Method Article

In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische obstructieve longziekte (COPD) wordt grotendeels toegeschreven aan blootstelling aan tabaksrook. Onderzoek naar hoe luchtwegepitheelcellen zich functioneel aanpassen aan tabaksrook is cruciaal voor het begrijpen van de pathogenese van COPD. De huidige studie was om een in vitro model op te zetten met behulp van primaire muizen luchtwegepitheelcellen om de real-life impact van tabaksrook na te bootsen. In tegenstelling tot gevestigde cellijnen behouden primaire cellen meer in vivo-achtige eigenschappen, waaronder groeipatronen, veroudering en differentiatie. Deze cellen vertonen een gevoelige ontstekingsreactie en efficiënte differentiatie, waardoor fysiologische omstandigheden nauw worden weergegeven. In dit model werden primaire muizen luchtwegepitheelcellen gedurende 28 dagen gekweekt onder een lucht-vloeistofinterface met een optimale concentratie sigarettenrookextract (CSE), wat leidde tot de transformatie van een monolaag van ongedifferentieerde cellen in een pseudogestratificeerd zuilvormig epitheel, indicatief voor CSE-acclimatisatie. Uitgebreide multi-omics-analyses werden vervolgens toegepast om de mechanismen op te helderen waarmee CSE de differentiatie van basale luchtwegcellen beïnvloedt. Deze inzichten bieden een beter begrip van de cellulaire processen die ten grondslag liggen aan de progressie van COPD als reactie op blootstelling aan tabaksrook.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische obstructieve longziekte (COPD) is een heterogene longaandoening met complexe kenmerken, terwijl patiënten met COPD geleidelijk jonger worden1. Roken, een primaire risicofactor voor COPD2, heeft een grote invloed op de epitheelcellen van de luchtwegen, die dienen als de eerste barrière tegen tabaksrook. Ondanks deze bekende associatie blijven de gedetailleerde mechanismen waardoor tabaksrook veranderingen in luchtwegepitheelcellen induceert onvoldoende onderzocht. Een grondig begrip van deze moleculaire veranderingen is essentieel voor het identificeren van vroege diagnostische markers en therapeutische doelen voor COPD.

Om deze kloof te dichten, hebben we een nieuw in vitro model ontwikkeld met behulp van luchtwegepitheelcellen van muizen. Deze cellen werden onderworpen aan langdurige stimulatie met sigarettenrookextract (CSE), waardoor we dynamische cellulaire veranderingen kunnen volgen en de veranderingen in luchtwegepitheelcellen onder langdurige tabaksstimulatie en het onderliggende mechanisme kunnen onderzoeken. In dit model werd transwell gebruikt om de lucht-vloeistofinterface van luchtwegepitheelcellen te bieden, en sigarettenrookextract werd gestimuleerd in het vroege stadium van epitheelceldifferentiatie tot het einde van de differentiatie na 28 dagen. Eerdere studies onderzochten alleen de differentiatie en kortetermijnstimulatie van luchtwegepitheelcellen (cellijndominantie). Ze waren beperkt tot een enkel regelgevend traject 3,4,5,6. Het hier gepresenteerde protocol maakt echter gebruik van primaire luchtwegepitheelcellen van muizen en optimaliseert het celextractieproces voor een betere celactiviteit dan eerdere methoden voor het kweken van luchtwegepitheelcellen. Dit model richt zich op veranderingen in cellulaire differentiatie naast uitgebreide transcriptomische, proteomische, metabolomische en epigenomische analyses. Door gebruik te maken van immunofluorescentie en geavanceerde multi-omics-technieken, wilden we de cellulaire reacties van luchtwegepitheelcellen op chronische blootstelling aan tabaksrook ophelderen, en zo bijdragen aan een beter begrip van de pathogenese van COPD. Dit model kan worden gebruikt om de veranderingen in het differentiatiepatroon van luchtwegepitheelcellen en het mechanisme ervan te onderzoeken dat wordt veroorzaakt door langdurige stimulatie van verschillende verontreinigende stoffen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het totale protocol vereist 44 dagen, waaronder 1 dag voor de bereiding van luchtwegepitheelcellen geïsoleerd uit muizenluchtpijpen, 15 dagen voor celproliferatie en 28 dagen voor CSE-stimulatie op de lucht-vloeistofinterface. Alle proefdieren zijn gehuisvest in de SPF Barrier Animal Room van het Animal Experiment Center van Capital Medical University en zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee van Capital Medical University (AEEI-2020-100) om te voldoen aan de vereisten van ARRIVE-richtlijnen7.

