Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chronische obstructieve longziekte (COPD) wordt grotendeels toegeschreven aan blootstelling aan tabaksrook. Onderzoek naar hoe luchtwegepitheelcellen zich functioneel aanpassen aan tabaksrook is cruciaal voor het begrijpen van de pathogenese van COPD. De huidige studie was om een in vitro model op te zetten met behulp van primaire muizen luchtwegepitheelcellen om de real-life impact van tabaksrook na te bootsen. In tegenstelling tot gevestigde cellijnen behouden primaire cellen meer in vivo-achtige eigenschappen, waaronder groeipatronen, veroudering en differentiatie. Deze cellen vertonen een gevoelige ontstekingsreactie en efficiënte differentiatie, waardoor fysiologische omstandigheden nauw worden weergegeven. In dit model werden primaire muizen luchtwegepitheelcellen gedurende 28 dagen gekweekt onder een lucht-vloeistofinterface met een optimale concentratie sigarettenrookextract (CSE), wat leidde tot de transformatie van een monolaag van ongedifferentieerde cellen in een pseudogestratificeerd zuilvormig epitheel, indicatief voor CSE-acclimatisatie. Uitgebreide multi-omics-analyses werden vervolgens toegepast om de mechanismen op te helderen waarmee CSE de differentiatie van basale luchtwegcellen beïnvloedt. Deze inzichten bieden een beter begrip van de cellulaire processen die ten grondslag liggen aan de progressie van COPD als reactie op blootstelling aan tabaksrook.
Inleiding
Chronische obstructieve longziekte (COPD) is een heterogene longaandoening met complexe kenmerken, terwijl patiënten met COPD geleidelijk jonger worden1. Roken, een primaire risicofactor voor COPD2, heeft een grote invloed op de epitheelcellen van de luchtwegen, die dienen als de eerste barrière tegen tabaksrook. Ondanks deze bekende associatie blijven de gedetailleerde mechanismen waardoor tabaksrook veranderingen in luchtwegepitheelcellen induceert onvoldoende onderzocht. Een grondig begrip van deze moleculaire veranderingen is essentieel voor het identificeren van vroege diagnostische markers en therapeutische doelen voor COPD.
Om deze kloof te dichten, hebben we een nieuw in vitro model ontwikkeld met behulp van luchtwegepitheelcellen van muizen. Deze cellen werden onderworpen aan langdurige stimulatie met sigarettenrookextract (CSE), waardoor we dynamische cellulaire veranderingen kunnen volgen en de veranderingen in luchtwegepitheelcellen onder langdurige tabaksstimulatie en het onderliggende mechanisme kunnen onderzoeken. In dit model werd transwell gebruikt om de lucht-vloeistofinterface van luchtwegepitheelcellen te bieden, en sigarettenrookextract werd gestimuleerd in het vroege stadium van epitheelceldifferentiatie tot het einde van de differentiatie na 28 dagen. Eerdere studies onderzochten alleen de differentiatie en kortetermijnstimulatie van luchtwegepitheelcellen (cellijndominantie). Ze waren beperkt tot een enkel regelgevend traject 3,4,5,6. Het hier gepresenteerde protocol maakt echter gebruik van primaire luchtwegepitheelcellen van muizen en optimaliseert het celextractieproces voor een betere celactiviteit dan eerdere methoden voor het kweken van luchtwegepitheelcellen. Dit model richt zich op veranderingen in cellulaire differentiatie naast uitgebreide transcriptomische, proteomische, metabolomische en epigenomische analyses. Door gebruik te maken van immunofluorescentie en geavanceerde multi-omics-technieken, wilden we de cellulaire reacties van luchtwegepitheelcellen op chronische blootstelling aan tabaksrook ophelderen, en zo bijdragen aan een beter begrip van de pathogenese van COPD. Dit model kan worden gebruikt om de veranderingen in het differentiatiepatroon van luchtwegepitheelcellen en het mechanisme ervan te onderzoeken dat wordt veroorzaakt door langdurige stimulatie van verschillende verontreinigende stoffen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het totale protocol vereist 44 dagen, waaronder 1 dag voor de bereiding van luchtwegepitheelcellen geïsoleerd uit muizenluchtpijpen, 15 dagen voor celproliferatie en 28 dagen voor CSE-stimulatie op de lucht-vloeistofinterface. Alle proefdieren zijn gehuisvest in de SPF Barrier Animal Room van het Animal Experiment Center van Capital Medical University en zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee van Capital Medical University (AEEI-2020-100) om te voldoen aan de vereisten van ARRIVE-richtlijnen7.
