Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67072

⸱

2 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Campinas, 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS) Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Samenvatting

De DNA-schaderespons is een genetische informatiebeveiliging die cellen beschermt tegen het bestendigen van beschadigd DNA. De karakterisering van de eiwitten die in dit proces samenwerken, maakt de identificatie van alternatieve doelen voor therapeutische interventie bij verschillende ziekten mogelijk, zoals kanker, verouderingsgerelateerde ziekten en chronische ontstekingen. De Proximity Ligand Assay (PLA) is ontstaan als een hulpmiddel voor het schatten van de interactie tussen eiwitten en de ruimtelijke nabijheid tussen organellen of cellulaire structuren en maakt bijvoorbeeld de temporele lokalisatie en co-lokalisatieanalyse onder stressomstandigheden mogelijk. De methode is eenvoudig omdat het vergelijkbaar is met conventionele immunofluorescentie en tegelijkertijd de kleuring van een organel, cellulaire structuur of een specifieke marker zoals mitochondriën, endoplasmatisch reticulum, PML-lichamen of DNA-dubbelstrengsmarker, yH2AX mogelijk maakt. De fosforylering van de S139 bij Histone 2A-variant, H2AX, toen aangeduid als yH2AX, wordt veel gebruikt als een zeer gevoelige en specifieke marker van DNA-dubbelstrengsbreuken. Elke focus van yH2AX-kleuring komt overeen met één breuk in het DNA die een paar minuten na de schade optreedt. De analyse van veranderingen in yH2AX-foci is de meest gebruikelijke test om te bestuderen of het eiwit van belang betrokken is bij DNA-schaderespons (DDR). Of een directe rol in de DNA-schadeplaats wordt verwacht, fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de colokalisatie van het betreffende eiwit met yH2AX-foci te verifiëren. Echter, met uitzondering van de nieuwe super-resolutie fluorescentiemethoden, kan de lokale interactie met DNA-schadeplaatsen een beetje subjectief zijn. Hier tonen we een test om de lokalisatie van eiwitten in de DDR-route te evalueren met behulp van yH2AX als marker van de schadeplaats. Deze test kan worden gebruikt om de temporele lokalisatie te karakteriseren onder verschillende beledigingen die DNA-schade veroorzaken.

Inleiding

Cellulaire DNA-schade treedt dagelijks op vanwege de spontane chemische reacties en wordt ook versterkt door exogene factoren zoals genotoxische stoffen (straling en chemicaliën zoals etoposide) en oxidatieve stress 1,2,3. De cellen hebben een complexe machinerie die een groot aantal verschillende soorten DNA-schade corrigeert, van het verwijderen van basen tot replicatieve vorktorsie of onderbreking van de meest schadelijke laesie: de DNA-dubbelstrengsbreuk 4,5.

Verschillende eiwitten die deelnemen aan de DDR zijn al gekarakteriseerd, en uitstekende revisies onderzoeken de routes van niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologe recombinatie (HR), de belangrijkste routes die worden geïmpliceerd bij dubbelstrengsbreuken (DSB) reparatie 5,6. De fosforylering van de histon H2A-variant, H2AX, bij serine 139 (daarna y-H2AX genoemd) wordt al vele jaren gebruikt als een gevoelige en betrouwbare marker van de dubbelstrengsbreuk. De fosforylering van H2AX wordt waargenomen in de eerste minuten na de schade enkan uren aanhouden 7.

Het voordeel van het gebruik van de immunofluorescentiedetectie van γ-H2AX-foci is de karakterisering van de temporele en ruimtelijke verdeling van de foci, evenals de co-kleuring met andere eiwitten. Bovendien vereist immunofluorescentie geen lysis, waardoor de cellulaire contextinformatie behouden blijft en informatiever wordt. Bovendien, aangezien γ-H2AX de novo wordt gevormd, is het niet overvloedig aanwezig in afwezigheid van DNA-schade, waardoor het een specifieke marker7 is.

