Een obstructief chronisch pancreatitismodel tot stand gebracht door middel van elektrocoagulatie

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een nieuwe benadering voor het modelleren van chronische obstructieve pancreatitis, waarbij visualisatie van de pancreasbuis en elektrocoagulatie van de pancreasbuis betrokken zijn om obstructie van de pancreasbuis te veroorzaken.

Samenvatting

Chronische pancreatitis (CP) is een ernstige ontstekingsaandoening die de alvleesklier kan vernietigen, tot diabetes kan leiden en het risico op alvleesklierkanker kan verhogen, wat ernstige gevolgen heeft voor de kwaliteit van leven van patiënten. Het aanpakken van CP is een cruciaal onderzoeksaandachtspunt in de gastro-enterologie. We ontwikkelden een nieuw diermodel om de beperkingen van bestaande diermodellen te overwinnen, met behulp van 8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen.

Nadat we de alvleesklier hadden blootgesteld door middel van een buikoperatie bij verdoofde muizen, klemden we de gemeenschappelijke galwegen in de buurt van de lever vast om te voorkomen dat methyleenblauw erin zou komen. Een capillair werd in het galkanaal ingebracht om de kleurstof te injecteren en nadat het pancreaskanaal was gekleurd. Nadat de ductus pancreaticoduodena in beeld was gebracht, werd de pancreas geselecteerd voor elektrocoagulatie in het midden en onderste 2/3 van de positie tussen de gemeenschappelijke galwegen en de superieure arteria pancreaticoduodenal. De elektrocoagulatie werd beëindigd wanneer de blauwe kleuringsoplossing niet kon worden herkend. De buik werd vervolgens gesloten en de muizen werden normaal grootgebracht. 7, 14, 21 en 28 dagen na de operatie werd de alvleesklier onderzocht met behulp van HE-kleuring, Masson-kleuring en immunohistochemie, en bloedserum werd geanalyseerd op biochemische parameters. De pathologie na 14 dagen kwam nauw overeen met de kenmerken van chronische pancreatitis, net als de biochemische parameters van het serum.

Inleiding

Chronische pancreatitis (CP) is een ernstige progressieve ontstekingsaandoening, die leidt tot de vernietiging van de alvleesklier en zich manifesteert als buikpijn en spijsverteringsstoornissen. Na verloop van tijd kan het diabetes mellitus veroorzaken en het risico op alvleesklierkanker verhogen. Het vaststellen van het diermodel van CP en het ontwikkelen van effectieve therapeutische strategieën is dus cruciaal.

Exocriene acinaire cellen van de alvleesklier produceren en scheiden een groot aantal spijsverteringsenzymen af. Wanneer de regulatie van organellen en eiwithomeostase worden verstoord, kan dit leiden tot onjuiste activering van intracellulair trypsinogeen, wat uiteindelijk leidt tot acinaire celbeschadiging en de ontwikkeling van pancreatitis¹.

Eerdere studies hebben aangetoond dat muizenmodellen, vooral die geïnduceerd door herhaalde ceruleïne-injecties² en chirurgische ligatie van pancreaskanalen ^3,4, een belangrijke rol hebben gespeeld bij het bestuderen van CP. Ceruleïne kan acute pancreatitis veroorzaken die kan overgaan in een chronische toestand, maar het ontbreken van specifieke obstructie van de ductus pancreaticus beperkt de klinische betekenis ervan bij het simuleren van obstructieve pancreatitis. Hoewel chirurgische ligatie de obstructieve aard van menselijke CP beter nabootst, is het zeer invasief, moeilijk uit te voeren en leidt het vaak tot ernstige systemische effecten, wat de studie van gelokaliseerde ductale pathologieën belemmert.

Om deze beperkingen aan te pakken, is een nieuw obstructief CP-model door middel van elektrocoagulatie voorgesteld. Vergelijkbaar met het principe van ligatie van de ductus pancreaticus, blokkeert het de ductus pancreaticus, maar is het gemakkelijker uit te voeren en heeft het een hoger slagingspercentage. Onderzoekers hebben voorgesteld dat radiofrequente ablatie in het hoofdkanaal van de alvleesklier van varkens een veilige en effectieve methode is voor het induceren van pancreasatrofie⁵, wat ook suggereert dat het afsnijden van het hoofdkanaal van de alvleesklier met hoogfrequente elektrocoagulatie vergelijkbare effecten kan veroorzaken. Deze techniek omvat retrograde punctie van de ductus pancreaticus en injectie van methyleenblauwoplossing voor ductale kleuring, gevolgd door elektrocoagulatie om gelokaliseerde ductale obstructie te induceren (Figuur 1). Deze benadering versnelt ontstekingen en fibrose, bootst menselijke obstructieve CP na, terwijl wijdverspreide ontstekingsreacties en systemische complicaties worden vermeden. In vergelijking met conventionele modellen biedt het elektrocoagulatiemodel verschillende voordelen: het richt zich specifiek op de ductus pancreaticus, vermindert de variabiliteit en vermindert systemische complicaties. Het biedt een meer ziektespecifieke, reproduceerbare en veelzijdige benadering voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan ductale obstructie bij CP en de rol ervan bij ziekteprogressie.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Commissie voor het gebruik en de verzorging van dieren van de Naval Medical University. Zorg ervoor dat al het chirurgische materiaal steriel is.

