerd in diermodellen, waarbij wordt gestreefd naar klinische vertaling na veelbelovende preklinische resultaten. In dit artikel zullen we de gebruikte protocollen presenteren, geïllustreerd met één radiofarmaceutisch middel, om kwaliteitscontrole en -borging te garanderen, evenals de standaardpraktijk voor intraveneuze injectie bij muizen en PET/CT-scan, om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van preklinisch onderzoek in moleculaire beeldvorming te verbeteren. Het protocol is onderverdeeld in drie verschillende secties: radiochemie (tracersynthese en kwaliteitscontrole), generatie van diermodellen (subcutaan tumormodel) en beeldvorming.

Protocol

Het onderzoeksprotocol voldoet aan de hoogste normen op het gebied van dierenwelzijn en is in strikte overeenstemming met de Richtlijnen Dierenverzorging van het Universitair Ziekenhuis RWTH Aken. We doen er alles aan om de ethische en humane behandeling van alle dieren die bij de onderzoeken betrokken zijn, te waarborgen, en de procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door een Duitse bevoegde autoriteit (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) voor naleving van de Dierenbeschermingswet, in samenhang met de verordening voor de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.

OPMERKING: Een volledige lijst van de apparatuur, materialen en reagentia die tijdens dit onderzoek zijn gebruikt, vindt u in de materiaaltabel. Het is belangrijk op te merken dat de behandeling van 68Ga waar mogelijk met een pipet moet worden gedaan en zeker geen metaal moet bevatten, aangezien het strijkijzer de etiketteringsopbrengst enorm kan verminderen. Dit betekent dat naalden moeten worden vermeden totdat de radiochemische procedures zijn voltooid.

1. Radiochemie

  1. Radiolabeling van NM-02-DOTA-GA met 68Ga
    LET OP: Het protocol omvat de behandeling en manipulatie van radioactieve materialen. Onderzoekers moeten de lokale wetgeving volgen over het omgaan met radioactieve materialen, ALARA-praktijken (zo laag als redelijkerwijs haalbaar), werken met loden afscherming, de directe contacttijd minimaliseren en de maximale afstand aanhouden bij elke stap van blootstelling aan straling. Experimentele procedures moeten worden gecontroleerd met apparatuur voor het detecteren van radioactiviteit.
    1. Elute de 68Ge/68Ga-Generator handmatig of automatisch in 10 ml 0,6 M HCL (1,2 GBq/10 ml). Vang de 68Ga op een PS-H+ cartridge (maat M - 0,8 ml) door het eluaat door de cartridge te leiden. Elueer de PS-H+ SPE-cartridge met in totaal 1 ml 4 M NaCl stapsgewijs en langzaam in een microcentrifugebuis.
    2. Gooi de eerste 0,3 ml van het eluaat weg en vang de rest 0,7 ml op in een andere microcentrifugebuis.
    3. Neem een nieuwe microcentrifugebuis en ga verder met het radioactief labelen van NM-02-DOTA-GA zoals vermeld in het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Het nanobody-chelatorconjugaat (NM-02-DOTA-GA) werd eerder bereid volgens het protocol van de leverancier. Het conjugaat kan in aliquots bij -80 °C gedurende enkele maanden worden bewaard.
    4. Stel de pH van het product in op ongeveer 7 met maximaal 5 μL 3 M NH4OAc.
  2. Kwaliteitscontrole
    1. Meet de activiteit van het geconcentreerde monster in de microcentrifugebuis met behulp van een activiteitsmeter op de juiste instelling (68Ga als isotoop; spuit van 1 ml, 0,1 ml voor geometrie). De radiochemische opbrengst (voor verval gecorrigeerd) moet ten minste 40% zijn.
    2. Bepaal de pH met een pH-teststrip (0-14) door een voldoende hoeveelheid op de pH-teststrip (10-15 μL) te spotten.
    3. Dunnelaagchromatografie (TLC)
      1. Spot 1 μL van het radioactieve labelreactiemengsel op een met silica geïmpregneerde TLC-strip. Laat het aliquot ongeveer 1 minuut drogen. Laat de TLC draaien met citroenzuur als een mobiele fase, voorgevuld voor ongeveer 2-3 mm, in een gesloten TLC-kamer. Haal de TLC-strip uit de kamer wanneer de vloeistof de bovenkant van de strip heeft bereikt.
      2. Plaats de TLC-strip op een radio-TLC-scanner en meet deze volgens het protocol van de fabrikant. Het product moet bij de oorsprong verschijnen (Rf < 0,2), terwijl vrije 68Ga-kationen zullen elueren met het oplosmiddelfront (Rf > 0,9).
      3. Bereken de radiolabelingsopbrengst van de reactie door het radiochromatogram te gebruiken, het geïntegreerde gebied onder de curve (AUC) van Rf 0,0-0,2 te delen door de totale AUC (Rf 0,0-1,0) en te vermenigvuldigen met 100.
    4. Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC)
      1. Zorg ervoor dat de HPLC ten minste 10 minuten heeft gedraaid met het juiste oplosmiddel om alle leidingen onder water te zetten en pas de instelling voor de meting aan. Gebruik de isocratische stroom van een 50:50 mengsel van acetonitril (oplosmiddel A) en een mengsel van 0,9% NaCl-oplossing (980 ml) gecombineerd met trifluorazijnzuur (1 ml) en citraatoplossing (20 ml) als oplosmiddel B. Meet de UV-absorptie bij 280 nm.
      2. Neem 5 μL van het product en verdun het met 15 μL 0,9% NaCl. Injecteer 15 μl van het mengsel in de analytische radioactieve HPLC (kolom 5 μm SEC-s2000 154 Å; debiet: 2 ml/min).
      3. Gebruik de isocratische stroom van een 50:50 mengsel van acetonitril (oplosmiddel A) en een mengsel van 0,9% NaCl-oplossing (980 ml) gecombineerd met trifluorazijnzuur (1 ml) en citraatoplossing (20 ml) als oplosmiddel B. Meet de UV-absorptie bij 280 nm. Er is een kleine verschuiving in retentietijden tussen de UV- en gammakanalen; dit komt door het ontwerp van de HPLC (het gammasignaal wordt in serie geïnstalleerd na de UV-detector).
      4. Bepaal de radiochemische zuiverheid door de pieken in het gammakanaal te integreren. Het product moet zich in het integratiebereik bevinden dat eerder werd bepaald door het niet-radioactief gelabelde nanobody te meten. Integreer daarnaast alle andere pieken in het gammakanaal en evalueer ze als onzuiverheden. De zuiverheid moet >95% zijn.
    5. Endotoxine
      1. Bereid een 1:20 verdunning van het product met een totaal volume van 150 μL met (gecertificeerd) endotoxinevrij water om te verdunnen.
      2. Plaats een wegwerpbare endotoxinepatroon, die in de handel is voorgevuld met alle benodigde reagentia, in de endotoxinetestlezer en laad 25 μl van het verdunde product in elke patroonkamer.
      3. Druk op Play. Het PTS heeft interne positieve en negatieve controles en zal worden opgenomen in het eindverslag. De test duurt ongeveer 15 minuten. Het product wordt als endotoxinevrij beschouwd als het endotoxinegehalte < 8,7 EU/ml is bij Vmax = 20 ml.
    6. Steriliteit achteraf
      1. Na injectie en afname van het kwaliteitsmonster wordt het radiofarmacon in een steriele injectieflacon in de koelkast bij 4 °C bewaard.
      2. Overhandig het monster aan een gecertificeerd instituut voor het analyseren van de steriliteit (intern of een extern bedrijf) als de vrijstellingslimiet van10,5 Bq of 10 Bq/g niet wordt overschreden om een steriliteitstest volgens12 uit te voeren.
  3. Spuitvoorbereiding (één per dier)
    1. Meet de activiteit van het product met behulp van een activiteitenmeter op de juiste instelling (68Ga als isotoop; spuit van 1 ml, 0,1 ml voor geometrie).
    2. Neem 15 MBq van het product (ongeveer 25 μL) in een microcentrifugebuisje en vul het volume met 0,9% NaCl tot 75 μL.
    3. Voeg 50 μl toe aan de spuit en meet deze met een activiteitsmeter op de juiste instelling (68Ga als isotoop; spuit van 1 ml, 0,1 ml voor geometrie). De spuit moet 10 MBq van het product bevatten.
      OPMERKING: Zodra de 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 is gevormd, zijn plastic pipetpunten niet meer nodig bij het hanteren van de 68Ga. Vanaf nu moet u, wanneer in het protocol wordt vermeld dat met een vloeistof wordt omgegaan, een geschikte spuit (1 ml) en naald (27-30 G) gebruiken.

