Methodenartikel

Identificatie van slapende cellen in een zebravis T-cel acute lymfoblastische leukemiemodel met behulp van celproliferatiekleuring

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67059

⸱

19 juli 2024

 ,  , 
1Pharmacology and Nutritional Sciences, The University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, The University of Kentucky, 3Department of Molecular and Cellular Biochemistry, The University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

We gebruikten celproliferatiekleuring om slapende cellen te identificeren in het zebravis T-acute lymfoblastische leukemiemodel. De kleuring wordt vastgehouden in niet-delende cellen en verminderd tijdens celproliferatie, waardoor slapende cellen kunnen worden geselecteerd voor verder onderzoek. Dit protocol biedt een functioneel hulpmiddel om zelfvernieuwing te bestuderen in de context van cellulaire rust.

Samenvatting

Cellulaire rust is een toestand van groeistilstand of vertraagde proliferatie die wordt beschreven in normale en kankerstamcellen (CSC's). Rust kan CSC's beschermen tegen antiproliferatieve chemotherapie. In T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL) patiënt-afgeleide xenograft (PDX) muismodellen worden slapende cellen geassocieerd met behandelingsresistentie en stamvorming. Kleurstoffen voor celproliferatie zijn populaire hulpmiddelen voor het volgen van celdeling. De fluorescerende kleurstof is covalent verankerd in aminegroepen op het membraan en de macromoleculen in de cel. Dit maakt het mogelijk om gelabelde cellen tot 10 delingen te volgen, die kunnen worden opgelost door flowcytometrie.

Uiteindelijk zullen cellen met de hoogste proliferatiesnelheden een lage kleurstofretentie hebben, omdat deze bij elke celdeling wordt verdund, terwijl slapende, langzamer delende cellen de hoogste retentie hebben. Het gebruik van kleurstoffen voor celproliferatie om slapende cellen te isoleren is geoptimaliseerd en beschreven in T-ALL muismodellen. Als aanvulling op de bestaande muismodellen biedt het rag2:Myc-afgeleide zebravis T-ALL-model een uitstekende locatie om zelfvernieuwing in T-ALL te ondervragen vanwege de hoge frequentie van leukemische stamcellen (LSC's) en het gemak van zebravissen voor grootschalige transplantatie-experimenten.

Hier beschrijven we de workflow voor het kleuren van zebravis T-ALL-cellen met een celproliferatiekleurstof, het optimaliseren van de concentratie van de kleurstof voor zebraviscellen, het passeren van succesvol gekleurde cellen in vivo en het verzamelen van cellen met verschillende niveaus van kleurstofretentie door levende celsortering van getransplanteerde dieren. Gezien de afwezigheid van gevestigde celoppervlaktemakers voor LSC's in T-ALL, biedt deze benadering een functioneel middel om slapende cellen in vivo te ondervragen. Voor representatieve resultaten beschrijven we de implantatie-efficiëntie en de LSC-frequentie van hoge en lage kleurstofbehoudende cellen. Deze methode kan helpen bij het onderzoeken van aanvullende eigenschappen van slapende cellen, waaronder geneesmiddelrespons, transcriptieprofielen en morfologie.

Inleiding

Volwassen stamcellen zijn verantwoordelijk voor de regeneratie van gedifferentieerde celtypen in een bepaald orgaan en zijn voornamelijk aanwezig in een slapende, niet-delende toestand 1,2. Hematopoëtische stamcellen (HSC's), die het bloed in stand houden, blijven bijvoorbeeld grotendeels in rust en slechts een klein deel komt in de celcyclus om zichzelf te vernieuwen of te differentiëren om rijpe bloedbestanddelen te genereren3. Evenzo bezit bij kanker een zeldzame subpopulatie van cellen, kankerstamcellen (CSC's) genaamd, het vermogen tot zelfvernieuwing en zijn ze verantwoordelijk voor het langdurig onderhoud van demaligniteit. Kankerstamcellen bestaan in vivo in een staat van rust of langzame groei, waardoor ze kunnen ontsnappen aan de antiproliferatieve kankerbehandelingen5, klaring door het immuunsysteem kunnen ontwijken6, oxidatieve stress kunnen verminderen en hun DNA-herstelroutes kunnen verbeteren7. Zelfs een laag aantal CSC's dat na de behandeling achterblijft, kan de tumor mogelijk opnieuw bevolken, wat resulteert in een terugval van een patiënt8. Dienovereenkomstig is het begrijpen van cellulaire rust veelbelovend voor de identificatie van potentiële kwetsbaarheden van CSC's en de ontwikkeling van nieuwe manieren om ze aan te pakken.