1. Laparotomie

1. Dien een mengsel van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) toe via intraperitoneale injectie voor anesthesie-inductie. Bewaak de anesthesiediepte door het verlies van pedaalreflex en hoornvliesreflex te beoordelen. Geef indien nodig extra doses (20% van de aanvangsdosis) om tijdens de procedure voldoende anesthesie te behouden. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen. Plaats het dier op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
2. Gebruik een trimmer om het haar (~2 cm²) tussen de borst en de onderbuik te scheren. Desinfecteer het operatiegebied 3x met afwisselende rondes chloorhexidine/jodium en alcohol.
3. Bevestig de muizen met chirurgische tape op de operatieplaat en breng steriele lakens aan.
4. Gebruik een schaar om een 2 cm lange incisie in de centrale buik te maken, gevolgd door een incisie van 1 cm tussen de bovenbuik en de processus xiphoid.

2. De alvleesklier lokaliseren en blootstellen

1. Zoek met behulp van een buikvergroter het gebied van de alvleesklier waar elektrocoagulatie zal worden uitgevoerd.
2. Identificeer met behulp van een steriel wattenstaafje de twaalfvingerige darm vanaf de achterkant van de linker bovenbuik en draai de twaalfvingerige darm om het heldere galkanaal te visualiseren dat de lever verbindt.

3. Het traceren van de operatieplaats

1. Gebruik een microvasculaire clip om de proximale gemeenschappelijke galwegen tijdelijk af te sluiten en lekkage van retrograde infusie in de lever te voorkomen.
2. Sluit de polyethyleen buis met een binnendiameter van 0,25 mm en een buitendiameter van 0,35 mm aan op de naald met een buitendiameter van 0,25 mm. Gebruik dit apparaat om het rond de ampul in te brengen. Richt op de belangrijkste papil van de twaalfvingerige darm en breng het buisje erin in. Breng de katheter halverwege in het galkanaal in en stop met inbrengen.
3. Start de infuuspomp en micropomp 0,2% methyleenblauwoplossing (verdund in 0,9% zoutoplossing) in een dosis van 50 μl/10 g gedurende 2 minuten met een snelheid van 50 μl/min. De ductus pancreaticus zal geleidelijk blauw worden.
4. Trek aan het einde van de sessie de polyethyleen buis naar buiten en verwijder de microvasculaire clip.

4. Inductie van de elektrocoagulatieprocedure

1. Fixeer met behulp van steriele wattenstaafjes de alvleesklier en richt het elektrocoagulatiemes op het blauwe gedeelte voor elektrocoagulatie. De elektrocoagulatieplaats bevindt zich in het midden en onderste 2/3 tussen de gemeenschappelijke galwegen en de superieure pancreaticoduodenale slagader.
   1. Om deze studie te volgen, gebruikt u de volgende bedrijfsparameters van elektrocoagulatie: spanning : 220 V; Elektrodemateriaal: puur koper; Behandelingstijd: behandeling in de positie van de alvleesklier waarbij bloedvaten gedurende 2-3 s worden vermeden, totdat het blauw van methyleenblauw gemarkeerde positie wordt vervangen door geel of bruin na elektrocoagulatie; Grootte operatiegebied: Afhankelijk van de muizen bevindt het elektrocoagulatiegebied zich aan de achterkant van de alvleesklier. Kies de positie tussen het gemeenschappelijke galkanaal en de voorste superieure pancreaticoduodenale slagader; temperatuur: 300 °C.
2. Beëindig de elektrocoagulatie wanneer de blauwe kleuringsoplossing niet wordt gezien.
3. Sluit de buik met 4-0 resorbeerbare hechtingen en de huid met 4-0 niet-absorberende monofilament polypropyleen hechtingen. Neem niet meer dan 20 minuten tussen laparotomie en hechten.
4. Behandel de controlegroep op dezelfde manier als de experimentele muizen, maar zorg ervoor dat de infusiecomponenten alleen uit methyleenblauw bestaan. Dien in de controlegroep (Sham) de methyleenblauw-injectie toe, maar voer geen elektrocoagulatiechirurgie uit.

