Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Integratief protocol voor het genereren van iPSC-afgeleide 3D humane leverorganoïden

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67070

⸱

6 december 2024

 ,  ,  , 
1Section of Adult and Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Chicago

In dit artikel

Samenvatting

Menselijke iPSC-afgeleide 3D-leverorganoïden vormen een potentieel hulpmiddel om de werking van het schildklierhormoon op de leverontwikkeling te begrijpen.

Samenvatting

Het verkrijgen van stabiele levercellen in kweek vormt een aanzienlijke uitdaging voor leverstudies. Met dit in gedachten wordt een geoptimaliseerde methode afgebeeld waarbij gebruik wordt gemaakt van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) om 3D-culturen van menselijke leverorganoïden (HHO's) te genereren. Het gebruik van HHO's biedt een waardevolle benadering voor het begrijpen van leverontwikkeling, het ontrafelen van leverziekten, het uitvoeren van high-throughput studies voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en het onderzoeken van het potentieel voor levertransplantatie. In het eerste onderzoek werd door middel van immunofluorescentie en kwantitatieve RT-PCR-technieken de progressie gevolgd, waarbij de aanwezigheid van verschillende celpopulaties werd geïdentificeerd, zoals hepatoblasten en de twee soorten van hepatoblast afgeleide cellen: cholangiocyten of hepatocytachtige cellen, in verschillende ontwikkelingsstadia. Dit rapport presenteert een eenvoudig 3D-protocol dat begint bij hiPSC om HHO's te verwerven die de stadia van de ontwikkeling van menselijke embryo's weerspiegelen. Het protocol, dat 46-50 dagen beslaat, omvat verschillende stappen: (i) nauwgezet beheer van hiPSC-cultuur om HHO's te genereren, (ii) initiatie van celdifferentiatie in 2D en de daaropvolgende overgang naar 3D, en (iii) een geoptimaliseerde dissociatiestrategie om HHO's op te splitsen in afzonderlijke cellen voor single-cell RNA-sequencing. Ter illustratie van de brede toepassingen van deze aanpak werd het huidige protocol eerder toegepast om de rol van schildklierhormoonsignalering bij de ontwikkeling van levercellen te ontrafelen.

Inleiding

De lever vervult diverse metabolische functies, zoals het reguleren van de beschikbaarheid van gemakkelijk bruikbare energiesubstraten zoals glucose- en ketonlichamen, evenals ontgiftende xenobiotische verbindingen. In de afgelopen jaren is er een aanzienlijke toename geweest in de prevalentie van leveraandoeningen, grotendeels toegeschreven aan niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), die, indien onbehandeld, kan overgaan in cirrose of kanker1. Daarom is het absoluut noodzakelijk om de metabolische functies van de lever en de gerelateerde ziekten te begrijpen om de ontwikkeling van effectieve behandelingen te vergemakkelijken 2,3.

De opkomst van driedimensionale (3D) culturen heeft geleid tot de creatie van het organoïdemodel, een baanbrekende en innovatieve benadering om de functionaliteit en complexiteit van orgaanontwikkeling aan te pakken4. Organoïden worden gedefinieerd als 3D-zelfgeorganiseerde aggregaten van gedifferentieerde cellen die de functies en cytoarchitectuur van het respectieve orgaan nabootsen5.

In de afgelopen decennia heeft een groot aantal protocollen voor menselijke hepatische organoïden (HHO) brede belangstelling gekregen, variërend van het gebruik van diverse menselijke iPSC-afgeleide cellen6 of uitsluitend hepatocyten-achtige cellen7 tot de opname van een verscheidenheid aan ingewikkelde micro-omgevingen van groeifactoren of remmers en differentiërende voorlopercellen in monolaag7 of 3D8. Deze benaderingen lenen zich voor een groot aantal potentiële doelstellingen, van screening van geneesmiddelen met hoge doorvoer9 tot het verkrijgen van meer inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan leverziekten10.

Hier wordt een stapsgewijs protocol van HHO-differentiatie uitgevoerd op basis van de genoemde chemische signalen11 , met methodologisch aangepaste variaties. Dit protocol begint met de juiste behandeling en kweek van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC), waarbij technieken worden beschreven voor extracellulaire matrixgelmanipulatie, celpassage en differentiatie in HHO's. Het proces begint met het stimuleren van de differentiatie van hiPSC's tot definitief endoderm (DE)12 en vervolgens het nabootsen van de in vivo effecten van FGF en BMP om de ontwikkeling van monolaagcellen van de posterieure voordarm (PFG) te bevorderen13. De 3D-architectuur wordt bereikt op dag 10 wanneer de PFG-cellen worden gedifferentieerd in een onrijpe leverfase die de hepatoblasten zal worden, de foetale voorlopercel van cholangiocyten en hepatocyten2. Ten slotte worden de 3D-structuren gedissocieerd in afzonderlijke cellen voor RNA-sequencingstudies. Als voorbeeld van de toepasbaarheid van dit protocol werd aangetoond hoe dit HHO-model zich leent voor de studie van de werking van schildklierhormonen en het type 2 dejodinase (D2) op de ontwikkeling van hepatocyten en cholangiocyten14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Beheer van hiPSC