Kleurstoffen voor celproliferatie, zoals de carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) kleuring en zijn derivaten, worden vaak gebruikt om de frequentie van celdelingen te volgen. De kleurstof dringt door het celmembraan en ondergaat, eenmaal in de cel, activering door intracellulaire esterasen tot een fluorescerend product. De resulterende fluorescerende verbinding wordt in de cel vastgehouden door de covalente amidebindingen die worden gevormd tussen de succinimidylgroep en de aminefunctionele groepen van intracellulaire eiwitten10. Bij elke celdeling wordt de fluorescerende verbinding gelijkmatig verdeeld over de twee resulterende cellen, waardoor een tweevoudige signaalverdunning ontstaat. Deze kleurstof maakt de detectie van maximaal 10 celdelingen mogelijk door middel van flowcytometrie-analyse11.

Deze benadering is eerder gebruikt om CSC-populaties in vitro te verrijken door langzaam cyclische populaties van cellen te identificeren met een hoge retentie van de kleurstof11,12. In T-ALL is CVSE gebruikt om tumorgroei in vivo te volgen in van de patiënt afgeleide xenotransplantaten bij muizen. Na cellabeling en drie weken transplantatie toonde flowcytometrie-analyse een zeldzame populatie van cellen die nog steeds CFSE-fluorescentie behielden. Deze populatie werd geassocieerd met stamvorming, behandelingsresistentie en hoge gelijkenis met terugvalveroorzakende cellen bij patiënten13. Dienovereenkomstig biedt deze kleurstof een nuttig hulpmiddel voor de studie van leukemiestamcellen (LSC) fenotypes in T-ALL.

Het doel van het werk is om de toepassing van de kleurstof voor celproliferatie uit te breiden om rust in vivo te bestuderen met behulp van een T-ALL-model van een zebravis. Met name de rag2:Myc-gedreven zebravis T-ALL model14 biedt een uitstekende locatie voor de studie van zelfvernieuwing vanwege de hoge frequentie van LSC's in vergelijking met muismodellen en menselijke ziekten15. Bovendien maakt het gebruik van zebravissen grootschalige transplantatiestudies mogelijk, die kunnen worden uitgevoerd tegen veel lagere kosten van zorg en onderhoud in vergelijking met hun muistegenhangers16. Zebravissen zijn ook uitstekend geschikt voor live beeldvormingstoepassingen, omdat fluorescerend gelabelde tumorcellen gemakkelijk kunnen worden bekeken met behulp van een eenvoudige fluorescentiemicroscoop om de snelheid van tumorontwikkeling te schatten16.

In dit protocol beschrijven we de workflow voor het kleuren van zebravis T-ALL cellen met celproliferatiekleurstof, gevolgd door in vivo vermeerdering van gekleurde cellen in syngene CG1 zebravissen. Bij de ontwikkeling van leukemie beschrijven we het sorteren van cellen die de kleurstof hebben vastgehouden en hun gebruik voor een daaropvolgend beperkend verdunningstransplantatie-experiment om de snelheid van LSC-zelfvernieuwing te kwantificeren. Dit protocol kan worden uitgebreid voor aanvullende toepassingen, waaronder in vivo screening van geneesmiddelen van potentiële verbindingen voor het targeten van slapende LSC's. Bovendien kunnen verzamelde cellen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse analyses, zoals transcriptomische profilering, proteomics en metabolomics, die unieke inzichten bieden in het gedrag van slapende LSC's in T-ALL.

Protocol

In dit protocol gebruiken we GFP-gelabelde zebravis T-ALL-cellen die eerder zijn gegenereerd in de CG1-stam en dus direct kunnen worden geïnjecteerd in de ontvangende syngene CG1-zebravis15. Kort gezegd werd leukemie gegenereerd door DNA-micro-injectie van rag2:Myc en rag2:GFP in eencellige CG1-zebravisembryo's. Dieren werden vanaf 3 weken na injectie gecontroleerd op de ontwikkeling van leukemie met behulp van fluorescentiemicroscopie. GFP-positieve leukemiecellen werden FACS geïsoleerd en serieel getransplanteerd in ontvangende CG1-zebravissen om klonen te genereren met een hoge frequentie van LSC. Details van het gehele protocol worden beschreven door Blackburn et al.15.

Als alternatief kan primaire rag2:Myc-afgeleide T-ALL worden gegenereerd door DNA-micro-injectie van zebravisembryo's17. De DNA-micro-injectie van rag2:Myc met een rag2-gestuurde fluorescerende reporter zoals GFP kan resulteren in de ontwikkeling van B-cel, T-cel en gemengd ALL18. Van de leukemieklonen die in dit protocol worden gebruikt, is eerder geverifieerd dat ze T-ALL15 zijn. Alle experimentele procedures met zebravissen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Kentucky, protocol 2019-3399.

