Methodenartikel

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

DOI:

10.3791/67078

⸱

26 juli 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn in weefsel levende macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CZS), die tal van functies uitvoeren die de neuronale gezondheid en CZS-homeostase ondersteunen. Ze vormen een belangrijke populatie van immuuncellen die geassocieerd zijn met de ziekteactiviteit van het CZS en nemen reactieve fenotypes aan die mogelijk bijdragen aan neuronaal letsel tijdens chronische neurodegeneratieve ziekten zoals multiple sclerose (MS). De verschillende mechanismen waarmee microglia de neuronale functie en overleving tijdens gezondheid en ziekte reguleren, blijven beperkt vanwege uitdagingen bij het oplossen van de complexe in vivo interacties tussen microglia, neuronen en andere CZS-omgevingsfactoren. De in vitro benadering van het gelijktijdig kweken van microglia en neuronen blijft dus een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van microglia-neuronale interacties. Hier presenteren we een protocol om primaire microglia en neuronen van muizen te genereren en samen te kweken. In het bijzonder werden microglia na 9-10 dagen in vitro geïsoleerd uit een gemengde gliacultuur die was vastgesteld op basis van hersenhomogenaten afkomstig van neonatale muizen tussen postnatale dagen 0-2. Neuronale cellen werden geïsoleerd uit hersenschors van muizenembryo's tussen embryonale dagen 16-18. Na 4-5 dagen in vitro werden neuronale cellen gezaaid in platen met 96 putjes, gevolgd door de toevoeging van microglia om de co-cultuur te vormen. Zorgvuldige timing is van cruciaal belang voor dit protocol, aangezien beide celtypen experimentele rijpheid moeten bereiken om de co-cultuur tot stand te brengen. Over het algemeen kan deze co-cultuur nuttig zijn voor het bestuderen van interacties tussen microglia en neuronen en kan het meerdere uitlezingen bieden, waaronder immunofluorescentiemicroscopie, live beeldvorming en RNA- en eiwittests.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn in het weefsel levende macrofagen die immunosurveillance en homeostase in het centrale zenuwstelsel (CZS) vergemakkelijken1,2,3. Ze zijn afkomstig van erytromyeloïde voorlopercellen van de dooierzak die de hersenen koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling 4,5,6 en worden gedurende de hele levensduur van het organisme in stand gehouden door zelfvernieuwing, wat proliferatie en apoptose met zich meebrengt7. In steady-state hebben rustende microglia een vertakte morfologie en houden ze zich bezig met weefselbewaking 8,9,10.

Microglia brengen talrijke receptoren op het celoppervlak tot expressie, waardoor ze snel kunnen reageren op veranderingen in het CZS11,12 en ontstekingsreacties kunnen bevorderen in geval van infecties of weefselbeschadiging 12,13,14, evenals tijdens neurodegeneratieve ziekten 9,15, zoals multiple sclerose (MS)16,17. Microglia brengen ook receptoren tot expressie voor verschillende neurotransmitters en neuropeptiden 18,19,20, wat suggereert dat ze ook kunnen reageren op neuronale activiteit en deze kunnen reguleren 21,22. Microglia en neuronen interageren inderdaad in verschillende vormen van bidirectionele communicatie 8,23, zoals directe interacties gemedieerd door membraaneiwitten of indirecte interacties via oplosbare factoren of tussenliggende cellen23,24.

Verschillende neurotransmitters die door neuronen worden uitgescheiden, kunnen bijvoorbeeld de neuroprotectieve of inflammatoire activiteit van microglia moduleren 25,26,27. Bovendien helpen directe interacties tussen neuronen en microglia om microglia in een homeostatische toestand te houden28. Omgekeerd kunnen directe interacties van microglia met neuronen neuronale circuits vormen29 en neuronale signalering beïnvloeden 30,31,32. Aangezien verstoringen van deze interacties hyperexcitabiliteit van neuronenveroorzaken 30 en microglia-reactiviteit33,34, worden ontregelde microglia-neuronale interacties geïmpliceerd als een bijdragende factor aan neurologische aandoeningen33,35. Er is inderdaad beschreven dat psychotische23,26 en neurodegeneratieve ziekten disfunctionele microglia-neuronale interacties vertonen33. Hoewel deze observaties het belang van microglia-neuronale communicatie in het CZS benadrukken, zijn specifieke mechanismen van hoe deze interacties microgliale en neuronale functies in gezondheid en ziekte reguleren relatief onbekend.