1. Isolatie van primaire muizen luchtwegepitheelcellen uit muizen luchtpijpen

  1. Voorbereiding
    1. Bereid een volledig expansiemiddel voor door 1 ml 50x supplement en 0,05 ml hydrocortisonbouillon te combineren met 48,95 ml expansiebasismiddel. Bewaren bij 4 °C en binnen 4 weken gebruiken.
    2. Los 7,5 mg proteïnase en 5 mg deoxyribonuclease I op in 5 ml Ham's F-12 om een proteïnase-oplossing te bereiden. Filtreer het om te steriliseren en bewaar het bij 4 °C en gebruik het binnen 4 weken.
    3. Bereid antibiotische oplossingen voor door 0,05 ml 100x penicilline/streptomycine en 0,01 ml 500x gentamicine/amfotericine toe te voegen aan 5 ml volledig expansiemedium, PBS en proteïnase-oplossing (100 E/ml penicilline, 100 E/ml streptomycine, 10 μg/ml gentamicine en 0,25 μg/ml amfotericine B). Bewaren bij 4 °C en binnen 4 weken gebruiken.
    4. Steriliseer chirurgische instrumenten en bereid de biologische veiligheidskast voor op celisolatie. Zorg er tegelijkertijd voor dat de standaard celkweekapparatuur klaar is voor gebruik.
    5. Bereid met collageen beklede schalen met rattenstaart door rattenstaartcollageen (100 μg/ml in 0,02 N azijnzuur) toe te voegen aan kweekschaaltjes van 100 mm en transwells van 24 mm (0,05 ml/cm2). Laat een nacht open staan onder UV-licht voor sterilisatie.
  2. Isolatie van primaire luchtwegepitheelcellen van muizen
    1. Gebruik C57BL/6 muizen (6-8 weken oud, mannelijk, SPF-grootgebracht) voor isolatie van tracheale epitheelcellen. Euthanaseren met een overdosis van 1% pentobarbital-natriumoplossing (ongeveer 200 mg/kg). Gebruik vijf muizen voor voldoende celopbrengst.
    2. Steriliseer de muis door onderdompeling in een 75% ethanoloplossing, zonder de neus en mond onder te dompelen in alcohol om te voorkomen dat alcohol in de luchtpijp stroomt.
    3. Ontleed de muis.
      1. Gebruik chirurgische messen en pincetten, een set apparaten voor het snijden en openen van de opperhuid van de onderkaak tot de buikholte van de muis.
      2. Gebruik een andere set chirurgische instrumenten om de schildklieren aan beide zijden uit elkaar te scheuren en de verbindingen tussen de luchtpijp, het omliggende spierweefsel en de slokdarm te verwijderen.
      3. Snijd daarna voorzichtig in de borstkas, gebruik een tang om dieper in de borstholte te graven, verwijder de hele long en zoek het uiteinde van de luchtpijp.
    4. Verwerk de luchtpijp.
      1. Snijd de luchtpijp van het schildklierkraakbeen naar de tracheo-bronchiale tak af en doe deze in een pre-koud expansiemedium met vier antibiotica.
      2. Schud de buis om zoveel mogelijk bloed van het oppervlak van de luchtpijp te spoelen, houd het op ijs en begin dan met de operatie voor de volgende muis.
    5. Breng alle verzamelde luchtpijpen over naar een voorkoude PBS-buffer met vier antibiotica (200 E/ml penicilline, 200 E/ml streptomycine, 20 μg/ml gentamicine en 0,5 μg/ml amfotericine B) voor voorbehandeling vóór de spijsvertering.
    6. Gebruik een set chirurgische instrumenten om stolsels en ander weefsel van de oppervlakken van de luchtpijp te verwijderen en snijd ze vervolgens in een maat van 1cm2 .
    7. Tracheaal weefsel in proteïnase-oplossing bij 37 °C gedurende 40 minuten incuberen.
    8. Schud de buis na 40 minuten meerdere keren en gebruik een celzeef van 40 μm om de resterende weefsels te verwijderen. Spoel de gehakte luchtpijpen af op een zeef met 5 ml expansiemedium, centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
    9. Resuspendeer de verkregen cellen in 8 ml expansiemedium.
    10. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
    11. Plaat P0-celsuspensie op schaaltjes van 100 mm (1 x10 4 levende cellen/cm2) voorbekleed met rattenstaartcollageen en kweek de cellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.

