Constructie van een olfactometer voor onderzoek naar olfactorisch gedrag bij knaagdieren

Summary

Dit protocol beschrijft de constructie van een olfactometer voor go/no-go olfactorische gedragsexperimenten. Stapsgewijze instructies, samen met afbeeldingen, worden meegeleverd om de succesvolle constructie van de olfactometer te garanderen. Informatie voor het oplossen van problemen die zich tijdens het proces voordoen, is ook inbegrepen.

Abstract

Het gebruik van olfactometers om het gedrag en de hersenactiviteit van knaagdieren tijdens olfactorische taken te bestuderen, is cruciaal voor het begrijpen van hersencircuits. Deze geavanceerde apparaten stellen onderzoekers in staat om geurstimuli nauwkeurig te controleren en af te geven, waardoor complexe olfactorische processen bij knaagdieren kunnen worden onderzocht. Hoewel in de handel verkrijgbare olfactometers handig zijn, vormen ze uitdagingen wanneer zich technische problemen voordoen, waarvoor vaak kostbare hulp nodig is en die mogelijk de onderzoekstijdlijnen verstoren. Dit artikel beschrijft de constructie van een op maat gemaakte olfactometer die speciaal is ontworpen voor experimenten met olfactorisch gedrag van muizen, met een uitgebreide lijst met onderdelen en stapsgewijze instructies. De olfactometer wordt bestuurd via MATLAB en biedt een gebruiksvriendelijke interface voor onderzoekers. Belangrijk is dat de open-sourcecode gebruikers in staat stelt het systeem aan te passen en aan te passen, waarbij gedragstaken worden afgestemd op specifieke experimentele behoeften. Het bouwen van een aangepaste olfactometer geeft gebruikers de kennis en mogelijkheid om zelfstandig experimenteel ontwerp en probleemoplossing op maat uit te voeren, waardoor zowel tijd als middelen worden bespaard. Deze aanpak vergroot niet alleen de flexibiliteit van het onderzoek, maar bevordert ook een beter begrip van de functionaliteit van de apparatuur, wat uiteindelijk leidt tot robuustere en betrouwbaardere olfactorische studies bij knaagdieren.

Introduction

De ingewikkelde mechanismen die ten grondslag liggen aan olfactorische besluitvorming bieden fascinerende inzichten in de opmerkelijke complexiteit van het sensorische verwerkingssysteem van de hersenen ^1,2,3. In de bulbus olfactorius van muizen komt een breed scala aan olfactorische sensorische neuronen samen op ongeveer 2.200 glomeruli, elk geïnnerveerd door neuronen die dezelfde reukreceptor tot expressie brengen⁴. Opmerkelijk is dat zelfs enkelvoudige synthetische geurstoffen een aanzienlijk deel van de ongeveer 1.100 olfactorische receptoren bij muizen kunnen stimuleren ^5,6. De uitdaging gaat echter verder dan de eerste detectie van geurstoffen. De temporele dynamiek van de aankomst van geurstoffen, beïnvloed door de ritmische handeling van het snuiven, verrijkt het sensorische landschap verder en voegt informatielagen toe die de hersenen kunnen ontcijferen. Verergerd door de complexiteit van natuurlijke stimuli, zoals soortgenoten urine, die honderden geurstoffen bevat, staat het olfactorische systeem voor de formidabele taak om ingewikkelde patronen van glomerulaire activering te ontwarren om onderscheid te maken tussen verschillende geuren ^7,8.

Om deze uitdaging aan te gaan, orkestreren de hersenen neurale activiteit in meerdere regio's, waaronder de piriforme cortex, de laterale entorhinale cortex, de hippocampus, de olfactorische tuberkel, de prefrontale cortex en zelfs het cerebellum 9,10,11,12,13,14. Binnen deze circuits integreren en moduleren piramidale cellen in de piriforme cortex informatie die wordt doorgegeven door mitraliscellen, terwijl andere hersengebieden een unieke rol spelen bij het vormgeven van olfactorische waarneming 15,16,17. Bovendien wordt de verwerking van olfactorische stimuli door de hersenen dynamisch beïnvloed door contextuele factoren, wat het aanpassingsvermogen en de verfijning van het olfactorische besluitvormingsproces onderstreept.

Dit artikel beschrijft de constructie van een aangepaste olfactometer die computergestuurde beoordeling mogelijk maakt van de gedragsprestaties van vrij bewegende muizen die bezig zijn met een go/no-go-taak. In deze associatieve leertaak start de waterarme muis een proef door aan een waterafgiftetuit te likken die zich in een geurige toedieningsneuskegel bevindt. Een van de twee geurstoffen wordt 1-1,5 s nadat het dier de proef heeft gestart, toegediend. Als de geurstof de beloonde (S+) geurstof is, ontvangt de muis een waterbeloning als hij ten minste één keer likt in elk van de vier tijdvensters van 0,5 s (een treffer). Anders krijgt de muis geen beloning (Miss). Als het dier de niet-beloonde geurstof (S-) krijgt, wordt er geen beloning uitgedeeld, en als de muis in elk van de vier tijdvensters (Vals Alarm, FA) likt, wordt een tijdsvertraging opgelegd voor de start van de volgende proef. Als het dier in een van de tijdvensters niet likt, wordt de proef geteld als een correcte afwijzing (CR) en wordt er geen vertraging toegepast. Het percentage correcte prestaties wordt berekend als het percentage proeven waarin de muis een Hit of CR scoort in een periode van twintig proeven:

