Methodenartikel

Lasercelablatie in intacte Drosophila-larven onthult synaptische competitie

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 juli 2024

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol demonstreert de lasercelablatie van individuele neuronen in intacte Drosophila-larven . De methode maakt het mogelijk om het effect te bestuderen van het verminderen van competitie tussen neuronen in het zich ontwikkelende zenuwstelsel.

Samenvatting

Het protocol beschrijft ablatie met één neuron met een 2-foton lasersysteem in het centrale zenuwstelsel (CZS) van intacte Drosophila melanogaster larven. Met behulp van deze niet-invasieve methode kan het zich ontwikkelende zenuwstelsel op een celspecifieke manier worden gemanipuleerd. Het verstoren van de ontwikkeling van individuele neuronen in een netwerk kan worden gebruikt om te bestuderen hoe het zenuwstelsel het verlies van synaptische input kan compenseren. Individuele neuronen werden specifiek geablateerd in het gigantische vezelsysteem van Drosophila, met een focus op twee neuronen: de presynaptische reuzenvezel (GF) en het postsynaptische tergotrochanterale motorneuron (TTMn). De GF synapseert met de ipsilaterale TTMn, die cruciaal is voor de ontsnappingsreactie. Het ablateren van een van de GF's in de3e instar hersenen, net nadat de GF axonale groei begint te starten, verwijdert de cel permanent tijdens de ontwikkeling van het CZS. De resterende GF reageert op de afwezige buur en vormt een ectopische synaptische terminal voor de contralaterale TTMn. Deze atypische, bilateraal symmetrische terminal innerveert beide TTMn's, zoals aangetoond door kleurstofkoppeling, en drijft beide motorneuronen aan, zoals aangetoond door elektrofysiologische tests. Samenvattend, de ablatie van een enkel interneuron toont synaptische competitie tussen een bilateraal paar neuronen die het verlies van één neuron kunnen compenseren en de normale reacties op het ontsnappingscircuit kunnen herstellen.

Inleiding

Laserablatie is een voorkeursinstrument voor het ontleden van neurale circuits in een breed scala aan organismen. Ontwikkeld in modelgenetische systemen zoals wormen en vliegen, is het in het hele dierenrijk toegepast om de structuur, functie en ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen 1,2,3. Hier werd ablatie met één neuron gebruikt om te onderzoeken hoe neuronen op elkaar inwerken tijdens de assemblage van het circuit in Drosophila. Het ontsnappingssysteem van de vlieg is een favoriet circuit voor analyse omdat het de grootste neuronen en de grootste synapsen in de volwassen vlieg bevat, en het circuit is deafgelopen decennia goed gekarakteriseerd. De rol die neuron-neuron-interacties spelen bij de assemblage van het Giant Fiber-circuit is een centraal punt van dit onderzoek.

Een type interactie dat sinds het werk van Hubel en Wiesel in de jaren 1960 een brandpunt is in de neurowetenschappen is "synaptische competitie"5,6. In dit protocol werd laserablatie gebruikt om de rol van competitie door middel van eencellige ablatie in het gigantische vezelsysteem (GFS) van Drosophila opnieuw te bekijken, waar de moleculaire onderbouwing van de verschijnselen zou kunnen worden ontdekt.

Ablatie van neuronen in de zich ontwikkelende vlieg was om verschillende redenen moeilijk, waaronder het visualiseren van de doelneuronen, de precisie van de ablatiemethode en de overleving van het exemplaar. Om deze problemen in het GFS op te lossen, werd het UAS/Gal4-systeem7 gebruikt om interessante neuronen te labelen, en een microscoop met twee fotonen werd gebruikt om de presynaptische reuzenvezel of het postsynaptische sprongmotorneuron (TTMn) te verwijderen.

In deze studie, om de rol te bepalen die naburige bilaterale neuronen spelen bij het aanpassen van synaptische connectiviteit en synaptische sterkte in het GFS, werd een van de bilaterale paren neuronen (presynaptische GF of postsynaptische motorneuron) verwijderd net voor de ontwikkeling van de pop. In dit ontwikkelingsstadium is de GF-axonogenese nog niet voltooid8. De GF-structuur en functie van het synaptische circuit bij de volwassene werden vervolgens onderzocht, met bijzondere aandacht voor de output van de resterende GF.