2. Expansiecultuur en passage van primaire muizen luchtwegepitheelcellen

  1. Vervang het medium voor de P0-celcultuur elke 3 dagen totdat de cellen 70%-80% confluentie bereiken, meestal binnen 6 dagen. Op dit punt kunnen tracheale epitheelcellen van muizen een intacte monolaag vormen met een geplaveid uiterlijk (Figuur 1A-D).
  2. Verwarm voldoende hoeveelheden PBS, volledig expansiemedium en celdissociatiekit zonder dierlijke bestanddelen (ACF) voor tot 37 °C.
  3. Spoel de cellen voorzichtig af met 3 ml PBS.
  4. Voer enzymatische dissociatie uit.
    1. Voeg 3 ml ACF-enzymatische dissociatieoplossing toe aan de schaal en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Maak na het pipetteren de cellen voorzichtig los en breng de celsuspensie over op 3 ml ACF-enzymremmingsoplossing.
    2. Herhaal de toevoeging van 3 ml ACF-enzymatische dissociatieoplossing en incubeer opnieuw gedurende 5 minuten om maximale celloslating te garanderen.
  5. Draai de celsuspensie op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
  6. Resuspendeer de cellen in 1 ml expansiemedium.
  7. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
  8. Plaat P1 cel suspensie op verschillende schalen van 100 mm (5 x10 4 levende cellen/cm2) voorgecoat met rattenstaartcollageen, en kweek de cellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.

3. Differentiatie en CSE-stimulatie van primaire muizen luchtwegepitheelcellen op het grensvlak tussen lucht en vloeistof

  1. Bevestig het celtype.
    1. Controleer de epitheliale oorsprong van geïsoleerde cellen met behulp van een immunofluorescentietest (IFA) met antilichamen tegen cytokeratines. Zaadcellen op glasplaatjes bedekt met rattenstaartcollageen en gebruik paraformaldehyde om ze gedurende ten minste 12 uur te fixeren nadat de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt.
    2. Was de objectglaasjes 3 keer met PBS-oplossing gedurende 5 minuten en incubeer ze met 3% BSA en 0,1% triton X-100 in PBS-oplossing bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur.
    3. Incubeer objectglaasjes 's nachts bij 4 °C met in de handel verkrijgbare anti-pan cytokeratine-antilichamen in een verdunning van 1:500.
    4. De volgende dag de objectglaasjes 3 keer wassen met PBS-oplossing gedurende 5 minuten en ze incuberen met secundaire antilichaambuffer in een verdunning van 1:1000 bij RT gedurende 2 uur in het donker.
    5. Was de glaasjes na incubatie 3 keer met PBS (5 min per wasbeurt) en voeg DAPI toe in een verdunning van 1:1000. Na incubatie bij RT gedurende 15 min, de glaasjes eenmaal wassen met PBS gedurende 5 min.
    6. Bekijk objectglaasjes onder een fluorescentiemicroscoop en vergelijk expressiepatronen met een positieve controle (A549-cellijn) en een negatieve controle (Raw264.7-cellijn) (Figuur 2).
  2. Zaai de cellen voor differentiatie.
    1. Maak de P2-cellen los en centrifugeer ze zoals eerder beschreven, en suspendeer de celpellet opnieuw in een geschikte hoeveelheid expansiemedium om het uitplateren van 1 x 104 levende cellen/cm2 te vergemakkelijken.
    2. Pipetteer 1 ml celsuspensie op de apicale kamer van het transwell polycarbonaat membraaninzetstuk. Voeg aan het basale compartiment van de transwell 1,5 ml proliferatiemedia toe.
  3. Incubeer de cellen bij 37 °C en vervang elke 3 dagen al het medium in de basale en apicale kamers volledig met behulp van expansiemedium totdat de samenvloeiing is bereikt. Dit duurt meestal 3-6 dagen.
  4. Bereid 50 ml volledig differentiatiemedium voor door 5 ml ALI 10x Supplement, 500 μL ALI Maintenance Supplement, 100 μL heparineoplossing en 250 μL hydrocortisonbouillonoplossing toe te voegen aan 44,15 ml ALI Basal Medium.
  5. Bereid CSE voor.
    1. Bubbel een sigaret door 12,5 ml differentiatiemedium en filtreer deze vervolgens door een poriënfilter van 0,22 μm om CSE te bereiden. Om standaardisatie tussen experimenten en batches van CSE te garanderen, meet u de absorptie bij 320 nm op een spectrofotometer en definieert u de optische dichtheid (OD) van 1 als 100%8.
  6. Gebruik het differentiatiemedium met een geschikte concentratie CSE om primaire muizen luchtwegepitheelcellen te stimuleren om effecten op de differentiatie van de cellen te detecteren.
  7. Laat de cellen gedurende 28 dagen differentiëren, waarbij het basale kamermedium wordt verwisseld en de apicale zijde twee keer per week wordt gewassen door het apicale kamermedium te verwijderen en het basale kamermedium te vervangen door het differentiatiemedium dat de juiste concentratie CSE bevat.
  8. Analyseer de cellen na blootstelling.
    1. Na blootstelling aan differentiatiemedium dat CSE bevat, de cellen en de kweeksupernatanten op elk tijdstip (d.w.z. 0-28 dagen) oogsten voor het detecteren van morfologische veranderingen (d.w.z. immunofluorescentietest (IFA) of hematoxyline-eosinekleuring (HE) of voor bio-informatica-analytische procedures (d.w.z. transcriptomics, proteomics, metabolomics, enz.).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Differentiatie
Luchtwegepitheelcellen van muizen zijn met succes gedifferentieerd na kweek op een lucht-vloeistofinterface met een differentiatiemedium gedurende 28 dagen. De aanwezigheid van trilhaarcellen en bekercellen werd aangetoond door immunofluorescentiebepaling van trilhaartjesmarker geacetyleerd α-tubuline (groen; Figuur 3A) en de bekercelmarker Mucin5AC, respectievelijk6 (rood; Figuur 3B).