Percentage correct = 100 ((Hit + CR) / 20)

Er zijn twee belangrijke zaken om de goede werking van olfactometers te garanderen die zijn ontworpen om go/no-go olfactorisch gedrag te beoordelen. Ten eerste moet de olfactometer de reacties van de muis in realtime volgen om dienovereenkomstig geur- en waterbeloningen af te geven. Deze olfactometer wordt bereikt door likstenen te monitoren door de weerstand tussen de waterhoos en de kamerbodem te meten of door capaciteit¹⁸ te detecteren. Een MATLAB-programma gebruikt deze informatie vervolgens om beslissingen te nemen over de afgifte van geurstoffen en de waterbeloning. Het tweede probleem is de behoefte aan betrouwbare, reproduceerbare geurafgifte. Deze olfactometer wordt bereikt door kleppen te bedienen die met geur verzadigde lucht in evenwicht brengen met draaglucht, die vervolgens naar een neuskegel wordt gebracht. Lucht wordt in evenwicht gebracht met de geurstof door deze door een met minerale olie verdunde geuroplossing te laten borrelen. De concentratie van de geurstof wordt gemeten met een foto-ionisatiedetector en kan worden berekend op basis van dampdruk en activiteitscoëfficiënt, volgens procedures beschreven door Williams en Dewan^18,19.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Anschutz Medical Campus Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Colorado. De dieren die in deze studie werden gebruikt, waren mannelijke CaMKIIα WT-muizen, twee maanden oud op het moment van tetrode-implantatie. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Printplaat en solderen van enkelpolige, enkelvoudige worp (SPST) kortstondige drukknoppen

1. Verkrijg de op maat gemaakte witte plint met gaten om de rekken voor geurkleppen, debietmeters, SSR48-bord en andere componenten te bevestigen die worden weergegeven in afbeelding 1A.
   OPMERKING: De witte plint die in dit onderzoek is gebruikt, is geproduceerd door de machinewerkplaats van het Neurotechnology Center op de CU Anschutz Medical Campus (Figuur 1A). De ontwerpbestanden zijn beschikbaar op
2. Voeg 1-inch schroeven en 3/4 inch spacers toe voor plaatsing van het SSR48-RACK. De schroeven bevinden zich rechtsboven aan de achterkant van het whiteboard (Figuur 1A).
3. Monteer het SSR48-RACK. Het SSR48-RACK bevindt zich linksboven aan de achterkant van het whiteboard (Afbeelding 1C).
4. Maak gaten (0,4 cm) om de schroefklemmenblokken aan de achterkant van het whiteboard te plaatsen. De stripblokken van de schroefklemmen bevinden zich rechtsmidden aan de achterkant van het whiteboard (Afbeelding 1D).
5. Van boven naar beneden: Het eerste stripblok met 4 schroefklemmen wordt gebruikt om draden voor 24 V aan te sluiten. Het volgende schroefklemmenblok wordt gebruikt voor 5 V-draden. Laat één schroefklemmenblok leeg en het laatste blok met 4 schroefklemmen wordt gebruikt om aarddraden aan te sluiten.
6. Boor gaten (0,8 cm) in de bedieningskast voor het plaatsen van de SPST momentane drukknopschakelaars. De schakelkast bevindt zich aan de onderkant van het whiteboard (Afbeelding 1E).
7. Stel de SPST-kortstondige drukknopschakelaars in. Soldeer twee draden aan de SPST momentane drukknopschakelaar. Het verdient de voorkeur om twee verschillende kleuren te gebruiken, zoals rood en zwart of groen (Figuur 1F).
8. Bevestig de SPST-kortstondige drukknopschakelaar aan de schakelkast. De drukknoppen worden geleverd met een moer die wordt gebruikt om te bevestigen aan de zwarte doos van de besturing (Figuur 1G).
9. Zet de draden vast door ze te draaien of vast te zetten met tape om ze bij elkaar en georganiseerd te houden.
   OPMERKING: De 24 V-stroom wordt gebruikt om de knijpkleppen en geurkleppen van stroom te voorzien, en 5 V-stroom wordt gebruikt voor het likcircuit.
10. Plaats de geurkleppen in de sleuven van het geurkleppenrek in het midden van het whiteboard (Afbeelding 2A).
    1. Trek de draden af die van de kleppen komen en soldeer een draad van elke klep op een dikkere draad. Plaats een draad in de aarde op de schroefklemmenstrookblokken aan de achterkant van het whiteboard en een tweede draad in de overeenkomstige pin in het SSR48-RACK. Geurklep 1 gaat bijvoorbeeld naar pin 1, geurklep 2 gaat naar pin 2, enz. (Figuur 2B).
    2. Sluit de pennen 1 tot en met 8 in het SSR48-RACK aan op elk twee knijpkleppen (in- en uitschakelkleppen voor de minerale olie-equilibratieflacons). Sluit voor elke klep één draad van een drukknop aan op de 24 V-voeding en de andere draad op de pin in de SSR48-RACK die op de klep is aangesloten. De andere draad gaat van de klep naar de massa. Raadpleeg afbeelding 2B,C voor het plaatsen van de draden op hun plaats.
    3. Plaats de waterklep en de eindklep in de overeenkomstige sleuven in de klepplaat. De sleuf bevindt zich in het midden van het whiteboard. Zie het kleppenplaatje in Figuur 1 en de plaatsing van de kleppen in Figuur 3A.
    4. Sluit de waterklep en eindklep aan op respectievelijk de massa en de pennen 17 en 18 in het SSR48-RACK. Sluit drukknoppen aan op 24 V en op pennen 17 en 18 (Figuur 2B).

