Methodenartikel

Een geïntegreerde methode voor het maken van flexibele en handige elektrofysiologische optrodes voor in-vivo-opname in meerdere regio's

DOI:

10.3791/67071

⸱

21 november 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een vereenvoudigde en kosteneffectieve aanpak ontwikkeld voor de fabricage van elektroden en hebben opnames gemaakt van signalen in meerdere regio's bij vrij bewegende muizen. Door gebruik te maken van optogenetica, naast elektrofysiologie in meerdere regio's en registratie van calciumsignalen, kon de onthulling van neuronale activiteiten in verschillende regio's in het aanvalsaanmaakmodel worden vastgesteld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epilepsie is een neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door gesynchroniseerde abnormale ontladingen waarbij meerdere hersengebieden betrokken zijn. Focale laesies vergemakkelijken de verspreiding van epileptische signalen via geassocieerde neurale circuits. Daarom is in vivo registratie van lokaal veldpotentiaal (LFP) van de kritieke hersengebieden essentieel voor het ontcijferen van de circuits die betrokken zijn bij de voortplanting van aanvallen. De huidige methoden voor de fabricage en implantatie van elektroden zijn echter niet flexibel. Hier presenteren we een handig apparaat dat is ontworpen voor elektrofysiologische opnames (LFP's en elektro-encefalografie [EEG]) in meerdere regio's. Bovendien hebben we optogenetische manipulatie en calciumsignaleringsregistratie naadloos geïntegreerd met LFP-registratie. Robuuste na-ontladingen werden waargenomen in verschillende afzonderlijke regio's tijdens epileptische aanvallen, vergezeld van een toenemende calciumsignalering. De aanpak die in deze studie wordt gebruikt, biedt een handige en flexibele strategie voor synchrone neurale opnames in verschillende delen van de hersenen. Het heeft het potentieel om onderzoek naar neurologische aandoeningen te bevorderen door inzicht te geven in de neurale profielen van meerdere regio's die bij deze aandoeningen betrokken zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epilepsie is een veel voorkomende neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door terugkerende aanvallen, die zich manifesteren als convulsies, sensorische stoornissenen bewustzijnsverlies. De pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan epilepsie zijn complex en omvatten meerdere onderling verbonden hersengebieden 2,3. Recente ontwikkelingen op het gebied van neuroimaging hebben licht geworpen op de grootschalige netwerken die betrokken zijn bij epilepsie 4,5. Het begrip van de ingewikkelde circuits en netwerkmechanismen die ten grondslag liggen aan het ontstaan en de verspreiding van epilepsie blijft echter beperkt, deels als gevolg van de ontoereikende toepassing van neuraleopnametechnieken in meerdere regio's. Daarom is het absoluut noodzakelijk om een flexibele, geïntegreerde methode te ontwikkelen die in staat is om tegelijkertijd neurale activiteit in ongelijksoortige hersengebieden te monitoren.

Elektrofysiologische opnames worden uitgevoerd om aanvallen vast te leggen en de aanwezigheid van epilepsie vast te stellen7. Behalve voor het registreren van elektrofysiologische activiteit, wordt er in epilepsiestudies steeds meer nadruk gelegd op de precieze calciumactiviteit van specifieke neurale populaties 8,9. Vooruitgang in de synthese van calciumindicatoren en verschillende sondeontwerpen hebben onderzoekers ertoe aangezet om vezelfotometrie toe te passen voor het vastleggen van veranderingen in neuronale activiteit en neurale stoffen in de hersenen10,11. De twee onafhankelijke methoden voor het detecteren van neuronale activiteit, namelijk elektrofysiologie en vezelfotometrieregistratie, vullen elkaar aan en vergemakkelijken een beter begrip van dynamische neuronale processen.