Binnen een complex milieu zoals het CZS kunnen meerdere omgevingsfactoren microglia-neuronale interacties beïnvloeden, wat het vermogen beperkt om voorbijgaande cellulaire interacties in vivo te bestuderen. Hier presenteren we een in vitro microglia-neuronaal co-cultuursysteem dat kan worden gebruikt om directe cellulaire interacties tussen microglia en neuronen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de generatie van primaire microglia en neuronen uit de cortex van neonatale muizen tussen respectievelijk postnatale dagen 0-2 en embryonale muizen dag 16-18. Neuronen en microglia worden vervolgens samen gekweekt in platen met 96 putjes voor stroomafwaartse high-throughput-experimenten. We hebben deze benadering eerder gebruikt om aan te tonen dat microglia-fagocytose neuronen beschermt tegen geoxideerde fosfatidylcholine-gemedieerde celdood37, wat suggereert dat deze methode kan helpen om de rol van microglia in de context van neurodegeneratie en MS te begrijpen. Evenzo kunnen microglia-neuronale co-culturen ook nuttig zijn voor het onderzoeken van de impact van microglia-neuronale overspraak in andere contexten, zoals virale infecties38 of neuronaal letsel en herstel39. Over het algemeen stellen in vitro microglia-neuronale co-cultuursystemen onderzoekers in staat om microglia-neuronale interacties te bestuderen in een manipuleerbare en gecontroleerde omgeving, die een aanvulling vormt op in vivo modellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gehuisvest en behandeld met goedkeuring van de University Animal Care Committee (UACC) van de University of Saskatchewan en de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Voor dit onderzoek werden postnatale dagen 0-2 CD1 mannelijke en vrouwelijke muizen en embryonale dagen 16-18 (E16-18) embryo's van zwangere CD1-muizen gebruikt. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Primaire microgliacultuur

OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de gemengde glia- en neuronale culturen zo te timen dat microglia binnen 2 dagen nadat de neuronen in een plaat met 96 putjes zijn gezaaid, rijp en klaar zijn voor de oogst.