OPMERKING: hiPSC's (CS03iCTR-n3-cellijn) werden in de handel gekocht. Het juiste beheer van de extracellulaire matrixgelcoating en het hiPSC-medium is essentieel voor het bevestigen van de hiPSC's aan de platen en het voeden ervan. Hier werden de volumes beschreven die nodig waren voor één plaat met 6 putjes. De resterende hiPSC's van de plaat met 6 putjes, die niet differentiëren tot organoïden, kunnen worden opgeslagen in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

  1. Dosering van extracellulaire matrixgel en hiPSC-medium
    1. Ontdooi het flesje extracellulaire matrixgel op de juiste manier door het een nacht in een bakje met ijs bij 4 °C te plaatsen.
      OPMERKING: Controleer vóór de aliquotatie het analysecertificaat om het volume van de verdunningsfactor te controleren. Dit vertegenwoordigt de eiwitconcentratie van de extracellulaire matrixgel; Daarom varieert het van partij tot partij.
    2. Verdeel extracellulaire matrixgel in geschikte aliquots volgens de verdunningsfactor (4x, 2x en 1x) met behulp van voorgekoelde en geëtiketteerde tubes. Voeg een 4x verdunningsfactor van extracellulaire matrixgel toe aan 25 ml koude DMEM/F12 om vier platen met 6 putjes te coaten. Sluit de deksels onmiddellijk af met laboratoriumafdichtfolie en vries ze in bij -80 °C. Vermijd langdurige blootstelling aan lucht en het ontstaan van luchtbellen in de aliquots.
    3. Ontdooi 100 ml hiPSC-supplement medium bij 4 °C 's nachts. Voeg het toe aan 400 ml hiPSC basaal medium. Eenmaal gehomogeniseerd met een serologische pipet van 50 ml, verdeel het hiPSC-medium in buisjes van 40 ml en vries het in bij -20 °C tot gebruik.
  2. Plaatcoating voor de hiPSC-cultuur
    1. Nummeren en labelen van de 6-well plaat(en). Houd een extracellulaire matrix gel aliquot in de buurt, ondergedompeld in droogijs.
    2. Voor het coaten van een plaat met 6 putjes, verdunt u een extracellulair matrixgelgehalte (1x) in 6,25 ml koude DMEM/F12 (2x in 12,5 ml en 4x in 25 ml DMEM/F12).
    3. Pipetteer een klein volume DMEM/F12 (~500 μL) in de extracellulaire matrix gelbuis. Draai op en neer om de extracellulaire matrixgel te ontdooien en homogeniseren met koude DMEM/F12, waardoor het ontstaan van bubbels wordt voorkomen, en breng deze terug naar de rest van de koude DMEM/F12-bevattende buis met behulp van een serologische pipet om volledig te mengen.
    4. Integreer 1 ml extracellulaire matrixgel in DMEM/F12 in één putje voor het coaten van de plaat met 6 putjes (6 ml voor de hele plaat). Verdeel de 1 ml gelijkmatig over het oppervlak door de plaat zonder te schudden te verplaatsen totdat deze volledig bedekt is.
    5. Laat voor gebruik 1 uur op kamertemperatuur (RT) staan. Als de 6-wells plaat niet volledig wordt gebruikt, sluit deze dan af met laboratoriumafdichtfolie en bewaar deze in de koelkast bij 4 °C.
      LET OP: Een gecoate plaat is 1 week houdbaar in de koelkast bij 4 °C.
  3. Ontdooien en cultuur van hiPSC
    1. Bereken van tevoren het volume hiPSC medium en warm bij RT samen met de 6-well gecoate plaat 1 uur voor gebruik (2 ml per putje).
      OPMERKING: In geval van koude of bevroren voedingsmiddelen, dompel ze 15 minuten voor gebruik onder in een broedmachine van 37 °C of een waterbad.
    2. Splits 1 ml hiPSC's in vloeistof N2 van een cryovial in 3 putjes van een plaat met 6 putjes (verhouding 1:3). Gebruik voor een hele plaat met 6 putjes 2 cryovials. Hier beschrijft het protocol het ontdooien en kweken van hiPSC's uit één cryovial. Herhaal het proces voor 2 cryovials.
    3. Breng de cryovial met ongeveer 1 ml bevroren hiPSC's in door deze door de dop te houden en door het oppervlakkige water te schuiven, waarbij de bodem van de injectieflacon tot het ontdooien in een waterbad bij 37 °C wordt ondergedompeld.
    4. Eenmaal ontdooid, spuit u de cryovial met ethanol en pipett u de 1 ml hiPSC's. Doseer langzaam in een lege, conische tube van 15 ml. Voeg druppel voor druppel 5 ml warme hiPSC medium toe terwijl u de tube voorzichtig schudt.