H2AX wordt meestal gefosforyleerd door proteïnekinase ataxie-teleangiëctasie gemuteerd (ATM) en DNA-afhankelijk proteïnekinase (DNA-PK), de sensoren van DSB's. Ku70/80 (XRCC6 röntgenreparatie cross-complementing 6/ XRCC5 röntgenreparatie cross-complementing 5) en DNA-proteïnekinase katalytische subeenheid (DNA-PKcs) zijn verantwoordelijk voor DSB-identificatie en de bescherming van DNA-uiteinden, terwijl Artemis eindverwerking uitvoert om ligatie door het XRCC4-Ligase IV-complex te vergemakkelijken. De fosforylering van H2AX op plaatsen die DSB's flankeren, fungeert als een signaal voor de rekrutering van verschillende reparatie-eiwitten en signalering voor stilstand, doodof overleving van de celcyclus8.

De analyse van veranderingen in y-H2AX-foci is de meest gebruikelijke test om te bestuderen of het eiwit van belang betrokken is bij de respons op DNA-schade. Of een directe rol in de DNA-schadeplaats wordt verwacht, fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de co-lokalisatie van het eiwit van belang met y-H2AX-foci te verifiëren. Afgezien van de nieuwe superresolutie-fluorescentiemethoden kan het echter lastig zijn om de lokale interactie met DNA-schadeplaatsen te concluderen. Bovendien is de detectie van immunofluorescentie meestal afhankelijk van veel eiwitmoleculen op de plaats van DNA-schade, waardoor het moeilijk is om schaarse eiwitten te identificeren9.

Hier tonen we een test om de lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn bij de DDR-route te evalueren met behulp van y-H2AX als marker van de schadeplaats. Deze test kan worden gebruikt om temporele lokalisatie te karakteriseren onder verschillende beledigingen die DNA-schade veroorzaken.

De Proximity Ligand Assay (PLA) is naar voren gekomen als een hulpmiddel voor het schatten van de interactie tussen eiwitten en de ruimtelijke nabijheid tussen organellen of cellulaire structuren 10,11 en maakt bijvoorbeeld de temporele lokalisatie en co-lokalisatieanalyse onder stressomstandigheden mogelijk. De methode is eenvoudig omdat het lijkt op conventionele immunofluorescentie en de gelijktijdige kleuring van organel- of cellulaire structuurspecifieke markers mogelijk maakt, zoals mitochondriën, endoplasmatisch reticulum, PML-lichamen of DNA-dubbelstrengsmarker, yH2AX. Het gebruik van PLA maakt het mogelijk om eiwitinteractie tijdens DNA-schade op een gevoelige, specifieke en betrouwbare manier te identificeren die kan worden gebruikt om de interactie tijdens de celcyclus te volgen, als reactie op verschillende stimuli en op verschillende tijdstippen na genotoxische stress.

We tonen hier het gebruik van PLA gelijktijdig met conventionele γ-H2AX-immunofluorescentie om de Nek4-Ku70-interactie te lokaliseren na etoposide-geïnduceerde DNA-schade. Nek4, een familielid van Nek (NIMA-related kinases), heeft geen duidelijke rol in de reactie op DNA-schade. In 2012 toonden Nguyen en collega's aan dat Nek4 interageert met Ku70/Ku80-eiwitten, en bij afwezigheid van Nek4 worden deze eiwitten niet gerekruteerd naar de DNA-schadeplaats en is de H2AX-fosforylering verstoord12. De cellulaire lokalisatie van deze interactie is tot nu toe onbekend. We hebben een vermindering van Ku70-fosforylering waargenomen in cellen die Nek4-kinase-dode mutant13tot expressie brengen, maar of Nek4 direct Ku70 fosforyleert, moet nog worden opgehelderd. Aangezien de interactie tussen Nek4 en Ku70 toeneemt na behandeling met etoposide volgens immunoprecipitatiestudies12, proberen we deze interactie te lokaliseren met behulp van PLA en de γ-H2AX-marker.