Bepaling van de CSE-concentratie voor celdifferentiatie
Stimuleer de geïsoleerde epitheelcellen met verschillende concentraties CSE gedurende 24 uur. De resultaten toonden aan dat de levensvatbaarheid van de epitheelcellen afnam wanneer de concentratie van CSE hoger was dan 6% (p <0,05, figuur 4A). Om de celactiviteit onder langdurige stimulatie te behouden, werden kweekmediums met 2%, 4% en 6% CSE gebruikt om de differentiatie van epitheelcellen gedurende 28 dagen te stimuleren. Bovendien toonden de resultaten aan dat met de toename van de CSE-concentratie er geen significante celdood was in de epitheelcellen (Figuur 4B), maar dat er een geleidelijke verandering was in het aantal intercellulaire transmembraanresistentie (TEER) (Figuur 4C) en geëxfolieerde cellen (Figuur 4D). Bovendien werd een algehele vermindering van gedifferentieerde cellen en trilhaarcellen waargenomen wanneer luchtwegepitheelcelculturen van muizen chronisch werden blootgesteld aan CSE (Figuur 4E-H). Daarom werd gekozen voor het differentiatiemedium met 6% CSE om de epitheliale barrièrefunctie te ontregelen en het aantal trilhaarcellen te verminderen zonder de levensvatbaarheid van de cellen af te nemen, terwijl epitheelcellen gedurende 28 dagen werden gedifferentieerd.