    5. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het bovenstaande subtiel door op te zuigen met een glazen pipet die op het vacuüm is aangesloten zonder de pellet te verstoren en er wat restmedium achter te laten. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 6 ml medium en voeg vervolgens 2 ml per putje toe in 3 putjes van de plaat met 6 putjes.
      OPMERKING: Laat kleine aggregaten van hiPSC's achter voor een correcte groei.
    6. Buig de plaat met 6 putjes om en zuig de extracellulaire matrixgel op van de eerder gecoate plaat zonder de punt naar de bodem van de put te raken.
    7. Breng 2 ml van het medium met hiPSC's per putje over. Schud de plaat voorzichtig naar voren, naar achteren en van links naar rechts om de hiPSC-aggregaten gelijkmatig over de plaat te verdelen.
    8. Plaats de 6-wells plaat in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Vervang het medium dagelijks (2 ml per putje) en controleer de progressieve groei.
    9. Passage hiPSC's wanneer 80% groeiconfluentie is verkregen (na 4-5 dagen; zie figuur 1A). Kenmerken van gezonde en proliferatieve hiPSC's zijn onder meer duidelijke grenzen en een strakke verpakking van grote kernen in het midden van de groeiende celaggregaties.
  4. Passeren van hiPSC
    1. Zodra de hiPSC's 80% confluentie bereiken, wat wijst op ongeveer 1,2 x 106 cellen per putje, gaat het over in een nieuwe plaat met 6 putjes. Splits in een verhouding van 1:3 (van 1 ver naar 3), of pas de verhouding aan (1:4; 1:6) volgens de vereisten van het experiment.
    2. Bereid vóór het passeren de vereiste extracellulaire matrixgelinbedding voor het juiste aantal platen met 6 putjes voor, zoals beschreven in stap 1.2.
    3. Verwijder het bovenstaande uit elk putje en voeg 2 ml PBS per putje toe. Zuig de PBS op, gevolgd door de toevoeging van 1 ml hiPSC-losmakend medium per putje gedurende 1 minuut. Verwijder vervolgens de 1 ml hiPSC-loslaatmedium.
    4. Plaats de 6-wells plaat 7 minuten in een broedmachine bij 37 °C. Voeg 1 ml hiPSC-medium toe per putje. Maak los en verzamel door 1 ml van het hiPSC-medium met cellen in de buis van 15 ml te pipetteren.
    5. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Om de cellen in een plaat met 6 putjes te plaatsen, herhaalt u stap 1.3.5-1.3.7. Plaats de 6-wells plaat in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Ga naar stap 1.5. om hiPSC indien nodig te bevriezen.
  5. HiPSC invriezen (optioneel)
    OPMERKING: Het aantal hiPSC's dat nodig is voor promotie naar HO's kan resulteren in overgebleven putten die op lange termijn kunnen worden bewaard. Mocht het nodig zijn om de doorgang voor cryoviale opslag uit te breiden, dan kunnen de hiPSC's gedurende langere perioden worden gehandhaafd.
    1. Ontdooi het benodigde volume cryopreservatiemedium (1 ml per putje cellen) tot ijs bij 4 °C. Label cryobuisjes met het aantal passages, de datum en de cellijn. Maak cellen los met hiPSC-losmakend medium zoals in stap 1.4. in een conische buis van 15 ml.
    2. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig de supernatant volledig op en laat de celpellet voorzichtig ongemoeid. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 1 ml koud cryopreservatiemedium (per putje) door hiPSC-aggregaten te laten.
      OPMERKING: Als putten een lage dichtheid hebben, minder dan 50% samenvloeiend, mag 1 ml cryopreservatiemedium worden gebruikt voor elke 2 putjes.
    3. Breng 1 ml cryopreservatiemedium met de hiPSC's over in de cryobuis. Schud de cryobuis voorzichtig om de celinhoud te homogeniseren.
      OPMERKING: Als u meer tubes voorbereidt om te cryopreserveren, laat dan de reeds voorbereide tubes in ijs liggen.
    4. Plaats de buizen een nacht in de vriescontainer met gecontroleerde snelheid bij -80 °C. Breng de slangen na 24 uur over in de tank met vloeibare stikstof.