Gewoonlijk zijn de interactiestudies gebaseerd op immunoprecipitatietests, maar deze zijn in vitro en geven geen informatie over de locatie van de interactie. Indien mogelijk kan een immunoprecipitatie van gefractioneerde cellen (kern, mitochondriaal, celmembraan of cytosol) worden uitgevoerd, maar het uitvoeren van een tijdsverloop van de interactie is kostbaar en arbeidsintensief. Immunofluorescentie kan informatie geven over de cellulaire lokalisatie van de eiwitten, maar het bewijzen van de interactie kan moeilijk zijn en hangt af van de resolutie van de microscopen. Hier laten we het voordeel zien van het gebruik van de Proximity Ligand Assay om de interactie van twee eiwitten in een context van DNA-schade te monitoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cel plateren

OPMERKING: Cellen kunnen worden gezaaid in microscopisch kleine fluorescentieglaasjes, kamers of platen. Het gebruik van kleine dekglaasjes of platen met 96/384 putjes wordt aanbevolen voor het testen van meerdere omstandigheden en reservereagentia. Het gebruik van dekglaasjes is aan te raden voor cellijnen die gemakkelijk kunnen worden losgemaakt, zoals HEK293-cellen. De dekglaasjes kunnen vooraf worden gecoat met een poly-L-lysine-oplossing om de bevestiging te verbeteren.

  1. Plaatcellen die een voertuig overwegen, technische controles en biologische controles. Gebruik technische replicaten bij twee of drie putten per toestand.
    OPMERKING: Het gebruik van technische controle (zowel secundaire als slechts één primaire) is verplicht. Indien mogelijk moet ook biologische bestrijding worden opgenomen (bijv. overexpressie of knockdown van een van de doeleiwitten of een aandoening waarvan bekend is dat deze de interactie verandert, bijvoorbeeld).
    1. Kweek U2OS-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 4,5 g/l glucose en 4 mM L-glutamine op met weefselcultuur behandelde platen bij 37 °C in 5% CO2 en een bevochtigde atmosfeer die 90% lucht bevat. Afhankelijk van het aantal te testen omstandigheden en bij gebruik van een 384 of dekglaasjes op een plaat van 60 mm, begin je met respectievelijk een plaat van 60 of 100 mm.
    2. Wanneer de cellen 60%-70% confluentie bereiken, splits je de cellen met 0,25% trypsine-EDTA 14. Cellen tellen met behulp van een Neubauer-kamer of een automatische teller14. Plaat 4 x 105 cellen in 60 mm plaat met meerdere ronde dekglaasjes van 13 mm of 4 x 105 cellen per putje in plaat(en) met 384 putjes en 12 - 24 uur incuberen bij 37 °C in een bevochtigde incubator van 5% CO2 .

2. Bereiding van oplossingen

OPMERKING: De concentratie en tijden van de behandeling zijn gekozen op basis van literatuurresultaten, die wijzen op de activering van DNA-schadeherstelroutes15,16.

  1. Bereid de stockoplossing van Etoposide voor met een concentratie van 50 mM in DMSO. De voorraadoplossing kan enkele maanden bij -20 °C worden bewaard. Verdun de etoposide-oplossing voor gebruik in het volledige kweekmedium in een eindconcentratie van 25 μM. Gebruik DMSO in een verdunning van 0,05% in het volledige kweekmedium als voertuigbesturing.
  2. Bereid 20x Zoutoplossing Natriumcitraat (SSC; 3,0 M NaCl, 0,30 M trinatriumcitraat pH 7,0). Deze oplossing kan enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.

3. Celbehandeling en fixatie

NOTITIE: Laat de cellen op geen enkel moment drogen; Probeer zoveel mogelijk gebruik te maken van de vorige oplossingen. De geschikte methode voor celfixatie (ijskoude methanol of 4% paraformaldehyde (PFA)) moet vooraf worden bepaald, evenals de verdunning van het antilichaam, met behulp van een conventioneel immunofluorescentie-experiment.

LET OP: Methanol moet op de juiste manier worden afgevoerd.