1. Zebravis T-ALL cellen in vivo vermeerderen

  1. Ontdooi een injectieflacon met 1 ml bevroren GFP-gelabelde zebravis T-ALL-cellen in een waterbad van 37 °C met zacht schudden, tot het ontdooid is. Eenmaal ontdooid, overbrengen naar ijs.
  2. Pipetteer de inhoud van het buisje langzaam in een conisch buisje van 15 ml met 4 ml vismedia (0,9x PBS + 5% FBS) om het vriesmedium te verdunnen.
  3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.500 × g bij 4 °C. Verwijder het medium van de pellet. Resuspendeer in 0,5 ml vismedia en bewaar de cellen op ijs.
  4. Tel de cellen en verdun ze indien nodig tot 100.000 cellen/5 μL.
  5. Verdoof de volwassen CG1-zebravis door 200 μL verdoving van 4 mg/ml (MS-222) toe te voegen aan 25 ml water van het vissysteem in een petrischaaltje. Houd de CG1-vis met de buikzijde naar boven en injecteer 5-6 μL in de intraperitoneale (IP) ruimte met behulp van een Hamilton-microliterspuit. Verplaats de dieren terug naar hun tanks en controleer of ze weer normaal kunnen zwemmen voordat u ze weer op het systeem zet.
    OPMERKING: Volwassen zebravissen van 60 dagen of ouder werden gebruikt voor de transplantatieonderzoeken die in dit protocol worden beschreven.
  6. Bewaak de groei van leukemie eenmaal per week met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Zie deel 2 hieronder voor meer informatie over de screeningprocedure.

2. Oogsten van fluorescerend gelabelde leukemiecellen

  1. Verdoof de volwassen CG1-zebravis ongeveer 21-28 dagen na de transplantatie door 200 μl (4-5 druppels) 4 mg/ml verdoving toe te voegen aan 25 ml water in het vissysteem in een petrischaaltje.
  2. Onderzoek de CG1-zebravis op leukemielast door het percentage GFP-gelabelde leukemiecellen in het dier te beoordelen met een epifluorescentiemicroscoop, met behulp van het juiste filter om de GFP-fluorescentie te detecteren. De GFP-positieve leukemie is klaar om geoogst te worden als deze zich over >70% van het dier heeft verspreid.
  3. Euthanaseer het dier door 1 ml verdoving van 4 mg/ml toe te voegen aan een petrischaaltje met 9 ml water van het vissysteem. Laat alle tekenen van leven ophouden; Observeer bijvoorbeeld de vissen voor het stoppen van de operculaire beweging (~5 min).
  4. Verplaats de zebravis in een nieuw petrischaaltje en voeg 1 ml vismedia toe om als buffer voor de cellen te dienen. Onthoofd met een nieuw scheermesje eerst de zebravis en macereer vervolgens het weefsel met hetzelfde scheermesje. Pipetter op en neer om grote klompen cellen los te maken.
  5. Leid de cellen door een celzeef van 40 μm in een conische buis van 50 ml om te dissociëren tot een eencellige suspensie. Bewaar de cellen op ijs.

3. Optimalisatie van de concentratie van de kleurstof voor celproliferatie (CellTrace Far Red) voor kleuring en levensvatbaarheid van zebraviscellen

OPMERKING: Voor dit protocol, en aangezien de tumorcellen GFP-gelabeld zijn, hebben we een verrode celproliferatiekleurstof (CellTrace Far Red) gebruikt om spectrale overlapping te voorkomen, die CT-FR zal worden genoemd.

  1. Bereid onmiddellijk voor gebruik een 1 mM-oplossing van de fluorescerende kleurstof door het juiste volume DMSO toe te voegen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Zorg voor werkende oplossingen van 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM en 0,01 mM; Verdun indien nodig in vismedia om de levensvatbaarheid van de cellen na kleuring te testen.
  2. Tel de cellen en verzamel 1 × 106 cellen in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
  3. Centrifugeer bij 2.500 × g bij 4 °C gedurende 5 min. Verwijder de vloeistof en resuspendeer de cellen in 1 ml 0,9x PBS.
  4. Verdeel de celsuspensie over vier buisjes van elk 250 μl voor behandeling met CT-FR.
  5. Voeg 250 μL 0,9x PBS toe om het volume op 500 μL te brengen, elk met ongeveer 250.000 cellen/buis.
  6. Voeg de benodigde hoeveelheden van de hierboven beschreven werkoplossingen toe aan elk van de vier buizen om de volgende eindconcentraties te bereiken: 1 μM, 0,5 μM, 0,1 μM en 0,05 μM. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C, beschermd tegen licht.
  7. Pelleteer de cellen door ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur rond te draaien op 2.500 × g . Verwijder de vloeistof en was de cellen met 500 μL vismedia om de overtollige kleurstof te verwijderen.
  8. Pellet opnieuw, verwijder de vloeistof en resuspendeer in 25 μL vismedia. Gebruik 1 μL om cellen te tellen in een verdunning van 1:10 in 50% Trypan Blue.
  9. Onderzoek de cellen onder de microscoop op levensvatbaarheid van de cellen; levende cellen houden het trypan-blauw niet vast en zien er helder uit onder de microscoop, terwijl dode cellen de kleurstof opnemen en er donker uitzien. Onderzoek eerst de cellen onder het juiste fluorescentiekanaal om tumorcellen te identificeren en gebruik vervolgens het helderveldkanaal om de levensvatbaarheid van de cel te beoordelen.
  10. Selecteer de concentratie die resulteert in een succesvolle kleuring met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen (>90% trypan blauwnegatieve cellen).
    OPMERKING: Voor de T-ALL-cellen van de zebravis die in dit experiment werden getest, werd een concentratie van 1 μM gebruikt voor een succesvolle kleuring en >90% van de levensvatbaarheid van de cel.