1. Isolatie van primaire muizen luchtwegepitheelcellen uit muizen luchtpijpen
- Voorbereiding
- Bereid een volledig expansiemiddel voor door 1 ml 50x supplement en 0,05 ml hydrocortisonbouillon te combineren met 48,95 ml expansiebasismiddel. Bewaren bij 4 °C en binnen 4 weken gebruiken.
- Los 7,5 mg proteïnase en 5 mg deoxyribonuclease I op in 5 ml Ham's F-12 om een proteïnase-oplossing te bereiden. Filtreer het om te steriliseren en bewaar het bij 4 °C en gebruik het binnen 4 weken.
- Bereid antibiotische oplossingen voor door 0,05 ml 100x penicilline/streptomycine en 0,01 ml 500x gentamicine/amfotericine toe te voegen aan 5 ml volledig expansiemedium, PBS en proteïnase-oplossing (100 E/ml penicilline, 100 E/ml streptomycine, 10 μg/ml gentamicine en 0,25 μg/ml amfotericine B). Bewaren bij 4 °C en binnen 4 weken gebruiken.
- Steriliseer chirurgische instrumenten en bereid de biologische veiligheidskast voor op celisolatie. Zorg er tegelijkertijd voor dat de standaard celkweekapparatuur klaar is voor gebruik.
- Bereid met collageen beklede schalen met rattenstaart door rattenstaartcollageen (100 μg/ml in 0,02 N azijnzuur) toe te voegen aan kweekschaaltjes van 100 mm en transwells van 24 mm (0,05 ml/cm2). Laat een nacht open staan onder UV-licht voor sterilisatie.
- Isolatie van primaire luchtwegepitheelcellen van muizen
- Gebruik C57BL/6 muizen (6-8 weken oud, mannelijk, SPF-grootgebracht) voor isolatie van tracheale epitheelcellen. Euthanaseren met een overdosis van 1% pentobarbital-natriumoplossing (ongeveer 200 mg/kg). Gebruik vijf muizen voor voldoende celopbrengst.
- Steriliseer de muis door onderdompeling in een 75% ethanoloplossing, zonder de neus en mond onder te dompelen in alcohol om te voorkomen dat alcohol in de luchtpijp stroomt.
- Ontleed de muis.
- Gebruik chirurgische messen en pincetten, een set apparaten voor het snijden en openen van de opperhuid van de onderkaak tot de buikholte van de muis.
- Gebruik een andere set chirurgische instrumenten om de schildklieren aan beide zijden uit elkaar te scheuren en de verbindingen tussen de luchtpijp, het omliggende spierweefsel en de slokdarm te verwijderen.
- Snijd daarna voorzichtig in de borstkas, gebruik een tang om dieper in de borstholte te graven, verwijder de hele long en zoek het uiteinde van de luchtpijp.
- Verwerk de luchtpijp.
- Snijd de luchtpijp van het schildklierkraakbeen naar de tracheo-bronchiale tak af en doe deze in een pre-koud expansiemedium met vier antibiotica.
- Schud de buis om zoveel mogelijk bloed van het oppervlak van de luchtpijp te spoelen, houd het op ijs en begin dan met de operatie voor de volgende muis.
- Breng alle verzamelde luchtpijpen over naar een voorkoude PBS-buffer met vier antibiotica (200 E/ml penicilline, 200 E/ml streptomycine, 20 μg/ml gentamicine en 0,5 μg/ml amfotericine B) voor voorbehandeling vóór de spijsvertering.
- Gebruik een set chirurgische instrumenten om stolsels en ander weefsel van de oppervlakken van de luchtpijp te verwijderen en snijd ze vervolgens in een maat van 1cm2 .
- Tracheaal weefsel in proteïnase-oplossing bij 37 °C gedurende 40 minuten incuberen.
- Schud de buis na 40 minuten meerdere keren en gebruik een celzeef van 40 μm om de resterende weefsels te verwijderen. Spoel de gehakte luchtpijpen af op een zeef met 5 ml expansiemedium, centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi de supernatant weg.