Protocol

Alle dieren die voor het protocol werden gebruikt, waren van de soort Drosophila melanogaster. Er zijn geen ethische kwesties rond het gebruik van deze soort. Ethische goedkeuring was niet nodig om dit werk uit te voeren. De details van de Drosophila-soorten , reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Drosophila kweken en het juiste larvale stadium selecteren

  1. Kies een Gal4-driverlijn die de expressie stimuleert in de cellen die moeten worden geablateerd en combineer deze opnieuw met of kruis deze naar een UAS-GFP-reporterlijn. Vliegen grootbrengen op standaard vliegenvoer bij 25 °C.
    OPMERKING: Voor ablatie van gigantische vezels (GF) werd R91H05-Gal4 of A307-Gal4 opnieuw gecombineerd met UAS-GFP. ShakB(lethal)-GAL4 gerecombineerd met UAS-GFP werd gebruikt voor TTMn-ablaties (zie Tabel met materialen).
  2. Selecteer larven die uit het voer beginnen te komen en kruip langs de zijkant van het voerflesje omhoog. Die larven bevinden zich in het zwervende stadium, het voorkeursstadium voor het uitvoeren van GF-celablatie.
    OPMERKING: Ablatie kan in elk larvale stadium worden uitgevoerd. Het laatste larvale stadium was belangrijk voor de manipulatie van de ontwikkeling van het GFS, omdat de GF-cellichamen gemakkelijk in de hersenen kunnen worden geïdentificeerd, maar de GF-axonen hebben in dit stadium nog geen verbindingen gemaakt met hun doelen.

2. Bereiding van de 3e instar larve

OPMERKING: Larven werden verdoofd met behulp van een methode die vergelijkbaar is met Burra et al.9. Om de proceduretijden kort te houden, bereidt u slechts één larve per keer voor. Korte blootstelling aan verdoving zal de overleving van proefdieren verbeteren10.

  1. Bereid een glazen schaal voor met een goed sluitend deksel. Leg een watje in de schaal en voeg onder een zuurkast ongeveer 3-5 ml ethylether toe (gevaarlijke, ontvlambare vloeistof, laboratoriumjas, handschoenen, veiligheidsbril). Dek de schaal af met het deksel.
  2. Verzamel individuele larven van de 3einstar uit vliegenflesjes. In het3e larvale stadium verlaten de larven het voedingsmedium en kruipen langs de zijkant van de voerflacon11 omhoog.
    1. Zorg ervoor dat de larven nog in beweging zijn en niet zijn begonnen met de vorming van puparium. Larven die stilstaan en een verkorting van het lichaam vertonen, beginnen te verpoppen en zijn ongeschikt voor ablatie. Pak larven op met een klein penseel.
      OPMERKING: Het 3elarvale stadium begint na de tweede vervelling na 72 uur ontwikkeling (na het leggen van de eieren) en duurt tot de vorming van puparium om 120 uur voor vliegen die bij 25 °C zijn grootgebracht.
  3. Breng een larve over in een kleine, open container. Plaats de container in de glazen schaal met ethylether en sluit de schaal goed af. Plaats de glazen schaal bij het openen onder een snorkel of in een zuurkast om te voorkomen dat dampen ontsnappen.
    1. Verwijder met tussenpozen van 30 s het deksel met de larve van de schaal en controleer de larve op mobiliteit onder een dissectiemicroscoop. De larve zal over het algemeen binnen 1 minuut geïmmobiliseerd zijn. Zodra de mondhaken stoppen met trillen, is de larve klaar om op te stijgen. Gooi alle larven weg die na 3 minuten niet volledig geïmmobiliseerd zijn.
      OPMERKING: De bovenkant van een omgekeerd deksel van een microcentrifugebuis (deksel verwijderd van de buis) kan als container worden gebruikt.

3. Montage van larven op objectglaasjes voor ablatie

  1. Plaats de verdoofde larve op een glazen microscoopglaasje. Dompel de larve onder in een druppel insectenzoutoplossing; Dit zal een deel van de voedselresten wegspoelen die aan de larve kunnen blijven kleven.
  2. Verwijder onder de dissectiemicroscoop het grootste deel van de zoutoplossing met een papieren zakdoekje. Plaats de larve met de dorsale kant naar boven voor GF-ablatie of de ventrale kant naar boven voor TTMn-ablatie. Laat langzaam een glazen dekglaasje op de larve zakken. Voeg zoutoplossing toe aan de zijkant van het dekglaasje om de ruimte tussen het glasplaatje en het dekglaasje op te vullen.
  3. Controleer voor GF-ablatie de positionering van de hersenen onder sterke vergroting op de dissectiemicroscoop. Zorg ervoor dat de hersenen horizontaal liggen en zichtbaar zijn door de nagelriem. Vaak zijn de hersenen bedekt met vetweefsel, waardoor visualisatie en celablatie onmogelijk worden.
    1. Om eventueel vetweefsel dat de hersenen bedekt te verplaatsen, oefent u lichte druk uit op het dekglaasje met een tang en beweegt u het dekglaasje heen en weer. Als het vetweefsel op deze manier niet uit de hersenen kan worden verwijderd, gebruik dan een andere larve.

4. Lokaliseren van de doelcellen

OPMERKING: Het multi-fotonsysteem dat voor dit onderzoek werd gebruikt, was op een rechtopstaande microscoop gemonteerd. Systeemspecifieke software werd gebruikt om de instellingen voor acquisitie en laserstimulatie te regelen. Het systeem was uitgerust met een epifluorescentielichtbron om de monsters te lokaliseren. De objectieflens was een wateronderdompelingslens met een vergroting van 25x, een lange werkafstand van 2 mm en een NA van 1.10.