2. Stroomvoorziening

1. Koop een voeding en een verlengsnoer. Informatie over het specifieke type voeding is te vinden in de materiaaltabel. De voeding levert 24 V (V3) en 5 V (V1) uitgangen en aarde naar de olfactometer.
2. Knip de stekker van het netsnoer voor de voeding af. In het bijzonder het vrouwelijke deel van het verlengsnoer. Als het eenmaal is doorgeknipt, zijn er drie draden te zien. De groene draad is aangesloten op G (massa) op de voeding en de andere twee draden (wit en zwart) zijn aangesloten op respectievelijk L en N van de 120 V AC-ingang op de voeding (Afbeelding 3B).
   LET OP: De 120 V-stroomdraden zijn zichtbaar en er bestaat gevaar voor letsel door elektrische schokken. Het is het beste om het af te dekken met een isolator.
3. Knip het ene uiteinde van de draad door die de SSR48-RACK van stroom voorziet. Sluit een van de draden aan op de G-schroef in de voeding en de tweede op de V1 van de voeding (Figuur 3C).
4. Sluit op de voeding een draad van G2 aan op de massa op de schroefklemmenstrookblokken (Afbeelding 2C).
5. Sluit op de voeding een draad van V1 aan op de 5 V schroefklemmenstrookblokken (Afbeelding 2C).
6. Sluit op de voeding een draad van V3 aan op de 24 V schroefklemmenblokken (Afbeelding 2C).

3. De raad van de Sensor likken

1. Zorg voor een breadboard met 400 bindpunten en leid een draad die aansluit van de bindpunten B7 naar B15 (Figuur 3D).
2. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op bindpunt 6+ en het andere uiteinde op bindpunt C22 van het breadboard (Figuur 3D).
3. Sluit het ene uiteinde aan op D16 en het tweede uiteinde op G22 van het breadboard (Figuur 3D).
4. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf I22 en het tweede uiteinde op 29- van het breadboard (Figuur 3D).
5. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf 20A en het tweede uiteinde op 29A van het breadboard (Figuur 3D).
6. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op 21B en het tweede uiteinde op 28B van het breadboard (Figuur 3D).
7. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf 1+ van het breadboard en het tweede uiteinde op de 5 V van de schroefklemmenblokken (Afbeelding 3D).
8. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf 1- van het breadboard en het tweede uiteinde op de aarde van de schroefklemmenblokken (Afbeelding 3D).
9. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf C7 van het breadboard en het tweede uiteinde op pin 27 op de SSR-48RACK (Figuur 3D).
10. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf 28C van het breadboard, en aan het tweede uiteinde is een krokodillenklem bevestigd die wordt aangesloten op het metalen deel van de waterspuit (Figuur 3D).
11. Sluit het ene uiteinde van een draad aan op sleuf 20B van het breadboard en het andere uiteinde op de middelste klem van de potentiometer (Figuur 3D). De twee klemmen die zijn aangesloten op de weerstandselementen van de potentiometer zijn aangesloten op massa en 5 V. De middelste klem is aangesloten op het breadboard.
12. Verkrijg weerstanden van 21 mΩ. Sluit voor de eerste het ene uiteinde aan op 19A en het tweede uiteinde op 20D. Sluit voor het tweede uiteinde het ene uiteinde aan op 22C en het andere uiteinde op 21D. Sluit aan op de potentiometer (Figuur 3D).
13. Zorg voor één kΩ-weerstand. Sluit het ene uiteinde aan op 14C en het tweede uiteinde op 19C. Sluit aan op de potentiometer (Figuur 3D).
14. Zorg voor een weerstand van 120 Ω. Sluit het ene uiteinde aan op 7D en het tweede uiteinde op 7H (Figuur 3D).
15. Zorg voor een LED-lampje. De kleur doet er niet toe. Sluit een LED-draad aan op 7J en de tweede draad op 6- (Figuur 3D).
16. Zorg voor twee operationele versterkers (op-amps). De aansluitingen voor de eerste zijn E10 naar E16, F10-F16 (Figuur 3D).

