Methodenartikel

Studies naar het ontstekingsremmende effect van Xiaoyao-pillen bij de behandeling van postmenopauzale osteoporose bij muizen

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67051

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

In dit artikel

Samenvatting

Postmenopauzale osteoporose is een wereldwijd probleem voor de volksgezondheid geworden. Het doel van deze studie is om de therapeutische effecten en gerelateerde mechanismen van de traditionele Chinese geneeskunde Xiaoyao-pillen op deze aandoening te onderzoeken.

Samenvatting

Osteoporose is een veel voorkomende stofwisselingsziekte bij oudere en postmenopauzale vrouwen, zonder duidelijke symptomen in de vroege stadia. In de laatste stadia van deze aandoening zijn de patiënten vatbaar voor fracturen, en dit kan hun gezondheid en kwaliteit van leven ernstig aantasten. Door de wereldwijde stijging van de levensverwachting is osteoporose een wereldwijd probleem geworden. De Xiaoyao-pillen waren eerder
Gebruikt bij de behandeling van depressie. Bovendien leek het medicijn oestrogeenachtige activiteit te hebben, wat de expressie van ALP, een vroege osteoblast-specifieke marker, en COL-1, een belangrijk onderdeel van de extracellulaire matrix van het bot, beïnvloedde. Xiaoyao-pillen werden beoordeeld op hun effecten op postmenopauzale osteoporose (PMOM) bij muizen. De doelinformatie van elke kruidencomponent van Xiaoyao-pillen was toegankelijk via de database van Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP). Informatie van GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank en andere websites werd gebruikt om het regulerende netwerk van het kruidencomplex te construeren via Cytoscape en String-netwerk om de eiwitinteracties te beoordelen. Muizen werden ovariëctomie ondergaan en behandeld met hoge en lage doses Xiaoyao-pillen en deze werden vergeleken met controles. Hun symptomen werden beoordeeld door immunocytochemie van botweefsel. De resultaten suggereerden dat Xiaoyao-pillen het vermogen hadden om de symptomen van PMOM bij muizen met ovariëctomie te verlichten via de IL-17-signaleringsroute. Dit medicijn heeft het potentieel om een nieuw therapeutisch middel te worden voor de behandeling van osteoporose.

Inleiding

De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) definieert osteoporose (OP) als een ziekte die wordt gekenmerkt door een afname van de botmassa en verslechtering van de microarchitectuur van botweefsel, wat leidt tot een toename van botbrosheid en dus een verhoogd risico op fracturen. De klinische betekenis van osteoporose is dat het kan leiden tot fracturen, die gepaard gaan met hoge mortaliteit, morbiditeit en economische kosten2. Postmenopauzale osteoporose (PMOP) wordt veroorzaakt door een afname van de oestrogeenspiegels bij vrouwen na de menopauze, wat leidt tot een toename van de osteoclastactiviteit, wat resulteert in botverlies en vernietiging van de botmicrostructuur. Dit veroorzaakt vaak osteoporose met ernstige gevolgen voor de gezondheid3. Huidige therapieën voor PMOP omvatten oestrogeenvervangingstherapie, bisfosfonaten en bijschildklierhormoon, maar ze kunnen verschillende gradaties van nadelige effecten, onvoldoende therapietrouw op de lange termijn en hoge kosten hebben4. Daarom is betaalbare kruidengeneeskunde een levensvatbaar alternatief voor een groot deel van de bevolking.

Xiaoyao-pillen zijn opgenomen in de Chinese Farmacopee5 en bevatten acht kruidencomponenten, waaronder Chai Hu, Angelica sinensis, White paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, zoethout en verse gember. Van al deze kruiden is bekend dat ze effectief zijn bij het ontgiften van de lever en het versterken van de milt, het voeden van het bloed en het reguleren van de menstruatiecyclus, en het mengsel is ook gebruikt voor de behandeling van depressie6. De rol van Xiaoyao-pillen bij osteoporose is echter onduidelijk.

Vroege studies hebben gesuggereerd dat ontsteking kan leiden tot botverlies7, en dat de afname van de botdichtheid die met dit proces gepaard gaat, kan worden versneld door de menopauze. Daarnaast is er een sterke relatie tussen de ontwikkeling van osteoporose en ontstekingen. De ontstekingsfactor, interleukine-17 (IL-17), is een pro-inflammatoire factor die wordt uitgescheiden door Th17-cellen, een subset van CD4+ T-lymfocyten. Deze cellen worden in verband gebracht met verschillende chronische ontstekingsaandoeningen en spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van botafbraak bij reumatoïde artritis8. Bovendien stimuleert IL-17 de nucleaire factor-κ B-ligandreceptoractivator (RANKL), die osteoclastogenese reguleert, wat leidt tot een grotere botresorptie dan botvorming9. IL-17 stimuleert de expressie van andere osteoclastogene cytokines zoals TNFα, IL-1, IL-6 en IL-8. Het heeft het vermogen om samen te werken met andere ontstekingsfactoren, waardoor het een belangrijk ontstekingseffect is10.

Studies hebben ook een verband aangetoond tussen Xiaoyao-pillen en ontstekingen. Shi et al.11 en Fang et al.12 hebben onlangs bevestigd dat Xiaoyao-pillen de niveaus van respectievelijk IL-6 en TNF-α kunnen verlagen. In een ander onderzoek naar metabolisme-geassocieerde steatohepatitis werd gemeld dat Xiaoyao-pillen de expressie van propionzuur konden verhogen, wat op zijn beurt de expressie van TNF-α remt en een ontstekingsremmend effect uitoefent13. Op dit moment is het echter niet bekend of Xiaoyao-pillen de ontwikkeling van PMOM kunnen reguleren door een ontstekingsreactie via IL-17 te mediëren, wat het doel van deze studie was.

Deze studie voorspelde de kruising van de doelen van Xiaoyao-pillen en osteoporose-gerelateerde genen door middel van netwerkfarmacologie en bio-informatica-analyse en analyseerde de kruisende genen voor eiwitinteracties, GO en KEGG. Op basis van de voorspelde resultaten kan de expressie van Act1 en IL-6, die sleuteleiwitten zijn in de IL-17-signaleringsroute, worden waargenomen14,15, evenals de botomzetmarkers alkalische fosfatase (ALP) en collageen type I (COL-1), om de therapeutische werkzaamheid van de Xiaoyao-pillen in het PMOM-muizenmodel te observeren.

Protocol

De Ethische Commissie voor Proefdieren van de Youjiang Medical University for Nationalities keurde het onderzoeksprotocol goed (goedkeuringsnummer: 2022101502). Vrouwelijke C57BL/6-muizen, in de leeftijd van 10-12 weken, SPF-klasse en lichaamsgewicht (22 ± 2) g, werden gehuisvest in het SPF-klasse dierexperimentcentrum van de Youjiang Medical University for Nationalities. De proefdieren werden op een temperatuur van 24-26 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 55% tot 60% gehouden.

1. Farmacologiedatabase en analyseplatform voor traditionele Chinese geneeskundesystemen

OPMERKING: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) zijn platforms voor farmacologie in de Chinese geneeskunde die informatie bevatten over TCM-ingrediënten, ADME-gerelateerde eigenschappen, doelen en ziekten16,17.

  1. Ga naar de TCMSP-webinterface. Zoek naar de naam van Herb, voer de naam van het Chinese medicijn in en klik op Zoeken. Klik op Latijnse naam in de zoekresultaten. Voer screening uit op de resultaten van de ingrediënten met de parameters OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18.
  2. Kopieer alle resultaten en sla ze op in TXT-formaat, genaamd Chinese Medicine Name_ingredients.txt.
  3. Filter onder Informatie over doelen op het tabblad Gerelateerde doelen op Mol-ID (d.w.z. het resultaat in stap 1.2).
  4. Kopieer de gefilterde resultaten en sla ze op in TXT-indeling met de naam Chinese Medicine Name_targets.txt.
    OPMERKING: Door de bovenstaande stappen werden alle in aanmerking komende actieve ingrediënten en de bijbehorende doelinformatie van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) verkregen.
  5. Plaats alle bovenstaande ingredients.txt bestanden en targets.txt bestanden in dezelfde map en plaats de Perl-scripts (Supplementary Coding File 1) in die map.
  6. Open CMD, typ het pad van de cd-map, voer het in en voer het Perl-script uit. Haal een nieuw tekstbestand op (allTargets.txt). Dit nieuwe tekstbestand (allTargets.txt) bevat de naam van het kruid, de naam van het ingrediënt, de ingrediënt-ID en het doel.

2. UniProt-databank

OPMERKING: De UniProt-database (https://www.uniprot.org/) bevat menselijke eiwitsequenties geannoteerd met functionele informatie, en wordt gebruikt om de namen van doelen te normaliseren naar hun officiële namen18.

  1. Ga naar de UniProt webinterface. Klik op het tabblad Zoeken , selecteer UniProtKB en klik op Zoeken.
  2. Filter in de linkerzijbalk, selecteer Beoordeeld (Swiss-Prot) voor Status en Menselijk voor Populaire organismen. Klik op Downloaden, selecteer Alles downloaden, selecteer TSV bij Indeling en klik op Downloaden om het annotatiebestand te downloaden.
  3. Pak het gedownloade bestand uit in de huidige map, open het uitgepakte bestand en kopieer en plak het in een tekstbestand met de naam ann.txt.

3. Conversie van doel-ID's voor geneesmiddelen

  1. Stop alle drug target files die allTargets.txt verkregen in sectie 1 en het UniProt annotatiebestand ann.txt verkregen in sectie 2 in een map en stop de Perl scripts (Supplementary Coding File 2) erin.
  2. Open CMD, typ cd + spatie + mappad, voer het in en voer het Perl-script uit om een nieuw tekstbestand (allTargets.symbol.txt) te verkrijgen. Dit nieuwe tekstbestand (allTargets.symbol.txt) bevat de kruidennaam, de ingrediënt-ID, de ingrediëntnaam en de gen-ID.