Bovendien zijn synchrone registratie en modulerende neurale activiteit cruciaal voor het verkrijgen van inzicht in het functioneren van de hersenen op zowel netwerk- als cellulair niveau. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om de complexe processen van de hersenen in realtime te observeren en te manipuleren. Optogenetica is naar voren gekomen als een onmisbaar hulpmiddel voor het onderzoeken van neurale signalering, vanwege het onderscheidende vermogen voor selectieve stimulatie of remming12. Ondanks wijdverbreide toepassingen van elektrofysiologische opname op meerdere locaties in de neurowetenschappen13, blijft de integratie van elektrofysiologische registratie in meerdere regio's met vezelfotometrie en optogenetische manipulatie beperkt. Wat nog belangrijker is, is dat de huidige methoden voor het fabriceren en implanteren van elektroden met meerdere regio's niet flexibel zijn14. Deze beperkingen belemmeren ons vermogen om specifieke circuitfuncties en interacties in meerdere regio's te ontleden. Hier presenteren we een kosteneffectieve en handige multi-regio in vivo opnamebenadering die licht werpt op neuronale processen in verschillende regio's bij door aanmaakvorming geïnduceerde aanvallen en andere neuropsychiatrische stoornissen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Fudan University en werd uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften die zijn opgesteld door de National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Alle mogelijke maatregelen werden geïmplementeerd om het aantal dieren dat in dit onderzoek werd gebruikt tot een minimum te beperken. De tijd die nodig is om elke stap uit te voeren, is opgenomen in de respectievelijke stappen.

1. Voorbereiding van de elektroden (Figuur 1)

  1. Knip een geschikte lengte wolfraamdraad af (~20 mm) en brand de isolatielaag aan het ene uiteinde af om de wolfraamdraad bloot te leggen (1,6-2 mm). Buig het andere uiteinde van de draad in een "L"-vorm (zie figuur 1A, ~1 min)
  2. Plaats het "L"-uiteinde van de wolfraamdraad voorzichtig op de optische vezel (zie afbeelding 1B, ~1 min).
    NOTITIE: De wolfraamdraad moet 0.2-0.4 mm langer zijn dan de punt van optische vezel.
  3. Doop een druppel lijm en breng deze aan op het grensvlak van de optische vezel en de wolfraamdraad (zie figuur 1C, ~1 min). Door de oppervlaktespanning van de vloeistof zal de wolfraamdraad zich hechten aan de optische vezel.
  4. Breng de lijm één keer aan en laat deze drogen. Breng vervolgens een tweede laag aan. Dit zal de verbinding tussen de wolfraamdraad en de optische vezel verder aanspannen (zie figuur 1C, ~1 min).
    NOTITIE: Tijdens het applicatieproces moet ervoor worden gezorgd dat de lijm niet naar de punt van de optische vezel stroomt, omdat dit de doorlaatbaarheid kan beïnvloeden.
  5. Gebruik lijm op de hoek van de "L"-vorm om de basis van de optische vezel en de wolfraamdraad nauw aan elkaar te hechten (~1 min).
    OPMERKING: Het grotere contactoppervlak en de sferische stolling van de lijmdruppel zorgen voor een stevige hechting tussen de optische vezel en de wolfraamdraad.