4. Lucht- en watervoorziening

1. Plaats twee debietmeters (een 2 L/min en een 50 cc/min) in de debietmeterhouders. Figuur 4A toont het algehele luchtstroomsysteem en Figuur 4B toont de vergrote weergave van de debietmeters.
2. Zorg voor een aquariumpomp om een luchtstroom van 2 l/min te leveren. Het hier gebruikte aquariumpompmodel heeft twee uitgangen (zie materiaaltabel). Sluit een klein stukje slang van elk van de twee uitgangen van de aquariumpomp aan op de twee ingangen van een T-connector (Afbeelding 4B).
3. Sluit een stuk slang aan van de uitgang van de T-connector naar de ingang van een actief koolfilter (Figuur 4B).
4. Sluit de slang van de uitgang van het koolstoffilter aan op een T-connector en sluit de twee uitgangen van de connector aan op een kogelkraan om het luchtdebiet aan te passen (Figuur 4C).
5. Sluit de uitgang van elke kogelkraan aan op de ingang van de debietmeters (Figuur 4D).
6. Sluit de uitgang van de 50 cm/min debietmeter aan op het bovenste spruitstuk en zorg voor lucht in de geurevenwichtsflesjes van 40 ml met geurstoffen verdund in minerale olie (Figuur 4E).
7. Sluit de uitgang van elke geurflacon aan op de overeenkomstige ingang in het onderste spruitstuk.
8. De buisjes die de geurflesjes met de spruitstukken verbinden, zijn slangjes die worden geopend door de twee afzonderlijke slangkleppen. Plaats de slang in de knijpkleppen.
9. Sluit de uitgang van de 2 L/min flowmeter aan op de ingang van de zij-ingang van het onderste spruitstuk.
10. Sluit de uitgang van het onderste spruitstuk aan op de ingang van de laatste (omleidings)klep (Figuur 4F).
    1. Sluit de standaard aan uitgang van de laatste klep aan op de geurafgiftebuis in de go/no-gochamber. Sluit de standaard uitstroom van de eindklep aan op een uitlaatpijp (Figuur 4G). Dit resulteert in een continue niet-geodoriseerde luchtstroom van 2 l/min wanneer de laatste klep is uitgeschakeld.
    2. Zorg er voor elke proef voor dat de laatste klep wordt ingeschakeld wanneer het dier likt, de lucht naar de uitlaat brengt, en tegelijkertijd wordt de geurklep ingeschakeld. Dit resulteert in het evenwicht van geur in de achtergrondluchtstroom.
    3. Zorg er na 1-1,5 s voor dat de laatste klep wordt uitgeschakeld en de lucht terug naar de kamer wordt geleid. Dit resulteert in een sterke toename van de geurstofconcentratie. Na 2,5 s gaat het geurventiel uit en gaat de geurconcentratie weer naar 0.
    4. Sluit een naald van 18 G aan op de punt van de spuit van 5 ml die zal worden gebruikt om de waterbeloning toe te dienen (Figuur 4H).
    5. Sluit een buis (2 mm diameter) aan op de punt van de naald (Figuur 4H).
    6. Sluit het andere uiteinde van de buis aan op de ingang van de waterklep. Het kan nodig zijn om een buis met een andere diameter te snijden om in de ingang van de waterklep te passen (Figuur 4I).
    7. Sluit de slang aan van de uitgang van de waterklep naar de liksteen (Figuur 5A).

5. De olfactometer aansluiten op de computer en de software installeren

1. Sluit de SSR48-RACK aan op de DIO96H/50 met een 100-pins female-to-female connector. Sluit de USB-kabel van de DIO96/H50 aan op de computer (Afbeelding 5B).
2. Download de nieuwste versie van mccdaq-software en -stuurprogramma's en InstaCal.
   OPMERKING: InstaCal is het programma dat de communicatie tussen de computer en DIO96/H50 test. Download hier de nieuwste software en stuurprogramma's: https://www.mccdaq.com/software-downloads.aspx.
3. Voer InstaCal uit. Zorg ervoor dat de "Universal Serial Bus" het bord # als het juiste nummer vermeldt, meestal #1 = bord #1 USB-DIO96H/50.
4. MATLAB downloaden.
5. Download de MATLAB-programma's om de olfactometer vanaf https://github.com/restrepd/dropc te laten draaien.
6. Open MATLAB als beheerder en stel het pad zo in dat MATLAB de programma's herkent. Klik op het tabblad Home in de MATLAB-omgeving op Set Path in de sectie Environment. Dit opent een dialoogvenster waarin u mappen in het zoekpad kunt toevoegen.
7. Voer daqregister('mcc') uit. Wijzig het bordnummer in dropcInitializePortsNow.m.
   OPMERKING: handles.dio = digitalio('mcc',1); %(1 of 0, afhankelijk van de computer).
8. Test dropcspm.m door een dry run uit te voeren waarbij de gebruiker op elke proef "reageert" door de elektrische lus tussen de liktuit en de metalen vloer van de geaarde kamer aan te sluiten.
   OPMERKING: De olfactometer is nu klaar voor gebruik. Informatie over het trainen van de muis is te vinden in Nicole Arevalo et ^al.20.