5. Dieren in leven houden

1. Voor postoperatieve wondverzorging van de muis na een buikoperatie moet de incisie dagelijks worden onderzocht op bloedingen of roodheid: als er een bloeding optreedt, oefen dan lichte druk uit met steriel gaas om het te stoppen en vervang vervolgens het verband, en als er roodheid is, breng dan eenmaal per dag erytromycinezalf aan, terwijl u ook maatregelen neemt om te voorkomen dat de muis aan de wond knagt. Wat analgesie betreft, dien carprofen (5 mg/kg) toe via intraperitoneale injectie onmiddellijk na de operatie, daarna eenmaal per 24 uur gedurende 3 opeenvolgende dagen.

6. Analysemethoden

1. Meet de biochemische indexen van het serum en observeer pathologische veranderingen in het pancreasweefsel op de 7e, 14e, 21e en 28e dag van elektrocoagulatie.
2. Verdoof het dier met een mengsel van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) via intraperitoneale injectie en verzamel ongeveer 500 μL bloed via de orbitale plexus.
3. Houd de huid voorzichtig op de rug vast om een licht uitsteeksel van de oogbol te vergemakkelijken.
4. Plaats het uiteinde van het haarvatvat in de ooghoek en breng het voorzichtig onder de oogbol in een hoek van ongeveer 30°-45°. Draai het capillair totdat het bloed begint te stromen.
5. Houd aan het einde van de collectie de oogleden gesloten door lichte druk uit te oefenen met gaas.
6. Centrifugeer het serum (1.200 × g, 15 min) en verwijder het bovenstaande voor de bepaling van amylase, bilirubine en hyaluronzuur (stap 6.10).
7. Verdoof muizen met ketamine-xylazine, bevestig dat ze zich in een diepe anesthesietoestand bevinden (geen pedaalreflex of hoornvliesreflex) en voer vervolgens cervicale dislocatie uit voor euthanasie.
8. Plaats de geëuthanaseerde muizen op de operatietafel bij 4 °C en gebruik een schaar en tang om een "V"-incisie in de buikwand te maken om de buikholte bloot te leggen. Verwijder de alvleesklier van de muizen en verdeel het orgaan in drie delen om te kleuren.
9. Verwerk de alvleesklier door deze te fixeren in een 4% polyformaldehyde-oplossing en in paraffine in te bedden. Snijd paraffineblokken van de alvleesklier in secties van 0,5 mm dik en kleur ze met hematoxyline en eosine (HE) en de kleuring van Masson voor visualisatie onder een lichtmicroscoop. Gebruik het in paraffine ingebedde pancreasweefsel voor immunohistochemische analyse.
10. Meet amylase (U/dL), bilirubine (mmol/L) en hyaluronzuur (μg/L) met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de aanbevelingen van de fabrikanten.

Resultaten

De dieren werden verdeeld in een controlegroep (alleen injectie van methyleenblauw voor elektrische coagulatie) en een elektrische stollingsgroep, in totaal 20 muizen in elke groep. Het sterftecijfer was 0% in de controlegroep en 15% in de elektrische stollingsgroep; Het slagingspercentage van het bouwen van het model (aantal levende modelmuizen) was 71%. In elke groep werden een tiental dieren gekozen voor pathologische beoordeling. Drie muizen in elke groep werden willekeurig geselecteerd op de 7e, 14e, 21e en 28e dag voor HE, Masson en immunohistochemische kleuring. Het proces van modelleren wordt weergegeven in figuur 1. Na het traceren met methyleenblauw, elektrocoaguleerden we de locatie tussen de gemeenschappelijke galwegen en de voorste superieure pancreaticoduodenale slagader op de alvleesklier van muizen. Als het elektrocoagulatiegebied wordt geselecteerd in het middelste en onderste deel van de positie met een gebied van minder dan een derde, zal het effect waarschijnlijk niet aan de verwachtingen voldoen. Als het echter meer dan 2/3 is, zullen de muizen waarschijnlijk binnen 72 uur na elektrocoagulatie overlijden, wat waarschijnlijk te wijten is aan ernstige acute pancreatitis die optreedt nadat het pancreaskanaal volledig is geblokkeerd.