  6. Gebruik solderen om een verbinding tot stand te brengen tussen de wolfraamdraad en de pin van de vrouwelijke connector (zie afbeelding 1D, ~3 min voor elk)
    OPMERKING: Aangezien wolfraamdraad niet gevoelig is voor warmte, kan het slagingspercentage van het solderen tot bijna 100% worden verhoogd door een metalen huls die wordt gevormd door de locatie van de pinsleuf door te snijden om de twee componenten fysiek te verenigen. Vervolgens zorgt soldeervulling van de huls voor een stabiele verbinding tussen de ingebrachte wolfraamdraad en de pen.
  7. Soldeer volgens het experimentele ontwerp het vereiste aantal optrodes (zie figuur 1E, ~10 min)
    OPMERKING: In dit onderzoek werden drie optrodes gebruikt.
  8. Knip de geëmailleerde draad op de juiste lengte (~30 mm) en brand de isolatie aan beide uiteinden af. Wikkel het ene uiteinde van de geëmailleerde draad om de basis van de schroef en soldeer deze. Sluit het andere uiteinde van de geëmailleerde draad aan op de pinnen van de vrouwelijke connector via een soldeerbout, die dient als EEG-opname en massaverbinding voor de schedelelektrode (zie afbeelding 1F, ~5 min)
    OPMERKING: Door de flexibiliteit van de geëmailleerde draad is het handig om de schedel en de pinnen van de vrouwelijke connector aan te sluiten. Solderen na het wikkelen van de geëmailleerde draad om een schroef is betrouwbaarder dan solderen op het oppervlak.
  9. Breng smeltlijm aan op de pinarray van de vrouwelijke connector om de vrouwelijke connector in te kapselen en ervoor te zorgen dat de soldeerverbindingen volledig zijn omhuld. Vorm tijdens het stollen van de smeltlijm de lijm met behulp van een plastic plaat om de ruimtebeslag tijdens de implantatie te minimaliseren (zie afbeelding 1F, ~3 min)
    OPMERKING: Vanwege de mogelijke brandrisico's die gepaard gaan met het gebruik van smeltlijm, wordt AB-lijm als een veiliger alternatief beschouwd.
  10. Gebruik vervolgens een lichtintensiteitsmeter en een digitale multimeter om de helderheid en geleidbaarheid te meten. Na het doorstaan van deze tests is de opstelling klaar voor gebruik (zie figuur 1G, ~2 min)
    OPMERKING: Draag bij het werken met lasers altijd een veiligheidsbril die geschikt is voor de specifieke golflengte en kracht van het laserlicht. Hoogwaardige vezels zijn nodig om ten minste 80% van het licht van het uiteinde van het patchkoord naar de punt van de implanteerbare vezel door te laten. Bovendien werd de weerstand van de punt van de wolfraamdraad tot de sleuf van de pin-header gemeten met een acceptabel bereik van 1-5 Ω.
  11. Dompel de voorbereide elektroden voor gebruik 15 minuten onder in 75% alcohol en breng ze vervolgens over naar een steriele zoutoplossing (~16 min).
    OPMERKING: Het totale gewicht van het ingekapselde elektrodeapparaat (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) heeft geen invloed op de activiteit van de muizen. De elektroden worden vooraf gesteriliseerd met behulp van plasmasterilisatie.