4. Zoeken in de database

  1. GeneCards: Database met menselijke genen (GeneCards) database
    OPMERKING: De GeneCards-database (https://www.genecards.org/) biedt voorspellings- en annotatie-informatie voor menselijke genen. Het wordt gebruikt om toegang te krijgen tot ziektedoelen19,20.
    1. Ga naar de webinterface van GeneCards. Typ osteoporose in het zoekvak en klik op Zoeken.
    2. Klik op Exporteren en selecteer Exporteren naar Excel.
    3. Open het gedownloade bestand, kopieer de genen met relevantiescore ≥ 1, plak ze en sla ze op in een bestand met de naam GeneCards.txt.
  2. OMIM-databank
    OPMERKING: De OMIM-database (https://omim.org) bevat menselijke genen, genetische ziekten en eigenschappen21.
    1. Ga naar de webinterface van OMIM. Klik op GENE Map, typ osteoporose in het zoekvak en klik op Zoeken.
    2. Klik op Downloaden als en selecteer Excel-bestand.
    3. Open het gedownloade bestand, kopieer de gennaam in de kolom Goedgekeurd symbool, plak het en sla het op in een bestand met de naam OMIM.txt.
  3. PharmGkb databank
    OPMERKING: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), de kennisbank voor farmacogenomica, bevat annotaties op het etiket van geneesmiddelen, geneesmiddelgerichte routes, farmacogenetische samenvattingen en relaties tussen genen, geneesmiddelen en ziekten22.
    1. Ga naar de interface van de PharmGkb-website. Typ osteoporose in het zoekvak, klik op Zoeken en vink Gen aan in de linkerzijbalk.
    2. Voer alle resultaten handmatig in en sla ze op in een bestand met de naam PharmGkb.txt.
  4. TTD: Therapeutische Target Database (TTD) database
    OPMERKING: De TTD-database (https://idrblab.org/ttd/) biedt informatie over eiwit- en nucleïnezuurdoelen, gerichte ziekten, route-informatie en overeenkomstige geneesmiddelen voor elk doelwit23.
    1. Ga naar de TTD-webinterface. Typ osteoporose in het zoekvak en klik op Zoeken.
    2. Klik op Doelgegevens onder Doel-id in het resultaat, kopieer de doelnaam, plak deze en sla deze op in een bestand met de naam TTD.txt. In totaal werden 33 resultaten verkregen. Sla elk resultaat op dezelfde manier op.
  5. Database van DrugBank Online (DrugBank)
    OPMERKING: De DrugBank-database (https://go.drugbank.com) bevat informatie over geneesmiddelen en geneesmiddeldoelwitten, geneesmiddelinteracties, geneesmiddelmechanismen en geneesmiddelmetabolisme24.
    1. Ga naar de interface van de DrugBank-website. Selecteer Indicaties op het tabblad Zoeken, typ osteoporose in het zoekvak en klik op Zoeken.
    2. Klik op de vermelding Osteoporose in de resultaten voor meer informatie, klik op het tabblad GENEESMIDDELEN EN DOELEN en klik op de juiste link in de TARGET-kolom van de tabel.
    3. Klik op Details in Eiwit, kopieer de gennaam, plak deze en sla deze op in een bestand met de naam DrugBank.txt. Sla elk resultaat op dezelfde manier op.

5. Venn-diagram

  1. Ziekte-geassocieerde genfusie en venn-mapping
    1. Zet de opgeslagen txt-bestanden en het script in dezelfde map.
    2. Open de R-code (Merge Disease-Related Genes), kopieer en plak het pad waar het bovenstaande txt-bestand is opgeslagen in de regel waar de setwd zich bevindt in de R-code.
    3. Open de R-software, voer de gewijzigde R-code uit en sla op. Stel het gen in, geef het bestand een Disease.txt.
    4. Open de website van het Draw Venn Diagram; Kopieer en plak in de invoersectie de tekstinhoud die in de secties 4 tot en met 8 is opgeslagen één voor één in de lijst, geef deze een naam met de betreffende database en klik op Verzenden.
    5. Klik op Afbeelding opslaan als PNG onder de afbeelding en sla het tekstresultaat op in dezelfde map.
  2. Kruising van geneesmiddeldoelen en ziekte-geassocieerde genen
    1. Plaats het allTargets.symbol.txt bestand dat in sectie 3 is verkregen en het Disease.txt bestand dat in stap 5.1.3 is verkregen, in dezelfde map.
    2. Open de R-code (drug target and disease-related gene take intersection), kopieer en plak het pad waar het bovenstaande txt-bestand is opgeslagen naar de regel waar de setwd zich bevindt in de R-code.
    3. Open de R-software, voer de gewijzigde R-code uit en sla op. Stel het gen in, geef het bestand een Drug_Disease.txt.
    4. Open de website van het Draw Venn-diagram. Kopieer en plak in het invoergedeelte allTargets.symbol.txt en Disease.txt in de lijst en noem ze naar hun respectievelijke bestanden.
    5. Klik op Afbeelding opslaan als PNG onder de afbeelding en sla de tekstresultaten op in dezelfde map.

6. Opbouw van het regulerend netwerk van TCM-compounding

  1. Plaats het allTargets.symbol.txt bestand dat in sectie 3 is verkregen in dezelfde map als het Disease.txt-bestand en het bijbehorende Perl-script (Supplementary Coding File 3).
  2. Open CMD, typ het pad van het cd-bestand, druk op Enter en voer het Perl-script uit. Krijg vier nieuwe txt-bestanden: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt en net.type.txt. Het network.txt bestand bevat de TCM-ingrediënt-ID, het doelgen, de doelrelatie en de naam van het ingrediënt. net.type.txt bevat de naam, kenmerken en affiliatie van knooppunten. net.geneLists.txt is de lijst van genen, en net.molLists.txt is de lijst van ingrediënten.
  3. Kopieer de nieuw verkregen tekstbestanden in dezelfde nieuwe map.
  4. Open de Cytoscape 3.9.1-software, klik op Bestand, klik op Importeren en selecteer Network Form File. Selecteer net.network.txt, plaats de eerste kolom van Component-ID als Bronknooppunt, de tweede kolom van Genen als Doelknooppunt en de derde kolom van Doelrelatie als Interactietype en klik op OK.
  5. Importeer net.type.txt uit het venster Knooppuntentabel. Klik op het tabblad Selecteren, selecteer Knooppunten, selecteer Uit ID-lijstbestand, selecteer net.geneLists.txt en klik op Openen.
  6. Klik op het tabblad Lay-out, selecteer Indeling van in graden gesorteerde cirkels en selecteer Alleen geselecteerde knooppunten. Pas zowel de hoogte als de breedte van de knooppunten aan op 70.
  7. Klik op het tweede vak in Hoogte, selecteer graden.layout in Kolom, selecteer Continue toewijzing in Toewijzingstype en dubbelklik op het venster Hoogteaanpassing aan de rechterkant van Huidige toewijzing om de boven- en ondergrenzen van de hoogte aan te passen aan een geschikt bereik.
  8. Herhaal de bewerking met de optie Breedte.
  9. Klik nogmaals op het tabblad Lay-out en klik op Hulpmiddelen voor lay-out > Pas de schaal aan zodat de knooppunten elkaar niet overlappen.
  10. Klik op het venster rechtsboven van de software om het knooppuntnetwerk uitgeschakeld te maken, klik op het tabblad Selecteren , selecteer Knooppunten, selecteer Uit ID-lijstbestand, selecteer net.molLists.txt en klik op Openen.
  11. Klik op het tabblad Lay-out, selecteer Lay-out groepskenmerken, selecteer Alleen geselecteerde knooppunten en klik op Type.
  12. Klik op Label Lettergrootte in de linkerkolom en stel Standaardwaarde in op 12. Klik op Standaardwaarde in Afbeelding/Grafiek 1 in de linkerkolom.
  13. Selecteer Grafieken in het pop-upvenster, klik op Cirkeldiagram en selecteer de items in de kolom Beschikbare kolommen, behalve voor graden. Lay-out op de kolom met geselecteerde kolommen en klik op Toepassen.
  14. Klik op Border Paint in de linkerkolom en stel de standaardwaarde in op #003EF8. Klik op het tabblad Rand onder aan de linkerzijbalk en stel Breedte in op 0,8.
  15. Klik op Bestand op de bovenste werkbalk, selecteer Exporteren en selecteer vervolgens Netwerk naar afbeelding.
  16. Selecteer in het pop-upvenster PNG-indeling voor Formaat, selecteer de opslagmap en geef het afbeeldingsnetwerk een naam, stel de zoom in Afbeeldingsgrootte in op de maximale 500%, selecteer Transparante achtergrond en klik op OK om het opslaan van de afbeelding te voltooien.

7. Eiwit-eiwit interactienetwerken (PPI) constructies

  1. Open de STRING-website (https://string-db.org/), klik op Multiple Protein, klik op Bladeren in Upload een bestand, selecteer het Drug_Disease.txt bestand dat is verkregen in stap 5.2.3 en selecteer Homo sapiens in Organisms. Klik op Zoeken en klik op Doorgaan.
  2. Klik op Instellingen, stel de minimaal vereiste interactiescore in op de hoogste betrouwbaarheid (0,900) en vink Verberg niet-verbonden knooppunten in het netwerk aan in de netwerkweergave-opties. Klik op Bijwerken.
  3. Maak aanpassingen aan de knooppunten in het netwerkdiagram zodat er geen overlapping of occlusie is.
  4. Klik op Exports en klik op Downloaden als bitmap met hoge resolutie om de kaart van het eiwitinterwerkende netwerk in PNG-indeling te krijgen. Download ook het TSV-bestand als een korte tekstuitvoer in tabelvorm. Sla beide bestanden op in een uniforme map. Het TSV-bestand bevat de gennaam, de interne STRING-ID en scores voor verschillende attributen.