  1. Plaats het monster op de tafel van de multifotonmicroscoop en gebruik het GFP-filter om het monster in de epifluorescentiemodus te lokaliseren. Voor GF-ablatie kunnen de cellichamen in de hersenen worden geïdentificeerd, zoals te zien is in figuur 1A,C,D. Voor TTMn-ablatie kan een cluster van vier cellen worden geïdentificeerd vanaf de ventrale zijde in het ventrale zenuwkoord (VNC), zoals weergegeven in figuur 1A,B. Als u klaar bent met scherpstellen, centreert u de cellen in het gezichtsveld en schakelt u over naar de 2-fotonmodus.

5. Instellen van de ablatieparameters

  1. Pas de laserinstellingen en detectorversterking aan om de GFP-expressiecellen te bekijken met de Galvano-scanner. Een golflengte van 870 nm werkt het beste voor het visualiseren van het GFP-signaal. Centreer de cel in het gezichtsveld.
  2. Gebruik een cirkelvormig interessegebied (ROI) om het gebied voor ablatie te definiëren. Zorg ervoor dat de ROI het grootste deel van het oppervlak van de cel beslaat (Figuur 1E,G).
  3. Stel het ablatieprotocol in de software in. Stel een verwervingskader in, dan stimulatie, gevolgd door een ander verwervingskader.
  4. Start de instelling van het stimulatielaservermogen op een lagere waarde (10%-20%) en voer het stimulatieprotocol uit. Een succesvolle ablatie is te herkennen aan een duidelijke cirkel in het midden van de cel soma op de plaats van de ROI en een toename van de fluorescentie rondom de ROI (Figuur 1F).
    1. Als de ablatie niet is gelukt en de cel alleen is gebleekt (Figuur 1H), verhoog dan het laservermogen met stappen van 5% of het aantal lussen één voor één en voer het protocol opnieuw uit. Het toegepaste laservermogen lag tussen de 10% en 40% voor het systeem dat in het protocol werd gebruikt.
      OPMERKING: De instellingen van het laservermogen voor ablatie zijn sterk afhankelijk van hoe diep de cellen zich in het weefsel bevinden en andere factoren zoals het vouwen van de nagelriem. Als cellen helder en duidelijk zichtbaar zijn, bevindt het laservermogen zich aan de onderkant van het bereik. Het laservermogen zal voor elk systeem anders zijn, afhankelijk van het lasermodel en de leeftijd van de laser.

figure-protocol-1
Figuur 1: Identificatie van neuronen voor laserablatie in intacte Drosophila L3 larven. (A) Schema van de locatie van reuzenvezel (GF) soma in de hersenen en cluster van motorneuronen die het tergotrochanterale motorneuron (TTMn) in het ventrale zenuwkoord (VNC) bevatten. (B) Projectie van maximale intensiteit van shakB(lethal)-Gal4 die de expressie van GFP in de larvale VNC aandrijft. De middellijn wordt aangegeven door de stippellijn. De cirkel geeft het cluster van neuronen aan die de TTMn bevatten en die het doelwit zijn van laserablatie. Schaalbalk: 50 μm. (C) Gedeeltelijke projectieweergave van de larvale hersenen die GFP tot expressie brengen onder controle van A307-Gal4. De cirkel geeft de GF soma aan die het doelwit is van laserablatie. Schaalbalk: 50 μm. (D) Projectie van maximale intensiteit van de hersenen met R91H05-Gal4 die UAS-GFP aandrijft. Beide GF's (cirkels) zijn herkenbaar aan locatie, vorm en grootte. Schaalbalk: 50 μm. (E) GF soma vergrote weergave vóór laserablatie. De magenta cirkel geeft het doelgebied voor laserablatie aan. Schaalbalk: 10 μm. (F) GF soma vergrote weergave na levering van gelokaliseerd laservermogen en succesvolle ablatie. Schaalbalk: 10 μm. (G) GF soma vergrote weergave vóór laserablatie. De magenta cirkel geeft het doelgebied voor laserablatie aan. Schaalbalk: 10 μm. (H) GF soma vergrote weergave na levering van gelokaliseerd laservermogen en mislukte ablatie (bleken). Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Herstel van de larven

  1. Nadat de cel met succes is verwijderd, verwijdert u het dekglaasje en pakt u de larven voorzichtig met een penseel van het glaasje. Doe de larven in een voedselflesje. Larven zullen binnen 30 minuten weer beginnen rond te kruipen.
    OPMERKING: Door de proceduretijd kort te houden, worden de overlevingskansen van dieren verbeterd. Met ervaring kan het experiment in iets minder dan 10 minuten worden uitgevoerd.
  2. Ga door met het kweken van larven onder standaardomstandigheden totdat ze uit het omhulsel van de pop komen.

7. Testen van de functionaliteit van het GFS bij volwassen vliegen

OPMERKING: De volgende stappen worden in detail uitgelegd in Allan en Godenschwege12 en Augustin et al.13.