2. Stapsgewijze differentiatie van hiPSC naar leverorganoïden

OPMERKING: De reconstitutie van de reagentia werd uitgevoerd en gevolgd volgens de richtlijnen van de fabrikant.

  1. 2D-differentiatie van hiPSC naar DE (dag 0-dag 4 (D-0 naar D-4); Figuur 1B)
    1. Als de cellen na 3 passages gezond zijn en goed en snel groeien, ga dan verder met de differentiatie van de hiPSC. Smeer een plaat met 6 putjes in zoals beschreven in stap 1.2. Om hiPSC in DE te onderscheiden, gebruikt u de DE-kit door de instructies van de fabrikant te volgen.
    2. Alvorens met de differentiatie te beginnen, kweekt u hiPSC's in een passageverhouding van 2:1 (van 6 putjes naar 3 om de differentiatie te beginnen) gedurende 24 uur om de celconcentratie te bereiken in de put die is aangegeven in de DE-instructies.
    3. Voer differentiatie uit volgens het protocol van de fabrikant met de volgende wijzigingen.
      1. Verhoog de concentratie van Y-27632 toegevoegd aan hiPSC van 10 μM naar 50 μM (een dag voor het starten van de differentiatie).
      2. Verhoog 1,5 ml per putje van het dissociatiereagens en ook het volume van DMEM/F12 tot dezelfde hoeveelheid per put als het dissociatiereagens. Voeg 1 ml DMEM/F12 (van de 1,5) toe aan elk putje en een extra 0,5 ml wordt opgehoopt in een buis van 15 of 50 ml.
  2. Differentiatie van DE-cellen in PFG-cellen (D-4 tot D-10; Figuur 1C)
    1. Bereid PFG-medium (Advanced DMEM/F12 als basaal medium, 1x Glutamax-supplement, 1x B27-supplement, 20 ng/ml BMP4, 10 ng/ml FGF2) voor de differentiatie van DE-cellen dagen voor de inductie in PFG en bewaar het bij 4 °C.
      OPMERKING: B27 bevat T3 als onderdeel van de samenstelling. In het geval van schildklierhormoonstudies (TH) moet vanaf nu B27 worden vervangen door zelfgemaakte B2615 die geen TH bevat.
    2. Verwarm het PFG-medium (2 ml per putje) en geavanceerde DMEM/F12 gedurende 37 °C gedurende 15 minuten of RT gedurende 1 uur. Buig over de plaat en zuig het DE-medium uit de putjes op met een glazen pipet die is aangesloten op een vacuüm (of handmatig met een P1000-pipet) zonder de cellen te krassen.
    3. Voeg 2 ml warme geavanceerde DMEM/F12 per putje toe en zuig het vervolgens op. Voeg 2 ml warm PFG-medium per putje toe aan de plaat met 6 putjes. Verander het medium de komende 6 dagen dagelijks.
  3. Inductie van 2D PFG-cellen naar 3D onrijpe leverorganoïden (IHO's; D-10 tot D-18)
    OPMERKING: Er zijn bijna 30.000-35.000 cellen nodig in 30 μL die wordt toegevoegd aan elk putje van de ULA-plaat met 96 putjes. De passageverhouding is 2:1, uit 2 putjes (plaat met 6 putjes) met een monolaag van gedifferentieerde PFG-cellen; het zorgt voor een volledige 96-well ultra-low attachment (ULA) plaat (Figuur 1D).
    1. Voordat u met de 3D-organoïden begint of eerder, moet u vooraf het IHO-medium (Advanced DMEM/F12 als basaal medium, 1x N2-supplement, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 5 μM CHIR99021, 500 nM valproïnezuur, 50 ng/ml humane epidermale groeifactor (EGF), 20 ng/ml menselijke hepatocytgroeifactor (HGF), 40 ng/ml Jagged-1, 300 ng/ml N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclisch 35 monofosfaat natriumzout (dbCAMP), 10 μM Nicotinamide) en bewaar het bij 4 °C.
    2. Label een plaat met 96 putjes voor ultra-lage bevestigingen (ULA). Gebruik voor het losmaken van de PFG-cellen het celdissociatie-enzym volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Verwarm het dissociatie-enzym, geavanceerde DMEM/F12 en PBS voor gebruik bij 37 °C. Zuig het PFG-medium van de putten op en gooi het weg. Voeg 2 ml PBS per putje toe en zuig het vervolgens op.
    4. Voeg 1,5 ml celdissociatie-enzym toe per putje bij 37 °C gedurende 7 minuten om de cellen los te maken van het putje. Zonder het celdissociatie-enzym te verwijderen, voegt u 1 ml geavanceerde DMEM toe. Verzamel alle cellen en voeg ze toe aan een tube van 50 ml.
    5. Tel het aantal cellen per ml met een cellenteller of een hemocytometer. Centrifugeer op 150 x g gedurende 8 min.
    6. Voeg aan de pellet het juiste volume toe (3 ml IHO-medium voor een volledige ULA-plaat met 96 putjes) en 1x extracellulaire matrixgel om aan te passen aan het uiteindelijke aantal benodigde cellen (30.000-35.000 cellen).
    7. Plaats de plaat met 96 putjes in een broedmachine met een temperatuur van 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Na 24 uur (D-11) zullen cellen zich hergroeperen in een cirkelvormige vorm; voeg 50 μL per putje van het IHO-medium toe.
