Dit protocol demonstreert de lasercelablatie van individuele neuronen in intacte Drosophila-larven . De methode maakt het mogelijk om het effect te bestuderen van het verminderen van competitie tussen neuronen in het zich ontwikkelende zenuwstelsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lasercelablatie in intacte Drosophila-larven onthult synaptische competitie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het protocol beschrijft ablatie met één neuron met een 2-foton lasersysteem in het centrale zenuwstelsel (CZS) van intacte Drosophila melanogaster larven. Met behulp van deze niet-invasieve methode kan het zich ontwikkelende zenuwstelsel op een celspecifieke manier worden gemanipuleerd. Het verstoren van de ontwikkeling van individuele neuronen in een netwerk kan worden gebruikt om te bestuderen hoe het zenuwstelsel het verlies van synaptische input kan compenseren. Individuele neuronen werden specifiek geablateerd in het gigantische vezelsysteem van Drosophila, met een focus op twee neuronen: de presynaptische reuzenvezel (GF) en het postsynaptische tergotrochanterale motorneuron (TTMn). De GF synapseert met de ipsilaterale TTMn, die cruciaal is voor de ontsnappingsreactie. Het ablateren van een van de GF's in de3e instar hersenen, net nadat de GF axonale groei begint te starten, verwijdert de cel permanent tijdens de ontwikkeling van het CZS. De resterende GF reageert op de afwezige buur en vormt een ectopische synaptische terminal voor de contralaterale TTMn. Deze atypische, bilateraal symmetrische terminal innerveert beide TTMn's, zoals aangetoond door kleurstofkoppeling, en drijft beide motorneuronen aan, zoals aangetoond door elektrofysiologische tests. Samenvattend, de ablatie van een enkel interneuron toont synaptische competitie tussen een bilateraal paar neuronen die het verlies van één neuron kunnen compenseren en de normale reacties op het ontsnappingscircuit kunnen herstellen.
Inleiding
Laserablatie is een voorkeursinstrument voor het ontleden van neurale circuits in een breed scala aan organismen. Ontwikkeld in modelgenetische systemen zoals wormen en vliegen, is het in het hele dierenrijk toegepast om de structuur, functie en ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen 1,2,3. Hier werd ablatie met één neuron gebruikt om te onderzoeken hoe neuronen op elkaar inwerken tijdens de assemblage van het circuit in Drosophila. Het ontsnappingssysteem van de vlieg is een favoriet circuit voor analyse omdat het de grootste neuronen en de grootste synapse....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren die voor het protocol werden gebruikt, waren van de soort Drosophila melanogaster. Er zijn geen ethische kwesties rond het gebruik van deze soort. Ethische goedkeuring was niet nodig om dit werk uit te voeren. De details van de Drosophila-soorten , reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Drosophila kweken en het juiste larvale stadium selecteren
- Kies een Gal4-driverlijn die de expressie stimuleert in de cellen die moeten worden geablateerd en combineer deze opnieuw met of kruis deze naar een UAS-GFP-r....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze methode kan worden gebruikt om de ontwikkeling van specifieke neuronale netwerken in het zenuwstelsel van Drosophila te manipuleren. De primaire onderzoeksvraag hierbij was de vorming van synaptische verbindingen. Het verwijderen van de presynaptische GF of de postsynaptische TTMn maakte het mogelijk om reactieve synaptogenese bij deze centrale synaps en de moleculaire mechanismen die cruciaal zijn voor synaptische functie en ontwikkeling te onderzoeken. Zoals beschreven in het protocol werd lasercelablatie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Celablatie met een 2-fotonenmicroscoop bleek een zeer succesvolle methode te zijn om de ontwikkeling van neuronale circuits in Drosophila te manipuleren. Omdat deze methode niet-invasief is, veroorzaakt het minimale schade aan het dier. De gegevens ondersteunen het nut van deze celspecifieke manipulatie van bekende circuits.
Cruciaal voor het succes van de ablatie was het selecteren van de meest geschikte Gal4-driver. Aangezien het GFS goed bestudeerd is, zijn er veel specifieke Gal4-.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Experimenten met de 2-fotonmicroscoop werden uitgevoerd in de FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. We willen het Jupiter Life Science Initiative bedanken voor de financiële steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentratie |
| Apo LWD 25x/1.10W Objectief | Nikon | MRD77220 | water-immersie lange werkafstand |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Saffier Vision II Laser | Coherent | ||
| Katoenen Bal | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrodamine, 10.000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila-zoutvloeistof | recept van Gu en O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Gevaar, Ontvlambare vloeistof |
| Vliegvoer B (Bloomington-recept) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methylsalicylaat | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifugebuisje 1,5 ml | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscoopdekje 18x18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotine Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-foton microscoop | Nikon | op een staande FN1 microscoopstandaard | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Verwervings- en data-analysesoftware | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (fosfaatbufferoplossing) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tabletten |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(dodelijk)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscoopglasplaatje | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent-oplossing |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
Referenties
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for loca....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