  1. Verwijder het kweekmedium uit de putjes en voeg een kweekmedium toe dat etoposide of DMSO bevat op respectievelijk 25 μM of 0,05%. Incubeer cellen bij 37 °C in 5% CO2 en een bevochtigde atmosfeer met 90% lucht met etoposide of DMSO gedurende 3 verschillende tijdsperioden: 20 min, 1 uur en 3 uur. Bij gebruik van 384 platen moeten alle voorwaarden tegelijkertijd worden gefixeerd.
    1. Begin hiervoor met het behandelen van de aandoening met de langste behandelingstijd, zoals 3 uur. Behandel na 2 uur de behandelingsconditie van 1 uur en als er nog 20 minuten over zijn voor fixatie, behandel dan de aandoening van 20 minuten. Hierna kunnen alle voorwaarden tegelijkertijd worden vastgesteld.
  2. Haal het medium uit de putjes en was de cellen met PBS 3x.
  3. Fixeer de cellen door ijskoude methanol toe te voegen met voldoende volume om het putoppervlak te bedekken. Incubeer gedurende 10 minuten bij -20 °C. Was de putjes 3x met PBS.
    OPMERKING: Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd. De platen kunnen 1 week bewaard worden bij 4 °C.

4. Permeabilisatie en blokkering

OPMERKING: Als u de PFA-fixatiemethode gebruikt, moet vóór permeabilisatie een stap van blokkering met glycine worden uitgevoerd. De vochtigheidskamer kan worden voorbereid door een waterpan in de incubator te plaatsen, wat resulteert in een luchtvochtigheid van ongeveer 95%. De 384 plaat of glaasjes kunnen worden geïncubeerd in een gesloten plastic container boven filtreerpapier of een bevochtigde spons en transparante film.

  1. Tik de PBS van de monsters af.
  2. Voeg 30-40 μL permeabilisatiebuffer toe (0,2% Triton X-100 in PBS) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. 3x wassen met PBS
  3. Tik de PBS van de monsters af en voeg 30-40 μL 1x blokkeringsoplossing toe die in de PLA-kit zit (als alternatief kan 3% runderserumalbumine en Triton X-100 0,1% in PBS-oplossing worden gebruikt) aan elk putje/dekglaasje.
  4. Incubeer de plaat in een voorverwarmde vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 1 uur.

5. Primaire antilichaamincubatie (PLA)

OPMERKING: Als u dekglaasjes gebruikt, is het belangrijk ervoor te zorgen dat de antilichaamoplossing alle dekglaasjes bedekt. Speciale aandacht moet worden besteed aan de selectie van antilichamen. De antilichamen moeten afkomstig zijn van verschillende diersoorten en het secundaire antilichaam dat voor γ-H2AX wordt gebruikt, mag niet gericht zijn tegen de soortgastheer van de productie van de PLA-sondes. De primaire antilichamen die voor PLA werden gebruikt, werden bijvoorbeeld gekweekt bij muizen en geiten. De PLA-sondes, anti-muis en anti-geit, werden in de ezel geproduceerd. Het antilichaam tegen γ-H2AX werd geproduceerd bij konijnen en het secundaire dat werd gebruikt, is anti-konijn geproduceerd bij ezels. Op deze manier zal de secundaire de PLA-sondes niet herkennen.

  1. Verdun de primaire antilichamen (de muis anti-Ku70 1:100 en geit anti-Nek4 1:50; konijn anti-Nek5 1:25 en muis anti-TOPIIβ 1:25) in antilichaamverdunningsmiddel dat in de kit wordt meegeleverd (als alternatief kan 3% runderserumalbumine en Triton X-100 0,1% in PBS-oplossing worden gebruikt). Bereid 30 μl antilichaamoplossing per aandoening bij gebruik van dekglaasjes of 20 μl per putje bij gebruik van een plaat met 384 putjes.
  2. Tik de blokkerende oplossing af. Voeg de primaire antilichaamoplossing toe aan elk putje. Incubeer 's nachts bij 4 °C in een vochtigheidskamer.