6. Dierproeven

1. Bereid de proefdieren zorgvuldig voor om met het experimentele proces te beginnen. Weeg elke muis afzonderlijk met behulp van een gekalibreerde weegschaal en noteer het gewicht in een laboratoriumlogboek. Bewaak deze cruciale gegevens tijdens het onderzoek om de gezondheid van de dieren te volgen en eventuele gewichtsveranderingen onmiddellijk aan te pakken.
2. Plaats de muizen na het wegen voorzichtig in de speciaal ontworpen muizenkamer. Activeer de sensoren en stimuli afgiftesystemen voor de olfactorische discriminatietaak. Zorg ervoor dat de kamer de stress voor de dieren tot een minimum beperkt, terwijl de experimentele omstandigheden nauwkeurig onder controle blijven.
3. Zorg ervoor dat het dier zich op zijn gemak voelt in de kamer. Start het MATLAB-programma om experimentele parameters te controleren, zoals het toedienen van geurstimuli (2,5 s), het doseren van water en het registreren van reacties. Analyseer gegevens in realtime om onmiddellijke feedback te krijgen over de prestaties van het dier.
4. Bewaak en analyseer de prestaties van het dier continu. Bekijk de berekende vaardigheidsscore op basis van het percentage juiste antwoorden. Streef ernaar dat elk dier een prestatiescore van 80 of hoger behaalt, wat de drempel voor taakvaardigheid markeert.
5. Begin met de nieuwe fase van het experiment zodra het dier consequent een vaardigheidsscore van 80 of hoger behaalt, wat aangeeft dat het aanvankelijke onderscheid tussen geurparen beheerst. Draai het geurpaar om, laat de eerder beloonde geur onbeloond en vice versa.
   1. Test de cognitieve flexibiliteit van het dier en het vermogen om associaties af te leren en opnieuw te leren, waardoor waardevolle inzichten worden verkregen in de plasticiteit van olfactorisch leren bij muizen.

Results

Volgens het hier beschreven protocol kan een olfactometer worden ingesteld om het go/no-go-gedrag van muizen te testen en onderscheid te maken tussen geuren. Figuur 6A toont het gedrag van een muis tijdens de eerste trainingsdag in de go/no-go-taak, met ethylacetaat als S+-geurstof en een combinatie van ethylacetaat en propylacetaat als S-. Het percentage correct wordt berekend als het percentage proeven waarin de muis een treffer of correcte afwijzing scoort. Aanvankelijk begon de muis bij 50% correct omdat hij likte als reactie op beide geurstoffen. Na verschillende proeven leerde hij echter alleen te likken voor de S+ en stopte met likken voor de S-. Figuur 6B toont het percentage correct voor de laatste dag van de go/no-go-taak in de voorwaartse richting, waar het dier vaardigheid bereikte met prestaties van 80% of hoger. Op dit punt werden de geurstoffen omgekeerd (REV), met ethylacetaat als de S-odorant en de combinatie van ethylacetaat en propylacetaat als de S+. Figuur 6C toont het percentage correct op de eerste dag van de go/no-go-taak in omgekeerde richting, waarbij de prestaties van de muis daalden tot 10%. F toont de prestaties van de muis op de laatste dag van de omkering, waar hij opnieuw vaardigheid bereikte.

Afbeelding 1: Whiteboard voorkant van de olfactometer en bedrading. (A) De afmetingen van de olfactometer zijn 22" B x 16" H x 8.5" D, weergegeven zonder bedrading of interface/likborden, zoals geleverd door de machinewerkplaats. Er zijn gaten voorgeboord voor geurkleppen, thermometers, water- en eindkleppen, waterspuit, geurflessenrek, geurkleprek en de muiskamer. (B) De olfactometer is voorbereid met de 8 bouten die nodig zijn om de SSR48-RACK aan de linkerachterkant te monteren. (C) Olfactometer met SSR48-RACK gemonteerd, inclusief aangesloten relais. (D) Schroefklemmenstrookblokken toegevoegd aan de olfactometer, met aangewezen secties voor 12 V, 5 V en massa. (E) Controle zwarte doos met geboorde gaten voor SPST tijdelijke drukknopschakelaars, met tape die elke knop labelt door klepbediening. (F) SPST kortstondige drukknopschakelaar met twee kleurgecodeerde krimpkousdraden die zijn gesoldeerd om blootgestelde gebieden te beschermen. (G) SPST kortstondige drukknopschakelaar gemonteerd op de zwarte doos van de bediening en vastgezet met de meegeleverde zeskantmoer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Geurkleppen en schema's. (A) Geurkleppen die stevig in sleuven zijn bevestigd en met schroeven zijn bevestigd. (B) Schema van de bedrading van de geurklep naar de SSR48-RACK en de schroefklemmenstrips. (C) Bedradingsschema van de zwarte doos van de bediening, voeding, SSR48-RACK en schroefklemmenblokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Opstelling van water en eindklep met voeding. (A) Water en eindkleppen toegevoegd aan de aangewezen sleuven in de olfactometer en vastgezet met schroeven. (B) Voedingsbedrading aangesloten om de olfactometer van stroom te voorzien. (C) Stroombedrading voor de SSR48-RACK. (D) Liksensor met aangesloten componenten, inclusief weerstanden, draden, LED en operationele versterker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Luchttoevoersysteem met debietmeters en slangen. (A) Debietmeters die met schroeven aan het rek zijn bevestigd. (B) Aquariumpomp aangesloten op slang, verbonden met een T-verbinding. (C) Een koolstoffilter met slang bevestigd aan de uitgang, met aansluitingen op individuele regelaars. (D) Slangen van regelaars die zijn aangesloten op de ingangen van de debietmeter. (E) Slangen bevestigd aan de uitgangen van de debietmeter. (F) Slang van het spruitstuk naar de uiteindelijke klepingang. (G) Afsluitklep met slang aangesloten op de geurpoort van de olfactometer. (H) Spuit van 5 ml gevuld met water, slang bevestigd aan een naald van 18 G. (I) Slang aangesloten op de ingang van de waterklep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 5: Definitieve waterklepaansluitingen en systeemoverzicht. (A) Slang van de uitgang van de waterklep naar de lixit in de olfactometer. (B) Aansluiting van de olfactometer op de DIO96H/50 met behulp van een female-to-female kabel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Voorbeeld van gedragsprestaties in een go/no go-taak voor een muis. Het percentage correcte antwoorden in elke sessie wordt weergegeven voor: (A) De eerste dag van voorwaartse conditionering (S+: 1% isoamylacetaat, S-: minerale olie). (B) De laatste dag van voorwaartse conditionering. (C) De eerste dag na omkering (S+: minerale olie, S-: 1% isoamylacetaat). (D) De laatste dag van omgekeerde conditionering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Concentratieverloop van isoamylacetaat in de geurpoort. Gemeten concentratie van 10% isoamylacetaat (verdund in minerale olie) in de geurpoort, met behulp van een foto-ionisatieapparaat (PID). Verticale lijnen geven het begin en einde van de geurafgifte aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Een uitgebreide stap-voor-stap handleiding voor het bouwen van een olfactometer die is ontworpen voor geurassociatietaken is te vinden in de literatuur. Onderzoekers kunnen verschillende uitdagingen tegenkomen tijdens de montage en bediening van het apparaat, maar gelukkig zijn er gevestigde methoden voor probleemoplossing om deze problemen aan te pakken. Eenmaal goed geconstrueerd en gekalibreerd, dient de olfactometer als een hulpmiddel van onschatbare waarde voor wetenschappers die experimenten uitvoeren met betrekking tot reukzin, waardoor nauwkeurige controle en afgifte van geurstimuli mogelijk is.