2. Generatie van diermodellen

  1. Huisvesting van dieren
    1. Gebruik vrouwelijke immunodeficiënte Rj: ATHYM-Foxn1nu/nu-muizen op de leeftijd van 6-8 weken (van een commerciële leverancier) voor het ontwikkelen van onderhuidse tumoren. Verblijf bij aankomst alle muizen direct in de dierenkamer en geef minimaal 1 week natransport de tijd om te acclimatiseren.
    2. Huisvest de dieren onder een 12 uur licht/12 uur donker cyclus en zorg voor gratis toegang tot voedsel en water. Houd de kamertemperatuur en relatieve luchtvochtigheid tussen respectievelijk 20-25 °C en 45%-65%.
  2. Voorbereiding van cellen voor implantatie
    1. Begin de celcultuur met 1 x 106 SKOV-3-cellen en voeg 25 ml voorverwarmde DMEM/F12-media verrijkt met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine toe in een T175-celkweekkolf.
    2. Kweek de cellen in een broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 en vervang minimaal 2x per week het complete medium.
    3. Neem 1 week of uiterlijk 1 dag vóór de implantatie van de cel 20 μl medium uit de celkweekkolf om te testen op mycoplasma13. Gebruik alleen mycoplasma-negatieve cellen voor celinjectie.
    4. Zuig op de dag van de celinjectie het volledige medium op en pipetteer 5 ml PBS in de fles. Draai de fles meerdere keren heen en weer om het resterende medium af te wassen.
    5. Voeg 3 ml trypsine toe aan de kolf en incubeer deze gedurende 4 minuten in de incubator bij 37 °C en 5 % CO2 om de cellen te dissociëren. Controleer onder de microscoop met een vergroting van 40x of de cellen zijn losgekomen van de celkweekkolf.
    6. Voeg 7 ml medium toe om de trypsineactiviteit te neutraliseren en breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 50 ml.
    7. Centrifugeer de cellen op 150 x g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur) om een celpellet te krijgen. Verwijder het bovenstaande en voeg 1 ml medium toe om de cellen opnieuw te suspenderen.
    8. Neem 12 μL van de celsuspensie in een microcentrifugebuisje en voeg een gelijke hoeveelheid trypanblauw toe. Laad de hemocytometerkamer met 10 μl van de zorgvuldig gemengde celsuspensie.
    9. Tel de onbevlekte, levensvatbare cellen binnen het gedefinieerde gebied en bereken het celaantal. Stel de celconcentratie in op 5 x 10 media van7 cellen/ml en meng de celsuspensie voorzichtig met 1 ml basaalmembraanmatrix.
    10. Neem 5 x 106 cellen in 0,2 ml celmedia met 50% basaalmembraanmatrix in een insulinespuit van 1 ml voor elke muis. Houd de spuit op ijs tot de injectie om stolling van de basaalmembraanmatrix te voorkomen.
      OPMERKING: Als een muis minder dan 20 g weegt, injecteer dan slechts 150 μl (voor 15-20 g) of 100 μl (voor 10-15 g) van het mengsel. Bij subcutane toepassingen wordt ervoor gezorgd dat het maximale volume van 10 ml/kg lichaamsgewicht dat door de GV-SOLAS wordt aanbevolen, niet wordt overschreden14.
  3. Inenting en opvolging
    1. Injecteer de celsuspensie subcutaan in de flank van het wakkere dier door de nek en staart met één hand vast te zetten. Meestal geven we de voorkeur aan injecties op de linkerflank.
    2. Wacht 10-15 s totdat de basaalmembraanmatrix is uitgehard en verwijder vervolgens de naald.
    3. Bewaak de tumorgroei dagelijks na implantatie met behulp van een digitale schuifmaat om twee loodrechte tumorassen te meten.
    4. Beoordeel met behulp van die metingen de tumorgroei met behulp van het tumorvolume berekend door de formule:
      VT = L × B2 × π / 6
      waarbij VT het tumorvolume is in mm3, L de lengte van de tumor in mm (d.w.z. de grootste van twee loodrechte assen) en B de breedte van de tumor in mm (d.w.z. de kleinste van twee loodrechte assen15). Deze techniek heeft de neiging om het tumorvolume te overschatten, omdat het ook de huid omvat.
    5. De tumormassa beïnvloedt het gewicht van de muis wanneer gemeten op de elektronische weegschaal. Gebruik de volgende formule om het gewicht van het dier te berekenen, gecorrigeerd voor de tumormassa:
      mmuis-T = mmuis - 0,82 × VT
      waarbij mmuis-T het gewicht van de muis is exclusief de tumormassa in g, mmuis het gewicht van de muis volgens de elektronische schaal in g en VT het berekende tumorvolume in mm3 is. Het getal 0,82 g/mm3 is het resultaat van de gemiddelde waarde van een reeks tumoren die zijn geïsoleerd uit eerdere dierproeven, gewogen en hun volume bepaald met behulp van de gegeven formule. Het vertegenwoordigt een gemiddelde tumordichtheid.
    6. Bepaal bovendien hoe groot de tumor is in vergelijking met de muis en controleer de tumorlast met behulp van de volgende formule:
      Tumorlast [%] = (0,82 × VT) / mmuis × 100
      waarbij de tumorlast wordt uitgedrukt als een percentage, komt 0,82 × VT overeen met de tumormassa in g (d.w.z. VT, het berekende tumorvolume in mm3, maal de gemiddelde tumordichtheid), en mmuis is het muisgewicht volgens de schaal in g.
    7. Wanneer de dieren een tumorvolume van meer dan 200 mm3 bereiken, plan ze dan in voor niet-invasieve PET/CT of SPECT/CT, afhankelijk van het experiment.