- Resuspendeer de verkregen cellen in 8 ml expansiemedium.
- Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
- Plaat P0-celsuspensie op schaaltjes van 100 mm (1 x10 4 levende cellen/cm2) voorbekleed met rattenstaartcollageen en kweek de cellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.
2. Expansiecultuur en passage van primaire muizen luchtwegepitheelcellen
- Vervang het medium voor de P0-celcultuur elke 3 dagen totdat de cellen 70%-80% confluentie bereiken, meestal binnen 6 dagen. Op dit punt kunnen tracheale epitheelcellen van muizen een intacte monolaag vormen met een geplaveid uiterlijk (Figuur 1A-D).
- Verwarm voldoende hoeveelheden PBS, volledig expansiemedium en celdissociatiekit zonder dierlijke bestanddelen (ACF) voor tot 37 °C.
- Spoel de cellen voorzichtig af met 3 ml PBS.
- Voer enzymatische dissociatie uit.
- Voeg 3 ml ACF-enzymatische dissociatieoplossing toe aan de schaal en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Maak na het pipetteren de cellen voorzichtig los en breng de celsuspensie over op 3 ml ACF-enzymremmingsoplossing.
- Herhaal de toevoeging van 3 ml ACF-enzymatische dissociatieoplossing en incubeer opnieuw gedurende 5 minuten om maximale celloslating te garanderen.
- Draai de celsuspensie op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml expansiemedium.
- Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
- Plaat P1 cel suspensie op verschillende schalen van 100 mm (5 x10 4 levende cellen/cm2) voorgecoat met rattenstaartcollageen, en kweek de cellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.
3. Differentiatie en CSE-stimulatie van primaire muizen luchtwegepitheelcellen op het grensvlak tussen lucht en vloeistof
- Bevestig het celtype.
- Controleer de epitheliale oorsprong van geïsoleerde cellen met behulp van een immunofluorescentietest (IFA) met antilichamen tegen cytokeratines. Zaadcellen op glasplaatjes bedekt met rattenstaartcollageen en gebruik paraformaldehyde om ze gedurende ten minste 12 uur te fixeren nadat de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt.
- Was de objectglaasjes 3 keer met PBS-oplossing gedurende 5 minuten en incubeer ze met 3% BSA en 0,1% triton X-100 in PBS-oplossing bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur.
- Incubeer objectglaasjes 's nachts bij 4 °C met in de handel verkrijgbare anti-pan cytokeratine-antilichamen in een verdunning van 1:500.
- De volgende dag de objectglaasjes 3 keer wassen met PBS-oplossing gedurende 5 minuten en ze incuberen met secundaire antilichaambuffer in een verdunning van 1:1000 bij RT gedurende 2 uur in het donker.
- Was de glaasjes na incubatie 3 keer met PBS (5 min per wasbeurt) en voeg DAPI toe in een verdunning van 1:1000. Na incubatie bij RT gedurende 15 min, de glaasjes eenmaal wassen met PBS gedurende 5 min.
- Bekijk objectglaasjes onder een fluorescentiemicroscoop en vergelijk expressiepatronen met een positieve controle (A549-cellijn) en een negatieve controle (Raw264.7-cellijn) (Figuur 2).
- Zaai de cellen voor differentiatie.
- Maak de P2-cellen los en centrifugeer ze zoals eerder beschreven, en suspendeer de celpellet opnieuw in een geschikte hoeveelheid expansiemedium om het uitplateren van 1 x 104 levende cellen/cm2 te vergemakkelijken.
- Pipetteer 1 ml celsuspensie op de apicale kamer van het transwell polycarbonaat membraaninzetstuk. Voeg aan het basale compartiment van de transwell 1,5 ml proliferatiemedia toe.
- Incubeer de cellen bij 37 °C en vervang elke 3 dagen al het medium in de basale en apicale kamers volledig met behulp van expansiemedium totdat de samenvloeiing is bereikt. Dit duurt meestal 3-6 dagen.
- Bereid 50 ml volledig differentiatiemedium voor door 5 ml ALI 10x Supplement, 500 μL ALI Maintenance Supplement, 100 μL heparineoplossing en 250 μL hydrocortisonbouillonoplossing toe te voegen aan 44,15 ml ALI Basal Medium.