4. Vermeerdering van CT-FR-gekleurde T-ALL zebraviscellen in vivo

  1. Gebruik de geoptimaliseerde CT-FR-concentratie uit sectie 3 om de zebraviscellen te kleuren. Laat sommige tumorcellen ongekleurd voor de aanmaak van de GFP-gelabelde T-ALL-tumor, als GFP-positieve controle tijdens FACS-sortering. Verdun zowel gekleurde als ongekleurde cellen tot 50.000 cellen/5 μL voor transplantatie.
  2. Verdoof de volwassen CG1-zebravis door 200 μL verdoving van 4 mg/ml toe te voegen aan 25 ml water uit het vissysteem in een petrischaaltje.
  3. Injecteer 5 μl van de celsuspensie in de IP-holte van de zebravis, zoals beschreven in sectie 1 voor zowel de gekleurde als de ongekleurde cellen. Injecteer 5-6 zebravissen per groep om rekening te houden met de mogelijke sterfte na injectie.
  4. Onderzoek de dieren door middel van fluorescerende microscopie onder sedatie 2x per week op het ontstaan van leukemie.
    OPMERKING: Na ~10-14 dagen zou de leukemie ongeveer 30-40% van dit lichaam moeten bezetten. Plan binnen dit tijdsbestek de oogst van leukemie en de daaropvolgende sortering. Wachten tot de tumor zich tot een grote omvang heeft uitgebreid, kan resulteren in een grotere verdunning van de fluorescerende celkleurstof en moeilijkheden bij het detecteren van het signaal. Overweeg optimalisatie van de timing van de tumoroogst voor het gekozen tumormodel. Bovendien wordt hier een frequentere tumormonitoring aanbevolen om ervoor te zorgen dat de gewenste tumorgrootte wordt vastgelegd.

5. Voorbereiden voor het sorteren van CT-FR-gekleurde T-ALL cellen van zebravissen

  1. Bereid de volgende controles voor de celsortering voor: Geen kleurcontrole (ongekleurde, niet-transgene, eencellige suspensie, van een wildtype zebravis), GFP-gelabelde T-ALL-cellen en nieuw gekleurde CT-FR WT-zebraviscellen (voor het instellen van een maximale drempel van verrood signaal).
  2. Voorbereiding van ongekleurde en CT-FR-controles
    1. Oogst wildtype (WT) viscellen door een niet-getransplanteerde CG1-zebravis te euthanaseren door 1 ml verdoving van 4 mg/ml toe te voegen aan een petrischaal met 9 ml water uit het vissysteem.
    2. Verplaats de zebravis in een nieuw petrischaaltje en voeg 1 ml vismedia toe om als buffer voor de cellen te dienen. Gebruik een nieuw scheermesje om de zebravis eerst te onthoofden en vervolgens te macereren met hetzelfde scheermesje; piped op en neer om grote celklonten los te maken.
    3. Leid de cellen door een celzeef van 40 μm in een conische buis van 50 ml om te dissociëren tot een eencellige suspensie. Bewaar de cellen op ijs.
    4. Breng voor de CT-FR-controle 250.000 WT-cellen over in een microcentrifugebuis en pellet de cellen door centrifugatie bij 2.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het vismedium en voeg 500 μL 0,9x PBS+ 1% FBS toe.
    5. Voeg 0,5 μl van de 1 mM CT-FR kleurstofoplossing toe voor een eindconcentratie van 1 μM. Pipeer voorzichtig met 1.000 μL pipet om te mengen. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 min, beschermd tegen licht.
    6. Verwijder de vloeistof en was de cellen met 500 μL vismedia om de overtollige kleurstof te verwijderen.
    7. Pelleteer de cellen opnieuw door te centrifugeren, verwijder de vloeistof en resuspendeer de cellen in 500 μL 0.9x PBS+ 1% FBS en leid ze door een filterdop van 35 μm in een FACS-buis. Blijf op het ijs.
  3. Voorbereiding van de donorplaat
    OPMERKING: De donorplaat is een v-bodemplaat met 96 putjes waarin de CT-FR-gekleurde T-ALL-cellen van getransplanteerde zebravissen worden gesorteerd. Elk putje van de plaat bevat 5.000 ongekleurde, WT CG1-cellen in 50 μL vismedia om als drager te dienen om de gesorteerde cellen in de volgende stappen te helpen pelleteren.
    1. Tel 500.000 WT CG1-cellen en breng ze over in een conische buis van 15 ml.
    2. Verdun deze celvoorraad tot 100 cellen/μL door 5 ml vismedia toe te voegen.
    3. Doseer 50 μL van de celsuspensie in elk putje van de plaat met 96 putjes. Meng de buis van de celsuspensie na elke rij om de homogeniteit van de celsuspensie te behouden. Houd de plaat op 4 °C tot het gesorteerd is.
  4. Voorbereiding van de getransplanteerde vismonsters
    1. Selecteer getransplanteerde vis met 30-40% T-ALL last. Verzamel vissen die zijn getransplanteerd met zowel de CT-FR-gekleurde cellen als ongekleurde GFP-tumorcellen.
    2. Oogst de cellen zoals beschreven in deel 2.
      OPMERKING: Aangezien de kleurstofbehoudende cellen naar verwachting in een lage hoeveelheid aanwezig zullen zijn, moet u zich voorbereiden op het sorteren van een groot aantal cellen uit het CT-FR GFP-monster.
    3. Verdun tot de juiste concentratie voor het sorteren van ~3-5 × 106 cellen/ml in 0,9x PBS + 1% FBS en passeer door een filterdop van 35 μm in een FACS-buis. Voeg DAPI (1 mg/ml) toe in een verdunning van 1:1.000 als een essentiële kleurstof om dode cellen uit te sluiten. Blijf op het ijs.
    4. Breng voor de ongekleurde GFP-tumorcellen 250.000 cellen over in een microcentrifugebuis en pellet bij 2.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het vismedium, voeg 500 μL PBS toe en passeer door een filterdop van 35 μm in een FACS-buis. Blijf op het ijs.