3. Beeldvorming

  1. Spuitvoorbereiding (op maat gemaakt systeem)
    OPMERKING: De muisstaart is klein; daarom is het gebruik van een canule van 27 G of kleiner vereist (grotere aantallen komen overeen met kleinere naalden). In het geval van vrouwelijke muizen zijn de enige toegankelijke aderen voor bolusinjecties de drie staartaders. Anatomisch gezien ligt de dorsale staartader dichter bij de wervelkolom in vergelijking met de twee laterale aders; Injecteer niet in deze ader om iatrogene botkrabben te voorkomen. Op basis van ervaring levert het gebruik van een 30G-canule de beste resultaten op, omdat er ook toegang kan worden verkregen tot kleinere aderen. Aangezien er geen 30G-katheters te koop zijn, moet dit type met zorg worden gemaakt door de onderzoeker.
    1. Bereid de spuit met de radioactieve tracer voor, afhankelijk van de geplande toedieningsweg. Zorg er bij intraveneuze injecties voor dat een muis van 25 g een maximaal volume van 5 ml/kg lichaamsgewicht toedient; dit betekent een maximaal geïnjecteerd volume van 125 μL.
    2. Om een 30G-katheter voor te bereiden, gebruikt u eerst een 30G-naald en verwijdert u de metalen naaldschacht, met een metalen schaar of door deze weg te buigen van het plastic.
    3. Steek handmatig een PE10-buis met een diameter van 0.3 mm in het deel van de as dat van de naaf is verwijderd. Er moet voor worden gezorgd dat de buis niet wordt geperforeerd.
      OPMERKING: Er kunnen ook andere soorten plastic worden gebruikt; PE10 biedt echter de beste balans tussen wandstijfheid en flexibiliteit.
  2. Intraveneuze injectie
    OPMERKING: Intraveneuze injecties kunnen ook worden gedaan bij wakkere dieren; Als dit echter niet nodig is, moeten de dieren onder isofluraan-sedatie worden geïnjecteerd om de belasting van het proefdier te verminderen.
    1. Vul de 30G-katheter met 0,9% NaCl-buffer of een andere gewenste buffer.
    2. Plaats de muis in een inductiekamer en vul deze continu met een mengsel van zuurstof (of perslucht van medische kwaliteit) en gasvormig isofluraan totdat het dier de oprichtreflex verliest. Gebruik voor inductie 3,5%-5% isofluraan met een zuurstof- of luchtstroom van 0,8 l/min.
    3. Plaats de verdoofde muis onmiddellijk in een eerste ventrale positie op een verwarmingsmat (37-38 °C) terwijl u de isofluraansedatie door een neuskegel nog handhaaft. Controleer de muizen regelmatig op tekenen van oververhitting (bijv. overmatig uitrekken, snelle ademhaling, roodheid van de huid). Gebruik voor het onderhoud van de anesthesie 1,8%-2,5% isofluraan met een zuurstof- of luchtstroom van 0,8 l/min.
    4. Breng een oogzalf aan op de ogen van het dier om uitdroging tijdens de sedatie te voorkomen. Inspecteer beide laterale staartaders en selecteer de beste voor injectie. Er moet rekening worden gehouden met de zichtbaarheid en de diameter van de ader. Voor het beste resultaat draait u de staart lichtjes zodat de geselecteerde ader in contact komt met de verwarmingsmat en laat u de ader 1 minuut verwijden.
    5. Draai de hele muis op de zijligging zodat de geselecteerde ader naar boven komt. Fixeer de punt en basis van de staart met tape.
    6. Neem de 30G-katheter met de dominante hand en plaats voorzichtig de wijsvinger van de niet-dominante hand op de geselecteerde ader om een back-up van bloed binnenin te creëren. Op de plaats van de back-up zal de ader zich verwijden en een kleine bult vormen.
    7. Plaats met de dominante hand de 30G-katheter evenwijdig aan de staart met het gezicht naar de bult op de ader. Beweeg de dominante hand naar voren. Meestal zorgt deze techniek voor een directe venapunctie.
    8. Eenmaal in de ader wordt bloedreflux zichtbaar in de plastic buis. Fixeer de plastic slang om ervoor te zorgen dat de naald tijdens de injectie niet in de ader beweegt. Steek aan het vrije uiteinde van de buis de tracerspuit in die is aangesloten op een naald van 30 G.
      OPMERKING: Wanneer een dynamische verdeling van de tracer moet worden beoordeeld, moeten de volgende punten worden uitgevoerd nadat het dier op het PET-scannerbed is geplaatst en het PET is gestart.