2. Protocol voor elektrode-implantatie (Figuur 2)

  1. Verdoof de muizen met isofluraan (2%-4%) en zet ze vast in een stereotaxisch apparaat (zie figuur 2A, ~2 min). Gebruik oogzalf op de ogen van muizen om uitdroging onder narcose te voorkomen. Breng lidocaïne aan op de huid rond de omtrek van de schedelincisie en een subcutane injectie van carprofen in een dosis van 5 mg/kg.
    OPMERKING: Een goede verdoving wordt bevestigd door de afwezigheid van de oprichtreflex en het verlies van de reactie op het knijpen van de teen. Voor langdurige chirurgische ingrepen is het gebruik van een injecteerbare verdoving geschikter.
  2. Nadat u het dier in het stereotaxische apparaat hebt vastgezet, snijdt u de hoofdhuid langs de rand van de schedel weg en veegt u het schedeloppervlak af met 75% alcohol om de posities van de bregma en lambda bloot te leggen (zie figuur 2B, ~3 min).
    OPMERKING: De pre-operatieve procedure omvat het knippen van het haar, het desinfecteren van de operatieplaats, het voorsteriliseren van de instrumenten en chirurgische instrumenten.
  3. Zet de hersenen waterpas en boor gaten (~0,8 mm) boven de interessegebieden (ROI) met behulp van een microboor. Injecteer de relevante virussen met een spuitpomp (zie figuur 2C - F, ~20 min).
    OPMERKING: Gedetailleerde informatie over de virussen en ROI's in dit onderzoek wordt weergegeven in de materiaaltabel en figuur 3.
  4. Houd de optrodes vast met een houder en beweeg hun punt naar het bregmapunt, waarbij u deze positie op 'nul' instelt. Gebruik het bregmapunt als referentiecoördinaat en verplaats de optrodes naar de doelgebieden (zie figuur 2G, ~3 min). Plaats de optroden 0,3 mm boven de injectieplaats van het virus.
    OPMERKING: Bij de verticale implantatiestrategie is de minimale afstand tussen de twee elektroden ongeveer 2 mm, afhankelijk van de dikte van de glasvezelhuls en de buitendiameter van de huls. Een schuine invoegmethode kan worden gebruikt voor gelijktijdige opname vanuit dichtbij gelegen regio's.
  5. Nadat u de optische vezels in de overeenkomstige hersengebieden hebt ingebracht, brengt u een kleine hoeveelheid weefsellijm eromheen aan om het blootgestelde weefsel te bedekken. Breng vervolgens achtereenvolgens extra lijm en een beetje tandheelkundig cement aan. Nadat het tandcement is gestold, laat u de houder voorzichtig los (zie figuur 2H, ~5 min).
  6. Voer vóór elke nieuwe implantatie van de optrode een herkalibratie uit, waarbij stap 2.4 wordt herhaald (zie figuur 2I).
    OPMERKING: Plaats voor elke implantatie de optrode op bregma als het 'nulpunt'.
  7. Nadat alle optroden zijn geïmplanteerd, boort u met een microboor de gaten achter het lambdapunt voor 'Ground' en boven de neocortex voor 'EEG' (~1 min).
    NOTITIE: De grootte van het geboorde gat (~1.1 mm) moet overeenkomen met de diameter van de schroef.
  8. Steek schedelschroeven in het gat boven de cortex en achter het lambdapunt (zie figuur 2J, ~5 min).
    NOTITIE: Schedelschroeven worden respectievelijk gebruikt voor EEG-opname en aarding.
  9. Organiseer de wolfraamdraden en geëmailleerde draden zo dat ze boven het implantatiegebied worden geplaatst en niet buiten de schedel worden blootgesteld. Zet de positie van de vrouwelijke connector vast met behulp van een houder (zie figuur 2K, ~2 min).
  10. Vul de implantatieplaats met tandheelkundig cement om een stabiele verbinding tussen het elektrodeapparaat en de schedel te garanderen. Kapsel de interne draden in en laat de insteekgaten van de vrouwelijke connector bloot voor aansluiting op de hoofdtrap (zie afbeelding 2L, ~6 min).
  11. Breng na het uitharden van tandcement jodium aan op de huid rond de omtrek van de blootgestelde hoofdhuid en plaats het dier vervolgens op een verwarmingskussen (~1 min).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier niet onbeheerd wordt achtergelaten totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om sterns te blijven liggen. Steriele omstandigheden moeten tijdens de overlevingsoperatie worden gehandhaafd.
  12. Dien antibiotica en pijnstillers toe om het herstel na de operatie te ondersteunen.
    OPMERKING: Dieren die een operatie hebben ondergaan, worden pas opnieuw geïntroduceerd in het gezelschap van andere dieren als ze volledig zijn hersteld. Dieren kregen intraperitoneale injecties van ceftriaxonnatrium (180 mg/kg) en subcutane injecties met carprofen (5 mg/kg) en lidocaïnegel werd gedurende 3 dagen dagelijks op de chirurgische wonden aangebracht. De dieren moeten gedurende een bepaalde periode overleven om de gedragstests te voltooien. Vervolgens worden ze geëuthanaseerd met 4%-5% isofluraan, gevolgd door perfusie en weefselsecties om de virale infectie en de plaatsen van elektrode-implantatie te beoordelen.