  1. Test volwassen vliegen op de leeftijd 2-5 dagen na de ontsluiting. Verdoof vliegen met CO2 en monteer ze op tandwas door de poten in de was te duwen. Spreid de vleugels in een hoek van 90° en bevestig ze op hun plaats met de was. Zet de kop vast door de proboscis in de was te duwen.
  2. Plaats stimulatiedraden in beide ogen, een aardingsdraad in de buik en glazen opname-elektroden in de springspieren (TTM's) aan elke kant.
  3. Stimuleer het GF-circuit met enkele stimuli om de responslatentie voor beide spieren te meten. Stimuleer het circuit met respectievelijk 100 Hz en 200 Hz treinen van stimuli om de volgende frequentie voor beide spieren te meten.

8. Ontleding en etikettering van het gigantische vezelsysteem voor confocale beeldvorming

OPMERKING: Vlieg-CZS-dissectie en kleurstofinjectie worden gedetailleerd beschreven in Boerner en Godenschwege14.

  1. Verwijder de vlieg voorzichtig met een pincet uit de tandwas en breng deze over naar een met siliconenelastomeer beklede petrischaal onder een dissectiescoop.
  2. Verwijder de poten, vleugels en slurf met een schaar en gebruik insectenpennen om de vlieg met de rug naar boven in de elastomeercoating vast te zetten.
  3. Maak een laterale incisie langs de middellijn vanaf de middelste buik, door de hele thorax en langs de nek, waarbij de thorax met het hoofd wordt verbonden. Open de vlieg met insectenpinnen. Verwijder organen en klieren van de vlieg zonder het zenuwstelsel te beschadigen.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen GF-axonen worden geïnjecteerd met kleurstoffen om de GF's en elektrisch gekoppelde neuronen te labelen13.
  4. Verwijder de hoofdcapsule van het hoofd om de hersenen bloot te leggen.

9. Immunohistochemie van het zenuwstelsel

  1. Na dissectie van het CZS, fixeer de vlieg in 4% PFA in PBS gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (RT). Was gedurende 20 minuten in PBS op RT (3 keer).
  2. Blokkeer het monster gedurende 1 uur bij RT in 3% BSA in PBS met 0,5% wasmiddeloplossing.
  3. Incubeer gedurende 2-3 nachten bij 4 °C in 3% BSA in PBS met 0,3% wasmiddeloplossing en anti-GFP voor konijnen (1:500). Was gedurende 20 minuten in PBS op RT (6 keer).
  4. 's Nachts incuberen bij 4 °C in PBS met anti-konijn Alexa 488. Was gedurende 20 minuten in PBS op RT (6 keer).
  5. Dehydrateer monsters met een oplopende ethanolreeks (50%, 70%, 90%, 100% ethanol) gedurende 10 minuten per stap. Verwijder de pinnen en knip de buik en de vliegspieren af. Breng de rest van de thorax met het zenuwstelsel over op een objectglaasje en bedek het met een bevestigingsmedium zoals methylsalicylaat. Plaats een dekglaasje op het monster en plak het af met nagellak.
  6. Bekijk het zenuwstelsel op een confocale microscoop om de anatomie van de GF-terminal te analyseren.

Resultaten

Deze methode kan worden gebruikt om de ontwikkeling van specifieke neuronale netwerken in het zenuwstelsel van Drosophila te manipuleren. De primaire onderzoeksvraag hierbij was de vorming van synaptische verbindingen. Het verwijderen van de presynaptische GF of de postsynaptische TTMn maakte het mogelijk om reactieve synaptogenese bij deze centrale synaps en de moleculaire mechanismen die cruciaal zijn voor synaptische functie en ontwikkeling te onderzoeken. Zoals beschreven in het protocol werd lasercelablatie van een van de GF's of een van de TTMn's uitgevoerd en werden de effecten op de synaps na de ontwikkeling van de pop bij de volwassen vlieg geanalyseerd.

Om ervoor te zorgen dat de procedure geen negatief effect heeft op de overleving van dieren, werden simulablaties parallel uitgevoerd. Voor schijnablaties werden dieren op dezelfde manier behandeld als proefdieren, maar laserpulsen werden afgegeven met een laservermogen van 0%. In 82,4% van de gevallen ontwikkelden dieren van schijnablaties zich tot volwassen vliegen. GF's van nep-geablateerde vliegen waren in staat om te reageren met een latentie van minder dan 1 ms en een stimulatie van 100 Hz te volgen voor 79,3% van de stimuli. De anatomie van GF was niet te onderscheiden van onbehandelde vliegen.