6. Sorteren

NOTITIE: Bewaar alle buisjes en de donorplaat de hele tijd op ijs, behalve wanneer ze worden gebruikt voor het sorteren.

  1. Voor het sorteren van parameters en poorten begint u met het toepassen van de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingspoorten om de cellen van belang te identificeren op basis van hun grootte en celresten te elimineren. Gebruik vervolgens de voorwaartse verstrooiingshoogte versus het voorwaartse verstrooiingsgebied om dubbele cellen uit te sluiten en alleen enkelingen te behouden. Gebruik ten slotte de besturingselementen zonder kleur en één kleur om de kwadranten te tekenen om GFP-positieve en CT-FR-positieve celpopulaties te identificeren.
    OPMERKING: De CT-FR-controle zal naar verwachting veel helderder zijn dan de monsters voor sortering, aangezien de kleuring voor de controle vers is gedaan zonder celdelingen; cellen van de CT-FR GFP-monsters zullen naar verwachting aan de onderkant van de CT-FR-positieve poort verschijnen.
  2. Sorteer het aantal cellen dat in elke vis moet worden getransplanteerd in één putje van de donorplaat.
    OPMERKING: Voor dit experiment hebben we een beperkende verdunningstest gebruikt om de frequentie van leukemiestamcellen in CT-FR High en CT-FR Low te schatten. Deze test gebruikte een dosis van 25 cellen, getransplanteerd in 3 dieren, en een dosis van 10 cellen, getransplanteerd in 10 dieren. Een typische beperkende verdunningstest met behulp van de zebravis rag2:Myc-afgeleide T-ALL zou een groep met een hoger aantal cellen (500 of 1.000) omvatten, aangezien de LSC-frequentie in dit model wordt geschat op 1 LSC in honderden cellen. In deze test gebruiken we echter een van de T-ALL-klonen die eerder zijn beschreven door Blackburn et al.15. De LSC-frequentie in het hier gebruikte monster is ~1 LSC in tientallen cellen; We voorspellen dat leukemie wordt gedetecteerd bij dieren die zijn getransplanteerd in de 25-cellengroep. Bij het optimaliseren van deze test voor uw ziektemodel, moet u voorzichtig zijn bij het selecteren van de groep met een hoger celgetal om de implantatie van de tumor te garanderen.
  3. Bewaar de plaat na het sorteren op ijs tot hij klaar is voor transplantatie.
    OPMERKING: Sorteerprocedures kunnen stressvol zijn en de levensvatbaarheid van de cellen beïnvloeden. Voordat het eigenlijke beperkende verdunningsexperiment werd uitgevoerd, werd een proefsorteerexperiment uitgevoerd. Gesorteerde cellen werden getransplanteerd en de ontwikkeling van leukemie werd gecontroleerd om te bepalen of de sortering schadelijk was voor de levensvatbaarheid van de cellen. Als alternatief kan de levensvatbaarheid van de cellen worden beoordeeld door de gesorteerde cellen te kleuren met Trypan-blauw en ze vóór transplantatie onder de microscoop te onderzoeken.

7. Het transplanteren van gesorteerde cellen bij het beperken van verdunning en het volgen van het begin van de tumor

  1. Draai de plaat met behulp van een grote tafelcentrifuge rond bij 2.500 × g bij 4 °C.
  2. Verwijder voorzichtig 45 μl van het supernatans uit elk putje, laat 5 μl vloeistof achter en zorg ervoor dat u de celkorrel op de bodem van het putje niet aanraakt.
  3. Resuspendeer de cellen met een pipet van 20 μL. Resuspendeer 2-3 putjes met de pipet en injecteer vervolgens met behulp van de Hamilton-microliterspuit de celsuspensies van elk putje in het gewenste aantal CG1-zebravissen via IP-transplantatie. Resuspendeer vervolgens de cellen in de volgende groep putjes om hervestiging van de cellen te voorkomen.
  4. Onderzoek de zebravis door middel van fluorescentiemicroscopie onder sedatie eenmaal per week op de ontwikkeling van T-ALL gedurende ten minste 6 weken.