Hieruit concluderen we dat op de 14e dag na elektrocoagulatie een histologisch beeld van chronische pancreatitis kan worden waargenomen in de alvleesklier van muizen (zoals weergegeven in figuur 1), die niet volledig is geblokkeerd maar wordt gevormd na gedeeltelijke blokkering van de pancreatikanaals. Het weefsel op dag 7 vertoonde licht weefseloedeem en het weefsel vertoonde geen tekenen van chronische pancreatitis. Op dag 14 toonde HE-kleuring van pancreasweefsel aan dat pancreasacinaire cellen verspreid waren. Op de 21e dag herstelde de mate van ontsteking van de acinaire cellen in het pancreasweefsel zich geleidelijk. Er waren tekenen van omkering van de pathologische veranderingen in het weefsel op dag 28 (Figuur 2). Dit kan te wijten zijn aan onvoldoende elektrocoagulatie van de pancreasbuis tijdens het elektrocoagulatieproces, evenals aan het compenserende effect van de resterende pancreasbuis na gedeeltelijke obstructie van de pancreasbuis.

Masson-kleuring toonde aan dat de mate van fibrose in de operatiegroep significant ernstiger was dan die in de schijnoperatiegroep. Immunohistochemische scores voor de kleuring van col-1 en (alfa-gladde spieractine) SMA waren hoger (Figuur 3). De aanwezigheid van chronische pancreatitis in het pancreasweefsel werd waargenomen door pathologische analyse op dag 14, en de veranderingen ervoor en erna werden vergeleken door HE-kleuring alleen in pathologische analyse daarna. Door de analyse van de biochemische indicatoren van het serum bleek dat de concentraties van serumamylase, bilirubine en hyaluronzuur hoger waren in de elektrische stollingsgroep dan in de controlegroep, wat wijst op het ontstaan van chronische pancreatitis (figuur 4).

Figuur 1: Schematische weergave van obstructieve chronische pancreatitis geïnduceerd door elektrocoagulatie bij muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Hematoxyline-eosinekleuring van pancreasweefsels in de loop van de tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Hematoxyline-eosine en Masson kleuring en immunohistochemie van de alvleesklier. Afkortingen: Col-1 = alfa-1 type 1 collageen; SMA = alfa-gladde spieractine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten van biochemische serumindices van muizen in verschillende periodes. (A) Hyaluronzuurconcentratie in serum (μg/L). (B) Serumbilirubineconcentratie (mmol/L). (C) Serum amylaseconcentratie (U/dL). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het risico en de ernst van pancreatitis worden bepaald door zowel genetische als omgevingsfactoren⁶. De volledige genezing van klinische pancreatitis is een doel in de gastro-enterologie, waarbij het creëren van diermodellen de eerste stap is. Er bestaan verschillende methoden om deze modellen tot stand te brengen, elk met zijn voor- en nadelen 7,8,9,10,11.

Chirurgen hebben hoogfrequente elektrocoagulatie gebruikt om endoluminale thermische ablatie (ETHA) in het hoofdkanaal van de alvleesklier uit te voeren om de exocriene secretie van de alvleesklier te verminderen, waardoor de incidentie van postoperatieve pancreasfistel (POPF) na pancreaticoduodenectomie (PD)¹² wordt verminderd. Dit suggereert dat de methode van thermische ablatie die pancreasatrofie veroorzaakt, in de klinische praktijk is geïmplementeerd. We ontwikkelden een nieuw model van obstructieve pancreatitis door methyleenblauw te gebruiken om de ductus pancreaticus te visualiseren en nauwkeurig te elektrocoaguleren.

C57BL/6 Mannelijke muizen van 8 weken oud werden geselecteerd voor dit experiment. Vrouwelijke muizen hebben een voortplantingscyclus en de niveaus van hormonen in het lichaam kunnen van invloed zijn op de experimentele gegevens. Op de leeftijd van 8 weken waren de muizen in de bloei van hun leven met volwassen lichaamsorganen en een goede gezondheidsindex, en de mannelijke muizen van dezelfde leeftijd waren sterker in omvang. In de postoperatieve observatiemaand van 1 maand hebben we de alvleesklier van muizen bemonsterd op 7, 14, 21 en 28 dagen; De resultaten verkregen na 14 dagen komen meestal overeen met de pathologische kenmerken van pancreatitis.