3. Protocol voor het opnemen in vivo van de hersenen

  1. Voordat u signaalregistratie en gedragstests (open veldtest)15 uitvoert, moet u ervoor zorgen dat de muis een periode van 3 dagen van voorzichtige behandeling ondergaat om hem aan de omgeving te laten wennen.
    OPMERKING: In deze studie werden de muizen in een open veld (42 cm × 42 cm) geplaatst om vrij te kunnen bewegen, zodat we hun aanvalsgedrag konden observeren.
  2. Na het verdoven van de muizen met isofluraan (2%-4%), sluit u de optische vezels achtereenvolgens aan in de volgorde van de opnameplaats voordat u de headstage inbrengt.
  3. Stel de lichtpuls van 635 nm in met een inschakelduur van 10% op 20 Hz. Stel de lichtstimulatie in op 10 s (200 pulsen) tijdens het opnemen. Stel de intensiteit bij de glasvezeltips in op 3 mW.
  4. Gebruik een glasvezelfotometriesysteem om de gedragstestperiode van Gcamp6m-signalen vast te leggen met een bemonsteringsfrequentie van 30 Hz door een LED-kanaal van 470 nm.
  5. Registreer tegelijkertijd calciumsignalen, LFP's en EEG onder optogenetische stimulatie, samen met bijbehorende gedragsprestaties (zie figuur 3).
  6. Gebruik transistor-transistor logic (TTL) signaalsynchronisatietagging om tijdelijke consistentie in opgenomen gegevens te garanderen.

4. Gegevensverwerking

  1. Laad fotometriegegevens in MATLAB-software. Gebruik vervolgens aangepaste codering (aanvullend bestand 1) om het calciumsignaal te detrenden.
  2. Definieer de veranderingen in fluorescentie-intensiteit met vergelijking (1):
    ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
    Waarbij Ft de real-time fluorescentiewaarden van het calciumsignaal vertegenwoordigt en F0 de gemiddelde basislijnfluorescentie-intensiteit vóór de gebeurtenis aangeeft.
  3. Importeer de elektrofysiologische gegevens, bemonsterde snelheid van 1000 Hz, in MATLAB (aanvullend bestand 2).
  4. Coördineer de weergave van calciumsignalering en elektrofysiologische gegevens in lijn met gesynchroniseerde markers.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We combineerden optogenetica met multiregionale elektrofysiologische registratie en calciumbeeldvorming om neuronale activiteit in verschillende hersengebieden te observeren tijdens optogenetische aanvallen. Voor dit doel werd een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat ChrimsonR tot expressie brengt onder controle van de CaMKIIα-promotor (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)16 geïnjecteerd in een klassieke epileptogene plaats, de piriforme cortex (ROI 1)17, bij knaagdieren. Bovendien werd AAV-hsyn-Gcamp6m18 geïnjecteerd in drie regio's (ROI 1-3, zoals weergegeven in figuur 3A). Vervolgens werden op maat gemaakte optroden in deze regio's geïmplanteerd en werden EEG-elektroden in de contralaterale schedel geïmplanteerd (Figuur 3B).