8. De bouw van de PPI-netwerkkern

  1. Plaats het TSV-bestand verkregen in sectie 7 en de benodigde Perl-scripts in een nieuwe map.
  2. Open de Cytoscape 3.9.1-software, klik op Bestand, selecteer Importeren, klik op Netwerk uit bestand, selecteer het bovenstaande TSV-bestand, plaats het eerste kolomknooppunt1 als bronknooppunt en het tweede kolomknooppunt2 als doelknooppunt en klik op OK.
  3. Klik op Stijl in de linkerzijbalk, klik op Standaardwaarde in breedte en stel deze in op 60. Sleep de knooppunten en zet ze neer zodat er geen overlapping en geen occlusie in het netwerk is.
  4. Klik op APP's in de bovenste werkbalk, klik op CytoNCA en klik op Openen.
  5. Selecteer in de linkerkolom Zonder gewicht onder Tussenheid, Nabijheid, Graad, Eigenvector, Lokale gemiddelde connectiviteitsmethode en Netwerk en klik op Analyseren.
  6. Wanneer de analyse is voltooid, klikt u op Knooppunttabel in het venster rechtsonder, klikt u op Exporteren, slaat u het op in de map en geeft u het score 1.
    OPMERKING: De CytoNCA-plug-in moet worden geïnstalleerd in de Cytoscape-software. Om dit te doen, klikt u op Apps in de bovenste werkbalk, klikt u op APP Manager, voert u CytoNCA in het zoekvak in, schakelt u CytoNCA in de middelste kolom van de geretourneerde resultaten in en klikt u op Installeren.
  7. Open score1, pas de naamkolom aan naar de eerste kolom, kopieer de informatie in de tabel, plak deze in een nieuw tekstbestand, geef deze een naam score1.txt en sla deze op.
  8. Open de R-code en kopieer en plak het pad waar het score1.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar de setwd zich in de R-code bevindt.
  9. Open de R-software en voer de gewijzigde code uit om twee nieuwe bestanden te krijgen, score2.txt en score2.gene.txt. Het score2.txt-bestand bevat de genen waarvoor alle programmascores groter waren dan de mediaan en de specifieke scores voor elk programma. score2.gene.txt bevat de genen die voor alle items hoger scoorden dan de mediaan.
  10. Om door te gaan in Cytoscape, klikt u op AnalysisPanel 1 in het venster rechtsonder, klikt u op Uploaden uit bestand aan de linkerkant van het venster, selecteert u de score2.gene.txt, klikt u op Openen en tikt u op OK in het pop-upvenster.
  11. Klik onderaan op Knooppunten selecteren en klik op OK in het pop-upvenster.
  12. Klik op Bestand in de bovenste werkbalk, selecteer Exporteren, klik op Netwerk naar afbeelding, pas de zoom (%) in Afbeeldingsgrootte aan tot maximaal 500%, vink Transparante achtergrond aan en sla het bestand op in dezelfde map, noem het netwerk1.
  13. Klik op Subnetwerk maken in de rechterzijbalk van het onderste venster om een subnetwerk te maken, analyseer het subnetwerk, klik op APP's in de werkbalk bovenaan, klik op CytoNCA en klik op Openen.
  14. Selecteer in de linkerzijbalk Zonder gewicht onder Tussenheid, Nabijheid, Graad, Eigenvector, Op lokale gemiddelde connectiviteit gebaseerde methode en Netwerk en klik op Analyseren.
  15. Wanneer de analyse is voltooid, klikt u op Knooppunttabel in het venster rechtsonder, klikt u op Exporteren en slaat u deze op in een nieuwe map met de naam score2.
  16. Open score2, pas de naamkolom aan naar de eerste kolom, kopieer de informatie in de tabel, plak deze in een nieuw tekstbestand, geef deze een naam score2.txt en sla deze op.
  17. Open de R-code en kopieer en plak het pad waar het score2.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar de setwd zich bevindt in de R-code.
  18. Open de R-software en voer de gewijzigde code uit om twee nieuwe bestanden te krijgen: score3.txt en score3.gene.txt. Het score3.txt bestand bevat de genen die hoger scoorden dan de mediaan voor alle items en de specifieke scores voor elk item. score3.gene.txt bevat de genen die voor alle items hoger scoorden dan de mediaan.
  19. Om door te gaan in Cytoscape, klikt u op AnalysisPanel 1 in het venster rechtsonder, klikt u op Uploaden uit bestand aan de linkerkant van het venster, selecteert u de score3.gene.txt, klikt u op Openen en tikt u op OK in het pop-upvenster.
  20. Klik onderaan op Knooppunten selecteren en klik op OK in het pop-upvenster.
  21. Klik op Bestand in de bovenste werkbalk, selecteer Exporteren, klik op Netwerk naar afbeelding, pas Zoom (%) in Afbeeldingsgrootte aan tot 500%, vink Transparante achtergrond aan en sla het bestand op in dezelfde map als degene die in deze stap wordt gebruikt, en noem het netwerk2.
  22. Klik op Subnetwerk maken in de rechterzijbalk van het onderstaande venster om een subnetwerk te maken.
  23. Klik op Bestand in de werkbalk bovenaan, selecteer Exporteren, klik op Netwerk naar afbeelding, pas de zoom (%) in afbeeldingsgrootte aan tot het maximum van 500%, vink Transparante achtergrond aan en sla het bestand op in dezelfde map als gebruikt in deze stap en noem het netwerk3.

9. Conversie van gen-ID

  1. Plaats het Drug_Disease.txt-bestand in dezelfde nieuwe map als het gewenste codebestand.
  2. Open de R-code (Supplementary Coding File 4) en kopieer en plak het pad waar het Drug_Disease.txt-bestand zich bevindt naar de regel waar de setwd zich bevindt in de R-code.
  3. Open de R-software, voer de gewijzigde code uit met behulp van de org. Hs.eg.db pakket om de gen-ID te converteren en uit te voeren na de voltooiing van een nieuw bestand id.txt. De id.txt bevat het symbool van het gen en de bijbehorende ID.

10. Analyse van GO-verrijking

  1. Plaats het id.txt bestand uit de vorige stap in dezelfde map als de GO-verrijkingsanalysecode.
  2. Open de R-code (Supplementary Coding File 5) en stel de werkmap in op id.txt en het pad waar de GO-code is opgeslagen.
  3. Open R-software, voer de gewijzigde code uit en gebruik clusterProfiler, org. Hs.eg.db, verrijk de plot, ggplot2 plot, de GO verrijkingsanalyse histogrammen en bubble plots. Haal drie nieuwe bestanden op, GO.txt, barplot.pdf en bubble.pdf, nadat de uitvoering is voltooid.
    OPMERKING: Het GO.txt is het verrijkingsresultaatbestand met verrijkingsclassificatie (BP, CC, MF), GO ID, GO-naam, genverhouding, achtergrondverhouding, verrijkingssignificantie p-waarde, gecorrigeerde p-waarde (p.adjust, waarde), gen-ID (naam) en aantal genen verrijkt op elke GO. barplot.pdf is het histogram, de bubbel. PDF is een bellenplot.

11. Analyse van KEGG-verrijking

  1. Plaats het id.txt-bestand in dezelfde map als de KEGG-verrijkingsanalysecode.
  2. Open de R-code (aanvullend coderingsbestand 6) en stel de werkmap in op het pad waar id.txt- en KEGG-code zijn opgeslagen.
  3. Open de R-software, voer de gewijzigde code uit en gebruik de clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2-pakket om GO verrijkingsanalysehistogrammen, bellenplots en padplots te plotten. De run wordt afgerond met de productie van drie nieuwe bestanden, KEGG.txt, barplot.pdf en bubble.pdf.
    OPMERKING: Het KEGG.txt-bestand is een verrijkingsresultaatbestand met route-ID, routebeschrijving, genverhouding, achtergrondverhouding, verrijkingssignificantie p-waarde, gecorrigeerde p-waarde (p.adjust, q-waarde), gen-ID (naam) en het aantal genen dat in elke route is verrijkt. barplot.pdf is een staafdiagram en bubble.pdf is een bellendiagram.
  4. Zoek IL-17 in het KEGG.txt bestand; Het resultaat laat zien dat er maar één route is; kopieer de pad-ID.
  5. Open de R-code, plak de IL-17-route-ID bij KEGGID en gebruik het pathview-pakket om de padkaart te labelen. Voer de gewijzigde R-code uit en krijg twee nieuwe bestanden, hsa04657.pathview.png en hsa04657.png.
    OPMERKING: Het hsa04657.png-bestand is de padkaart, hsa04657.pathview.png is de gelabelde padkaart en de rood gelabelde genen zijn de genen die aanwezig zijn in het interactienetwerk.

12. Bereiding van Xiaoyao-pillen

OPMERKING: Raadpleeg voor de gebruikte bereidingsmethode de Chinese Farmacopee5.