6. Incubatie van de PLA-sonde

OPMERKING: Kies de sondes en houd niet alleen rekening met de primaire antilichamen, maar ook met die welke bedoeld zijn voor gebruik in de immunofluorescentiestappen. Bij gebruik van platen met 384 putjes voor een lange incubatie van 37 °C kan langzame rotatie worden gebruikt om de verdeling van de antilichaamoplossing te verbeteren.

  1. Verdun de min- en plussondes 1:5 in het antilichaamverdunningsmiddel. Bereid 10 μl per putje voor als u platen met 384 putjes gebruikt of 20 μl per monster als u dekglaasjes gebruikt. Gebruik de volgende combinaties: Ezel anti-muis min met Ezel anti-geit plus; Ezel anti-muis min met Ezel anti-konijn plus.
  2. Tik de primaire antilichaamoplossing af. 1x wassen met TBS-T (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% van Tween-20). Was 3x gedurende 5 minuten met TBS-T op kamertemperatuur. Voer een extra wasbeurt uit met TBS-T.
  3. Tik af en voeg de PLA-sondeoplossing toe met 10 μL voor de platen en 20 μL voor de dekglaasjes. Incubeer in de voorverwarmde vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 1 uur.

7. Ligatie

OPMERKING: Wacht met het toevoegen van Ligase tot onmiddellijk voordat u het aan de monsters toevoegt. Ligase moet worden bewaard in een vriesblok (-20 °C). Verwijder volledig alle wasoplossing voordat u de ligaseoplossing toevoegt. Laat de cellen niet gedurende lange tijd zonder oplossing zitten. Bij gebruik van platen met 384 putjes voor de incubatie van 37 °C kan langzame rotatie worden gebruikt om de verdeling van de antilichaamoplossing te verbeteren.

  1. Verdun de 5x ligatiebuffer in zeer zuiver water. Bereid 10 μl per putje voor als je platen met 384 putjes gebruikt of 20 μl als je dekglaasjes gebruikt.
  2. Tik de PLA-sondeoplossing af. 1x wassen met TBS-T. Volg met drie extra wasbeurten, elk gedurende 5 minuten, met TBS-T. Was een laatste keer en tik de TBS-T af voor de volgende stap.
  3. Voeg Ligase toe aan de 1x Ligation-oplossing op 1:40, onmiddellijk voordat u het op de monsters aanbrengt. Incubeer in de voorverwarmde vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 30 min tot 1 uur.

8. Versterking en wassen

OPMERKING: Wacht met het toevoegen van de polymerase tot onmiddellijk voorafgaand aan de toevoeging aan het monster. De versterkingsbuffer is lichtgevoelig; Bescherm alle oplossingen met de buffer tegen licht. Polymerase moet worden bewaard in een vriesblok (-20 °C). Laat de cellen niet gedurende lange tijd zonder oplossing zitten. Bij gebruik van platen met 384 putjes voor incubatie bij 37 °C kan langzame rotatie de verdeling van de antilichaamoplossing verbeteren.

  1. Verwijder alle wasoplossing volledig voordat u de polymeraseoplossing toevoegt. Laat de cellen niet gedurende lange tijd zonder oplossing zitten. Verdun de 5x versterkingsbuffer in water met een hoge zuiverheid. Bereid 10 μl per putje voor als je platen met 384 putjes gebruikt of 20 μl als je dekglaasjes gebruikt.
  2. Tik de ligatieoplossing af. 1x wassen met TBS-T. Volg met drie extra wasbeurten, elk gedurende 5 minuten, met TBS-T. Was een laatste keer en tik de TBS-T af voor de volgende stap.
  3. Voeg het polymerase toe aan de 1x amplificatieoplossing in een verdunning van 1:80, onmiddellijk voordat het op de monsters wordt aangebracht. Incubeer in de voorverwarmde vochtigheidskamer bij 37 °C gedurende 100 min.
    OPMERKING: Vermijd vanaf deze stap directe blootstelling aan licht
  4. Tik de versterkingsbuffer af. Was 2x met 1x SSC-buffer gedurende 10 minuten elk. Was 2x met 0.01x SSC-buffer gedurende 2 minuten elk.