    9. Injecteer de inhoud van de tracerspuit langzaam gedurende ten minste 10 s. Terwijl u de 30G-naald nog steeds aangesloten houdt op het 30G-kathetersysteem, verwijdert u alleen de tracerspuit en sluit u een spuit met 0.9% NaCl-buffer (of een andere gewenste buffer) aan om de katheter door te spoelen. Controleer de ademhaling continu tijdens de injectieprocedure en pas de isofluraanconcentratie aan om ongeveer 1 ademhaling per seconde te behouden.
    10. Verwijder de 30G-katheter uit de staartader en gebruik een steriel katoenen kompres om het bloeden te stoppen.
    11. Om de overgebleven activiteit te meten, meet u de 30G-katheter, de bufferspuit, de lege tracerspuit en het katoenkompres, aangezien ze allemaal kleine hoeveelheden tracer bevatten die het dier niet hebben bereikt.
  3. PET/CT acquisitie
    OPMERKING: Voor 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 worden alle dieren afgebeeld met een PET/CT-systeem voor kleine dieren.
    1. PET acquisitie
      1. Plaats de verdoofde muis in een buikligging op de dierenmand en bevestig deze aan de PET-scanner. Schakel de isofluraanstroom naar de neuskegel op de PET en houd deze op 1,5%-2,5% isofluraan in medische lucht met 0,8 L/min zodat de ademhalingsfrequentie van het dier tijdens de scan tussen de 75 en 50 ademhalingen per minuut ligt.
      2. Bevestig de muis achter zijn nek aan het dierenbed met medische tape. Breng indien nodig nogmaals een oogheelkundige zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging tijdens de sedatie te voorkomen.
      3. Zet het verwarmingskussen in de dierenmand aan op ongeveer 80% vermogen, wat overeenkomt met ongeveer 30 °C.
      4. Stel de acquisitietijd in op 45 minuten en selecteer het interessegebied dat wordt gescand. Selecteer 68Ga als onderzoeksisotoop en start de scan. Voer de hoeveelheid geïnjecteerde activiteit, het tijdstip van injectie en het meettijdstip van de lege spuit in. De positie van een PET-bed is 160 mm, wat lang genoeg is voor een muizenscan van het hele lichaam.
      5. Wanneer een dynamische verdeling van de tracer moet worden beoordeeld, start u eerst de PET-scan, wacht u 30 s op acquisitie en gaat u dan pas verder met de stappen 3.2.9-3.2.10. Laat de katheter in de muis zitten met de bufferspuit eraan bevestigd om verder bloedverlies te voorkomen. De katheter kan aan het einde van de PET worden losgekoppeld, vóór de CT-acquisitie om artefacten te voorkomen.
    2. CT-acquisitie
      1. Koppel het dierenbed los van de PET-scanner en sluit het direct aan op de CT-scanner. Maak indien nodig ook de canule los van de staartader. Na ten minste 30 minuten na de venapunctie is de injectieplaats al gestold, zodat er geen bloeding meer zal optreden.
      2. Schakel de isofluraanstroom naar de neuskegel in de CT-scanner.
      3. Selecteer hetzelfde interessegebied dat moet worden gescand voor de PET-beeldvorming. Selecteer het standaard acquisitieprotocol: 440 μA, 50 kVp, 32 ms belichtingstijd en 1080° rotatie in een spiraalmodus met 960 opnamen/360°; de duur van de CT-scan is ongeveer 7 minuten voor een muizenscan van het hele lichaam.
      4. Beheers de ademhalingsfrequentie en zet het verwarmingskussen in de dierenmand aan. Houd de ademhaling tijdens de scans continu in de gaten en pas de isofluraanconcentratie aan om een ademhalingsfrequentie tussen 75 en 50 ademhalingen per minuut te behouden.

4. Dierenverzorging na beeldvorming

  1. Aan het einde van de scans heeft het dier minimaal 15 minuten nodig om wakker te worden. Om agressie van nestgenoten te voorkomen, houdt u het dier ongeveer 15 minuten alleen in een kooi of totdat het zelfstandig kan lopen totdat het weer in zijn oorspronkelijke huisvestingskooi wordt geplaatst. Gebruik gedurende deze tijd infrarood licht om onderkoeling te voorkomen.
  2. Plaats het dier in eerste instantie op zijn linkerzij (veilige positie) om een hemodynamische schok te voorkomen. Laat de oogzalf zitten, want deze zal door het dier zelf worden verwijderd zodra het wakker is.