  1. Neem 100 g Chai Hu, 100 g Angelica sinensis, 100 g White Paeonia lactiflora, 100 g gewokte Atractylodes macrocephala, 100 g Poria cocos, 80 g Radix glycyrrhizae preparate en 20 g Menthae herba.
  2. Plet de kruiden met behulp van een steenmolen of een poedermachine tot een fijn poeder; Verschillende kruiden worden in de bovenstaande verhoudingen gecombineerd en verpulverd tot een fijn poeder om op natuurlijke wijze met elkaar te mengen. Gebruik een medicijnzeef met 80 mazen en een binnendiameter van 180 μm ± 7,6 μm en zeef het verpulverde poeder. Meng.
  3. Neem 100 g gember, voeg water toe en kook het 2x gedurende 20 minuten per keer. Zeef en zet opzij.
  4. Neem een medicinale plaque, dompel een kleine bezem in gemberwater, borstel deze op de plaque, neem het bovenstaande poeder, strooi het op het gemberwater en draai de plaque zodat al het poeder nat is en het in een balvorm kan worden gegoten.
    OPMERKING: De vorming van de medicinale plaque is een essentiële stap tijdens de bereiding van TCM-pillen. Het grootste deel van de moso bamboe wordt in reepjes gespleten en tot een skelet geweven. De bamboehuid, of tengpi, wordt in het oppervlak geweven en wordt afgerond. Het oppervlak van de plaque moet dun worden bedekt met tungolie en vervolgens worden geborsteld met een vernislaag. Dit wordt gedroogd om waterdicht te worden. De pillen die op deze manier worden gemaakt, zijn rond en glad.
  5. Borstel het gemberwater er opnieuw op, strooi het poeder erover en draai de tandplak zodat het medicijn geleidelijk wordt afgerond en vergroot. Zet op een koele plaats om te drogen.

13. Vaststelling van het diermodel

  1. Na 7 dagen acclimatisatie, verdeelt u de experimentele muizen willekeurig in 4 groepen, namelijk de schijnoperatiegroep (Sham, waarbij alleen het vet rond de eierstokken werd verwijderd) en drie groepen muizen met ovariëctomie bestaande uit een modelgroep (OVX) en groepen met lage en hoge concentratie Xiaoyao-pillen.
  2. Verdoof de muizen met 3% natriumpentobarbital (40 mg/kg) intraperitoneaal geïnjecteerd. Controleer of de muizen in de anesthesietoestand komen door te kijken naar algemene spierontspanning, diepe en langzame ademhaling en vertraagde bewegingen. Breng vóór de operatie oogzalf aan op de ogen van de muizen.
  3. Leg de dieren in buikligging en scheer het niergebied van de rug met een scheerapparaat. Voer lokale desinfectie uit met 75% ethanol.
  4. Maak bilateraal een longitudinale incisie van ongeveer 1 cm, dicht bij het dorsale gebied van de nier, en snijd de fascia in om de spieren en het buikvlies te scheiden.
  5. Zoek het bovenste deel van de baarmoederhoorn en de eileiders voor ligatie. Steek een tang in de incisie voor verkenning en lokaliseer de eierstok, omhuld door vetweefsel in een felrood bloemkoolpatroon, met spiraalvormig gerangschikte eileiders onder de eierstok, die de eierstok verbinden met de baarmoederhoorn25. Verwijder de eierstokken met een chirurgische schaar en hechtdraad.
  6. Verwijder een kleine hoeveelheid vetweefsel in de buurt van de eierstok als controle in de schijnoperatiegroep. Observeer dieren totdat ze weer bij bewustzijn komen. Plaats postoperatieve dieren in aparte kooien tot volledig herstel.
  7. Om infectie te voorkomen, moet u muizen gedurende 3 dagen na de operatie gentamicine geven. Zorg na de operatie voor een normaal dieet en een goede groeiomgeving in overeenstemming met de werkelijke toestand van de muizen. Als er afwijkingen zijn, zoals een wondinfectie of verlies van eetlust, raadpleeg dan direct de instructeur van het Proefdierencentrum.

14. Toediening van medicatie

OPMERKING: Volgens Pharmacology Experimental Methodology26 was de conversie van de gebruikte doseringen voor mens en dier 9 g Xiaoyao-pillen voor een volwassene van 70 kg, wat overeenkomt met één dosis (dosering voor een enkele toediening).

  1. Gebruik voor de groepen met lage en hoge doses respectievelijk 0,683 g/kg en 2,73 g/kg voor een groep van 8 dieren. Gebruik de linkerhand om de muis te immobiliseren, zodat de mond van de muis zich in een rechte lijn met de slokdarm bevindt. Houd de maagsondenaald in de rechterhand en steek deze voorzichtig vanuit de mondhoek van de muis in de slokdarm langs de achterwand van de keelholte.
  2. Op dit punt kan de richting van de sondenaald enigszins worden gewijzigd om een geïnduceerde slikactie te stimuleren. Injecteer het medicijn. Voer dit eenmaal daags uit gedurende 12 weken.
  3. Voor de schijn- en modelgroepen, toediening van zoutoplossing eenmaal per dag gedurende 12 weken in een hoeveelheid die wordt bepaald door het gewicht van het dier.
  4. Euthanaseer muizen door cervicale dislocatie en knip hun achterpoten af. Huid de ledematen om de spier van het dijbeen te scheiden. Behandel de dijbenen van muizen gedurende 1 maand met EDTA-ontkalkingsoplossing en vervang deze dagelijks door een verse oplossing.

15. Hematoxyline-eosine kleuring (HE) kleuring

  1. Ontwas het dijbeenweefsel gedurende 8 minuten en plaats het vervolgens gedurende 3 minuten in gradiëntethanol; Spoel af met stromend water gedurende 1 min.
  2. Voeg de hematoxylinekleuringsoplossing druppelsgewijs toe aan de secties om het weefsel volledig te bedekken, vlek gedurende 5 minuten en was met kraanwater
  3. Voeg de zoutzuurdifferentiatieoplossing toe aan het weefsel op het objectglaasje en zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is. Stop wanneer verkleuring van het weefsel wordt waargenomen. Spoel af met kraanwater.
  4. Voeg de Eosine-kleurstofoplossing druppelsgewijs toe en laat het weefsel volledig bedekken, inwerkend gedurende 30 s tot 2 minuten. Spoel de overtollige kleurstof af met stromend water.
  5. Voer gradiënt-ethanoluitdroging uit met 75% watervrije ethanol gedurende 5 minuten, gevolgd door watervrije ethanol gedurende 5 minuten en helder met een wasoplossing gedurende 3 minuten.
  6. Laat een geschikte hoeveelheid neutrale kauwgom op het glaasje vallen, afhankelijk van de grootte van het weefsel, en laat het dekglaasje voorzichtig zakken, vermijd luchtbellen.

16. Micro-CT en immunohistochemische analyse

  1. Verwijder overtollige spieren en ligamenten rond de dijbeenmonsters van verschillende groepen muizen en fixeer de monsterweefsels gedurende 24 uur in 4% paraformaldehyde.
  2. Botweefsel aan de lucht drogen en micro-CT uitvoeren door botweefselscan om driedimensionale micro-CT-gegevens te verkrijgen.
  3. Snijd van de geconserveerde muizenwasblokjes ze in aaneengesloten secties van 6 μm dik en bak de plakjes 30-60 minuten op 70 °C -72 °C.
  4. Dewax gedurende 8 minuten, gevolgd door een behandeling met 75% watervrije ethanol gedurende 5 minuten, watervrije ethanol gedurende 5 minuten en PBS-spoeling gedurende 5 minuten gedurende 3x.
  5. Voer EDTA-hogedrukreparatie uit gedurende 15 minuten, gevolgd door PBS-wasbeurt gedurende 5 minuten gedurende 3x.
  6. Voeg druppelsgewijs 3% waterstofperoxide toe aan het weefsel, incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur en was 5x 5 minuten met PBS.
  7. Gebruik een immunohistochemie pen om een cirkel te tekenen. Wassen met PBS wash gedurende 3 minuten voor 3x.
  8. Kleuring in primair antilichaam (anti-ALP konijn pAb (1:200), anti-COL-1 konijn pAb (1:200), anti-IL-17 konijn pAb (1:275), anti-Act1 (1:500), anti-IL-6 konijn pAb (1:500)) 's nachts, gevolgd door PBS-bufferspoeling gedurende 5 minuten gedurende 3x.
  9. Voeg druppelsgewijs het secundaire antilichaam (HRP-geconjugeerde Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000)) toe en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Wassen met PBS-buffer gedurende 3 minuten voor 3x.
  10. Incubeer 3-5 minuten in DAB kant-en-klaar en spoel daarna af met PBS.
  11. Voer Hematoxyline-re-kleuring uit gedurende 3 minuten, gevolgd door PBS-spoeling.
  12. Gebruik de differentiatieoplossing gedurende ongeveer 10 s, gevolgd door PBS-spoeling.
  13. Voeg gedurende 10 s een blauwe retouroplossing toe, gevolgd door PBS-spoeling.
  14. Voer een behandeling met 75% watervrije ethanol uit gedurende 5 minuten, watervrije ethanol gedurende 5 minuten en helder gedurende 3 minuten. Gebruik neutrale hars voor het afdichten van dia's.

Resultaten

Actieve ingrediënten en werkingsdoelen van Xiaoyao-pillen
Door de TCMSP-database te doorzoeken en te screenen volgens de criteria van orale biologische beschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelachtige eigenschappen (DL) ≥ 0,18, werden 125 actieve ingrediënten gevonden in Xiaoyao-pillen. Onder hen waren de ingrediënten 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 en 2 respectievelijk afkomstig van White Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, zoethout en gember. Enkele van de actieve ingrediënten zijn weergegeven in tabel 1. Bovendien werden in totaal 879 doelen van effectieve actieve ingrediënten verkregen uit de TCMSP-database, en 232 doelen bleven over na ID-conversie en verwijdering van dubbele waarden.