9. γ-H2AX-kleuring (Immunofluorescentie - IF)

OPMERKING: Het labelen van γ-H2AX wordt uitgevoerd nadat de PLA is voltooid.

  1. Incubatie van primaire antilichamen (IF)
    1. Verdun de primaire antilichamen (Rabbit anti yH2AX op 1:100) in blokkerende oplossing (als alternatief kan 3% Bovine Serum Albumine en Triton X-100 0,1% in PBS-oplossing worden gebruikt). Bereid 30 μl antilichaamoplossing per putje als je dekglaasjes gebruikt of 20 μl als je een plaat met 384 putjes gebruikt.
    2. Tik op de 0.01x SSC-oplossing. 2x wassen met PBS.
    3. Voeg de primaire antilichaamoplossing toe aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  2. Secundaire incubatie van antilichamen (IF)
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de gekozen secundaire antilichamen de PLA-antilichamen of sondes niet herkennen. Bovendien moet de golflengte van het secundaire antilichaam verschillen van de golflengte van het PLA-detectiereagens. Bijvoorbeeld: ons PLA-detectiereagens bevat de fluorofoor 647 en de secundaire die we hebben gebruikt voor γ-H2AX-detectie is 488.
    1. Verdun de secundaire antilichamen (Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 488) in blokkerende oplossing (als alternatief kan 3% Bovine Serum Albumine en Triton X - 100 0,1% in PBS-oplossing worden gebruikt) in een verdunning van 1:300. Bereid 30 μl antilichaamoplossing per aandoening bij gebruik van dekglaasjes of 20 μl per putje bij gebruik van een plaat met 384 putjes. Voeg Hoechst 33342 kleurstof toe in een eindconcentratie van 0,6 μg/ml.
    2. Tik de primaire antilichaamoplossing af. 3x wassen met TBS-T.
    3. Voeg de secundaire antilichaamoplossing toe aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    4. 5x wassen met TBS-T. 2x wassen met 1x SSC buffer. 2x wassen met 0.01x SSC buffer.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen de platen enkele weken worden opgeslagen bij 4 °C (in SSC 0.01X) beschermd tegen licht. Bij gebruik van dekglaasjes kunnen de glaasjes worden gemonteerd en na 1 dag kunnen de glaasjes bij -20 °C worden bewaard.

10. Beeldacquisitie

  1. Gebruik een conventionele fluorescentiemicroscoop en het 63x objectief. Bepaal het tijdstip van expositie door negatieve en positieve controles te vergelijken om verzadiging en instorten van stippen te voorkomen.
    OPMERKING: Het gebruik van confocale microscopen verbetert de detectie van PLA-dots. Het 20x-objectief kan ook worden gebruikt om het aantal gedetecteerde kernen te vergroten.
  2. Zodra de expositietijd is aangepast, voert u alle acquisities van PLA-dots uit met dezelfde parameters. Probeer afbeeldingen te verkrijgen van verschillende putjes of coverslips-regio's om artefacten als gevolg van niet-homogene incubatie te voorkomen.
  3. Sla alle kanalen met hetzelfde naampatroon op. Als de microscoop afzonderlijk foto's maakt in de kanalen, slaat u de bijbehorende afbeeldingen met dezelfde naam op en voegt u alleen PLA of Nucleus toe aan het begin van de bestandsnaam om het kanaal te onderscheiden.

11. Analyse van afbeeldingen

OPMERKING: Er is een macro gemaakt voor de analyse van stippen per kern in afbeelding J/FIJI17 en voor gebruik met microscopen waarbij de schaalinformatie handmatig moet worden toegevoegd. De pixelgrootte van de gebruikte objectieflens moet bekend zijn. Plaats de afbeeldingen voor elk kanaal in verschillende mappen (aanvullend coderingsbestand 1, aanvullende afbeelding 1).
OPMERKING: De macro houdt rekening met afzonderlijk verkregen fluorescentiekanalen. In dit geval is het belangrijk om alle afbeeldingen met dezelfde naam op te slaan.