5. PET/CT reconstructie

  1. Voer PET-reconstructie uit met behulp van een 3-dimensionale geordende-subset verwachtingsmaximalisatie (d.w.z. OSEM-3D met 30 iteraties) met een energievenster van ± 15% vanaf een piek van 511 keV tot een isometrische voxelgrootte van 0,4 mm in een matrix van 192 × 192 × 384. Pas op CT gebaseerde correcties toe (d.w.z. dempingscorrectie, verstrooiingscorrectie, dode tijd en willekeurige gebeurtenissen) op de PET-reconstructie.
  2. Als een dynamische verdeling van de tracer moet worden beoordeeld, pas dan een reconstructie met meerdere frames toe. De volgende frames kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor een scan van 45 minuten: 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min en 2 x 10 min.
  3. Reconstrueer CT-standaard acquisitieprotocollen met behulp van een iteratief reconstructiealgoritme (d.w.z. ISRA) reconstructieproces tot een isometrische voxelgrootte van 0,2 mm in een matrix van 200 × 200 × 425. Converteer met behulp van software van de leverancier CT-waarden naar Hounsfield-eenheden (HU) met behulp van de formule:
    figure-protocol-1
    waarbij μw de lineaire dempingscoëfficiënt van water is, μa de lineaire dempingscoëfficiënt van lucht is en μt de lineaire dempingscoëfficiënt van het weefsel.
  4. PET- en CT-beelden werden na reconstructie automatisch uitgelijnd met behulp van de matrix die werd gegenereerd op basis van een capillaire fantoomscan. Archiveer alle gereconstrueerde gegevens en breng ze indien nodig over naar een databaseserver met behulp van beeldanalysesoftware.

6. Beeldverwerking en -analyse

OPMERKING: De co-geregistreerde PET/CT-beelden worden verder gebruikt voor kwantificering binnen de databaseserver van een beeldanalysesoftware, waar elke hybride scan als onderwerp wordt opgeslagen.

  1. Identificeer de tumor op basis van de CT en selecteer dit als het interessegebied. Maskeer de tumorbasis handmatig op CT.
  2. Om gebruikersonafhankelijke segmentatie te bereiken, drempelt u het nieuw gevormde tumormasker op PET of SPECT. Gebruik voor PET een minimale drempel van 1,0 gestandaardiseerde opnamewaarde (SUV). Gebruik voor SPECT een minimale drempel die hoger is dan de gemiddelde opname van de bloedpool zoals gemeten in het hart of de terminale abdominale aorta.
  3. Noteer het gemiddelde, het maximum, het gemiddelde van de heetste 10 voxels (d.w.z. het gemiddelde van 10) en de totale opname van de nieuw gegenereerde interessevolumes.
  4. Gebruik deze waarden om SUV- en target-to-background (TBR)-waarden te genereren, die verder zullen worden gebruikt voor statistische analyse.

Resultaten

Een van de belangrijkste aspecten van de kwaliteitscontrole van een radiofarmaceutisch middel is het gebruik van HPLC, omdat dit niet alleen de chemische en radiochemische zuiverheid aantoont (98,2% in dit geval), maar het ook mogelijk maakt om de identiteit van het radiofarmacon te bewijzen door de elutietijd en piekvorm te vergelijken met die van een niet-radioactieve referentieverbinding. Deze referentieverbinding is in dit geval een niet-gelabeld nanobody, waarvan bewezen is dat het de juiste verbinding is door klassieke technieken zoals massaspectrometrie of nucleaire magnetische resonantie. Deze technieken kunnen niet rechtstreeks op de radioactieve verbinding worden toegepast (er is niet genoeg massa om een signaal te genereren), maar door de radioactieve verbinding te vergelijken met zijn referentie, wordt voldoende bewijs verzameld dat de juiste verbinding inderdaad is gelabeld en niet is gewijzigd tijdens de synthese. Let op het kleine verschil in retentietijd tussen het radioactieve product en de referentie in figuur 1, die overeenkomt met de seriële meting van de HPLC-stroom (UV wordt eerst gemeten; de stroom heeft dan ongeveer 0,2 minuten nodig om de radioactiviteitsdetector te bereiken in een typische opstelling).

figure-results-1
Figuur 1: Typisch analytisch HPLC-chromatogram voor kwaliteitscontrole van 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 (GLNM-02). De UV-absorptie van de koude verbinding (d.w.z. het bovenste paneel) wordt gemeten bij 280 nm en vertoont een piek op 4,18 min, met een verschuiving van 0,22 min. De piek van het 68Ga-gelabelde product is te zien in de gammadetector (d.w.z. onderste paneel). Het radiochemisch rendement is 98,2%. mAU = milli absorptie-eenheden, NM-02 = ons product, UV = ultraviolet lichtkanaal, nm = nanometer, min = minuut, CPS = tellingen per seconde, GLMN-02 = 68Ga-gelabelde nanobody NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = gammakanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bij afwezigheid van HPLC of in aanvulling daarop, kan TLC worden gebruikt om de etiketteringsopbrengst en zuiverheid van het eindproduct te bepalen (maar niet de identiteit, en niet zo gedetailleerd als HPLC). Vanwege de lage complexiteit is TLC ideaal wanneer de radiosyntheseroute nog wordt geoptimaliseerd. Figuur 2 toont het TLC-chromatogram van 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 (schijnbare radiochemische zuiverheid 99,9%).

figure-results-2
Figuur 2: Typisch analytisch TLC-chromatogram voor kwaliteitscontrole van 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 (GLNM-02). Gebiedstellingen worden uitgezet tegen de afstand die het oplosmiddel (citraat) op de TLC-plaat heeft afgelegd. De Rf is 0,2 en de radiochemische zuiverheid is 99,9%. C = Tellingen, mm = millimeter, GLNM-02 = 68Ga-gelabelde nanobody NM-02, TLC = dunnelaagchromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bij het voorbereiden van beeldvormingsgegevens voor publicatie is het standaardpraktijk om ten minste één standalone CT- en PET-beeld te tonen. Deze aanpak maakt een uitgebreide evaluatie van de biodistributie van tracers mogelijk. Standaard CT-schaling ligt tussen -1000 HU en 1000 HU, waardoor alle zachte weefsels binnen één venster kunnen worden gevisualiseerd. Zoals te zien is in figuur 3A, maakt deze methode een duidelijke afbakening van de nieren van muizen mogelijk en maakt tegelijkertijd botbeoordeling mogelijk.