    8. Verhoog de volgende dag (D-12) tot 100 μL IHO-medium per putje. Verwijder bij D14 ~100-120 μL uit elk putje met de glazen pipet aangesloten op een vacuüm of met een pipet één voor één. Zorg ervoor dat u de organoïden niet aanzuigt. Voeg 100 μL IHO-medium toe op D-14 en D-16.
      OPMERKING: Na D-16, omdat het niet in beweging wordt gebracht, verschijnt overmatige groei die na D18 verdwijnt.
  4. Hepatoblast-organoïden (HBO's, D-18 tot D-26)
    OPMERKING: In deze stap worden IHO's van de ULA-plaat met 96 putjes verplaatst naar een ULA-plaat met 6 putjes. Voor 96 IHO's uit de vorige fase werden 10 organoïden per putje geplaatst, wat neerkomt op een totaal van 1 en 1/2 6-well ULA-platen om door te gaan met de rijping (Figuur 1E).
    1. Zoals gedaan in de vorige stappen van differentiatie, bereidt u het differentiatiemedium van de HBO in de voorgaande dagen voor.
      1. De cocktail van reagentia die worden gebruikt om te differentiëren in HBO's wordt beschreven in stap 2.3. Verwijder valproïnezuur en voeg de volgende biochemicaliën toe aan de cocktail: BMP7, BMP4 en FGF7. De uiteindelijke samenstelling is Advanced DMEM/F12 als basaal medium, 1x N2-supplement, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 5 μM CHIR99021, 500 nM valproïnezuur, 50 ng/ml menselijke epidermale groeifactor (EGF), 20 ng/ml menselijke hepatocytgroeifactor (HGF), 40 ng/ml Jagged-1, 300 ng/ml N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclisch 35 monofosfaat natriumzout (dbCAMP), 10 μM Nicotinamide, 25 ng/ml FGF7, 50 ng/ml BMP4, 20 ng/ml BMP7.
    2. Verwarm voorheen HBO medium (3 ml per putje) en Advanced DMEM/F12 (3 ml per putje) bij 37 °C. Voeg 3 ml warme geavanceerde DMEM/F12 toe aan elk putje.
    3. Verdeel 10 IHO-organoïden per putje vanaf de plaat met 96 putjes met een 200 ml brede boring. Verwijder de geavanceerde DMEM/F12 door over de plaat te buigen en deze op te zuigen met de glazen pipet aangesloten op het vacuüm (of handmatig met een P1000).
    4. Voeg 3 ml warm HBO-medium toe per putje. Zet de ULA-platen met 6 putjes aan en plaats ze op een schudder met meerdere platforms bij 65 tpm in de broedmachine, ingesteld op 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid. Vervang na 4 dagen (D-22) en 6 dagen (D-24) het HBO-medium (3 ml per putje).
  5. Rijping tot leverorganoïden (HO) via 2 verschillende fasen (D-26 tot D-46)
    OPMERKING: Dit is het laatste rijpingsproces dat plaatsvindt in twee perioden van differentiatie vanwege de inhoud en het type reagentia in het medium.
    1. Bereid van tevoren de eerste van de HO (HO1) medium voor en bewaar deze bij 4 °C. Verwijder Jagged1 en verlaag de concentratie van CHIR99021 in vergelijking met het HBO-medium. De uiteindelijke samenstelling is: Geavanceerd DMEM/F12 als basaal medium, 1x N2 supplement, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 2 μM CHIR99021, 50 ng/ml humane epidermale groeifactor (EGF), 20 ng/ml humane hepatocytgroeifactor (HGF), 300 ng/ml N-6,20-O-dibutyryladenosine 30,50-cyclisch 35 monofosfaat natriumzout (dbCAMP), 10 μM Nicotinamide, 25 ng/ml FGF7, 20 ng/ml BMP4, 20 ng/ml BMP7.
    2. Verwarm Advanced DMEM/F12 en HO1 medium voor gebruik bij 37 °C. Zuig in dezelfde ULA-plaat met 6 putjes het vorige HBO-medium voorzichtig op door over de plaat te buigen en de punt van de glazen pipet die is aangesloten op een vacuüm tegen de muur te plaatsen (of handmatig met een P1000-pipet).
    3. Voeg 3 ml warme Advanced DMEM/F12 toe per putje en zuig het op. Voeg 3 ml warm HO1 medium toe per putje. Vervang het HO1-medium elke 3 dagen (D-29, D-32, D-35, D-38) samen met het afnemen van monsters.
    4. Wijzig bij D 38 de cocktail van reagentia voor de tweede periode van HO (HO2) door CHIR99021, BMP4, dbcAMP en FGF7 te verwijderen en te vervangen door FGF19 en DAPT. De uiteindelijke mediumsamenstelling is Advanced DMEM/F12 als basaal medium, 1x N2-supplement, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM dexamethason, 50 ng/ml menselijke epidermale groeifactor (EGF), 20 ng/ml menselijke hepatocytgroeifactor (HGF), 10 μM nicotinamide, 20 ng/ml BMP7, 25 ng/ml FGF19, 5 μM DAPT.
    5. Verwarm Advanced DMEM/F12 en HO2 medium bij 37 °C voor gebruik. Ga verder met de ULA-plaat met 6 putjes en zuig het vorige HO1-medium voorzichtig op. Voeg 3 ml Advanced DMEM/F12 toe per putje en verwijder het.
    6. Voeg 3 ml warm HO2-medium toe per putje. Vervang het HO2-medium om de 4 dagen (D-42, D-46, D-50, ...) en neem monsters op dezelfde dagen als het medium wordt vervangen.