Voor elk proefdier werd de ablatie anatomisch geverifieerd. Bij GF-geablateerde dieren werd de niet-geablateerde GF met kleurstof geïnjecteerd en in beeld gebracht (zie hieronder). Als slechts één GF-axon zichtbaar was in het cervicale bindmiddel (CvC), werd ablatie van de andere GF aangenomen. Ablatie kan ook worden geverifieerd door de afwezigheid van een GFP-gelabelde soma aan de geablateerde kant van de hersenen (Figuur 2A, cirkel). Om TTMn-ablatie te beoordelen, werd het GFP-signaal in de volwassen VNC geanalyseerd, waarbij de TTMn soma en dendriet gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. De afwezigheid van de TTMn aan één kant was gemakkelijk te herkennen aan het ontbreken van soma en dendrieten (Figuur 2B, cirkel).

Om de functie van het GFS bij behandelde vliegen te testen, werden synaptische potentialen van de springspieren12,13, die worden geïnnerveerd door de TTMn, geregistreerd (Figuur 3A). De GF's vormen een gemengde elektrisch-chemische synaps met de TTMn mediale dendriet15. De GF-terminal is onvertakt en vertoont een typische zijwaartse buiging die tegengesteld is aan de TTMn-dendriet in het synaptische gebied (Figuur 3D, Figuur 4A pijlpunt). Bij controlevliegen innerveert elke GF uitsluitend zijn ipsilaterale motorneuron. In opnames van de TTM-vezels werd de sterkte van de verbinding beoordeeld door de responslatentie bij stimulatie van 1 Hz en de volgfrequentie bij stimulatie van 100 Hz te analyseren (Figuur 3B,C). Controlevliegen vertoonden een gemiddelde responslatentie van minder dan 1 ms en konden voor 78,1% van de stimuli een stimulatie van 100 Hz volgen (Figuur 3B). Nadat fysiologische opnames waren uitgevoerd, werd het monster ontleed om de CZS en GF's te onthullen, die met kleurstof werden geïnjecteerd met een mix van TRITC-Dextran en Neurobiotine. Het grote Dextran-molecuul labelt het GF-axon en het terminale, maar passeert geen gap junctions. Neurobiotine kan de gap junctions tussen GF en TTMn overbruggen, en het Neurobiotine-signaal werd gedetecteerd in de postsynaptische dendriet (Figuur 3E,F, pijlpunten). Deze neurobiotine kleurstofkoppeling bevestigde de elektrische koppeling tussen de twee neuronen. Neurobiotine kan ook worden gedetecteerd in veel andere neuronen in de VNC die via gap junctions zijn verbonden met de GF16 (Figuur 3E,F).

Dezelfde fysiologische en anatomische tests werden uitgevoerd nadat één GF in L3 was geablateerd. Het axon van de meeste (13/15) van de resterende GF's in ablatievliegen vertoont een splitsing van de terminal in twee takken: één op de gebruikelijke ipsilaterale locatie en één die de middellijn kruist naar een homologe positie contralateraal aan de intacte GF (Figuur 3G, pijl). Elke tak was met kleurstof gekoppeld aan een van de TTMn-dendrieten (Figuur 3H,I, pijlpunten). Fysiologische opnames van de TTM's bevestigden deze synaptische verbinding van één GF met beide TTMn's, hoewel zwakker dan normaal. De latentie van de TTM-respons was groter dan 1 ms voor beide zijden, en de volgende frequenties bij 100 Hz waren 37,1% voor de TTMn ipsilateraal ten opzichte van de intacte GF en 28% voor de contralaterale TTM (Figuur 3C).

Omdat ablatie van één GF ervoor zorgde dat de resterende GF beide doelneuronen innerverde, was het volgende experiment gericht op het observeren van de respons van naburige GF's wanneer men geen normaal ipsilateraal doelmotorneuron had. Voor dit experiment werd een van de postsynaptische neuronen verwijderd en werden de anatomie en functie van de resterende TTMn, evenals de morfologie van de GF-terminals, beoordeeld. Bij het visualiseren van zowel TTMn's als de GF's in volwassen controledieren, was het gebied van verondersteld synaptisch contact duidelijk zichtbaar (Figuur 4A, pijlpunten). Elke TTMn mediale dendriet werd geplaatst tegen de ipsilaterale GF presynaptische terminal. Kleine uitsteeksels van TTMn-dendrieten van beide zijden maakten contact met de middellijn (Figuur 4C; inzet). Kleurstofkoppeling met neurobiotine was merkbaar zichtbaar in beide TTMn (Figuur 4D, pijlpunten).

Wanneer één TTMn werd geablateerd, werd de morfologie van de resterende TTMn mediale dendriet veranderd. De mediale dendriet strekte zich bij deze exemplaren uit over een lange, dikke tak over de middellijn (Figuur 4I,K; gele pijlen). Bovendien strekten dunnere uitsteeksels naar beide GF-uiteinden zich naar voren uit (Figuur 4E,G; gele pijlpunten). De GF, ipsilateraal ten opzichte van de TTMn, vertoonde zijn gebruikelijke anatomie met een terminal die langs de TTMn-dendriet uitstak.