Multi-omics analyse
Twee groepen van de cellen die gedurende 28 dagen werden gestimuleerd met differentieel medium dat 0% of 6% CSE bevatte, werden geoogst. Totaal mRNA werd geëxtraheerd voor transcriptomics-analyse. Na de voorbereiding van de bibliotheek, sequencing, kwaliteitscontrole, lezingen, mapping naar het referentiegenoom en kwantificering van genexpressie, werd de differentiële expressie van genen tussen de twee groepen geanalyseerd. Het clusterProfiler R-pakket werd gebruikt om een verrijkingsanalyse uit te voeren van de genontologie (GO) voor genen die differentiële expressie vertoonden, waarbij aanpassingen werden gemaakt om rekening te houden met verschillen in genlengte (Figuur 5A). De Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dient als een uitgebreide database die het begrip van complexe biologische systeemfunctionaliteiten en -rollen op verschillende niveaus vergemakkelijkt, waaronder cellulair, organismaal en ecologisch, door gegevens op moleculair niveau te integreren die zijn afgeleid van uitgebreide datasets zoals die geproduceerd door genomische sequencing en experimentele methodologieën met hoge doorvoer (Figuur 5B). Voor proteomics werden totale eiwitten geëxtraheerd uit twee groepen cellen op 28 dagen na culturen met differentiële media die 0% of 6% CSE bevatten. Na eiwitkwaliteitstest, zoutverwijdering, eiwitenzymatische hydrolyse, Tandem Mass Tags (TMT)-etikettering van peptiden, scheiding van fracties, LC-MS-analyse, eiwitidentificatie en eiwitkwantificering, kunnen differentieel tot expressie gebrachte eiwitten tussen twee groepen worden gedefinieerd. GO-analyse werd uitgevoerd met behulp van het interproscan-programma tegen de niet-redundante eiwitdatabase (Figuur 6A) en KEGG werd gebruikt om de route te analyseren (Figuur 6B). Voor metabolomics werden de kweeksupernatanten 28 dagen na culturen verzameld uit twee groepen luchtwegepitheelcellen met een differentiatiemedium dat 0% of 6% CSE bevatte. Na HPLC-MS/MS-analyse, identificatie en kwantificering van metabolieten kunnen de differentiële metabolieten tussen de twee groepen worden gedefinieerd. De KEGG-database (Figuur 7A), de Human Metabolome Database (Figuur 7B) en de Lipidmaps-database (Figuur 7C) werden gebruikt om alle metabolieten te annoteren. De KEGG-database werd gebruikt om de functies van deze differentiële metabolieten en metabole routes te analyseren (Figuur 7D). Voor epigenomica werd ATAC-seq uitgevoerd zoals eerder gerapporteerd9. Kernen werden geëxtraheerd uit twee groepen cellen op 28 dagen na de kweek met differentieel medium dat 0% of 6% CSE bevatte, en de kernpellet werd geresuspendeerd in de Tn5-transposase-reactiemix. De transpositiereactie werd gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Na het toevoegen van een adapter, bibliotheekvoorbereiding, kwaliteitsbeoordeling, clustering en sequencing, kan differentiële epigenomica tussen twee groepen worden gedefinieerd. De GO-verrijkingsanalyse van differentieel piekgerelateerde genen weerspiegelt direct de nummerverdeling van differentieel piekgerelateerde genen in GO-items verrijkt met biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functie (Figuur 8A). De KEGG-database werd gebruikt om de functies van deze differentiële genen en routes te analyseren (Figuur 8B).

Genen die coderen voor tight junction eiwitten
Transcriptomische gegevens toonden aan dat na langdurige stimulatie van CSE, er een verminderde expressie was van talrijke genen die coderen voor tight junction-eiwitten, waaronder Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 en Ocln (Figuur 9A), waarbij verminderde expressie van Cldn3 en Ocln verder werd bevestigd door Western-Blot en immunohistochemie (IHC) (figuren 9B-E). Deze gegevens suggereren dat blootstelling aan CSE de expressie van tight junction-eiwitten van luchtwegepitheelcellen aanzienlijk vermindert.

Cytokine- en chemokine-expressie
Naast de afbraak van nauwe verbindingen, toonden transcriptomics ook aan dat na langdurige stimulatie van CSE, de expressie van sommige cytokines en chemokines, waaronder Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 en Il33, toenam, maar de expressie van Ccl5 afnam (Figuur 10A). De Luminex-test bevestigde verder dat er verhoogde concentraties van CXCL-5, CSF-3 en IL-1α waren (figuur 10B-D) maar verlaagde CCL-5 (figuur 10E) in het supernatans van muizen luchtwegepitheelcellen. Deze resultaten suggereren dat blootstelling aan CSE selectief inwerkt op de expressie van cytokinen en chemokines.