3. Dissociatie van één cel

OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de single-cell RNA-sequencingtechniek. Het aantal organoïden kan variëren afhankelijk van de grootte, en hoe ouder de dag van dissociatie, hoe groter de hoeveelheid cellen in de organoïden. Vroeger nam het aantal gedissocieerde organoïden toe en werden de dissociatietijden met gelijke hoeveelheden korter. Dissociatie werd uitgevoerd met 10 organoïden op D-14 en D-17, 8 organoïden op D-23 en D-26 en 6 organoïden op D-30 en D-45. De procedures voor één cluster van organoïden zijn gedetailleerd (Figuur 1F).

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid Advanced-DMEM met een eindconcentratie van 7,5% Bovine Albumine Fraction V (BSA) en filtreer na homogenisatie.
    2. Bereid 1 ml van het dissociatie-enzymmedium voor met 1 ml trypsine 0,5% - EDTA (10x) als basaal medium, 50 μM Y-27632, 40 E/μL RNaseremmer en 1 U/μL DNase I.
    3. Bereid het trypsine-inactiveringsmedium voor met 2 ml Advanced DMEM/F12 + 7,5% BSA als basaal medium, 50 μM Y-27632, 40 E/μL RNaseremmer en 1 E/μL DNase I.
    4. Verwarm zowel media als PBS op 37 °C voordat u begint.
  2. Dissociatie van HHO's
    1. Reinig de werkplek en het gereedschap met RNase cleaner. Verzamel het aantal organoïden volgens de dag van differentiatie in een polypropyleen buis van 15 ml met een wijd open punt.
    2. Wassen met PBS 2x-3x. Voeg 1 ml dissociatie-enzymmedium toe aan de buis van 15 ml met verzamelde organoïden en houd deze 5 minuten op 37 °C in een tuimelschakelaar bij 30 tpm.
      LET OP: Pas op dat u de buis niet van de tuimelschakelaar laat vallen.
    3. Controleer na 5 min eerst de dop op eventuele resterende organoïden, om vervolgens met een P1000 de organoïden mechanisch te verstoren door 10x per organoïde op en neer te draaien (60 keer in totaal). Herhaal dezelfde storing met een P200. Controleer de dop van de buis voor het geval de organoïden erop blijven plakken.
    4. Plaats de buis van 15 ml opnieuw op de wip in de broedmachine voor nog eens 5 minuten. Herhaal het proces van punt 4, te beginnen met het op en neer draaien van een P200 en verder met een serologische pipet van 1 ml die is aangesloten op een P10-tip.
    5. Plaats de tube van 15 ml de laatste 5 minuten weer op de wip in de broedmachine. Als er geen dissociatie is, laat het dan nog 5 minuten staan en herhaal de handmatige onderbreking.
    6. Voeg 1 ml trypsine-inactiveringsmedium toe en homogeniseer het. Plaats een nieuwe polypropyleen buis van 15 ml met een celzeef van 40 μm erop. Filtreer de 2 ml (cellen met het dissociatie-enzymmedium en het trypsine-inactiveringsmedium) door een celzeef van 40 μm in de buis van 15 ml.
    7. Voeg nog eens 1 ml trypsine-inactiveringsmedium toe om de resterende cellen uit de 40 μm celzeef te herstellen.
    8. Neem 5 μL eencellig medium gemengd met 5 μL van een kleurstofoplossing om het aantal gedissocieerde cellen te tellen dat verder moet gaan met hun fixatie. Tel de cellen na centrifugatie en resuspensie met het eerste reagens van de fixatiekit en voer de celfiltratie uit met behulp van een celzeef van 40 μm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Elke fase van dit protocol van stapsgewijze differentiatie van hiPSC naar HHO's werd gedefinieerd met behulp van kwantitatieve metingen door qPCR en immunofluorescentie van stadiumspecifieke bekende markers uit de bibliografie (Figuur 2). De stap-voor-stap van beide technieken en de behaalde resultaten met betrekking tot de juiste differentiatie in HO's werden weergegeven in14. In het vorige onderzoek werden hiPSC's gedefinieerd aan d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol biedt verschillende methodologische details over hoe om te gaan met hiPSC's en de daaropvolgende 3D-organoïde culturen. Dit omvat de twee belangrijkste kritieke stappen: (i) het losmaken van de 2D-culturen en vervolgens hun ontwikkeling tot 3D-leverorganoïden na 10 dagen, evenals (ii) de delicate dissociatie van een 3D-structuur in afzonderlijke cellen. Op basis van de beschikbare informatie is dit het eerste rapport van een 3D HHO-model om de werking van schildklier...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Antonio C. Bianco is consultant voor Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics. De andere auteurs hebben geen relevante onthullingen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6462Alle procedures