- Bereid CSE voor.
- Bubbel een sigaret door 12,5 ml differentiatiemedium en filtreer deze vervolgens door een poriënfilter van 0,22 μm om CSE te bereiden. Om standaardisatie tussen experimenten en batches van CSE te garanderen, meet u de absorptie bij 320 nm op een spectrofotometer en definieert u de optische dichtheid (OD) van 1 als 100%8.
- Gebruik het differentiatiemedium met een geschikte concentratie CSE om primaire muizen luchtwegepitheelcellen te stimuleren om effecten op de differentiatie van de cellen te detecteren.
- Laat de cellen gedurende 28 dagen differentiëren, waarbij het basale kamermedium wordt verwisseld en de apicale zijde twee keer per week wordt gewassen door het apicale kamermedium te verwijderen en het basale kamermedium te vervangen door het differentiatiemedium dat de juiste concentratie CSE bevat.
- Analyseer de cellen na blootstelling.
- Na blootstelling aan differentiatiemedium dat CSE bevat, de cellen en de kweeksupernatanten op elk tijdstip (d.w.z. 0-28 dagen) oogsten voor het detecteren van morfologische veranderingen (d.w.z. immunofluorescentietest (IFA) of hematoxyline-eosinekleuring (HE) of voor bio-informatica-analytische procedures (d.w.z. transcriptomics, proteomics, metabolomics, enz.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Differentiatie
Luchtwegepitheelcellen van muizen zijn met succes gedifferentieerd na kweek op een lucht-vloeistofinterface met een differentiatiemedium gedurende 28 dagen. De aanwezigheid van trilhaarcellen en bekercellen werd aangetoond door immunofluorescentiebepaling van trilhaartjesmarker geacetyleerd α-tubuline (groen; Figuur 3A) en de bekercelmarker Mucin5AC, respectievelijk6 (rood; Figuur 3B).
Bepali...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
COPD is een veel voorkomende chronische luchtwegontstekingsziekte. Blootstelling aan tabaksrook leidt tot chronische luchtwegontsteking, remodellering van de luchtwegen en structurele vernietiging van de longen, wat het resultaat is van de interactie van verschillende structurele cellen en immuuncellen10. Als frontlinie van het aangeboren immuunsysteem in de longen spelen luchtwegepitheelcellen een zeer belangrijke rol tijdens de ontwikkeling van de ziekte11. Vanuit dit oog...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82090013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100x Penicillin/Streptomycin oplossing | Gibco | 15140122 | |
| 24 mm Transwell met 0,4 µm Pore Polyester Membraan Insert, Stérile | BIOFIL | TCS016012 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 500x Gentamicin/Amphotericin Oplossing | Gibco | R01510 | |
| geacetyleerd α-Tubulin | CST | #5335 | |
| Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Konijn mAb | cellsignal | #5335 | |
| Dierlijk Component Vrije Cell Dissociatie Kit | Stemcell | 05426 | |
| Anti-pan Cytokeratin antilichaam | abcam | ab7753 | |
| Sigaretten | Marlboro | ||
| Claudin3 | immunoway | YT0949 | |
| Deoxyribonuclease I uit runderpancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Deoxyribonuclease I uit runderpancreas | Sigma | DN25 | |
| Ham’s F-12 | Sigma-Aldrich | N6658 | |
| Heparine Oplossing | Stemcell | 07980 | |
| Hydrocortison Stock Oplossing | Stemcell | 07925 | |
| Mucine 5AC | abcam | ab212636 | |
| Occludin | proteintech | 27260-1-AP | |
| PBS | Cytosci | CBS004S-BR500 | |
| Penicillin-Streptomycin Oplossing | Gibco | 15140122 | |
| PneumaCult-ALI Basis Medium | Stemcell | 05002 | |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | Stemcell | 05003 | |
| PneumaCult-ALI Onderhoudssupplement | Stemcell | 05006 | |
| PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement | Stemcell | 05042 | |
| PneumaCult-Ex Plus Basis Medium | Stemcell | 05041 | |
| Pronase E | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Rattenstaart collageen | Corning | 354236 | |
| Trypan Blauw | Stemcell | 07050 |
Referenties
- Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
- Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
- Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
- Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
- Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
- Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
- Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
- Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
- Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
- Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
- You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
- Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
- Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
- Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
- Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
- Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
- Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