figure-results-1
Figuur 1: Groei van primaire muizen luchtwegepitheelcellen. (A) Nieuw geïsoleerde cellen zien er rond en transparant uit. (B) Op dag 2 na de isolatie vormden geëxpandeerde cellen zich tot kleine celeilanden. (C) Tegen dag 4, de vorming van grotere celeilanden. (D) Op dag 6, meer dan 90% fusie met geplaveide morfologie. (4x vergroting; schaalbalken: 250 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunofluorescentietest van epitheelcelmarkers. Cytokeratine-expressie in primaire luchtwegepitheelcellen van muizen, A549 (positieve controle) en Raw264.7 (negatieve controle). Kernen gekleurd met DAPI (63x vergroting; schaalbalken: 40 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Immunofluorescentietest voor markers van trilhaarcellen en bekercellen. De gebruikte markers waren geacetyleerd (A) α-tubuline en (B) mucine 5AC voor het bevestigen van respectievelijk ciliacellen en slijmbekercellen (100 vergroting; schaalbalken: 10 μm in paneel A en 50 μm in paneel B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Impact van CSE-concentraties op epitheelcellen. (A) Levensvatbaarheid van cellen na 24 uur bij variërende CSE-concentraties. (B) Levensvatbaarheid van de cellen na 28 dagen. (C) TEER-meting. (D) Aantal geëxfolieerde cellen. (E-H) Immunofluorescentie voor trilhaarcellen (groen) en bekercellen (paars) bij CSE-concentraties van 0%, 2%, 4% en 6% (20x vergroting; schaalbalken: 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: GO- en KEGG-verrijkingsanalyses voor genexpressie. (A) Betekenis van GO-term in verrijkt biologisch proces, cellulaire component en moleculaire functie. (B) Aandeel van differentieel tot expressie gebrachte genen in KEGG-routes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Analyse van eiwitexpressie. (A) GO-verrijkingsstaafdiagram met differentiële eiwitexpressie. (B) Analyse van de KEGG-route op basis van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Analyse van de metaboliet KEGG-route. (A) Annoteren van alle metabolieten met behulp van de KEGG-database. (B) Het annoteren van alle metabolieten met behulp van de Human Metabolome Database. (C) Het annoteren van alle metabolieten met behulp van de Lipidmaps Database. (D) De verdeling van differentieel tot expressie gebrachte metabolieten in verschillende KEGG-routes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Differentieel Peak-gerelateerde genexpressieanalyse. (A) GO-verrijkingsstaafdiagram met differentiële eiwitexpressie. (B) Analyse van de KEGG-route op basis van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Expressie van tight junction-eiwit in epitheelcellen van de luchtwegen van muizen met of zonder CSE-stimulatie. (A) Heatmap van tight junction-eiwitexpressie in het transcriptoom. (B-E) De expressieniveaus van (B,C) Cldn3 en (D,E) Ocln in luchtwegepitheelcellen van muizen werden gedetecteerd door Western Blot en immunohistochemie voor Cldn3 en Ocln (vergroting 80; schaalbalken: 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Analyse van cytokine-expressie. (A) Transcriptoom heatmap van cytokine-expressie. (B-E) Luminex-test voor CXCL-5-, CSF-3-, IL-1α- en CCL-5-niveaus in cellen met/zonder CSE-stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COPD is een veel voorkomende chronische luchtwegontstekingsziekte. Blootstelling aan tabaksrook leidt tot chronische luchtwegontsteking, remodellering van de luchtwegen en structurele vernietiging van de longen, wat het resultaat is van de interactie van verschillende structurele cellen en immuuncellen10. Als frontlinie van het aangeboren immuunsysteem in de longen spelen luchtwegepitheelcellen een zeer belangrijke rol tijdens de ontwikkeling van de ziekte11. Vanuit dit oogpunt is het verduidelijken van hoe epitheelcellen veranderen en de stroomafwaartse cellen reguleren onder stimulatie van schadelijke stoffen een wetenschappelijk probleem dat dringend moet worden opgelost.