Netwerkanalyse van TCM - Actief ingrediënt - Kruisend doelwit - Ziekte
Verschillende databases werden doorzocht met behulp van het trefwoord osteoporose voor genen die verband houden met de ziekte. In de GeneCards database werden 1692 genen verkregen na filtering op basis van Relevance score ≥1. In totaal werden 35 genen verkregen in de OMIM-database. Er waren respectievelijk 3, 33 en 386 genen in de databases van PharmGkb, TTD en DrugBank. Vervolgens is het snijpunt van de resultaten van deze vijf databases gebruikt voor verdere analyse (Figuur 1A). Een van de genen die in vier databases vertegenwoordigd was, was CALCR. In totaal werden 102 kruisende genen verkregen na het combineren van de ziektegerelateerde genen en het nemen van de kruising met het geneesmiddeldoelwit (Figuur 1B). Op basis van de interacties tussen de ziektedoelen en de actieve ingrediënten van het medicijn, werd een TCM-actief ingrediënt-kruisend doelwit-ziektenetwerk geconstrueerd met Cytoscape-software. Als gevolg hiervan werden relaties tussen de componenten van het geneesmiddel en de polymorfe regulatie van ziektegerelateerde genscans verkregen (Figuur 2A).

In de String-database werden eiwitinteracties geanalyseerd op het snijvlak van ziektegenen en geneesmiddeldoelen om hun interactienetwerkdiagrammen te verkrijgen (Figuur 2B), en deze werden vervolgens gescreend op de meest centrale eiwitten (Figuur 2C-D). De resultaten toonden de sterkste interacties tussen FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 en STAT3 onder de ziektegenen en medicijndoelen (Figuur 2E).

GO-functie en analyse van de verrijking van de KEGG-route
De GO-verrijkingsanalyse toonde in totaal 2177 ingangen, waaronder 1990 vermeldingen van biologische processen (BP), 58 ingangen van celcomponenten (CC) en 129 vermeldingen van moleculaire functies (MF). Bij BP waren genen voornamelijk gericht op de reactie op voedingsniveaus, de reactie op oxidatieve stress en de cellulaire respons op oxidatieve stress. MF richtte zich op DNA-bindende transcriptiefactorbinding, RNA-polymerase II-specifieke DNA-bindende transcriptiefactorbinding, nucleaire receptoractiviteit, ligand-geactiveerde transcriptiefactoractiviteit en cytokine-activiteit (Figuur 3A-B).

In de analyse van de verrijking van de KEGG-route werden in totaal 168 gerelateerde signaalroutes verkregen, en de meest significante waren de AGE-RAGE-signaleringsroute, de IL-17-signaleringsroute, de TNF-signaleringsroute, de HIF-1-signaleringsroute en de Th17-celdifferentiatie (Figuur 3C-D). Er wordt gesuggereerd dat Xiaoyao-pillen op meerdere manieren therapeutische effecten op PMOM kunnen uitoefenen. Ontsteking wordt sterk geassocieerd met osteoporose en kan worden versneld door de menopauze, en IL-17 is een belangrijke ontstekingsfactor7. Daarom is het volgende plan om te onderzoeken of Xiaoyao-pillen osteoporose kunnen behandelen vanuit een inflammatoir perspectief met betrekking tot IL-17.

Structurele veranderingen in botweefsel voor en na verwijdering van eierstokweefsel
HE-kleuring toonde aan dat in de dijbenen van Sham-muizen de trabeculae strak gerangschikt waren, met een goede continuïteit, kleine openingen tussen de trabeculae, zeldzame fracturen en een normale grootte van de beenmergholte. Vergeleken met de Sham-groep waren de dijbenen van de OVX-groep schaars gerangschikt, met ernstige fracturen van de trabeculae, verstoorde continuïteit en een duidelijk vergrote beenmergholte, die typische osteoporotische veranderingen vertoonden (Figuur 4A).

Micro-CT vergelijking tussen de groepen
De dijbenen van muizen in de OVX-groep vertoonden een onvolledig trabeculair netwerk, een gedeeltelijk lege beenmergholte en dunner worden van de botcortex in vergelijking met die van muizen in de Sham-groep. De Sham-groep muizen vertoonde een overvloed aan trabeculae, goede continuïteit en een vernauwing van de mergholte in hun dijbenen (Figuur 4B).

Gedragseffecten van Xiaoyao-pillen op muizen
Tijdens de onderzoeksperiode hadden alle muizen in de andere groepen, behalve de OVX-groep, betere leefgewoonten, een normale haarkleur, een hoge mobiliteit en een goede gezondheid. De urine en ontlasting van elke muis waren binnen 1 week na behandeling met Xiaoyao-pillen weer normaal. Er waren geen beten, wondinfecties, gastro-intestinale obstructie, loslating van de hechting, huidnecrose van de incisie of dood van een van de muizen. De muizen in de OVX-groep waren vatbaar voor haaruitval, donkerder worden van de haarkleur, verminderde mobiliteit, langere reflexen, verhoogde uitscheiding en minder eten en drinken.

HE-kleuring van pathologische secties van muizen na medicamenteuze interventie
In de Sham-groep was het dijbeenweefsel dicht, reticulair en regelmatig gerangschikt. De grootte en continuïteit van de beenmergholte was normaal en de afstand tussen aangrenzende bottrabeculae was relatief klein. Vergeleken met de Sham-groep vertoonden de femurcortex en het poreuze bot in de OVX-groep duidelijke defecten, verminderde trabeculae, verhoogde openingen, onderbroken continuïteit, dunner worden van de structuur, verbreding van de mergholte en dunner worden van de botcortex. Vergeleken met de OVX-groep leken de femurtrabeculae van de muizen in de met geneesmiddelen behandelde groepen (lage en hoge doses) structureel intact, met verminderde afstand, verhoogde connectiviteit, vernauwde beenmergholten en dichtere structuren (Figuur 5A).

Detectie van beeldvormingsindices bij muizen na medicamenteuze interventie
In vergelijking met de Sham-groep hadden de dijbenen van muizen in de OVX-groep schaarse en gebroken bottrabeculae en verdunde botcortex. Vergeleken met de OVX-groep hadden de muizen in de groep met hooggedoseerde Xiaoyao-pillen minder gebroken bottrabeculae, herstelde reticulatie en een significante mate van gedeeltelijke verkleining van de beenmergholte. De muizen die met een lage dosis Xiaoyao-pillen werden behandeld, hadden echter nog steeds gebroken bottrabeculae, hoewel er sprake was van verhoogde bottrabeculae en een verkleining van de beenmergholte. De trabeculaire structuur van de bottrabeculae van de schijngeopereerde groep vertoonde meer continuïteit en volledigheid (Figuur 5B).

Immunohistochemische resultaten van weefsels in de groepen na medicamenteuze interventie
Act1 en IL-6 zijn sleuteleiwitten in de IL-17-signaleringsroute, en ALP en COL-1 zijn osteogene genen. Expressie van ALP-, COL-1-, IL-6-, IL-17- en Act1-eiwitten leidt tot de vorming van bruine of gele korrels op botweefsel. Immunohistochemische resultaten toonden aan dat de gemiddelde optische dichtheidswaarden van ALP en COL-1 in de geneesmiddelgroep hoger waren dan die in de OVX-groep na behandeling met Xiaoyao-pillen, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05). De gemiddelde optische dichtheidswaarden van IL-17, Act1 en IL-6 in de geneesmiddelgroep waren lager dan die in de OVX-groep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05; Figuur 6). Xiaoyao-pillen keerden de afname van ALP en COL-1 veroorzaakt door ovariëctomie om, terwijl ze de expressie van verschillende belangrijke eiwitten IL-17, IL-6 en Act1 in de IL-17-signaleringsroute verminderden, wat suggereert dat het medicijn zijn therapeutische effecten via deze route kan uitoefenen.