8. Bepaling van de frequentie van leukemiestamcellen

  1. Noteer het aantal positieve dieren per celdosis en behandelingsgroep 6 weken na transplantatie, waarbij dieren met een willekeurige hoeveelheid GFP-signaal als positief worden beschouwd. Beschouw dieren als een aanzienlijke leukemielast wanneer het GFP-signaal >50% van het lichaam beslaat.
  2. Gebruik de webgebaseerde statistische software ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19 om de frequentie van LSC's binnen elke celpopulatie te berekenen.
    OPMERKING: Een schematische illustratie van de workflow wordt gegeven in afbeelding 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Workflow voor het gebruik van de cell tracking kleuring om slapende cellen te isoleren in het zebravis T-ALL model. Schematische illustratie van het kleuren van zebravis T-ALL cellen met de celproliferatiekleuring, voortplanting in een CG1 zebravis (bovenste paneel) en het sorteren van cellen op basis van het behoud van de celproliferatievlek (middelste paneel). Verzamelde cellen werden gebruikt voor een beperkende verdunningstest om de frequentie van LSC's te bepalen (onderste paneel). Afkortingen: T-ALL = T-cel acute lymfatische leukemie; LSC's = leukemische stamcellen; CT-FR = CellTrace Ver Rood; FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; PE = fycoerythrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

We volgden het hierboven beschreven protocol om cellen te sorteren die de celproliferatiekleurstof, CT-FR, hebben behouden en hebben ze gebruikt voor een beperkende verdunningstest (LDA) om de LSC-frequentie te schatten in de CT-FR High- en CT-FR Low-populaties. Om de gating voor het flowcytometrie-experiment in te stellen, gebruikten we een controle zonder fluorofoor (geen kleur) naast controles met één kleur (Figuur 2A). Die kwadranten werden gebruikt om FITC- en PE-positieve en -negatieve populaties te identificeren voor de opstelling van de sorteerpoorten. De CT-FR eenkleurige positieve controle werd op dezelfde dag van de sortering bereid door WT-cellen van een niet-getransplanteerde zebravis te kleuren, en daarom wordt verwacht dat de signaalintensiteit veel hoger zal zijn dan het signaal van de gepropageerde cellen in het monster.

In CT-FR gekleurd GPF T-ALL (figuur 2B) werden cellen die in het kwadrant rechtsboven verschenen met een lage frequentie van 0,13% als CT-FR hoog beschouwd, en een sorteerpoort met het label "CT-FR hoog" werd in dit kwadrant geplaatst. Een andere poort werd gemaakt in het kwadrant rechtsonder om leukemiecellen te verzamelen die CT-FR Laag zijn. Aangezien de CT-FR High-cellen in lage hoeveelheden in het tumormonster voorkwamen, werd een groot aantal cellen (~2,5 × 106) gesorteerd om het benodigde aantal cellen te verzamelen voor het beperkende verdunningsexperiment.

Na het transplanteren van de CG1 zebravis met de gesorteerde cellen voor de LDA, werden de zebravissen gedurende 6 weken gemonitord. Cellen van de CT-FR High hadden een vier keer hogere LSC-frequentie in vergelijking met de CT-FR Low-celpopulatie (p = 0,0134) (Figuur 3A). Representatieve beelden van dieren 28 dagen na de transplantatie worden weergegeven in (Figuur 3B). In de CT-FR High, 10-cellige dosisgroep ontwikkelden 8 van de 9 dieren (89%) van de dieren leukemie, vergeleken met 2 op de 10 (20%) in de CT-FR Low-groep (Figuur 3A). Dieren uit de CT-FR High-groep hadden een significant kortere latentie tot leukemie (p = 0,0014) (Figuur 3C). Ten slotte hadden dieren uit de CT-FR High een significant lagere totale overleving (p = 0,0408) (Figuur 3D); in week 6 was 70% van de CT-FR Low dieren nog in leven, vergeleken met slechts 10% van de CT-FR High dieren. Deze resultaten tonen de verrijking van zelfvernieuwende LSC's aan binnen de langzaam delende, slapende celpopulatie in het rag2:Myc-gedreven zebravis T-ALL-model en het gebruik van de celproliferatiekleuring om deze populatie te isoleren.