Onlangs zijn verschillende diermodellen van COPD gerapporteerd die enkele beperkingen hebben overwonnen12. Matige niveaus van neutrofiele luchtwegontsteking, een Th1/Th17-inflammatoire signatuur, duidelijke hyperproductie van slijm, verhoogde remodellering van de luchtwegen, verminderde longfunctie en vergrote luchtruimten kunnen in deze modellen worden waargenomen. Hoewel deze modellen slechts 1 maand nodig hebben om COPD-achtige veranderingen vast te stellen, is het nog steeds onduidelijk wat er gebeurde bij de muizen die binnen 1 maand aan sigarettenrook werden blootgesteld. Het gebruik van langdurige CSE-stimulatie heeft het voordeel dat het gemakkelijker kan worden gekalibreerd, wat betekent dat luchtwegepitheelcellen kunnen worden blootgesteld aan een zo ernstig mogelijke sigaretstimulus zonder de dood, net als luchtwegepitheelcellen bij rokers. In dit geval is het monitoren van dynamische pathologische veranderingen die leiden tot luchtwegontsteking en de vorming van emfyseem van cruciaal belang voor een beter begrip van de pathogenese van COPD die relevant is voor roken. Daarom hebben we een in vitro model opgesteld om de rookstatus na te bootsen en hebben we geprobeerd dynamische veranderingen tijdens de blootstelling van CSE aan luchtwegepitheelcellen te volgen. Bovendien maken relatief gezuiverde luchtwegepitheelcellen de multi-omics-studie gemakkelijker dan die van hele weefsels, wat ons kan helpen om de moleculaire en cellulaire reacties te vinden in blootstelling van luchtwegepitheelcellen aan CSE en om de belangrijkste routes en therapeutische doelen van COPD bij hoge doorvoer te identificeren.

Hier is het protocol dat de isolatie van tracheale epitheelcellen van muizen beschrijft, aangepast aan de protocollen van Hilaire et al.13 en You et al.14 met enkele aanpassingen. In het protocol dat in deze studie werd gebruikt, werden luchtwegepitheelcellen van muizen gepropageerd en gedifferentieerd tot een pseudogestratificeerde structuur met trilhaar- en bekercellen met behulp van een lucht-vloeistofinterface en een medium dat CSE bevatte, waardoor een chronisch CSE-acclimatisatiemodel werd vastgesteld. De volgende gebeurtenissen zijn de kernpunten van het huidige model.

Gezien het feit dat cervicale dislocatie de nek mechanisch zou kunnen belasten en de epitheelcellen fysiek zou kunnen beschadigen, en chloraalhydraatanesthesie ook de luchtwegen zou kunnen beïnvloeden, werd pentobarbital-natrium gebruikt voor euthanasie15. Tijdens chirurgische ingrepen bij muizen kan het onderdompelen van alleen de nek en de onderste delen om te voorkomen dat alcohol de neus binnendringt, de levensvatbaarheid van luchtwegepitheelcellen vergroten16. Voorlopige gegevens van de huidige studie toonden aan dat luchtwegepitheelcellen die werden onderworpen aan tracheale intubatie of onderdompeling in alcohol, een lage levensvatbaarheid hadden en niet konden uitbreiden. Om luchtwegepitheelcellen zonder erytrocyten te krijgen, moet men bovendien voorzichtig zijn bij chirurgische ingrepen om bloedbesmetting te voorkomen bij het isoleren van de hoofdluchtwegen.

Zelfs bij specifieke pathogeenvrije muizen koloniseerden de luchtwegen aanzienlijke microben. De toevoeging van geschikte antibiotica in het expansiemedium van P0 primaire muizen luchtwegepitheelcellen is essentieel om besmetting door bacteriële of schimmelpathogenen te voorkomen. Een cocktailoplossing van penicilline, streptomycine, amfotericine B en gentamicine17 zorgt effectief voor de expansie van P0-muizenepitheelcellen in de luchtwegen in een steriele in vitro-omgeving . Voorlopige experimenten toonden aan dat als er geen effectieve remming van bacteriële besmetting is, P0-muizenepitheelcellen in de luchtwegen zullen afsterven vóór de eerste passage.

Bij vergistingsmethoden werden zowel 4 °C als 37 °C getest. Resultaten van voorlopige experimenten gaven aan dat digest in 37 °C beter presteerde dan 4 °C in termen van tijdsefficiëntie, cellevensvatbaarheid en celopbrengst.

Vóór het zaaien van epitheelcellen werd collageen in rattenstaart opgelost in azijnzuur en gebruikt voor de coating van kweekschalen om de adhesie van epitheelcellen te verbeteren18. De dichtheid van de collageencoating mag echter niet te hoog of te laag zijn; Een te lage dichtheid zorgt niet voor voldoende hechtingsomstandigheden, terwijl een te hoge dichtheid resulteert in kristallijn residu op het cultuuroppervlak.