Stel voor de PET-schaal de ondergrens in op een SUV van 0.0 met behoud van een minimale bovengrens van 1.0 (Figuur 3B), bij voorkeur met behulp van normalisatie van het lichaamsgewicht tijdens de SUV-berekening (d.w.z. SUVbw). Bovendien heeft voor kwantificering SUVmean de voorkeur in vergelijking met SUVmax; mocht de SUVmax worden gebruikt, gebruik dan het gemiddelde van de heetste 10 voxels in plaats van de waarde van de heetste enkele voxel in de SUVbw-berekening . Bereid functiefusies van PET/CT-beelden voor door de CT- en PET-segmenten samen te voegen (Afbeelding 3C).

Om lezers verder in staat te stellen de biodistributie van de tracer van het hele lichaam onafhankelijk te beoordelen, kan de projectie van de maximale intensiteit van dezelfde PET-scan worden gepresenteerd met behulp van dezelfde schaal als de PET-plak (Figuur 3D).

figure-results-3
Figuur 3: In vivo PET/CT-beelden van een subcutane SKOV-3 tumordragende muis. Het beeld werd verkregen 3 uur na intraveneuze injectie van 5 MBq 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 (GLNM-02). (A) Het CT-beeld is geschaald tussen -1000 HU en 1000 HU, terwijl (B) het PET-beeld tussen een SUV van 0.0 en 5.0 ligt. (C) De PET/CT-fusie gebruikt dezelfde schaal. (D) Het PET-beeld met maximale intensiteitsprojectie (MIP) wordt ook geschaald met een SUV van 0,0 en 5,0. Alle PET-beelden tonen een goede tumoropname van GLNM-02 en de renale klaring is duidelijk zichtbaar. CT = computertomografie, PET = positronemissietomografie, MIP = projectie met maximale intensiteit, HU = Hounsfield-eenheid, SUV = gestandaardiseerde opnamewaarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In het specifieke geval van de 68Ga-gelabelde nanobody NM-02 kan een opmerkelijke tumoropname worden waargenomen in de linkerflank van de muis. Bovendien is de renale klaring van de tracer ook duidelijk. Door de projectie van de maximale intensiteit van PET weer te geven, wordt ook de activiteit van de urineblaas zichtbaar, waardoor de renale klaring van de tracer wordt versterkt. In dit specifieke geval is het vermeldenswaard dat de nier, tumor en blaas niet in dezelfde 2D-plak kunnen worden getoond. Door de projectie van de maximale intensiteit in publicaties op te nemen, wordt de volledige biodistributie van de tracer in hetzelfde beeld weergegeven.

Discussie

Radiosynthese
De hier beschreven radiosynthese is typerend voor een nieuwe 68Ga-gelabelde verbinding - korte synthesetijd, met de nadruk op geschikte pH en het vermijden van metalen waar mogelijk. Hiervoor is het belangrijk om de volgorde waarin de componenten worden toegevoegd strikt aan te houden. In ieder geval moet de pH-waarde van de 68Ga-oplossing eerst worden aangepast naar pH 4 met 3 M NH4OAc; anders kan de nanobody verslechteren als de pH te zuur is. De algemene concepten van 68Ga-synthese zijn al eerder beschreven16, dus we zullen hier niet in details treden. De geautomatiseerde synthesemodule vereist verdere optimalisatie met betrekking tot een verlaging van de stralingsdosis. Dit vereist een aanzienlijke inspanning die buiten het bereik valt van verkennend onderzoek in een typisch preklinisch experiment, zoals hier beschreven. Bovendien is het onwaarschijnlijk dat een geautomatiseerde synthese de kleine volumes zal opleveren die we met de huidige methode kunnen produceren (< 1 ml), waardoor hogere concentraties van 68Ga en een hogere specifieke activiteit mogelijk zijn.

Kwaliteitscontroles moeten nog steeds tot in detail worden uitgevoerd en geregistreerd. Een uitzondering op dit detail is de pH: terwijl pH-metingen voor klinische syntheses vaak zeer nauwkeurig worden uitgevoerd met behulp van pH-meters, is het hier voldoende om de pH te meten met een eenvoudige pH-strip, aangezien de vereisten voor intraveneuze injecties dit toestaan (elke pH tussen 6 en 8 is toegestaan14). Deze eenvoudige techniek vermindert de kosten en de kans op besmetting van apparatuur met radioactief materiaal.

Formuleringen voor diermodellen
De uiteindelijke formulering van de tracer is een cruciaal aspect van de tracer, een aspect dat in preklinisch onderzoek vaak slechts slecht wordt beschreven. Hoewel er preklinisch duidelijke wetgeving is voor de formulering van geneesmiddelen voor proeven bij mensen, met inbegrip van radiofarmaceutica, zijn er alleen richtlijnen17,18 die niet specifiek ingaan op oplosmiddelen of formuleringen. Deze richtlijnen worden vaak gebruikt bij het opstellen of evalueren van wettelijk verplichte protocollen voor goedkeuring door (dier)ethische commissies (in Duitsland: LANUV19), maar deze documenten benadrukken onvoldoende het belang van formulering. Het is aannemelijk dat slechte formuleringen tot valse (negatieve) resultaten kunnen leiden, maar een dergelijke bewering is moeilijk te verifiëren gezien de hardnekkige publicatiebias die nog steeds bestaat, ook op het gebied van oncologie20.

Naast de ARRIVE-richtlijnen hebben we ervoor gekozen om zoveel mogelijk de wetgeving te volgen die is ontworpen voor menselijke toepassingen, ervan uitgaande dat formuleringen die geschikt zijn voor mensen over het algemeen ook geschikt zijn voor knaagdieren. Het grote verschil is de grootte van de proefpersoon en dus de hoeveelheid volume die veilig kan worden geïnjecteerd. Hiervoor hebben we ervoor gekozen om de verbinding waar mogelijk te zuiveren met behulp van moleculair gewicht cut-off (MWCO) filters, omdat bewezen is dat deze effectief zijn voor het zuiveren van grote verbindingen21. Hiermee kan een typische 68Ga-gelabelde tracer uiteindelijk worden opgelost in een oplossing naar keuze en in een klein volume dat geschikt is voor muizen (typische maximale intraveneuze injectie 100 - 150 μL).