figure-results-1
Figuur 1: Netwerkanalyse van de kruising van actieve ingrediënten uit de Chinese kruidengeneeskunde en ziektegerelateerde genen. (A) De kruising van ziektegerelateerde genen, verkregen uit de GeneCards-, OMIM-, PharmGkb-, TTD- en DrugBank-databases. Deze worden vertegenwoordigd door blauwe, rode, groene, gele en bruine kleuren met respectievelijk 1692, 35, 3, 33 en 386 genen. De kruising zijn de ziekte-geassocieerde genen in de vijf databases, en het overlappende deel geeft het aantal kruisende genen in elke database aan. (B) De kruising van de geneesmiddeldoelen (waarbij de blauwe kleur deze dataset aangeeft, d.w.z. de set geneesmiddelwerkende doelwitgenen die in de TCMSP-database zijn verzameld na ID-transformatie en verwijdering van duplicaten) en ziektegerelateerde genen (waarbij de rode kleur deze dataset aangeeft, die alle genen uit de vijf hierboven genoemde databases bevat) wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Interactie van actieve ingrediënten van TCM met ziektegerelateerde genregulerende netwerken en kerneiwitten. (A) Het regulerende netwerk van actieve ingrediënten en ziektegerelateerde genen in TCM toont de genregulerende relaties die overeenkomen met elk actief ingrediënt in de Xiaoyao-pillen, waarbij elk ingrediënt is gekoppeld aan het gen dat het reguleert. (B) De resultaten van de analyse van eiwit-eiwitinteractie van kruisende genen in STRING (de netwerkknooppunten vertegenwoordigen eiwitten, randen vertegenwoordigen eiwit-eiwitassociaties en meerdere bindingen duiden op meerdere interacties tussen twee eiwitten). (C-E) De eiwitinteracties die door String werden verkregen, werden verschillende keren gescreend. (C) Het eiwitinteractienetwerk werd verkregen na de eerste screening en het gemarkeerde deel is het kerngedeelte. (D) Het resultaat van de tweede screening en het gemarkeerde deel is het kerndeel. (E) Het meest centrale eiwitinteractienetwerk in het eiwitinteractienetwerk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: GO- en KEGG-verrijkingsanalyse. (A-B) De resultaten van GO-verrijkingsanalyse van kruisende genen zijn onderverdeeld in 3 ingangen, Biologisch Proces (BP), Cellulaire Component (CC) en Moleculaire Functie (MF), en elke vermelding toont alleen de top 10 van meest significant verrijkte genen. (C-D) De resultaten van KEGG-verrijkingsanalyse van de kruisende genen (met de top 30 van meest significant verrijkte). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Opstelling en evaluatie van het model voor ovariëctomie van muizen. (A) Vergelijking van de metafysaire botmorfologie tussen de nep-geopereerde en de ovariëctomie-groepen (10x). In de OVX-groep waren de trabeculaire fracturen ernstig, de continuïteit was verstoord en de beenmergholte was aanzienlijk vergroot, terwijl in de schijngroep de trabeculaire fracturen zeldzaam waren en de beenmergholte normaal van grootte was. (B) Micro-CT-scans van het dijbeen in de groepen die werden geopereerd en geoperiëctomieën. In de OVX-groep was het trabeculaire netwerk onvolledig en was de beenmergholte gedeeltelijk leeg. In de Sham-groep waren de trabeculae overvloedig en continu, en de beenmergholte was smal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: HE en micro-CT assay na behandeling met de Xiaoyao pillen. (A) HE-kleuring (10x) van dijbeensecties van muizen in elke groep na de behandeling met Xiaoyao-pillen. In de OVX-groep waren de bottrabeculae verminderd, werd de continuïteit onderbroken, was de structuur schaars en werd de mergholte vergroot. In de Sham-groep hadden de bottrabeculae een goede continuïteit, het dijbeenweefsel was structureel dicht en de beenmergholte was normaal. Vergeleken met de OVX-groep leken de bottrabeculae in de geneesmiddelgroep structureel intact, met verhoogde connectiviteit, een verminderde beenmergholte en een dichtere structuur dan in de modelgroep. (B) Vergelijking van micro-CT van dijbenen van muizen in elke groep na behandeling met Xiaoyao-pillen. De bottrabeculae in de dijbenen van muizen in de groep met ovariëctomie waren schaars en gebroken, terwijl de Sham-groep meer continue en intacte trabeculae had. Vergeleken met de groep met ovariëctomie hadden muizen in de groep met een hoge dosis medicamenteuze behandeling minder gebroken bottrabeculae, herstelde de reticulaire structuur en gedeeltelijk verminderde beenmergholte, terwijl de dieren in de groep met een lage dosis geneesmiddelen meer bottrabeculae en verminderde beenmergholte hadden, maar de gebroken bottrabeculae bleven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Immunohistochemie om het effect van Xiaoyao-pillen op de IL-17-signaleringsroute en osteogene markergeneiwitexpressie bij osteoporotische muizen te detecteren (40x). Positieve reacties voor de aanwezigheid van ALP-, COL-1-, IL-6-, IL-17- en Act1-eiwitten manifesteerden zich door het verschijnen van bruine of gele korrels op botweefsel. De expressie van ALP en COL-1 in de medicijngroep was hoger dan die in de OVX-groep (p < 0,05). De expressie van IL-17, Act1 en IL-6 in de geneesmiddelgroep was lager dan die in de OVX-groep (p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam van Traditionele Chinese geneeskundeMoleculair IDNaam van het molecuul
Witte paeonia lactifloraMOL001918paeoniflorgenone
Witte paeonia lactifloraMOL000211Kanton Mairin
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-acetoxyatractylon
Menthae HerbaMOL000471Aloë-emodine
Menthae HerbaMOL005190Eriodictyol
Chai HuMOL000354Isorhamnetin
Chai HuMOL013187Cubebin
Sinensis van engelwortelMOL000449Stigmasterol
Sinensis van engelwortelMOL000358bèta-sitosterol
Poria cocosMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Poria cocosMOL000283Ergosterol peroxide
DropMOL002311Glycyrol
DropMOL0049907,2',4'-trihydroxy - 5-methoxy-3 - arylcoumarine
Verse gemberMOL0061296-methylgingediacetaat2
Verse gemberMOL001771poriferast-5-en-3beta-ol

Tabel 1: Actieve ingrediënten in geselecteerde Chinese medicijnen. De eerste kolom bevat de namen van traditionele Chinese medicijnen, de tweede kolom is de ID van het actieve ingrediënt van de Chinese geneeskunde en de derde kolom is de naam van het actieve ingrediënt in de Chinese geneeskunde.

Aanvullend coderingsbestand 1: Kruidennaam, ingrediënt en doel-ID-samenvoegcode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: Conversie van doel-ID's voor geneesmiddelen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 3: Bestanden voor netwerkanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 4: Conversie van symbool naar gen-ID. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 5: GO-verrijkingsanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 6: KEGG-verrijkingsanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Volgens statistieken veroorzaakt osteoporose elk jaar 1,5 miljoen fracturen in de Verenigde Staten, en de overgrote meerderheid hiervan komt voor bij postmenopauzale vrouwen27. Met een toename van de vergrijzing van de bevolking wordt voorspeld dat de meerderheid van de toekomstige heupfracturen in de wereld in Azië zal plaatsvinden en dat tegen 2050 het totale aantal hiervan wereldwijd 8,2 miljoen zal bedragen28. De kosten van het voorkomen van fracturen zijn bijna gelijk aan die van de behandeling ervan, en het gebruik van medicijnen zal onvermijdelijk enkele bijwerkingen hebben29. Daarom is er dringend behoefte aan een meer kosteneffectieve manier om dit probleem in een verantwoordelijke samenleving aan te pakken.

Xiaoyao pillen bestaan uit acht ingrediënten. Studies naar de effecten van de ingrediënten op osteoporose zijn aan de gang. Poria cocos remt osteoclastogenese en osteolytische activiteit in een door osteoporose geïnduceerd muismodel met ovariëctomie30. De combinatie van twee componenten, zoethout en Shu-di-huang, kan een antioxiderende werking hebben door de NF-KB-signaleringsroute te remmen31. Het traditionele Chinese kruidentonicum, Danggui buxue tang, kan nuttig zijn bij de behandeling van osteoporose door zijn vermogen om botomzetting te remmen en de regulatie van de hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) -as te moduleren en daardoor botverlies bij ratten met ovariëctomie te voorkomen. Al deze resultaten suggereren dat Xiaoyao-pillen een therapeutisch effect kunnen hebben op osteoporose. De resultaten van deze studie suggereren ook dat Xiaoyao-pillen een anti-osteoporose-effect kunnen uitoefenen door de activiteit van de IL-17-signaleringsroute op een ontstekingsremmende manier te moduleren.

In totaal werden 168 relevante signaalroutes verkregen uit het regulerende netwerk van geneesmiddeldoelen en osteoporose-gerelateerde genen die in deze studie werden geconstrueerd, en deze studie onderzocht de IL-17-signaleringsroute verder. De IL-17-familie bestaat uit zes leden, waaronder IL-17A-F, waarvan IL-17A de eerste en belangrijkste was die werd ontdekt33. In vroege studies werd gedacht dat IL-17 in verband werd gebracht met inflammatoire en auto-immuunziekten bij mensen. Later suggereerden studies dat het een rol speelde bij het handhaven van de integriteit van de barrière, en het bleek ook geassocieerd te zijn met kanker15. Hoewel het geen fysiologische rol speelt bij botremodellering, gedraagt het zich anders tijdens abnormale botomstandigheden. Bovendien kan IL-17 fungeren als een zwakke activator en werkt het samen met andere cytokines om de energie-output te verhogen. Dit wordt aangetoond door de co-activering met TNFα15,34.

In vitro experimenten hebben aangetoond dat IL-17 proliferatie en differentiatie van osteoblastische MSC's kan induceren35, en het kan ook BMP-2-geïnduceerde differentiatie van primaire osteoblasten bij ratten remmen36. IL-17 kan osteoblasten stimuleren om RANKL tot expressie te brengen, wat op zijn beurt osteoclastogenese bevordert, maar dit effect lijkt afhankelijk te zijn van de aanwezigheid van osteoblasten37,38. In deze studie produceerden de verschillende concentraties van de Xiaoyao-pillen therapeutische effecten op PMOM-modelmuizen, vooral bij gebruik in hogere concentraties. IL-17, Act1 en IL-6, die gecorreleerd zijn met de IL-17-signaleringsroute, waren significant afgenomen bij deze muizen in vergelijking met controles. Toen de resultaten van de verrijkingsanalyse werden beoordeeld, suggereerden deze de betrokkenheid van de IL-17-route wanneer de dieren werden behandeld met Xiaoyao-pillen.

Deze studie testte ook enkele van de botconversiemarkers. ALP is een tetrameer membraangebonden enzym dat kan worden uitgescheiden door osteoblasten en een belangrijke rol speelt bij botachtige vorming en mineralisatie door de mineralisatieremmer pyrofosfaat39 af te breken. Ongeveer 90% van de organische fractie in de extracellulaire matrix van botweefsel bestaat uit COL-1, en tijdens botmineralisatie speelt collageen een sleutelrol in dit proces40. In het resultaat van deze studie waren de niveaus van ALP- en COL-1-eiwitexpressie, zoals waargenomen door immunohistochemie van muizen in de geneesmiddelengroep, hoger dan die in de modelgroep, wat suggereert dat het effect van Xiaoyao-pillen bij het verbeteren van osteoporose zou kunnen worden bereikt door de indicatoren van de osteogene genen te verhogen. Sommige geleerden hebben aangetoond dat de expressie en transcriptionele activiteit van de hepatocyten-oestrogeenreceptor (ERα) kan worden opgereguleerd door Xiaoyao san41. Van de extracten van Angelica sinensis, White Paeonia lactiflora en zoethout in de Xiaoyao san is aangetoond dat ze oestrogeenachtige activiteit hebben. Dezelfde ingrediënten zijn ook aanwezig in de Xiaoyao-pillen die in dit onderzoek zijn gebruikt, die zijn gemaakt op voorschrift van Xiaoyao san met moderne bereidingsmethoden. Daarom kan worden verondersteld dat Xiaoyao-pillen ook de expressie van osteogene genen zoals ALP en COL-1 kunnen verhogen door oestrogeenachtige effecten op osteoblasten uit te oefenen om hun activiteit te verhogen en de botkwaliteit te verbeteren.