Een cruciale stap is om meer epitheelcellen in leven te houden en fibroblastbesmetting te voorkomen. Om dit te bereiken, raden we aan dat 1) het gebruik van de diercomponentvrije celdissociatiekit epitheelcellen voorzichtig kan isoleren en onnodige cellulaire schade kan verminderen en 2) het gebruik van differentieel medium dat hydrocortison bevat, de groei van fibroblasten kan remmen en de proliferatie van epitheelcellen kan bevorderen.

Traditionele ondergedompelde monolaagculturen van luchtwegepitheelcellen zijn een hoofdbestanddeel geweest van respiratoir onderzoek en toxicologische studies. Deze methoden schieten echter tekort in het nauwkeurig repliceren van de gedifferentieerde kenmerken van luchtwegepitheelweefsels zoals gevonden in vivo. Om deze beperking aan te pakken, hebben we gekozen voor een alternatief luchtwegepitheelmodel. Dit model is gebaseerd op de kweek van primaire luchtwegcellen op microporeuze membraansteigers, zoals die worden geleverd door transwell-systemen, op een lucht-vloeistofinterface19. De blootstelling van het apicale oppervlak aan de omgevingslucht in deze ALI-cultuuropstelling is van groot belang voor het bevorderen van cellulaire differentiatie, waardoor de in vivo-omstandigheden beter worden nagebootst20.

Als differentiatie niet effectief is, is het van cruciaal belang om mogelijke redenen te evalueren. Dit omvat de mogelijkheid dat de cellen van de luchtwegepitheelcellen overmatige passatie hebben ondergaan, wat hun differentiatievermogen in gevaar kan brengen. Bovendien is het absoluut noodzakelijk om ervoor te zorgen dat slijm- en vochtophoping in de apicale kamer volledig wordt geëlimineerd tijdens het tweewekelijkse media-uitwisselingsproces, aangezien restinhoud het differentiatieproces kan belemmeren.

Hoewel dit model bepaalde beperkingen heeft, blijft het een waardevol hulpmiddel voor onderzoek. Een beperking is dat het gebruik van een CSE-bevattend medium om luchtwegepitheelcellen te stimuleren mogelijk niet volledig de in vivo omstandigheden repliceert die worden ervaren door de luchtwegepitheelcellen bij rokers. Bovendien is de levensvatbaarheid van gedifferentieerde trilhaarepitheelcellen in vitro doorgaans beperkt tot een maand. Ondanks deze beperkingen integreert het model effectief verschillende belangrijke aspecten: het vergemakkelijkt de studie van luchtwegepitheelceldifferentiatie op het lucht-vloeistofgrensvlak, langdurige acclimatisatie aan CSE en de toepassing van multi-omics-analyse over een bepaald tijdsbestek. Deze alomvattende aanpak biedt een geavanceerd en holistisch kader voor toekomstig onderzoek naar de fysiologische en pathologische mechanismen van luchtwegepitheelcellen. Bovendien helpt het bij de identificatie van potentiële biomarkers en therapeutische doelen voor luchtwegaandoeningen. We hopen dat onze ervaring nuttige informatie zal opleveren voor degenen die dit model willen gebruiken voor relevante studies.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Penicillin/Streptomycin oplossingGibco15140122
24 mm Transwell met 0,4 µm Pore Polyester Membraan Insert, StérileBIOFILTCS016012
40 µm Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin OplossingGibcoR01510
geacetyleerd α-TubulinCST#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Konijn mAb cellsignal#5335
Dierlijk Component Vrije Cell Dissociatie KitStemcell05426
Anti-pan Cytokeratin antilichaamabcamab7753
SigarettenMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoxyribonuclease I uit runderpancreasSigma-AldrichDN25
Deoxyribonuclease I uit runderpancreasSigmaDN25
Ham’s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparine Oplossing Stemcell07980
Hydrocortison Stock OplossingStemcell07925
Mucine 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin OplossingGibco15140122
PneumaCult-ALI
Basis Medium		Stemcell05002 
PneumaCult-ALI 10x SupplementStemcell05003 
PneumaCult-ALI OnderhoudssupplementStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basis MediumStemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Rattenstaart collageenCorning354236
Trypan BlauwStemcell07050 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Airway Epithelial CellsCigarette Smoke ExtractIn Vitro ModelMurine Airway CellsAir Liquid InterfaceCell DifferentiationMulti Omics AnalysisChronic Smoke ExposureImmunofluorescence AssayCOPD Pathogenesis

Related Articles