  1. Voorbereiding
    1. Voorwarme complete glia-kweekmedia, waaronder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 50 E/ml penicilline/streptomycine met 2,92 mg/ml L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1x niet-essentiële aminozuren en 20 mM HEPES in een waterbad van 37 °C.
    2. Voeg 5 ml 10 μg/ml poly-L-ornithine (PO) hydrobromide toe aan elke T-75 kolf. Draai de kolf voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat PO de bodem van de kolf volledig bedekt. Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator gedurende ten minste 1 uur.
      OPMERKING: Deze coatingstap is nodig om de celhechting aan de T-75-kolven te vergemakkelijken.
  2. Isolatie van hersenen van P0-P2 neonatale muizen
    OPMERKING: Steriliseer alle dissectie-instrumenten en behoud de steriliteit van de reagentia. Zorg ervoor dat u zich overal aan aseptische technieken houdt.
    1. Voordat u met de dissectie begint, spuit u het aanrecht af met 70% ethanol of desinfecterende spray op de plaats waar de dissectie zal plaatsvinden. Stel de dissectiemicroscoop op en plaats de petrischaal onder de microscoop. Giet 20 ml Leibovitz's L-15 media in de petrischaal. Houd het deksel van de petrischaal erop terwijl de microscoop niet in gebruik is om vervuiling te verminderen.
    2. Leg meerdere lagen keukenpapier neer en spuit de papieren handdoeken grondig in met 70% ethanol. Bereid de dissectie-instrumenten (dissectieschaar, een micro-tang en weefseltang) voor door ze grondig te besproeien met 70% ethanol en de gereedschappen op de papieren handdoeken te leggen.
    3. Breng de muis na de geboortedag 0-2 over op het keukenpapier en spuit de muis grondig in met 70% ethanol. Onthoofd de muis met een dissectieschaar (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    4. Terwijl u het hoofd voorzichtig vasthoudt, maakt u een incisie in de middellijn in de schedel, beginnend van de nek tot de neus. Trek de schedel terug met een weefseltang om de hersenen te onthullen.
    5. Gebruik een weefselpincet om de hersenen voorzichtig naar buiten te scheppen door de tang onder de hersenen in te brengen en de hersenen uit het hoofd te tillen. Plaats de hersenen onmiddellijk in de petrischaal met 20 ml L-15-media van Leibovitz.
    6. Verwijder onder een dissectiemicroscoop voorzichtig de hersenstam en de hersenvliezen met behulp van een micropincet. Verzamel de hersenen in een conische buis van 50 ml met 5 ml Leibovitz's L-15 media.
  3. Hersendissociatie, zaaien en onderhouden van gemengde gliacultuur
    OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit in een bioveiligheidskast.
    1. Hak de hersenen in ongeveer 1 mm2 stukken met een steriel wegwerpscalpelmesje. Breng de gehakte hersenen voorzichtig over in een nieuwe steriele buis van 50 ml.
    2. Voeg aan de gehakte hersenen een eindconcentratie van 0,25% trypsine toe en incubeer het weefsel gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C. Meng de oplossing elke 2-3 minuten door de buis voorzichtig om te keren om weefseldissociatie te bevorderen.
    3. Breng vanuit de 5% CO2 -incubator de T-75-kolven met 5 ml PO over naar de bioveiligheidskast. Gooi de PO weg en spoel de kolven 3 keer met steriele 1x fosfaatbufferoplossing (PBS). Zorg ervoor dat u de kolven grondig spoelt, aangezien overtollig PO giftig is voor cellen.
    4. Breng het verteerde weefsel uit het waterbad van 37 °C over naar de bioveiligheidskast. Voeg 5 ml volledige gliakweekmedia toe om de trypsine te neutraliseren. Meng de tissuesuspensie voorzichtig met een pipet van 10 ml.
    5. Plaats een steriele 70 μm nylon gaascelzeef op een steriele conische buis van 50 ml en maak het gaas nat door ongeveer 5 ml L-15 te gieten. Decanteer de celsuspensie voorzichtig door de celzeef. Verwijder de zuiger uit een steriele spuit van 1 ml, maal het weefsel met de zuiger in het gaas om weefselklonten te verwijderen en genereer een gehomogeniseerde celsuspensie.
    6. Giet periodiek ongeveer 5 ml van Leibovitz's L-15 media in het nylon gaas van 70 μm en blijf het weefsel op het gaas malen met de 1 ml-zuiger. Als er weinig tot geen zichtbaar weefsel op het gaas achterblijft, gooi het gaas dan weg en leg de celsuspensie opzij.
    7. Meng de celsuspensie door zachtjes op en neer te pipetteren. Voeg aan elke kolf gelijke volumes celsuspensie met 1-2 hersenen met glia-kweekmedia toe tot een eindvolume van 15 ml.
    8. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende een nacht in een 5% CO2 -incubator. Was de kolven de volgende dag twee keer met steriel 1x PBS om loszittende cellen en vuil te verwijderen.
    9. Voeg 15 ml verse, complete glia-kweekmedia toe aan de cultuur en incubeer bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator. Vervang na 3 dagen de helft van het medium door 10 ml vers gliacultuurmedium aangevuld met 40 ng/ml macrofaag koloniestimulerende factor (MCSF).
      OPMERKING: Daarna wordt de helft van het medium vervangen door 10 ml verse gliacultuurmedia aangevuld met 40 ng/ml MCSF om de 3 dagen. De cultuur wordt 8-10 dagen gehandhaafd voordat microglia worden geoogst.