Deze studie heeft met succes een model van PMOM bij muizen vastgesteld door beide eierstokken te verwijderen door middel van dorsale ovariëctomie. Het diermodel is de basis voor alle volgende experimenten in dit onderzoek. Bij het operatief verwijderen van de eierstokken van de muizen was het belangrijk om ervoor te zorgen dat de eierstokken van de muizen in de OVX- en geneesmiddelgroepen volledig werden verwijderd, terwijl in de schijngroep alleen het vet in de buurt van de eierstokken werd verwijderd, en het was ook belangrijk om wondinfecties te voorkomen.

Het aantal bottrabeculae en de verbindingsdichtheid van muizen werd verbeterd na behandeling van ovariëctomie met Xiaoyao-pillen, wat suggereerde dat dit medicijn een therapeutisch effect had op osteoporose. Immunohistochemie en immunocytochemie werden gebruikt om de werkzaamheid van de behandeling in deze studie te evalueren; De actietijd van verschillende reagentia is niet absoluut, vooral niet tijdens het proces van kleurontwikkeling, wat real-time observatie en tijdige reactie vereist om de beste resultaten te garanderen. Tijdens de incubatie van antilichamen wordt eerst de gradiënt van de antilichaamconcentratie ingesteld en na observatie en vergelijking wordt de meest geschikte concentratie gekozen voor de volgende experimenten.

Er waren echter enkele beperkingen in deze studie. De webfarmacologiegegevens hadden slechts één enkele gegevensbron en de analyse met betrekking tot de samenstelling van het geneesmiddel kwam slechts uit één database. Bovendien werd de werkzaamheid van Xiaoyao-pillen in deze studie niet vergeleken met positieve geneesmiddelen en was het niet mogelijk om de specifieke verschillen tussen Xiaoyao-pillen en de huidige behandelingsmodaliteiten te beoordelen.

Voor PMOM zijn bisfosfonaten de beschikbare eerstelijnsbehandelingsoptie. Het gebruik van deze geneesmiddelen kan echter leiden tot gastro-intestinale contra-indicaties en nog ernstigere atypische dijbeenfracturen en osteonecrose van de kaken42,43. De tweedelijns behandelingsopties omvatten het gebruik van denosumab en hormoontherapie. Van denosumab is aangetoond dat het heup-, wervel- en niet-wervelfracturen vermindert. Rebound kan echter optreden zodra het medicijn wordt stopgezet, en hoe langer de duur van de stopzetting, hoe groter het verlies aan botdichtheid 42,44,45. Menopauzale hormoontherapie vermindert het risico op osteoporotische fracturen van de wervelkolom, maar de effecten zijn leeftijdsgebonden en de risico's op lange termijn lijken op te wegen tegen de voordelen46. Sequentiële therapie is een langdurige behandelingsoptie voor PMOM, waarbij het gebruik van botvormende medicijnen gevolgd door antiresorptieve medicijnen de grootste toename van de botmassa kan bereiken. Specifieke medicijnen worden meestal per patiënt bepaald42.

In dit opzicht kan worden aangenomen dat traditionele Chinese kruiden een voordelig potentieel kunnen hebben bij de behandeling van osteoporose. Het werkingsmechanisme van kruidengeneeskunde is multi-pathway en multi-target in plaats van te werken via een enkel mechanisme47. Sommige geleerden hebben de werkzaamheid en veiligheid van sommige Chinese kruidengeneesmiddelen geëvalueerd, en ze hebben aangetoond dat het aantal fracturen bij het gebruik van een combinatie van Chinese en westerse medicijnen in vergelijking met alleen het toedienen van Chinese medicijnen lager was dan dat in de groep van alleen westerse geneeskunde48. In vergelijking met chemische geneesmiddelen hebben Chinese kruidengeneesmiddelen minder bijwerkingen, zijn ze relatief goedkoop en zijn ze geschikt voor langdurig gebruik. Chinese kruidengeneesmiddelen kunnen niet alleen de botmicrostructuur herstellen en het botvolume vergroten, maar ze kunnen ook de symptomen van zwakte van de lumbale wervelkolom en rugpijn verminderen of elimineren49. De huidige studie kan helpen bij het bieden van een mogelijke aanpak voor het ontdekken van nieuwe medicijnen en behandelingen.

De toepassing van Xiaoyao-pillen om PMOM te behandelen lijkt veelbelovend. In de huidige studie kunnen de pillen de botmassa en botkwaliteit verbeteren in een muismodel van PMOM door ontstekingen te onderdrukken. Sommige geleerden hebben zelfs gesuggereerd dat een combinatie van Chinese geneeskunde en acupunctuur effectief kan zijn bij de behandeling van PMOM50. Tegelijkertijd is bewezen dat een combinatie van Chinese en westerse geneeskunde effectief is51. Beide mogelijke remedies zijn geldig, hoewel elke aanbevolen behandeling met behulp van de Xiaoyao-pillen in combinatie met acupunctuur en westerse geneeskunde moet worden gevalideerd door klinische onderzoeken. De klinische betekenis van osteoporose ligt in botbreuken, en toekomstig onderzoek moet zich ook richten op het voorkomen hiervan.

Samenvattend toonde deze studie door middel van netwerkfarmacologie en dierproeven aan dat PMOM-muizen een significante verbetering van het botmetabolisme en een verhoogde botmassa vertoonden na behandeling met Xiaoyao-pillen. Het werkingsmechanisme voor dit fenomeen kan verband houden met de remming van de IL-17-signaleringsroute en de versterking van osteogene factoren, ALP en COL-1-activiteit. Deze studie legt een theoretische basis en experimentele basis voor de klinische toepassing van Xiaoyao-pillen bij de behandeling van osteoporose-geassocieerde ziekten.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Het Baise City Scientific Research and Technology Development Program (20224128) ondersteunde dit werk. De auteurs bedanken Dr. Dev Sooranna van het Imperial College London en YMUN voor het redigeren van het manuscript. YYX en ZYW hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1ml SamplerGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Voor anesthesie bij muizen
4% polyformaldehydeBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.P1110Voor weefselfixatie
6-0 absorbeerbare hechtdraad (hoekige naald)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Voor postoperatieve hechting
Absorberende wattenbalWinnerMIANQIU-500gVoor sterilisatie en hemostasis
Zelfklevende dia'sJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Voor weefseldoorsneden
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLVoor anesthesie bij muizen
Bluing SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1866Blauwe kleuring van de kernen van cellen na de werking van hematoxylinen differentiatie-oplossing
C57BL/6 muizenBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Voor gebruik in dierproeven
Chirurgische bladen van koolstofstaalPremier Medical Equipment Co.SP239Voor muischirurgie
CIKS/TRAF3IP2 Konijn pAbBIOSS ANTIBODIESbs-6202RBindt aan Act1 in weefsels
Cole's Hematoxyline-oplossing (voor conventionele kleuring)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1140Voor het kleuren van paraffinedwarsdoorsneden
Collageen Type I Polyklonaal antilichaamproteintech14695-1-APBindt aan COL-1 in weefsels
DAB-substraatkit, 20xBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.DA1010Voor weefselkeuverontwikkeling
Wegneembare chirurgische folie 50*60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Voor muischirurgie
EDTA-ontkalkingsoplossing (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.E1171-500mlVoor weefselontkalking
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching BufferBeyotime BiotechnologyP0100BAfzetting van endogene peroxidasen in weefsels of cellen
Milieuvriendelijk ontwassingshelder vloeistofServicebioG1128-1LVoor het ontwassen van paraffinedwarsdoorsneden
Ethyl AlcoholCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Voor dehydratatie van paraffinedwarsdoorsneden
Antilichaamverdunningsbuffer voor algemeen gebruikEpizyme BiotechPS119LVoor antilichaamdunning
Hematoxylinen differentiatieoplossingServicebioG1039-500MLVoor differentiatie na hematoxylinenkleuring en verwijdering van overmatig gebonden en niet-specifiek geadsorbeerd kleurstof uit weefsels
Hematoxylinen Eosine (HE) kleuringskitBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G1120-3*100mlVoor weefselkeuring
Hoge kwaliteit roestvrijstalen chirurgische mesgreepPremier Medical Equipment Co.SP0088Voor muischirurgie
HRP-geconjugeerd Affinipure Geit Anti-Konijn IgG(H+L)proteintechSA00001-2Bindt aan primair antilichaam en versterkt signaal
IL-17A Polyklonaal antilichaamproteintech13082-1-APBindt aan IL-17 in weefsels
IL-6 Polyklonaal antilichaamproteintech21865-1-APBindt aan IL-6 in weefsels
Immunohistochemische penBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)Voor het tekenen van cirkels in immunohistochemie
Medische chirurgische hechtdraad Niet-absorbeerbaar (bol) 5-0 3,5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2Voor postoperatieve hechting
Medische hechtnaalden Hoeknaalden 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Voor postoperatieve hechting
Neutraal BalsamBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.G8590Als plaksel
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Buffer voor het wassen van dia's en gedeeltelijke oplossingsverdunning
Eiwitvrije snelle blokkeerbuffer (1X)Epizyme BiotechPS108PVoorkomen van niet-specifieke binding van eiwitten
Konijn Anti-Bot Alkalische Fosfatase antilichaamBIOSS ANTIBODIESbs-6292RBindt aan alkalische fosfatase in weefsels
ZoutoplossingAffiliated Hospital Youjiang Medical University For NationalitiesLHN500Voor dieren via slangendruppel
Scheer-/Elektrisch scheerapparaatHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Voor het scheren van muizen
Roestvrijstalen medisch naaldhouder 14cm Dikke naaldPremier Medical Equipment Co.SP784Voor muischirurgie
Roestvrijstalen oftalmische tang 10,5cm Gebogen (Geen Haak)ZhuoyouyueYKNWW-10.5Voor muischirurgie
Roestvrijstalen oftalmische schaar/Chirurgische schaar 10CM Rechte puntPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJVoor muischirurgie
Roestvrijstalen punt maagnaald 12 Gauge 55mm ElleboogGWJ-12-55WVoor gebruik bij muizen via slangendruppel
Tris-EDTA antigeenreparatievloeistof (50x)proteintechPR30002Voor antigeenreparatie van paraffinedwarsdoorsneden
Houten dissectiebord 25*16cmJP16*24Voor muischirurgie
Xiaoyao pillenJiuzhitang Co.,Ltd.YPG-041Voor dier