De respons van de "verweesde" GF die geen doelmotorneuron had, was van primair belang. In de meeste gevallen (61,5% van de dieren) vertoonde de verweesde GF een gespleten terminal met één terminal aan de ipsilaterale zijde en de andere terminal die de middellijn kruiste en uitstak in de richting van de contralaterale TTMn-dendriet (Figuur 4J, pijlen). Deze gekruiste takken van de GF waren altijd kleiner dan die gezien in het complementaire experiment toen de naburige GF werd geablateerd (Figuur 3F). De ipsilaterale terminal maakte contact met de TTMn-tak die zich over de middellijn uitstrekte (Figuur 4I, gele pijl). In 23% van de exemplaren kruiste de verweesde GF de middellijn (Figuur 4F, pijl) en projecteerde langs een van de voorste takken van TTMn (Figuur 4E, gele pijlpunten) en was gekoppeld aan de resterende TTMn (Figuur 4H, pijlpunt).

Nog twee fenotypes werden waargenomen bij TTMn-ablatievliegen (Figuur 4M). Bij één van de 13 vliegen maakten beide GF's de normale buiging en bleven ze aan hun respectievelijke zijden van het zenuwstelsel. In een ander geval vertoonde de verweesde GF het bendless fenotype, waarbij de verweesde GF geen terminal maakte en stopte voor het gebied waar het gewoonlijk buigt. Voor alle vier de fenotypen waren de TTM-opnames aan de kant van de intacte TTMn vergelijkbaar met wildtype (WT) fysiologie met een responslatentie van minder dan 1 ms en een volgfrequentie bij 100 Hz bij 100% of bijna 100%. Het verwijderen van één doel kan ervoor zorgen dat beide GF's de resterende doel-TTMn delen. In de meeste gevallen zullen beide GF's een verbinding maken met de resterende TTMn. Over het algemeen zal de verweesde GF een bilaterale terminal vertonen. Bij controlevliegen zullen GF's nooit de middellijn overschrijden; bij ongeveer 85% van de TTMn-ablatievliegen stak één GF echter de middellijn over om contact te maken met de contralaterale TTMn. De innervatie van één TTMn door twee GF had geen negatieve invloed op de synaptische functie.

Het is opmerkelijk dat de afwezigheid van de naburige GF een groter effect heeft dan de afwezigheid van het doelmotorneuron. De bilaterale terminal gevormd in afwezigheid van de contralaterale GF is veel groter en duidelijker functioneel dan de veranderingen wanneer het doelwit wordt verwijderd.