2. Primaire neuroncultuur

  1. Voorbereiding
    1. Ontdooi B-27 plus supplement van B-27 plus neuronaal kweeksysteem. Voorwarm neurobasaal plus medium van B-27 plus neuronaal kweeksysteem, 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) en warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C in een waterbad.
    2. Smeer de T-25 kolven in met 5 ml 10 μg/ml oraal en broed de kolven gedurende ten minste 1 uur uit bij 37 °C. Bereid instrumenten en benodigdheden voor op dissectie.
      OPMERKING: Deze coatingstap vergemakkelijkt de celhechting aan de T-25-kolven.
  2. Hersenisolatie van E16-E18 muizenembryo's
    OPMERKING: Steriliseer alle dissectie-instrumenten en behoud de steriliteit van de reagentia. Zorg ervoor dat u zich overal aan aseptische technieken houdt.
    1. Voordat u met de dissectie begint, spuit u het aanrecht af met 70% ethanol of desinfecterende spray op de plaats waar de dissectie zal plaatsvinden. Stel de dissectiemicroscoop op en plaats de petrischaal onder de microscoop. Giet 20 ml 1x HBSS in de petrischaal. Houd het deksel van de petrischaal erop terwijl de microscoop niet in gebruik is om vervuiling te verminderen.
    2. Leg meerdere lagen keukenpapier neer en spuit de papieren handdoeken grondig in met 70% ethanol. Bereid de dissectie-instrumenten (veerschaar, een microtang en een weefseltang) voor door ze grondig in te spuiten met 70% ethanol en de gereedschappen op het keukenpapier te leggen.
    3. Verdoof een zwangere muis tussen draagtijd 16-18 met behulp van isofluraan en euthanaseer de muis door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    4. Leg de muis op zijn rug op een stuk keukenpapier gedrenkt in 70% ethanol. Desinfecteer de buikstreek met 70% ethanol. Til de huid van de onderbuik op met een weefseltang en voer een V-vormige incisie uit vanaf dit punt naar de onderste ribbenkast met een dissectieschaar.
    5. Pak de baarmoederhoorns met de embryo's vast met een weefseltang en verwijder de embryo's voorzichtig uit de buikholte. Desinfecteer de baarmoederhoorns met embryo's kort met 70% ethanol.
    6. Ontleed één embryo uit zijn individuele zak tegelijk. Maak met een veerschaar een incisie in de middellijn aan de bovenkant van de schedel, beginnend vanaf de achterkant van de nek tot de neus. Til vervolgens de schedel weg van de incisieplaats om de hersenen te onthullen. Schep de hersenen er voorzichtig uit met een weefselpincet en breng de hersenen over naar een petrischaaltje van 10 cm met 15 ml 1x HBSS.
    7. Verwijder onder een dissectiemicroscoop voorzichtig de hersenstam en de hersenvliezen aan weerszijden van de hersenschors met een micropincet. Breng de hersenschors over in een kegelvormige buis van 50 ml met 10 ml 1x HBSS en plaats ze op ijs.
  3. Hersendissociatie en zaaien van corticale neuronen in celcultuur
    OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit in een bioveiligheidskast.
    1. Hak de hersenen in ongeveer 1 mm2 stukjes in de conische buis van 50 ml met een steriel wegwerpscalpelmesje. Breng de gehakte hersenen over in een nieuwe steriele kegelvormige buis van 50 ml.
    2. Voeg trypsine toe aan de tube met een eindconcentratie van 0,25%. Dompel de tube 15 minuten onder in een heetwaterbad van 35-38 °C en meng de tube voorzichtig om het weefsel elke 2-3 minuten te homogeniseren.
    3. Haal de slang uit het warmwaterbad. Pipeteer de weefselsuspensie voorzichtig op en neer om de cellen verder te dissociëren en voeg vervolgens 0,5 ml warmte-geïnactiveerde FBS toe aan de gehomogeniseerde suspensie om de trypsine-activiteit te neutraliseren. Vermijd luchtbellen om toxiciteit voor neuronale cellen te minimaliseren.
    4. Plaats een steriele 70 μm nylon mesh celzeef op een steriele conische buis van 50 ml en bevochtig het gaas door ongeveer 5 ml neurobasale media toe te voegen. Filtreer de celsuspensie door de 70 μm nylon mesh celzeef. Gebruik een zuiger van de spuit van 1 ml om het weefsel voorzichtig in de celzeef te malen. Giet regelmatig ongeveer 5 ml 1x HBSS terwijl u doorgaat met malen om de celzeef te wassen.
    5. Centrifugeer de conische buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gedurende deze tijd, verdun het B-27 plus supplement in neurobasale plus media tot 1x de uiteindelijke concentratie om te gebruiken als volledige neurobasale media.
    6. Gooi de PO weg in de T-25 kolven en spoel de kolven drie keer met 5 ml 1x PBS.
    7. Decanteer voorzichtig om het supernatans te verwijderen en resuspendeer de celpellet door voorzichtig 2-3 ml van het volledige neurobasale medium op en neer te pipetteren. Bepaal de celconcentratie en het totale aantal cellen met een hemocytometer en trypanblauw. Verwacht tot 1,0 x 107 cellen per embryo.
    8. Bekleed de cellen in de PO-gecoate T-25 kolven met ongeveer 2,0 x 107 cellen per kolf in 5 ml volledige neurobasale media. Incubeer de celcultuur bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 .
    9. Voer elke 2-3 dagen een halve mediawissel uit door 2,5 ml media uit de kweekkolf te vervangen door vers gemaakte complete neurobasale media.