Referenties

  1. Kanis, J. A., Melton, L. J. 3rd, Christiansen, C., Johnston, C. C., Khaltaev, N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res. 9 (8), 1137-1141 (1994).
  2. Amin, U., Mcpartland, A., O'sullivan, M., Silke, C. An overview of the management of osteoporosis in the aging female population. Womens Health (Lond). 19, 17455057231176655(2023).
  3. Słupski, W., Jawień, P., Nowak, B. Botanicals in postmenopausal osteoporosis. Nutrients. 13 (5), 1609(2021).
  4. Sharma, A., et al. Understanding the mechanistic potential of plant based phytochemicals in management of postmenopausal osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114850(2023).
  5. Pharmacopoeia of people's republic of china. Chinese Pharmacopeia Commission. , (2020).
  6. Ji, Y., et al. Xiaoyao pills ameliorate depression-like behaviors and oxidative stress induced by olfactory bulbectomy in rats via the activation of the pik3ca-akt1-nfe2l2/bdnf signaling pathway. Front Pharmacol. 12, 643456(2021).
  7. Lencel, P., Magne, D. Inflammaging: The driving force in osteoporosis. Med Hypotheses. 76 (3), 317-321 (2011).
  8. Daoussis, D., Andonopoulos, A. P., Liossis, S. N. Wnt pathway and il-17: Novel regulators of joint remodeling in rheumatic diseases. Looking beyond the rank-rankl-opg axis. Semin Arthritis Rheum. 39 (5), 369-383 (2010).
  9. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Netw. 18 (1), e8(2018).
  10. Amatya, N., Garg, A. V., Gaffen, S. L. Il-17 signaling: The yin and the yang. Trends Immunol. 38 (5), 310-322 (2017).
  11. Shi, B., et al. Xiaoyao pills prevent lipopolysaccharide-induced depression by inhibiting inflammation and protecting nerves. Front Pharmacol. 10, 1324(2019).
  12. Fang, Y., et al. Xiaoyao pills attenuate inflammation and nerve injury induced by lipopolysaccharide in hippocampal neurons in vitro. Neural Plast. 2020, 8841332(2020).
  13. Zhang, X., et al. Effect of xiaoyao pills on fecal endogenous metabolites in rats with metabolism-associated steatohepatitis. J Shanxi Med University. 55, 36-43 (2024).
  14. Xiao, J., et al. Il-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 18 (1), 20220747(2023).
  15. Mcgeachy, M. J., Cua, D. J., Gaffen, S. L. The il-17 family of cytokines in health and disease. Immunity. 50 (4), 892-906 (2019).
  16. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  17. Wang, T., et al. Exploring the mechanism of luteolin by regulating microglia polarization based on network pharmacology and in vitro experiments. Sci Rep. 13 (1), 13767(2023).
  18. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  19. Barshir, R., et al. Genecarna: A comprehensive gene-centric database of human non-coding rnas in the genecards suite. J Mol Biol. 433 (11), 166913(2021).
  20. Wang, T., Jiang, X., Lu, Y., Ruan, Y., Wang, J. Identification and integration analysis of a novel prognostic signature associated with cuproptosis-related ferroptosis genes and relevant lncrna regulatory axis in lung adenocarcinoma. Aging (Albany NY). 15 (5), 1543-1563 (2023).
  21. Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F., Hamosh, A. Omim.Org: Leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nuc Acid Res. 47 (D1), D1038-D1043 (2019).
  22. Whirl-Carrillo, M., et al. An evidence-based framework for evaluating pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 110 (3), 563-572 (2021).
  23. Zhou, Y., et al. Ttd: Therapeutic target database describing target druggability information. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1465-D1477 (2024).
  24. Knox, C., et al. Drugbank 6.0: The drugbank knowledgebase for 2024. Nuc Acid Res. 52 (D1), D1265-D1275 (2024).
  25. Rendi, M. H., Muehlenbachs, A., Garcia, R. L., Boyd, K. L. Comparative anatomy and histology a mouse and human atlas. Chapter 17, Academic Press. 253-284 (2012).
  26. Chen, S. X. R. B. X. Pharmacology experimental methodology. , People's Medical Publishing House Co. Ltd. (2002).
  27. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  28. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  29. Walker, M. D., Shane, E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 389 (21), 1979-1991 (2023).
  30. Hwang, Y. H., Jang, S. A., Lee, A., Kim, T., Ha, H. Poria cocos ameliorates bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclastogenesis in vitro. Nutrients. 12 (5), 1383(2020).
  31. Ling, X., et al. Shu-di-huang and gan-cao herb pair restored the differentiation potentials of mesenchymal stem progenitors in treating osteoporosis via downregulation of nf-κb signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 7795527(2021).
  32. Zhou, L. P., et al. protective effects of danggui buxue tang alone and in combination with tamoxifen or raloxifene in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 9, 779(2018).
  33. Huangfu, L., Li, R., Huang, Y., Wang, S. The il-17 family in diseases: From bench to bedside. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 402(2023).
  34. Majumder, S., Mcgeachy, M. J. Il-17 in the pathogenesis of disease: Good intentions gone awry. Annu Rev Immunol. 39, 537-556 (2021).
  35. Le Goff, B., et al. Implication of il-17 in bone loss and structural damage in inflammatory rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2019, 8659302(2019).
  36. Zhang, J. R., et al. Different modulatory effects of il-17, il-22, and il-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017, 5950395(2017).
  37. Peng, R., et al. Il-17 promotes osteoclast-induced bone loss by regulating glutamine-dependent energy metabolism. Cell Death Dis. 15 (2), 111(2024).
  38. Sato, K., et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper t cell subset that links t cell activation and bone destruction. J Exp Med. 203 (12), 2673-2682 (2006).
  39. Shetty, S., Kapoor, N., Bondu, J. D., Thomas, N., Paul, T. V. Bone turnover markers: Emerging tool in the management of osteoporosis. Indian J Endocrinol Metab. 20 (6), 846-852 (2016).
  40. Selvaraj, V., Sekaran, S., Dhanasekaran, A., Warrier, S. Type 1 collagen: Synthesis, structure and key functions in bone mineralization. Differentiation. 136, 100757(2024).
  41. Hu, T., et al. Xiaoyao san attenuates hepatic steatosis through estrogen receptor α pathway in ovariectomized apoe-/- mice. J Ethnopharmacol. 282, 114612(2022).
  42. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  43. Schroeder, R. J., et al. Oral therapeutics post menopausal osteoporosis. Cureus. 15 (8), e42870(2023).
  44. Patel, D., Gorrell, C., Norris, J., Liu, J. A narrative review of the pharmaceutical management of osteoporosis. Ann Jt. 8, 25(2023).
  45. Minisola, S. Denosumab discontinuation: Covid-19 pandemic and beyond. JBMR Plus. 8 (7), ziae046(2024).
  46. ACOG Committee on Clinical Practice Guidelines-Gynecology. Management of postmenopausal osteoporosis: ACOG clinical practice guideline no. 2. Obstet Gynecol. 139 (4), 698-717 (2022).
  47. Peng, Z., Xu, R., You, Q. Role of traditional Chinese medicine in bone regeneration and osteoporosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 911326(2022).
  48. Li, J., et al. Clinical practice of traditional Chinese medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A literature review. Climacteric. 25 (6), 562-569 (2022).
  49. Zhang, N. D., et al. Traditional Chinese medicine formulas for the treatment of osteoporosis: Implication for antiosteoporotic drug discovery. J Ethnopharmacol. 189, 61-80 (2016).
  50. Ping, R., et al. Identifying the effective combination of acupuncture and traditional Chinese medicinal herbs for postmenopausal osteoporosis therapy through studies of their molecular regulation of bone homeostasis. J Tradit Chin Med. 44 (1), 212-219 (2024).
  51. Li, B., Jiang, C., Zhan, X. Combined therapy of yishen zhuanggu decoction and caltrate d600 alleviates postmenopausal osteoporosis by targeting foxo3a and activating the wnt/β-catenin pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 7732508(2022).

Herprints en machtigingen

Tags

Ovariectomerende muizenIL-17-signaleringimmunohistochemiebottrabeculaecollageen type éénalkalische fosfatasehematoxyline-eosin-kleuring
Studies naar het ontstekingsremmende effect van Xiaoyao-pillen bij de behandeling van postmenopauzale osteoporose bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.