figure-results-1
Figuur 2: Celsortering met behulp van flowcytometrie. (A) FACS-plots van vers CT-FR-gekleurde WT-cellen en GFP-gelabelde T-ALL-cellen werden gebruikt om de poorten te maken voor het sorteren van CT-FR-gekleurd. GFP+ T-ALL cellen. (B) Representatief voorbeeld van de gepropageerde CT-FR gekleurde GFP+ T-ALL cellen. Cellen uit het kwadrant rechtsboven werden beschouwd als CT-FR Hoog en cellen uit het kwadrant rechtsonder werden als CT-FR Laag beschouwd. Afkortingen: T-ALL = T-cel acute lymfatische leukemie; CT-FR = CellTrace Ver Rood; GFP = groen fluorescerend eiwit; FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; PE = fycoerythrine; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Significant hogere LSC-frequentie in cellen met een hoge retentie van de celproliferatiekleuring. (A) Gegevens van de beperkende verdunningstest die het aantal leukemie-positieve dieren na transplantatie vermeldt met twee toenemende doses cellen (10 en 25 cellen). De berekende LSC-frequentie en het 95%-betrouwbaarheidsinterval worden vermeld (p = 0,0134). B) representatieve beelden van dieren na 28 dagen transplantatie; schaalbalk = 10 mm. (C) Latentie tot significante leukemie beschouwd als de tijd die nodig is voor >50% van het dier om GFP-positief te worden, wat een significante leukemielast vertegenwoordigt. (D) Overlevingscurve van een getransplanteerd dier met 10 cellen. Afkortingen: LSC's = leukemische stamcellen; CT-FR = CellTrace Ver Rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Van LSC's is bekend dat ze resistent zijn tegen conventionele, antiproliferatieve chemotherapiebehandelingen, en het vinden van gerichte therapieën tegen deze cellen is veelbelovend bij het verminderen van het optreden van terugval en het verbeteren van de prognose van de patiënt20. Eerder onderzoek beschreef het gebruik van fluorescerende celproliferatiekleuringen om een kleine populatie van slapende cellen te identificeren die geassocieerd zijn met resistentie tegen geneesmiddelen en stamvorming in T-ALL PDX-modellen13. In dit werk beschrijven we het gebruik van een vergelijkbare celproliferatievlek om langzaam delende of slapende cellen op te lossen in een zebravismodel van T-ALL. We gebruikten deze tool om de verrijking van LSC's in de cellen met de hoogste retentie van de celproliferatiekleuring te beschrijven. De uitbreiding van deze onderzoeken naar zebravissen biedt tal van voordelen. Zebravissen zijn zeer vruchtbaar; Elk parend paar kan elke week honderden nakomelingen voortbrengen, waardoor transplantatie mogelijk wordt en verdunningsstudies waarvoor een groot aantal dieren nodig is, worden beperkt 15,17,21. Bovendien zijn zebravissen erg handig voor in vivo beeldvorming, waardoor positieve dieren snel kunnen worden gescreend door middel van eenvoudige fluorescentiemicroscopie16. Dit protocol kan dan ook als basis dienen voor aanvullend onderzoek naar slapende cellen in het zebravis T-ALL model.

Hier beschrijven we het gebruik van T-ALL-klonen met een hoge frequentie van LSC's die eerder werden gegenereerd in CG1-zebravis15, dus bevroren cellen werden eenvoudig ontdooid en vermeerderd voor gebruik. Als alternatief kan rag2:Myc-gedreven T-ALL worden gegenereerd door DNA-micro-injectie van zebravisembryo's, screening op dieren die T-ALL ontwikkelen en het oogsten van de leukemie van positieve zebravissen zoals eerder beschreven17. Ook voor dit soort onderzoek biedt het gebruik van de syngene zebravis tal van voordelen. Omdat de dieren genetisch identiek zijn, kunnen getransplanteerde cellen robuust in de gastheer worden geënt zonder zich aan te passen aan een nieuwe micro-omgeving, waardoor een nauwkeurige schatting van de LSC-frequentie mogelijk is 15,17,22.

Als alternatief voor het gebruik van syngene dieren kan dit protocol worden gevolgd met behulp van een wildtype zebravisstam die chemische of stralingsgemedieerde immuunablatie heeft ondergaan. Als immuungeablateerde dieren worden gebruikt, moet ervoor worden gezorgd dat de beperkende verdunningstest wordt geoptimaliseerd, aangezien er meer cellen nodig kunnen zijn voor een succesvolle implantatie bij allogene transplantatie. Bovendien zal vanwege het herstel van het immuunsysteem na 21 dagen waarschijnlijk een kortere observatieduur nodig zijn17. Dit protocol kan ook worden uitgebreid tot de xenotransplantatie van menselijke cellen. Zebravissen zijn naar voren gekomen als een efficiënt en kosteneffectief model voor xenotransplantaties van kanker, complementair aan hun muistegenhangers16. De volwassen immuundeficiënte prkdc−/−, il2rga−/− zebravissen zijn gebruikt om menselijke cellen met succes te enten bij 37 °C gedurende maximaal 60 dagen23. Met dit model kunnen menselijke cellen, in plaats van zich voort te planten en de gekleurde cellen in vivo te laten delen, zoals hier beschreven, worden gekleurd en in vitro worden gedeeld, vervolgens worden gesorteerd en getransplanteerd in een prkdc-/−, il2rga-/− zebravis voor in vivo studies. Er moet rekening worden gehouden met verschillende beperkingen bij het gebruik van zebravissen als xenotransplantaatmodel. Zo moeten zebravissen aangepast zijn om te kunnen overleven bij 37 °C. Bovendien zijn orthotope transplantaties mogelijk niet mogelijk voor bepaalde vormen van kanker vanwege de afwezigheid van bepaalde organen in de zebravis, zoals longen enborsten16.