Kritieke stappen
De gedownloade MATLAB-versie moet 2015 zijn, aangezien de geschreven code compatibel is met deze versie en het gebruik van een andere versie tot problemen kan leiden. Het is belangrijk om te controleren of het juiste bord is geselecteerd in instacall. De installatie van mcc.dill kan worden bereikt door daqregister('mcc') uit te voeren terwijl u bent ingelogd als MATLAB-beheerder.

Probleemoplossing
Voer aan het begin van elke trainingsweek de kalibratiesoftware (InstaCal) uit om er zeker van te zijn dat de pc en de olfactometer correct met elkaar communiceren. Open dit programma, klik op het bord en klik op Digitale kalibratie. Het luchtdebiet moet worden gecontroleerd. De achtergrondluchtstroom moet 2 l/min zijn en de stroom naar de geurevenwichtsflesjes moet 50 ml/min zijn. Het is uiterst belangrijk om routinematig te controleren op luchtdebiet aan de uitgang van de olfactometer.

Voordat u een muis plaatst, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de volgende parameters worden getest: (1) Geurkleppen: De geurkleppen moeten worden vastgeklikt wanneer u op de knop op de zwarte doos drukt. Luchtslangen moeten in de minerale olie borrelen, zonder dat er minerale olie in de slang zit. (2) Geurslang: Als geuren geen luchtbellen produceren, kan de slang verstopt zijn waar deze doorgaans in de buurt van de klep knelt. Vervanging van de slang kan nodig zijn. (3) Eindklep en waterklep: De laatste klep moet correct openen en de slang moet worden gecontroleerd op goede werking. Voor de waterklep moet alle lucht die de waterstroom blokkeert, worden vrijgemaakt, zodat het water in de waterpomp kan stromen. (4) Luchtstroom: De debietmeters moeten er gekalibreerd uitzien en op de juiste manier zijn geplaatst. (5) Relaislichten: Zorg ervoor dat de "lichten" op de relais correct worden geactiveerd tijdens het experiment. (6) Waterbeloningsrelais: Wanneer een waterbeloning wordt uitgedeeld, moet het relais boven het water knipperen terwijl de beloning wordt uitgedeeld. (7) Geur- en waterbeloningsrelais: Wanneer een geur is gekoppeld aan een waterbeloning, moet het rode relais boven het overeenkomstige klepnummer rood knipperen tijdens de beloning.

Beperkingen
De go/no-go-taak test het vermogen van de muis om 2 geuren te testen. Om de taak uit te voeren, moet het dier verschillende sessies doorlopen. Dit is geen techniek met een hoge doorvoer voor het testen van geurdiscriminatie. De olfactometer is ontworpen om olfactorische stimuli te testen. Het is geen multisensorisch testapparaat. Er kunnen echter wijzigingen worden aangebracht om andere sensorische inputs te testen.