figure-results-1
Figuur 2: Voorbeelden van succesvolle ablaties in het volwassen CZS. (A) Maximale intensiteitsprojectie van een volwassen vliegenbrein na larvale GF-ablatie. GFP (groen) wordt aangestuurd door A307-GAL4. De cirkel geeft het gebied aan waar de geablateerde GF ontbreekt. De pijlpunt wijst naar de resterende GF die GFP tot expressie brengt aan de andere kant van de hersenen. De GF was gevuld met TRITC-Dextran (rood). Het axon projecteert naar achteren in de richting van de VNC. Schaalbalk: 20 μm. (B) Projectie van maximale intensiteit van een volwassen VNC waarbij één TTMn werd geablateerd in L3. De resterende TTMn (pijlpunt) drukt GFP uit onder de shakB (dodelijke) driver. De oppervlakte van de ontbrekende TTMn wordt aangegeven door de cirkel. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Larvale ablatie van één reuzenvezel (GF) veroorzaakt bilaterale vertakking van het presynaptische uiteinde van de resterende GF. (A) Schema van de experimentele opstelling voor het testen van de structuur en functie van het volwassen reuzenvezelsysteem (GFS). De opname-elektrode meet de latentie en de volgende frequentie van tergotrochanterale motorneuron (TTMn) output bij de tergotrochanterale spieren (TTM) bij stimulatie van de hersenen in het intacte dier. Na dissectie van het zenuwstelsel werd de kleurstof geïnjecteerd in de GF-axonen bij het cervicale bindmiddel (CvC). (B,C) Steekproefsporen voor TTM-responslatentie en volgfrequentie bij 100 Hz (n vertegenwoordigt het aantal TTM dat van elke situatie is geregistreerd met gemiddelde latentie en volgende frequentie weergegeven). (B) Controledieren met twee intacte GF's vertonen TTM-latenties van minder dan 1 ms en volgfrequenties van bijna 100% bij 100 Hz. (C) De enige resterende GF in geablateerde dieren innerveert beide TTMn's. Latenties voor beide TTMn's zijn langer dan bij controles, en na 100 Hz is de frequentie aanzienlijk verlaagd. (D-I) Projectie met maximale intensiteit van confocale beeldstapels voor met kleurstof gevulde GF's. TRITC-Dextran (D,G,F,I in rood) en neurobiotine (E,H,F,I in grijs) werden samen geïnjecteerd. Neurobiotine kan gap junctions tussen de GF en de TTMn oversteken, waardoor de postsynaptische neuronen worden gelabeld. De stippellijnen geven de middellijn aan. (D) Typische GF-anatomie van controledieren met de terminale buiging. (E,F) Neurobiotine labelt veel postsynaptische neuronen die elektrisch gekoppeld zijn aan de GF's. De trans synaptisch gelabelde TTMn dendrieten worden aangeduid met pijlpunten. (G) Na ablatie groeit de resterende GF een extra terminal (pijl), die de middellijn kruist om de contralaterale TTMn te innerveren. (H,I) Beide TTMn (pijlpunten) zijn kleurstofgekoppeld aan dezelfde GF. Schaal balken: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4. Larvale ablatie van één tergotrochanteraal motorneuron (TTMn) veroorzaakt innervatie van het resterende TTMn door beide reuzenvezels (GF). (A-L) Projecties met maximale intensiteit van confocale beeldstapels van TTMn's gelabeld met GFP (groen) onder controle van shakB (lethal)-Gal4 en de GF's waren kleurstof gevuld met TRITC-Dextran (magenta) en Neurobiotine (rood). De stippellijn geeft de middellijn van het zenuwstelsel aan. (A-D) Controlemonsters met beide TTMn's intact. De GF's maken hun typische terminale buiging weg van de middellijn om contact te maken met de TTMn (A,B), en elke GF maakt contact met één TTMn. TTMn-dendrieten ontmoeten elkaar op de middellijn (C). Elke GF is kleurstof gekoppeld aan zijn TTMn (D, witte pijlpunten). (E-H) De linker TTMn werd geablateerd. De mediale dendriet van de resterende TTMn steekt uit over de middellijn (G, gele pijl). De verweesde GF kruist de middellijn (witte pijl) in het synaptische gebied en maakt contact met de contralaterale TTMn-dendriet (E,F). De GF's zijn kleurstof gekoppeld aan de resterende TTMn (H, pijlpunt). (I-L) Voorbeeld van een ander GF-fenotype waarbij de linker TTMn werd geablateerd. De mediale dendriet van de resterende TTMn steekt uit over de middellijn (I en K, gele pijl). De linker verweesde GF maakt een bilaterale terminal; de ene tak steekt contralateraal uit en de andere blijft ipsilateraal (J, pijlen) om verbinding te maken met de TTMn. Schaalbalken: 20 μm. (M) Schema van de waargenomen vier verschillende GF-fenotypes bij TTMn-ablatiedieren. n geeft het aantal dieren in elke klasse aan. Gegeven zijn de gemiddelden met standaardfout voor TTM-responslatentie en volgfrequentie (FF) bij 100 Hz voor de kant van de intacte TTMn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Celablatie met een 2-fotonenmicroscoop bleek een zeer succesvolle methode te zijn om de ontwikkeling van neuronale circuits in Drosophila te manipuleren. Omdat deze methode niet-invasief is, veroorzaakt het minimale schade aan het dier. De gegevens ondersteunen het nut van deze celspecifieke manipulatie van bekende circuits.

Cruciaal voor het succes van de ablatie was het selecteren van de meest geschikte Gal4-driver. Aangezien het GFS goed bestudeerd is, zijn er veel specifieke Gal4-driverlijnen beschreven7. De meeste Gal4-drivers zijn zeer beperkt, maar komen nog steeds tot expressie in veel andere neuronen. Een uitdaging was om de doelcellen in het intacte dier betrouwbaar te identificeren. Voor dieren met een duidelijk zichtbaar GFP-label kon ablatie worden uitgevoerd met een laag laservermogen en was er vaak slechts één proef nodig. Bij dieren waar vetweefsel de hersenen bedekte of de GFP-expressie zwak was, vereiste deletie van doelcellen een hoger laservermogen en meerdere lussen van laserblootstelling. De GF-cellichamen bevonden zich ongeveer 100 μm diep van de dorsale kant van de hersenen. Voor experimenten waarbij doelcellen zich op een diepere diepte bevinden, kan het nuttig zijn om ablatie uit te voeren in eerdere larvale stadia wanneer het zenuwstelsel kleiner is.

In eerdere experimenten in het lab werden verschillende methoden voor celablatie onderzocht. Het gebruik van het UAS/Gal4-systeem om de expressie van toxines te stimuleren, leidde ook tot de verwijdering van specifieke neuronen. Het is echter veel moeilijker om de deletie van afzonderlijke cellen te controleren en off-target effecten te voorkomen. De andere moeilijkheid is het beheersen van de exacte timing van de celdeletie-gebeurtenis. Lasercelablatie maakte nauwkeurige controle over de doellocatie en de timing van deletie mogelijk, maar er waren nog enkele uitdagingen die moesten worden overwonnen voordat de methode werd geperfectioneerd en slagingspercentages van meer dan 80% (overleving van dieren en succesvolle celablatie) werden bereikt. De overlevingskans van de dieren werd negatief beïnvloed door langdurige blootstelling aan ethylether en lange proceduretijden. Studies hebben aangetoond dat hoge overlevingspercentages bij verpopping (78%) en eclosie bij volwassenen (67%) kunnen worden bereikt bij blootstelling van L3 Drosophila-larven aan ethylether10 van 3,5 minuten. Blootstelling gedurende 3,5 minuut zorgt ervoor dat het dier tot 8 uur immobiel is. Voor lasercelablatie moeten dieren 30 minuten of minder immobiel zijn. Daarom kan de blootstellingstijd aan ethylether ruim onder de 3,5 minuten worden gehouden. In de meeste gevallen waren de larven binnen 1 minuut volledig onbeweeglijk.