  1. Met de macro kunt u een specifieke regio in het veld selecteren. Gebruik de optie Selecteer een ROI wanneer een gebied in de afbeelding artefacten vertoont die schadelijk kunnen zijn voor de analyse. Kies ROI aan het begin van de analyse en gebruik deze voor alle afbeeldingen.
    OPMERKING: Dit is een optionele functie. Als deze optie niet is geselecteerd, wordt de hele afbeelding in aanmerking genomen in de analyse (aanvullende afbeelding 2).
  2. Het ROI-bestand moet worden gemaakt voordat de macro wordt gebruikt, zoals hieronder wordt beschreven. Gebruik voor ROI-selectie een rechthoektool, selecteer het gebied voor analyse en voeg het toe aan de ROI-manager door te klikken op Bewerken > selectie> Toevoegen aan manager. Sla de ROI op door op Meer> Opslaan te klikken.
  3. Open in de ImageJ 17 afbeeldingen van verschillende omstandigheden om de parameters voor analyse aan te passen. Deze parameters moeten door de gebruiker worden bepaald en samen met de gegevens in het macroprogramma worden gespecificeerd (aanvullend coderingsbestand 1)
    1. Achtergrondcorrectie: Als u de achtergrond wilt verwijderen, klikt u op Verwerken> Achtergrond aftrekken. Test verschillende rollende balradius met behulp van de preview-functie). We hebben rolling 10 gebruikt voor PLA dots en rolling 100 voor nucleus.
    2. Verwijder ruis door op Geluid verwerken > > Verwijderen te klikken. Gebruik voor de kern de functie glad om de vulling van de kern te verbeteren door op Proces>Glad te klikken.
    3. Drempel aanpassen: Converteer naar een 8-bits afbeelding en pas de drempel aan door te klikken op Afbeelding > Type > 8-bits en Afbeelding > Aanpassen >Drempelwaarde. Pas de drempel dienovereenkomstig aan om alle kernen of stippen in de afbeelding te visualiseren, maar oververzadiging en instortende structuren te voorkomen. Maak aantekeningen van de waarden en test in verschillende afbeeldingen om te controleren of de drempelwaarde werkt voor verschillende afbeeldingen.
    4. Converteren naar masker door te klikken op Verwerken > Binaire > Converteren naar masker. Klik in het geval van de kern op Verwerken > Binaire > Gaten vullen, gevolgd door Proces > Binaire > Waterscheiding. In het geval van de PLA-punten klikt u op Verwerken > Binary > Watershed.
    5. Meet voor het tellen van kernen de oppervlakte of lengte van de verschillende kernen om de gemiddelde grootte te schatten. Gebruik een geschatte waarde om deeltjes te analyseren. Klik op Analyseren > Deeltjes analyseren en selecteer vervolgens Grootte instellen: 15-oneindig (deze waarden zijn afhankelijk van de grootte van de kernen). Controleer de volgende opties: Weergeven: Masker; Resultaten weergeven; Duidelijke resultaten; Samenvatten; Toevoegen aan Manager; Uitsluiten aan de randen.
    6. Meet voor het tellen van PLA-punten de oppervlakte of de straal van de stippen om de gemiddelde grootte te schatten. Selecteer Apply Nucleus Mask (apply mask is een functie op GDSC plugin, controleer of deze is geïnstalleerd) gevolgd door Analyze > Analyze particles and set. 0,02-3 (deze waarden zijn afhankelijk van de grootte van de kernen). Controleer de volgende opties: Weergeven: Masker; Resultaten weergeven; Duidelijke resultaten; Samenvatten; Toevoegen aan Manager; Uitsluiten aan de randen.
  4. De resultaten tonen het aantal stippen per kern in elke kern die in de afbeelding aanwezig is. Sla deze gegevens op.