In dit artikel wordt een olfactometer voor vloeistofverdunning beschreven waarbij de lucht die door de in minerale olie verdunde geur borrelt met een snelheid van 50 ml/min vooraf in evenwicht wordt gebracht met de achtergrondluchtstroom van 2 l/min. Voor dit ontwerp voor de afgifte van geurstoffen bepaalt de kinetiek van geurverdunning in de draagluchtstroom de snelheid van de toename van de concentratie van de geur in de achtergrondluchtstroom. Zoals te zien is in figuur 7, neemt de concentratie binnen 200 ms toe tot de helft van de uiteindelijke concentratie, terwijl de concentratieverandering meer dan een halve seconde vertraagt. Hoewel deze configuratie geen vierkante stapverandering in geurconcentratie veroorzaakt, is deze met succes gebruikt om geurdiscriminatie en -detectie te bestuderen²¹. Als het experimentele protocol een stapsgewijze verandering in geurconcentratie vereist, moet het ontwerp voor geurafgifte worden gewijzigd in drie continue achtergrondluchtstroomkanalen van 2 l/min waarbij geurstoffen continu worden afgegeven in de achtergrondluchtstroom van twee van de achtergrondluchtstroomkanalen. Het derde afgiftekanaal zou lucht leveren die in evenwicht is met minerale olie. In dit geval zouden omleidingskleppen worden gebruikt om een van de twee geurstoffen of geurvrije lucht naar de geurpoort te leiden. Dit zou resulteren in een stapsgewijze toename van de geurconcentratie bij de geurpoort (ook eerdere rapporten ^19,22). Hoe dan ook, het is van cruciaal belang om het tijdsverloop voor de verandering in geurconcentratie te documenteren met behulp van een foto-ionisatiedetector.

De olfactometer die hier wordt beschreven, is ontworpen voor gedragsexperimenten bij muizen, maar dit ontwerp is in het verleden gebruikt voor ratten. Het belangrijkste verschil is dat het nodig is om de kamer te vergroten voor studies met ratten²³. Ten slotte beoordeelt deze olfactometer het olfactorische gedrag van een enkele muis. Er is een geautomatiseerde olfactometer met hoge doorvoer beschreven om meerdere muizen te testen²⁴.

Betekenis
Dit protocol beschrijft een op maat gemaakte olfactometer, die de kosten verlaagt in vergelijking met andere beschikbare methoden.