Er zijn verschillende kanttekeningen bij deze aanpak. Eerst moet het gemeenschappelijke galkanaal zo dicht mogelijk bij het hepatische hilum worden geklemd om de injectie van de kleurstof in het pancreaskanaal te vergemakkelijken. Ten tweede moet aandacht worden besteed aan de snelheid en tijd van injectie van methyleenblauwe kleurstof in de ductus pancreaticus. De ductus pancreaticus kan niet worden gezien met te weinig kleurstofoplossing en te veel kleurstofoplossing zal de identificatie van de locatie van de ductus hoofdpancreation in het chirurgische veld belemmeren. Ten derde werd de elektrocoagulatie beëindigd toen de blauwe kleuringsoplossing niet kon worden gezien. In deze experimenten wordt een operatie uitgevoerd in het gebied dat wordt aangegeven door de methyleenblauwe kleuring, omdat het gebied van de alvleesklier van de muis dat geëlektroaguleerd is, anders zal zijn, daarom wordt de methyleenblauwe vlek gebruikt om de ductus pancreaticus te volgen. Ten vierde moet elke bloeding op de alvleesklier tijdens de operatie onmiddellijk worden gestopt. Tegelijkertijd moet het elektrocoagulatiemes worden gebruikt om de alvleesklier te snijden. Als het elektrocoagulatiemes om welke reden dan ook aan de alvleesklier vastzit, moet de elektrocoagulatietijd worden verlengd. Dit is de meest gebruikelijke manier om het optreden van ernstige postoperatieve complicaties veroorzaakt door lekkage van de alvleesklier te voorkomen.

Er zijn echter nadelen aan deze methode. De vaardigheid van de operator heeft een directe invloed op de uitkomst van het experiment, en de uniformiteit van de operatie bij verschillende muizen beïnvloedt het slagingspercentage van het model. Dit model simuleert de effecten van galstenen of obstructie van de pancreasbuis, wat leidt tot herhaalde aanvallen van acute pancreatitis, die uiteindelijk chronische pancreatitis veroorzaken. Dit zou de verhoogde bilirubinespiegels kunnen verklaren. Daarom kan dit model ook worden ontwikkeld als een model voor acute pancreatitis op basis van de mate van elektrocoagulatie. Vroege experimenten op de alvleesklier van muizen 3 dagen na elektrocoagulatie toonden kenmerken van acute pancreatitis, maar postoperatieve complicaties verlaagden het slagingspercentage van het model voor acute pancreatitis. Het kan echter niet worden uitgesloten dat de warmte die door de elektrocauterisatie tijdens het elektrocoagulatieproces wordt gegenereerd, zich naar het hoofdgalkanaal heeft verspreid. De vraag hoe acute pancreatitis stabiel kan worden geïnduceerd door middel van elektrocoagulatie is het onderzoeken waard.

Vergeleken met de traditionele cerulene-injectiemethode, die herhaalde injecties gedurende meerdere weken vereist, bespaart de elektrocoagulatiemethode tijd en is deze handiger. Terwijl cerulene-injectie een uitstekende stabiliteit en gebruiksgemak vertoont, duurt elektrocoagulatie ~20 minuten en bespaart het daaropvolgende experimentele tijd.

De ontwikkeling van nieuwe modellen heeft tot doel de natuurlijke geschiedenis van de ziekte te bestuderen en gerichte therapieën te ontwikkelen. Ons nieuwe diermodel helpt bij het simuleren van chronische pancreatitis veroorzaakt door obstructie van de pancreasductus bij muizen, inclusief post-endoscopische retrograde cholangiopancreatografie pancreatitis (ERCP)¹³.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16 mm microvascular clip	Stronger, Ningbo, China
Absorbable Suture	Yangzhou Jinhuan Medical Device Factory	4-0	-
Carprofen	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	C830557-5g	-
Capillary tube	Tygon,US	AAQ(AAD)04091	0.25 x 0.3 mm
Electrocoagulation knife	Shun Ye MEDICAL Equipment Co., LTD, Ningbo, China	Shun Ye BDD-YE-DF-1
Eye scissors
Ketamine Hydrochloride Injection (Ketaset CIII)	Zoetis Inc.	S5564	-
Methylene blue staining solution	Solarbio, Shanghai, China	G1303
Non absorbent 4-0 monofilament polypropylene suture	Jinhuan, Shanghai, China
Operating microscope	Murzider, Guangdong, China	MSD203
Ophthalmic forceps
Round head swab	Olga Sherer, Huaximedical, China
Syringe needle	Minank, Zhejiang, China		0.25 mm
Tissue forceps
Tissue scissors	Shanghai Puxin Instrument Technology Corporation
Xylazine Hydrochloride Injection	Bayer Animal Health	XYL-50-20	-