12. Visualiseren van de samengevoegde afbeeldingen

  1. Open de kanalen die overeenkomen met PLA, kern en γ-H2AX. Trek de achtergrond af en verwijder ruis, zoals vermeld in stap 11.4.1 en 11.4.2 voor alle afbeeldingen.
  2. Pas de helderheid en het contrast automatisch of handmatig aan met dezelfde waarde voor alle omstandigheden van hetzelfde kanaal. Selecteer Afbeelding > Pas > Helderheid/contrast aan.
  3. Combineer afbeeldingen (samenvoegen) door Afbeelding > Kleur > Samenvoegen kanalen te selecteren. Voeg een schaalbalk toe door Hulpmiddelen >voor analyseren > Schaalbalk te selecteren. Opslaan als. TIFF-bestand te openen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben interactie tussen Nek4 en Ku70 waargenomen in afwezigheid van behandeling met etoposide. Deze interactie kan echter ook buiten de kern plaatsvinden (Figuur 1A). De interactie tussen Nek4 en Ku70 neemt toe na DNA-schade en is geconcentreerd in de kern (Figuur 1A). In het geval van Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ) interactie, die in deze test wordt gebruikt als positieve controle op basis van literatuurresultaten

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gegevens tonen aan dat het gebruik van PLA gelijktijdig met een DNA-beschadigde marker de meeste informatie kan opleveren in een DNA-schaderesponsprofilering, die het ruimtelijke en temporele gedrag van de interactie na de belediging laat zien. PLA is een veelzijdige methode die is gebruikt voor dimerisatie-identificatie, bepaling van organellencontact, eiwit-nucleïnezuurinteractie en voornamelijk eiwit-eiwitinteractie 10,11,19,20.<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, via Grant Temático 2022/15126-9 aan JK en fellowship 21/09439-1 aan LARM) en de Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) voor de financiering van dit onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Black 384-well platesPerkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA212061:300
Duo link Donkey anti Mouse MinusSigmaDUO92004
Duolink antibody diluentSigmaDUO82008
Duolink blocking solution 1XSigmaDUO82007
Duolink Detection reagent Far redSigmaDUO92013
Duolink Donkey anti goat plusSigmaDUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plusSigmaDUO92002
EtoposideSigmaE1383
Goat anti Nek4Santa Cruz BiotechnologySC-5517geiten anti Nek4 werd gebruikt in een 1:50 verdunning
Hoechst 33342ThermoH13990,6 µg/mL
Leica DMI microscopeLeica
Mouse anti Ku70ThermoMA5-13110muis anti Ku70 werd gebruikt in een 1:100 verdunning
Mouse anti TOPIIβSanta Cruz BiotechnologySC-3650711:25
Rabbit anti Nek5Santa Cruz BiotechnologySC-845271:25
Rabbit anti Y H2AXCell Signalling9718S1:100 verdunning
U2OS cell lineATCCHTB-96 

Referenties

  1. Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
  2. Lindahl, T., Barnes, D. E. Repair of endogenous DNA damage. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).
  3. DNA damage, aging, and cancer. N Engl J Med. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).
  4. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).
  5. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: Making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  6. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  7. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
  8. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).
  9. Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks. Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).
  10. Karchugina, S., Chernoff, J. Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay. J Vis Exp. (140), (2018).
  11. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. J Vis Exp. (118), (2016).
  12. Nguyen, C. L., et al. Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts. Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).
  13. Basei, F. L., et al. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).
  14. Animal Cell Culture Guide. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).
  15. Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure. MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).
  16. Wei, F., et al. Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response. Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide. J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).
  19. George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines. STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).
  20. Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells. RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).
  21. Hegazy, M., et al. Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ. Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

DNA-schaderesponsGamma H2AX-kleuringeiwitlokalisatieimmunofluorescentiemicroscopieeiwitinteractieetoposidebehandelingImageJ-analysedubbelstrengsbreukennucleaire eiwitinteractie
Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.