De resultaten van de laserablatie tonen aan dat de GF netjes kan worden geablateerd en dat het effect op de contralaterale naburige GF gemakkelijk kan worden beoordeeld. Het resultaat van de ablatie was duidelijk en consistent. In 13 van de 15 eencellige ablaties vertonen de overige GF-partners een bilaterale terminal die nooit wordt gezien bij controledieren. Deze bilateraal symmetrische terminal is gemakkelijk te herkennen en de ongebruikelijke contralaterale tak is qua grootte vergelijkbaar met een normale terminal en is kleurstofgekoppeld aan het contralaterale doelmotorneuron. De bilaterale terminal is kleurstofgekoppeld aan beide doelmotorneuronen en functioneert in de meeste exemplaren bijna wildtype, waarbij zowel het normale-ipsilaterale doelwit als het contralaterale doelmotorneuron worden aangestuurd met latenties en volgfrequenties in de buurt van de controlewaarden.

Het aanvullende experiment, een eenzijdige ablatie van een doelmotorneuron, biedt een interessante vergelijking. Het resterende motorneuron vertoont vaak een reactieve dendritische groei, waarbij een proces zich over de middellijn uitbreidt naar de ruimte die normaal gesproken wordt ingenomen door de verwijderde buurman. Hoewel deze dendriet niet zo groot is als de verwijderde, vertoont hij een reactie die vergelijkbaar is met de GF's die hun bilaterale partner missen. Daarentegen reageert de nu doelloze GF slechts bescheiden op het afwezige doelwit, waardoor kleine processen over de middellijn en langs de resterende dendrieten van de motorneuron worden uitgebreid. Deze bescheiden respons staat in schril contrast met de dramatische respons van de GF op een ontbrekende bilateraal homologe GF, waarbij een grote contralaterale terminal wordt gevormd om de normale terminal aan te vullen en een bilaterale terminal te vormen.

Onlangs is een parallel ablatie-experiment uitgevoerd op de presynaptische input naar de GF in de hersenen, waar een soortgelijk type "competitie" voor synaptische ruimte werd onthuld17. Visuele invoer naar de GF-tegel de glomerulus waar de visuele projectieneuronen (VPN) de GF-dendrieten bereiken. Het verwijderen van één groep van de VPN's (in dit geval genetisch) toont aan dat de resterende VPN's een deel van de synaptische ruimte van de afwezige buurman overnemen en innerveren en een compenserend fysiologisch herstel van de visuele reactie op dreigende stimuli produceren. Wanneer de eerst aankomende afferenten worden verwijderd, nemen de latere aankomsten ruimte in en zijn ze niet langer bezet. De belangrijkste fenomenologische overeenkomst met dit werk is de schijnbare rol die fysieke bezetting speelt bij het bepalen van de balans tussen de verschillende inputs. De uitgangsklemmen van de twee GF's lijken met elkaar te concurreren om fysieke synaptische ruimte.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Experimenten met de 2-fotonmicroscoop werden uitgevoerd in de FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. We willen het Jupiter Life Science Initiative bedanken voor de financiële steun.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbitFisher ScientificA111221:500 concentratie
Apo LWD 25x/1.10W ObjectiefNikonMRD77220water-immersie lange werkafstand
Bovine Serum Albumine (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Saffier Vision II LaserCoherent
Katoenen BalGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrodamine, 10.000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)Fisher ScientificD1817
Drosophila-zoutvloeistofrecept van Gu en O'Dowd, 2006
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1Gevaar, Ontvlambare vloeistof
Vliegvoer B (Bloomington-recept)LabExpress7001-NV
MethylsalicylaatFisher ScientificO3695-500
Microcentrifugebuisje 1,5 mlEppendorf22363204
Microscoopdekje 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Neurobiotine TracerVector LaboratoriesSP-1120
Nikon A1R multi-foton microscoopNikonop een staande FN1 microscoopstandaard
NIS Elements Advanced ResearchNikonVerwervings- en data-analysesoftware
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (fosfaatbufferoplossing)Fisher BioReagentsBP2944-100Tabletten
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(dodelijk)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost microscoopglasplaatjeFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000detergent-oplossing
UAS-10xGFPBloomington Drosophila Stock Center32185

Referenties

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

TweefotonmicroscopieAssemblage van Neurale CircuitsReuzenvezelsysteemOptogeneticaAblatie van Enkelvoudige NeuronenOntsnappingsgedragGFP expresserende Cellen
Lasercelablatie in intacte Drosophila-larven onthult synaptische competitie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.