ChrimsonR en Gcamp6m kwamen 4 weken later sterk tot expressie in de doelhersengebieden (Figuur 3C). Muizen vertoonden gegeneraliseerd aanvalsgedrag na een korte fotostimulatie van 10 seconden bij 20 Hz om ChrimsonR-positieve neuronen te activeren. We verzamelden de calciumactiviteiten en LFP-signalen van de ROI's in vrij bewegende muizen door gebruik te maken van gelijktijdige multi-vezel fotometrie en elektrofysiologietechnieken (Figuur 3D). Robuuste na-ontladingen, samen met opmerkelijke verhogingen van Ca2+ -activiteiten, werden in deze regio's opgewekt door korte optogenetische stimulatie (Figuur 3E). In het optostimulerende gebied werd een respons van 30 Hz waargenomen, geïnduceerd door de activering van optogenetische eiwitten via een blauwlicht-LED met een bemonsteringsfrequentie van 30 Hz. Er werd geen 50 Hz-interferentie via het elektriciteitsnet waargenomen in de opnamekanalen. Deze resultaten toonden de betrouwbare registratie aan van gesynchroniseerde elektrofysiologische en calciumsignaleringsresponsen in meerdere regio's onder optogenetische stimulatie.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch ontwerp van flexibele optrode. (A) Voorbereiding van de "L"-vormige wolfraamdraden en optische vezels. (B) De optische vezels en de wolfraamdraden werden op het plakband geplaatst. (C) De optische vezel en de wolfraamdraad waren met lijm aan elkaar geplakt. (D,E) De wolfraamdraden werden aan de connector gelast. (F) De schroeven werden aan de connector gelast en de connector werd ingekapseld met smeltlijm. (G) Er werden kwaliteitsinspecties uitgevoerd op de optrode-assemblage. G staat voor het gaatje voor de massa-elektrode; R staat voor een gaatje voor de referentie-elektrode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Workflow van implantatiechirurgie. (A) De muis werd vastgezet op een stereotaxisch apparaat. (B) De hoofdhuid werd verwijderd en de schedel werd voldoende blootgesteld. (C) De glazen injectieleiding was aangesloten op de pomp. (D) Het hoofd van de muis was in een horizontale positie gebracht. (E,F) Er werden gaten geboord en het virus werd geïnjecteerd. (G) De tegenstander werd door de houder vastgegrepen. (H) De optrode werd geïmplanteerd in een verwant gebied en vastgemaakt met tandheelkundig cement. (I) Het opnieuw afstellen van de nulpositie vóór elke implantatie. (J) EEG-elektroden werden geïmplanteerd na implantatie van de trode. G/R: de massa-elektrode en de referentie-elektrode zijn kortgesloten op de pinposities. (K) De draden waren op volgorde gerangschikt en de connector was vast. (L) Het elektrodeapparaat was omwikkeld en bevestigd met tandheelkundig cement. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: In vivo synchrone elektrofysiologische en calciumregistratie. (A) Experimenteel ontwerp voor virale injecties. (B) Experimenteel schema voor de implantatie van optrode. (C) Confocale beelden tonen virusexpressie in doelgebieden. Schaalbalk = 200 μm. (D) Schema van optogenetische stimulatie, synchrone elektrofysiologische en calciumopname in vrij bewegende toestand. (E) Representatieve sporen van calciumsignalen (boven), LFP (midden) signalen, EEG (onder) en overeenkomstige vermogensspectrogrammen. Rode lijn: 10 s licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Coderingsbestanden voor calciumsignaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Coderingsbestanden voor LFP-signaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gebruikten we een zelfgemaakt optrode-apparaat voor in vivo neurale signaalregistratie in meerdere regio's. De haalbaarheid van dit systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie, registratie van calciumsignalen en elektrofysiologische registratie is gevalideerd. De hierin beschreven methode voor het bereiden van elektroden is efficiënt en kosteneffectief. Volgens de experimentele opzet zouden we signalen van relevante hersengebieden kunnen registreren. De strategische opstelling van optrodes maakt de mogelijke extractie van overvloedige informatie uit meerdere regio's in de hersenen mogelijk. De integratie van multimodale detectieparadigma's biedt mogelijkheden om ingewikkelde neurale circuits te ontleden en de relaties tussen hersengebieden op te helderen.

In de representatieve gegevens van de huidige studie werden calciumsignalen en elektrofysiologische signalen van breedspectrumneuronen van het hele lokale hersengebied tegelijkertijd geregistreerd. In navolging van de vooruitgang in de technologie voor de constructie van transgene dieren19,20, maakt de combinatie van Cre-muizen en FlpO-muizen met het expressie-Gcamp-virus het mogelijk om neurale activiteit van specifieke neuronen te registreren. Daarom stelt deze methode ons in staat om de reacties van specifieke neuronen in verschillende hersengebieden te decoderen via deze geïntegreerde benaderingen. Bovendien zullen diverse analytische methoden nuttig zijn bij het analyseren van de elektrofysiologische en calciumsignalen die uit meerdere hersengebieden worden verzameld. Coherentieanalyse en causaliteitsanalyse van Granger kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om nieuwe theoretische communicatiekenmerken tussen verschillende hersengebieden te verkrijgen. Bovendien helpen ontwikkelingen in technieken voor het traceren van circuits bij het ontrafelen van de structurele verbindingen tussen hersengebieden24. Deze geïntegreerde technologieën verbeterden het begrip van de bijbehorende reacties in verschillende hersengebieden en brachten een revolutie teweeg in het begrip van verbinding en interactie in circuits en netwerken.