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6470Alle procedures
15 mL Polypropilene Conical TubeFalcon (Corning)352097Dissociatie Hepatische Organoïden
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6465Alle procedures
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigmaT2877-100Hepatische Organoïde differentiatie
40 μm Cell Strainer Corning431750Dissociatie Hepatische Organoïden
50 mL tube Falcon (Corning)352070Alle procedures
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated MultidishesThermo fisher scientific140675hiPSC-onderhoud
A83-01 R&D Systems2939/10Hepatische Organoïde differentiatie
Advanced DMEM/F12Gibco12634010Hepatische Organoïde differentiatie
ART Wide Bore Filtered Pipette TipsART2069GPKAlle procedures
B27 supplement Gibco17504044Hepatische Organoïde differentiatie
BMP7 R&D Systems354-BP-010/CFHepatische Organoïde differentiatie
Bovine Albumin Fraction V (7,5% oplossing) Gibco15260037Dissociatie Hepatische Organoïden
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free voor weefselkweekGoldBioA-421-100Dissociatie Hepatische Organoïden
CHIR99021R&D Systems4423/10Hepatische Organoïde differentiatie
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3474Hepatische Organoïde differentiatie
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Corning3471Hepatische Organoïde differentiatie
CS03iCTR-n3 menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel lijnCedar-sinaihiPSC-onderhoud
DAPTR&D Systems2634/10Hepatische Organoïde differentiatie
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MGHepatische Organoïde differentiatie
DexamethasoneR&D Systems1126/100Hepatische Organoïde differentiatie
DMEM/F12Gibco11320033hiPSC-onderhoud
DNAse I, RNase-vrij, HCThermo Fisher scientificEN0523Dissociatie Hepatische Organoïden
Falcon 10 mL Serologische Pipet, Polystyreen, 0,1 Incrementen, Individueel verpakt, sterieleCorning357551Alle procedures
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyreen, 0,1 Incrementen, Individueel verpakt, sterieleCorning357543Alle procedures
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyreen, 1,0 Incrementen, Individueel verpakt, sterieleCorning357550Alle procedures
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)Stemcell Technologies100-0485Hepatische Organoïde differentiatie
Glutamax supplementGibco35050061Hepatische Organoïde differentiatie
L-ThyroxineSigmaT1775-1GHepatische Organoïde differentiatie
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-vrij, 5 mLCorning354277Extracellulair matrixgel
mFreSRStemcell Technologies5855hiPSC-cryopreserveringsmedium
mTeSR 5x Supplement Stemcell Technologies100-0276hiPSC-medium
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276hiPSC-medium
Multi Platform Shaker Fisherbrand (Thermo Fisher technologies)88861021Hepatische Organoïde differentiatie
N2 supplement Gibco17502048Hepatische Organoïde differentiatie
Nicotinamide R&D Systems4106/50Hepatische Organoïde differentiatie
PBS, pH 7,4Gibco10010023hiPSC-onderhoud
Recombinant human BMP4  R&D Systems314-BP-010/CFHepatische Organoïde differentiatie
Recombinant human EGFR&D Systems236-EG-200Hepatische Organoïde differentiatie
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGFR&D Systems233-FB-010/CFHepatische Organoïde differentiatie
Recombinant human FGF19R&D Systems959-FG-025/CFHepatische Organoïde differentiatie
Recombinant human HGFR&D Systems294-HG-005/CFHepatische Organoïde differentiatie
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera R&D Systems1277-JG-050Hepatische Organoïde differentiatie
Recombinant human KGF/FGF7R&D Systems251-KG-010/CFHepatische Organoïde differentiatie
ReLeSRStemcell Technologies100-0483hiPSC-losmedium
RNAse Inhibitor Ambion, gekloond, 40 U//μLInvitrogenAM2682Dissociatie Hepatische Organoïden
RNase ZapInvitrogenAM9780Dissociatie Hepatische Organoïden
Sorvall  Legend XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004539Alle procedures
STEMdiff Definitive Endoderm Kit