Concluderend biedt het gebruik van de celproliferatiekleuringen in het zebravis T-ALL-model een veelbelovende weg voor het onderzoek naar slapende LSC's en hun rol in de ontwikkeling van ziekten en resistentie tegen behandeling. Door gebruik te maken van de voordelen van de CG1-zebravissen, waaronder hun kosteneffectiviteit en genetische homogeniteit, biedt dit protocol een robuust platform voor het begrijpen van de LSC-biologie in T-ALL. Het gebruik van het zebravismodel kan een aanvulling zijn op muis- en PDX-modellen om de ontwikkeling van geoptimaliseerde en gerichte therapieën mogelijk te maken die uiteindelijk de prognose van T-ALL-patiënten zullen verbeteren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door het National Cancer Institute (R37CA227656 JSB). Dit onderzoek werd ook ondersteund door de Flow Cytometry and Immune Monitoring Shared Resources van het Markey Cancer Center (P30CA177558) van de Universiteit van Kentucky.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
26 G/2” micro-syringeHamilton87930NA
35 µm filter cap FACS tubesFalcon352235NA
40 µm cell strainerCELLTREAT229482NA
96-well skirted PCR plateThermo Fisher ScientificAB0800NA
Cell sorterSony BiotechnologySY3200NA
CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564NA
Conical tubesVWR10026-078NA
DAPIThermo Fisher Scientific62248NA
DMSOSigma-AldrichD4818NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)Caisson Labs22110001NA
Epifluorescence stereo microscopeNikonSMZ25NA
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-Aldrich12306CNA
Fish system waterN/AN/A0,03-0,05% zoutgehalte, pH 6,5-8, gebufferd met natriumbicarbonaat
Microcentrifuge tubesThermo Fisher ScientificC2171NA
MS-222PentaireTRS-1tricaine mesylaat, een verdovingsmiddel
Petri dishesCorning07-202-011NA
Razor bladesAmerican Line66-0089NA
Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282NA

Referenties

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118 (2), 149-161 (2004).
  3. Li, L., Bhatia, R. Stem cell quiescence. Clin. Cancer Res. 17 (15), 4936-4941 (2011).
  4. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  5. Chen, W., Dong, J., Haiech, J., Kilhoffer, M. -C., Zeniou, M. Cancer stem cell quiescence and plasticity as major challenges in cancer therapy. Stem Cells Int. 2016, 1740936(2016).
  6. Kleffel, S., Schatton, T. Tumor dormancy and cancer stem cells: Two sides of the same coin. Adv Exp Med Biol. 734, 145-179 (2013).
  7. Tuy, K., Rickenbacker, L., Hjelmeland, A. B. Reactive oxygen species produced by altered tumor metabolism impacts cancer stem cell maintenance. Redox Biol. 44, 101953(2021).
  8. Zhou, B. -B. S., et al. Tumour-initiating cells: Challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 806-823 (2009).
  9. Lyons, A. B., Blake, S. J., Doherty, K. V. Flow cytometric analysis of cell division by dilution of cfse and related dyes. Curr Protoc Cytom. 64 (1), 11-12 (2013).
  10. Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of cfse dye dilution. J Immunol Methods. 243 (1-2), 147-154 (2000).
  11. Azari, H., Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse) to identify quiescent glioblastoma stem-like cells. Methods Mol Biol. 1686, 59-67 (2018).
  12. Deleyrolle, L. P., Rohaus, M. R., Fortin, J. M., Reynolds, B. A., Azari, H. Identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse). J Vis Exp. (62), e3918(2012).
  13. Ebinger, S., et al. Characterization of rare, dormant, and therapy-resistant cells in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell. 30 (6), 849-862 (2016).
  14. Langenau, D. M., et al. Myc-induced t cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  15. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in t cell acute lymphoblastic leukemia through akt/mtorc1 pathway activation. Cancer Cell. 25 (3), 366-378 (2014).
  16. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).
  17. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. (53), e2790(2011).
  18. Borga, C., et al. Simultaneous b and t cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic myc: Implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 33 (2), 333-347 (2019).
  19. Hu, Y., Smyth, G. K. Elda: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  20. Bhojwani, D., Pui, C. -H. Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).
  21. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
  22. Al-Hamaly, M. A., et al. Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia. Biomed Pharmacother. 170, 116013(2024).
  23. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

T ALL bij zebravisleukemische stamcellencel sorteringflowcytometriekleurstofretentiein vivo transplantatielimiterende verdunningsanalysekankerstamcellen
Identificatie van slapende cellen in een zebravis T-cel acute lymfoblastische leukemiemodel met behulp van celproliferatiekleuring
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.