Toekomstige toepassingen
De olfactometer is speciaal ontworpen voor gebruik met muizen en moet worden aangepast voor gebruik met andere dieren, zoals ratten. Extra functies, zoals een opnamesysteem met meerdere elektroden (bijv. een opnamebord met meerdere elektroden), een Arduino Uno-bord of een camera, kunnen ook worden opgenomen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 1/8’’ modular ic breadboard socket	found on: amazon.com	ASIN ‏: B004MCSOQY	Powers the lights and lick censor
500 piece assorted carbon film resistors 1/4 watt	Found on amazon.com Brand:bojack		Resisters will go on the BreadBoard socket
50k-ohm linear taper potentiometer	Brand:TWTADE Found on: Amazon.com		Allows to the components of the olfactometer Power supply: Ac 220v-6A Shift diameter: 6mm/0.2” Shaft length: 15mm/0.59” mounting thread. Knob size 15/17mm/0.6 x 0.67”(d*H) the adjustment of power
5mm red LED	Found on: Amazon.com Brand:EDGELEC		Pre-wired with built in Resistor; 5mm round top bulb and wired LED's-Easy Connection with 3-6V DC Drive it, 7.9 inch long wires. Wattage: 1 Watts
6 position dual row brrier strip	Found on: Digikey.com	Base Product Number 1546306	Used for power and ground depending on how it is connected Voltage rating:300v Current rating (amps):20A Wire gauge:12-22 AWG
96 high current 50 pin connector female to female	Found on: Amazon.com Brand: ‎IIVVERR	Part Number:‎f5c953ee65a980d	Weight: 109G Pitch:2.54mm Total size: 50x6.4cm/2x2.5 inch
Aquarium pump -AAPA7.8L 125 GPH, 2 OUTLETS 3W	Found on:Amazon.com Brand: Hydrofarm store		This will connect to the double open end cold water housing and will be used to power the air on the machine
Barbed Tee connector polyethylene 1/4”	Found on: Uplastic.com	Item number:62200	Connects different air hoses to each other
Barbed Tee connector polyethylene 3/16”	Found on: Uplastic.com	Item number:62063	Connects different air hoses to each other
BD general use precision glide hypodermic needle 18 G ½	Found on: Medneedles.com	Item number: BD 305195	Used for the water system
Black box/manual control box	Brand:Otdorpatio Found on: Amazon	n/a	Used as the control box Dimensions: 3.94x2.68x1.97
Cable, pc power supply internal connections 10ft	Found on: Amazon.com		Connects to the power supply 40 watts
Cflex tubing, white ¼” id x 3/8” OD	Found on:uplastic.com	Item number:54033	Tubing used in the air system
custom-made white base board with holes to fasten the racks for odor valves, flow meters, SSR48 board	The Machine Shop of the Neurotechnology Center in the CU Anschutz Medical Campus
Diverter valve—miniature inert liquid valve, 3 way	Found on:Radwell.com	Part number:003-0258-900	1/8th BARB 24VDC UP TO 1500 SCCM 4.2W
Double open end cold water housing with blue sump	Found on:GRAINGER.COM BrandPENTAIR/PENTEK	Compatible Mfr. Model Number150295; 150578; 151117; 151118; 151120; 155003; 244043; 244686; 244687
Fisherbrand glass EPA vials	Found on: fishersci.com	Catalog no. 02-912-379	Used for odors
Fitting reducer 1/4” x 1/8”	Found on: uplastic.com	Item number: 64370	Adapter used in the air system hoses.
Hard Tubing, intramedic polyethylene,  0.045 (ID) 1 x 100
High infrared LED	Found on amazon.com Brand: gikfun		Memory clock speed 1mhz
Ic opamp gp 4 circuit 14dip	Found on: Amazon.com Brand:BOJACK		Operating Voltage 50 Volts Maximum Voltage 50 Volts
Jumper wire kit	Found on: Amazon.com Brand:Elegoo		Item Dimensions LxWxH: 0.04 x 8.27 x 0.04 inches
Mini spst momentary switch	Brand:Radioshack Found on: Amazon.com	B000TLWZM6	Used for the odor valves Operating volage: 250V Current rating:1 Amps
Multimeter	Found on Amazon.com Brand:AstroAl		Accurately measures AC/DC Current, AC/DC Voltage, Capacitance, Frequency, Duty Cycle, Resistance, Diode, Continuity and Temperature
Needle nose	Found on:amazon.com Brand:WorkPro		Will be used to bend wires
Odor valves	Found on:Radwell.com	SKU: 192833415 Part number:225T031	Pumps odors from odor vials. 30 PSIG 12 VDC
Phototransistor	Found on: Amazon.com Brand:HILETGO		Voltage: 1.3-1.5V Receive Range: (NM) 400-1000 Head Size: 5mm x 5mm / 0.2" x 0.2"(D*L)
Phototransistor and LED as pair
Pipe adapter 3/4” x 1/4”	Found on: uplastic.com	Item number: 64807	Adapter used in the air system hoses.
Pipe adapter for water housing pump- m ¾ x1/4”	Usplastic.com	Item number: 64807	Temperature range -50f to 275F Maximum pressure: 150psi Weoght 0.0015 lbs
Power supply 12v 30A 360W	Found on: Amazon.com Brand:ALITOVE		the main power source of the machine.  Input Voltage: 220 Volts Output: DC 12V 30A max.
PTFE Tubing	Found on Amazon.com
RITEFLOW FLOWMETERS WITH PLAIN ENDS (UNMOUNTED)	Found on:Globalindustrial.com Model number:t9FB3075514	Item number: H40407-0075	Monitors air flow in the olfactometer 150mm Scale, Size 2 Manufacturers Part Number:H40407-0075
Screw driver	Found on: Amazon.com Brand:Sharden		Used for screws on olfactometer
Shrimk wrap/tubing(various sizes to fir 18-22 gauge wire	Found on: Amazon.com Brand:eventronic		Material:Made of Polyolefin, Shrinkage Ratio:2:1 (will shrink to 1/2 its supplied diameter)
Silicone Tubing 0.030 x 0.065	Found on:Amazon.com Brand:Scientific commodities		Tubing for the odor vials
Solder- with lead	Found on:Uline.com	S-25294	Will be used with the soldering iron
Soldering iron	Found on:Uline.com	Model NO. H-10799	Will be used to solder the Bottons on the control box and other connections
Solid State Relay Module Quad Output – Red	Found on: https://www.sealevel.com/	Part: OB5Q   Model: DC Output QSSR Module	Capacitance: 8 pF Dimensions: 2.4" (L) x 1.1" (W) x 3.1" (H) # of I/O : 4 Outputs Max Line Voltage: 60 VDC Max On-State Current: 3A Minimum Line Voltage: 3 VDC Operating Temperature :-30°C to 80°C (-22°F to 176°F) Output Isolation: 4000 Vrms Storage Temperature: -40°C to 100°C (-40°F to 212°F)
SPST pushbutton switch	Brand:Apiele Found on: Amazon.com	n/a	Used inside of the control box control water valve and final valve. Operating voltage 250v Current rating: 1 Amps, 3 Amps
Ssr-rack 48	Found on:Radwell.com	SKU: 83105002	Processes all the connections of the olfactometer and works with quad-type sooid state relays.
Stainless steel feeding tubes
Tip tinner and cleaner	Found on: Amazon.com Brand:Thermaltronics	Model number: FBA-TMT-TC-2
Valve Ball PVC 1/4” barb buna	Found on: uplastic.com	Item number:62281
water valve	Found on: Ph.parker.com	Part #: 003-0257-900	Pumps water into the chamber Maximum Flow Rate: 1500 sccm Voltage (VDC): 24 Maximum Operating Pressure:50 psi, 3.44 bar
Wire 22awg	Brand:tuofeng Found on: Amazon.com	N/a	Used to wire different components of the olfactometer Material:copper Gauge 30.0
Wire snips	Found on:Amazon.com Brand:Billbotk		Will be used to snip wires
	As Brand: PTFE	Part #036663601452	Use for delivering odorants.
https://medschool.cuanschutz.edu/neurotechnologycenter/Cores/machine-shop