In Duitsland fungeert de GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, Engels: Vereniging voor proefdieren) als bemiddelaar tussen dierenbescherming en onderzoek, waar zowel mens als dier baat bij hebben. Daarom heeft deze vereniging aanbevelingen opgesteld voor meerdere aspecten van dieronderzoek, vooral op het gebied van oncologie en anesthesie, om de dierenzorg op nationaal niveau te standaardiseren14. Voortaan zien de meeste bevoegde autoriteiten en nationale ethische commissies toe op de naleving van die aanbevelingen in dierprotocollen. GV-SOLAS heeft aanbevelingen voor maximale volumes van de meeste toepassingsroutes. Voor intraveneuze injectie wordt een maximum van 5 ml/kg lichaamsgewicht aanbevolen; voor een muis van 25 g komt dit overeen met 150 μL. Om deze reden zijn alle producties van radioactieve tracers ingesteld op een maximaal injectievolume van 150 μL per dier. Overschrijding van deze drempel bij intraveneuze injectie verhoogt het risico op acute hartinsufficiëntie veroorzaakt door hypervolemie. Herhaalde intraveneuze injecties die deze drempel overschrijden, leiden tot een verhoogd risico op longfibrose, aangezien elke injectie, afhankelijk van de stroomsnelheid, licht longoedeem veroorzaakt. Een menselijk equivalent van de muis IV die in dit artikel wordt gepresenteerd, zou zijn om intraveneus in een bolus (binnen 10 s) een totaal volume van 375 ml te injecteren voor een mens van 75 kg. In de standaard klinische zorg wordt 500 ml 0,9% NaCl-oplossing gedurende 1 uur toegediend; dit betekent dat 375 ml gedurende 45 minuten zou worden toegediend om complicaties te voorkomen.

GV-SOLAS beveelt aan dat de tumorlast niet meer dan 5% bedraagt; Als het dier onder behandeling is, kan de last worden verlengd tot 10%22. Dit verschil tussen behandelde en onbehandelde groepen heeft het potentieel om een onderzoeksbias te creëren, vooral in het geval van overleving, aangezien behandelde tumormuizen een hogere tumorlast kunnen bereiken dan de afferente controlegroep. Om dergelijke gevallen te voorkomen, moet ofwel de tumorlast van 5% ook worden vastgesteld voor behandelde dieren; Dit kan echter leiden tot ethische dilemma's voor het doden van proefdieren voordat een zogenaamd humaan eindpunt is bereikt, of (bij voorkeur) stellen dat de verhoging naar 10% in het geval van de afferente controlegroepen ethisch gefundeerd is om vooringenomenheid te voorkomen.

Omdat de tumorlast elke dag op een niet-invasieve manier moet worden berekend, passen we een correctiefactor (d.w.z. 0,82) toe om het dagelijks berekende tumorvolume om te rekenen naar een tumorgewicht. We hebben deze factor berekend door tumordiameters te meten met behulp van een digitale schuifmaat voordat de dieren werden gedood volgens het protocol en later het werkelijke tumorgewicht met behulp van een weegschaal. Deze correctiefactor verschilt van de dichtheid van het tumorweefsel, omdat het gemeten tumorvolume ook de huid omvat. Daarom is deze factor waarschijnlijk < 1,0, aangezien het gemeten tumorvolume groter is dan het werkelijke tumorvolume. Omdat de tumoren die we wogen relatief groot waren, omdat de beoordeling op de laatste dag van het experiment werd gedaan, overschat deze factor inderdaad het gewicht van kleine tumoren. Het mag alleen worden gebruikt bij de beoordeling van de tumorbelasting.

Een ander aspect van de aanbevelingen van GV-SOLAS is dat voor muizen een vaste tumordiameter van 15 mm is ingesteld als humaan eindpunt17. Vaak heeft de tumor de neiging om snel te groeien langs het naaldkanaal dat door de subcutane injectie wordt gemaakt als er geen lucht of prop wordt geïnjecteerd na de oplossing die tumorcellen bevat. Daarom worden de 15 mm sneller bereikt op bepaalde toepassingsroutes. Aangezien sommige tumoren qua ervaring in een elliptische vorm groeien, hebben we de bovengenoemde tumorvolumeformule aangepast en gebruikt om onbevooroordeelde vergelijkingen te maken tussen verschillende toepassingsroutes.

De diermodellen die we gebruiken, zijn ontworpen volgens de richtlijnen ARRIVE17 en PREPARE18 , waardoor een gemakkelijke experimentele reproductie mogelijk is. Het model is onderhevig aan een zekere mate van variatie, aangezien de groeisnelheid van de tumor varieert tussen verschillende muizen, waardoor standaardisatie en interpretatie moeilijker te hanteren zijn. Deze variaties weerspiegelen echter de intra- en intertumorale heterogeniteit die aanwezig is bij de kankerpatiënten23.

Dit protocol is niet zonder beperkingen. Dieren moeten tijdens de injectie worden verdoofd, vooral tijdens de PET/CT-scan. Sedatie, vooral met isofluraan, beïnvloedt de bloedstroom en dieren kunnen onderkoeld raken, waardoor het gebruik van een verwarmingsmat en het controleren van de diepte van de sedatie nodig is. Dit probleem kan worden voorkomen door wakkere dieren te scannen; Dit vereist echter gespecialiseerde in-house software en expertise, die vaak niet beschikbaar zijn.

Een andere beperking is de stralingsdosis. Hoewel de dosis die de dieren ontvangen verwaarloosbaar is voor een enkele scan, kan het uitvoeren van meerdere scans (d.w.z. vooral als er meer dan 10) resulteren in een significante cumulatieve dosis, wat mogelijk van invloed kan zijn op de tumorgroei. Wanneer tumorgroei een uitleesparameter is, is het essentieel dat alle dieren hetzelfde aantal scans en doses krijgen om vergelijkbare groepen te garanderen, wat de werklast van het hele project verhoogt. Het gebruik van een PET/MRI-systeem in plaats van een PET/CT-systeem kan de blootstelling aan straling verminderen. Deze aanpak omvat echter langere scantijden, extra kosten en een andere methode om anatomische informatie te verkrijgen.