Referenties

  1. Peiseler, M., et al. Immune mechanisms linking metabolic injury to inflammation and fibrosis in fatty liver disease - novel insights into cellular communication circuits. J Hepatol. 77 (4), 1136-1160 (2022).
  2. Gordillo, M., Evans, T., Gouon-Evans, V. Orchestrating liver development. Development. 142 (12), 2094-2108 (2015).
  3. Lemaigre, F. P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies. Gastroenterology. 137 (1), 62-79 (2009).
  4. He, C., et al. Liver organoids, novel and promising modalities for exploring and repairing liver injury. Stem Cell Rev Rep. 19 (2), 345-357 (2023).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  6. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. J Hepatol. 70 (6), 1145-1158 (2019).
  9. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846.e10 (2021).
  10. Ouchi, R., et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 30 (2), 374-384.e6 (2019).
  11. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486.e12 (2020).
  12. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  13. Ang, L. T., et al. A roadmap for human liver differentiation from pluripotent stem cells. Cell Rep. 22 (8), 2190-2205 (2018).
  14. Hidalgo-Álvarez, J., Salas-Lucia, F., Vera Cruz, D., Fonseca, T. L., Bianco, A. C. Localized T3 production modifies the transcriptome and promotes the hepatocyte-like lineage in iPSC-derived hepatic organoids. JCI Insight. 8 (23), e173780(2023).
  15. B27 Supplement. , Hanna Lab Protocol – Weizmann Institute of Science. https://www.weizmann.ac.il/molgen/hanna/sites/molgen.hanna/files/users/user52/HANNA-LAB-B22-B27-PROTOCOL-V3.pdf (2016).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Zhu, X., Sun, J. CircHIPK3 regulates melanoma cell behaviors by binding with miR-215-5p to upregulate YY1. Mol Cell Probes. 53, 101644(2020).
  18. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  19. Walesky, C., Apte, U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 16 (3), 101-108 (2015).
  20. Fonseca, T. L., et al. Hepatic inactivation of the type 2 deiodinase confers resistance to alcoholic liver steatosis. Alcohol Clin Exp Res. 43 (7), 1376-1383 (2019).
  21. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  22. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387(2021).
  23. Arceneaux, D., et al. A contamination focused approach for optimizing the single-cell RNA-seq experiment. iScience. 26 (7), 107242(2023).
  24. Matsumoto, K., Nakamura, T. Hepatocyte growth factor: molecular structure and implications for a central role in liver regeneration. J Gastroenterol Hepatol. 6 (5), 509-519 (1991).
  25. Kimura, M., Moteki, H., Ogihara, M. Role of hepatocyte growth regulators in liver regeneration. Cells. 12 (2), 208(2023).
  26. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Luo, J. HGF-, EGF-, and dexamethasone-induced gene expression patterns during formation of tissue in hepatic organoid cultures. Gene Expr. 11 (2), 55-75 (2003).
  27. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel). 10 (2), 131(2023).
  28. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. J Hepatol. 62 (3), 581-589 (2015).
  29. Blohm, M. E., Vesterling-Hörner, D., Calaminus, G., Göbel, U. Alpha 1-fetoprotein (AFP) reference values in infants up to 2 years of age. Pediatr Hematol Oncol. 15 (2), 135-142 (1998).
  30. Liu, Q., Zeng, A., Liu, Z., Wu, C., Song, L. Liver organoids: From fabrication to application in liver diseases. Front Physiol. 13, 956244(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

iPSC-differentiatie3D-celkweekmenselijke leverorganoïdenhepatoblast-differentiatiesingle-cell RNA-sequencingimmunofluorescentieanalysekwantitatieve RT-PCRmodellering van leverziektenschildklierhormoonsignalering

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.