In deze studie hebben we optogenetische modellering van epilepsie gebruikt. Optogenetica biedt niet alleen een hogere temporele resolutie, maar ook een verbeterde celspecificiteit in vergelijking met elektrische stimulatie in het aanmaakmodel van epilepsie25,26. Bovendien maakt het de mogelijkheid om lichtafgifte en calciumregistratie uit te voeren via dezelfde optische vezel. De activiteitsdetecties in meerdere regio's en optogenetische modulaties zullen een aanvulling vormen op closed-loop epilepsie-interventiemethoden, waardoor regulerende interventies in meerdere hersengebieden mogelijk worden via remmende modulatie, waardoor de anti-epileptische effecten worden versterkt27,28. Het is ook belangrijk dat deze apparaten worden gecombineerd met andere bestaande neuromodulatietechnologieën voor de detectie en closed-loop interventie van chronische pijn29,30. Bovendien kan deze benadering zich uitstrekken tot andere neurologische aandoeningen zoals slaapstoornissen31 en de ziekte van Alzheimer, waarbij verschijnselen zoals oscillaties van 40 Hz en informatieverwerking na sensorische input opheldering vereisen via multi-regio in vivo opname32. Daarom zal het adept toepassen van deze veelzijdige benadering ons begrip van interacties tussen meerdere regio's verdiepen en waardevolle inzichten opleveren voor precisietherapieën bij verschillende ziekten.

Er zijn beperkingen in deze optrodedetectiemethode, die in toekomstig onderzoek kunnen worden verbeterd. Hoewel LFP-signalen gemakkelijk werden verkregen, bleef de detectie van spike-activiteiten een uitdaging met de huidige methode33. We streven ernaar om wolfraamdraad te vervangen door meerkanaals flexibele elektroden. De dikte van de vezel en de veiligheid van de lijmlijm moeten zorgvuldig worden overwogen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31871085), de Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1407300), het Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (2018SHZDZX01), ZJ Lab en Shanghai Center for Brain Science and Brain-Inspired Technology.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
8-32 adapterPlexonOp bestellingVerbind de vrouwelijke connector en headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherryTaitool BioscienceS0371-94 x 1012 VG/mL 
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitool BioscienceS0471-94 x 1012 VG/mL 
DAPISigma236276Titered 1:500
Tandheelkundig cementNew Century Dental430205
Elektrofysiologisch opnamesysteemPlexonOmniplex
Geëmailleerd draadN/AOp bestellingDiameter = 0.2 mm
Vrouwelijke connectorN/AOp bestelling1.25 mm pitch
LijmLoctite45282
LaserChangchun New IndustriesBH81563635 nm 
MATLABMathWorksR2021b
MicroboorRWD78001
Multichannel fiberfotometrieThinkerTechFPS-SS-MC-LED
Optische vezelXi'an BogaoL-200UMSelecteer de juiste vezellengte op basis van de diepte van de beoogde hersengebieden.
PFA-gecoate tungsteendraadA-M System795500Naakt 0.002"; Gecoat 0.0040"
VermogenmeterThorlabsPM100D
Stereotactisch frameRWD68807
Weefselkleefstof3M1469SB

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).">Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).
  2. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).">Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).">Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).">Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).">Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).
  6. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).">Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).
  7. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).">Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).">Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).
  9. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).">Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).">Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).">Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).">Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).
  13. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).">Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).
  14. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).">Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).">Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).">Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).">Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).
  18. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).">Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).">Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).">Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).">Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).">Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).">Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).
  24. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).">Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).">Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).
  26. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).">Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).
  27. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).">Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).
  28. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).">Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).
  29. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).">Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).">Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).">Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).
  32. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).">Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).">Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Electrophysiological OptrodesIn Vivo RecordingLocal Field PotentialMulti Region RecordingOptogenetic StimulationCalcium SignalingFiber PhotometryEEG RecordingNeural Circuit AnalysisEpilepsy Models

Gerelateerde artikelen