Door ons te houden aan aanbevelingen van welzijnsorganisaties zoals GV-SOLAS in Duitsland en gevestigde richtlijnen zoals ARRIVE en PREPARE te volgen, streven we ernaar diermodellen te standaardiseren en variabiliteit in experimentele protocollen te minimaliseren. Deze inspanningen zijn cruciaal om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van preklinische studies te waarborgen, en uiteindelijk de vertaling van veelbelovende radiofarmaceutica van de bank naar het bed te vergemakkelijken.

Openbaarmakingen

FMM is een medisch adviseur voor NanoMab Technology Ltd. en Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Hij heeft onlangs institutionele subsidies ontvangen van NanoMab Technology Ltd., Siemens en GE Precision Healthcare LLC. Daarnaast heeft hij een interventioneel onderzoekscontract met CURIUM.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn Susanne Allekotte dankbaar voor haar technische ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Activity meter ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
Centrifuge MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Endotoxin testing Endosafe nexgen-PTSCharles River-
Heating block NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
HPLC system, including radio detectorKnauer & Raytest-
Image analysis software Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-
Small animal PET/CT system β-CUBE and X-CUBEMolecubes NV-
TLC MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materials
0.3 mm diameter PE10 tubefisher scientific22-204008
30G needleB|Braun4656300
Centrifugal filter; 10 kDa MWCO, 0.5 mLMilliporeUFC501008
Chromatography paper strip iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Endotoxin Cartridge, 0.05 EU/ml sensitivity Charles RiverPTS-2005
HPLC Column Biosep SEC-s2000Phenomenex-
Microcentrifuge tube (1.5 mL)Eppendorf0030125150
pH strip 0.0 - 6.0Merck KGaA109531
pH strip 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ SPE cartridgeMacherey Nagel GmbH & Co. KG731861
Sterile vial 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
Reagents
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-
AmmoniumacetateMerck KGaA101116
Citric acidMerck KGaA100241
Hydrochloric acidMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-
P-SCN-Bz-DOTA-GACheMatechC115
Trifluoracetic acidMerck KGaAT6508
Ultrapure waterMerck KGaA101262

Referenties

  1. American Cancer Society. Cancer facts & figures 2024. , https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2024-cancer-facts-figures.html (2024).
  2. Cancer Research UK. Ovarian cancer survival. , https://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/ovarian-cancer/survival (2021).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Altunay, B., et al. Her2-directed antibodies, affibodies and nanobodies as drug-delivery vehicles in breast cancer with a specific focus on radioimmunotherapy and radioimmunoimaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 48 (5), 1371-1389 (2021).
  5. Altunay, B., Morgenroth, A., Mottaghy, F. M. Use of radionuclide-based imaging methods in breast cancer. Semin Nucl Med. 52 (5), 561-573 (2022).
  6. Mcgale, J., et al. Pet/ct and spect/ct imaging of her2-positive breast cancer. J Clin Med. 12 (15), 4882(2023).
  7. Zhang-Yin, J. State of the art in 2022 pet/ct in breast cancer: A review. J Clin Med. 12 (3), 968(2023).
  8. USFD Administration. Pet drug products - current good manufacturing practice (cgmp). , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pet-drug-products-current-good-manufacturing-practice-cgmp (2018).
  9. Official Journal of the European Union, L238. 60, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ:L:2017:238:TOC (2017).
  10. Korde, A., et al. Position paper to facilitate patient access to radiopharmaceuticals: Considerations for a suitable pharmaceutical regulatory framework. EJNMMI Radiopharm Chem. 9 (1), 2(2024).
  11. Korde, A., et al. Practical considerations for navigating the regulatory landscape of non-clinical studies for clinical translation of radiopharmaceuticals. EJNMMI Radiopharm Chem. 7 (1), 18(2022).
  12. European Pharmacopeia. , (2023).
  13. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Brorson, K. A., Chizhikov, V. E. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 25 (2-3), 69-77 (2011).
  14. Dülsner, A., et al. Technical information from the Committee for Animal Welfare Officers (GV-SOLAS) and Working Group 4 in the TVT Recommendation on substance administration to laboratory animals. GV-SOLAS. , (2017).
  15. derived xenograft (pdx) protocols at the jackson laboratory. , Available from: https://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/live/www/html/SOCHelp.html (2020).
  16. Velikyan, I. 68ga-based radiopharmaceuticals: Production and application relationship. Molecules. 20 (7), 12913-12943 (2015).
  17. Percie Du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the arrive guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  18. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. Prepare: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  19. Landesamt Für Natur UUVN. Tierversuche. , https://www.lanuv.nrw.de/verbraucherschutz/tierversuche (2024).
  20. Herrmann, D., et al. Statistical controversies in clinical research: Publication bias evaluations are not routinely conducted in clinical oncology systematic reviews. Ann Oncol. 28 (5), 931-937 (2017).
  21. Johnsen, E., et al. A critical evaluation of amicon ultra centrifugal filters for separating proteins, drugs and nanoparticles in biosamples. J Pharm Biomed Anal. 120, 106-111 (2016).
  22. TVT-Veröffentlichungen zum Download. , Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS). Available from: https://www.tierschutz-tvt.de/alle-merkblaetter-und-stellungnahmen/ (2024).
  23. Bedard, P. L., Hansen, A. R., Ratain, M. J., Siu, L. L. Tumour heterogeneity in the clinic. Nature. 501 (7467), 355-364 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Radiosynthese workflowPET voor kleine dieren68Ga radiotracersradiochemische zuiverheidintraveneuze injectiestaartveneucatheterradio HPLCPET CT beeldvormingmoleculaire beeldvorming

Gerelateerde artikelen