3. Co-cultuur van primaire neuronen en microglia

OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast.

  1. Neuronen zaaien in platen met 96 putjes
    1. Voeg 100 μl 10 μg/ml PO per putje toe en incubeer de kolven gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C om de putjes met PO te bedekken. Was de plaat 3 keer met 1x PBS voordat u de cellen zaait en zuig de resterende vloeistof op na de laatste wasbeurt.
    2. Neuronen gekweekt in T-25 kolven worden na 2-5 dagen in cultuur geoogst voor co-cultuur. Vervang het medium door 5 ml 1x Versene oplossing met 0,25% trypsine en 1 mg/ml DNase I om de neuronen los te maken van de kolf. Plaats de kolven 5-6 minuten in de incubator voor de spijsvertering en draai de kolf elke 2-3 minuten voorzichtig rond om de celloslating te bevorderen.
    3. Haal de kolf uit de couveuse en controleer onder een microscoop of de cellen zijn losgekomen. Voeg 0,5 ml warmte-geïnactiveerde FBS toe om de trypsine en DNase I te neutraliseren. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Was de kolf eenmaal met 5 ml complete neurobasale media om het aantal verzamelde neuronen te maximaliseren. Verzamel alle cellen in dezelfde conische buis van 15 ml.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celkorrel voorzichtig in 2-3 ml volledige neurobasale media.
    5. Tel cellen met een hemocytometer en voeg volledige neurobasale media toe om een uiteindelijke concentratie van 7,5 x 105 neuronen/ml te bereiken. Zaai 100 μL van de celsuspensie in elk putje in de PO-gecoate plaat met 96 putjes om 7,5 x 104 neuronen/putje te verkrijgen. Er wordt een opbrengst van 5-6 miljoen neuronen per kolf verwacht.
    6. Incubeer de neuronen 's nachts in een plaat met 96 putjes. Voeg de volgende dag 100 μL complete neurobasale media toe aan elk putje.
      OPMERKING: Zodra neuronen de juiste groei van het neurietproces vertonen (rond dag 3-4 na het zaaien in platen met 96 putjes), zijn ze klaar voor co-cultuur met microglia.
  2. Isolatie en microglia-neuronale co-cultuur
    1. Verzamel microglia tussen 8-10 dagen gemengde gliateelt door de T-75-kolven voorzichtig te wassen met glia-kweekmedia in elke kolf met een pipet van 10 ml en breng de cellen en media over in een steriele kegelvormige buis van 50 ml. Was de kolven opnieuw met 10 ml verse gliacultuurmedia om extra microglia van de kolven los te maken en de media op te vangen. Er wordt een opbrengst van 7,5 x 105 microglia per kolf verwacht.
    2. Voeg 20 ml verse gliacultuurmedia aangevuld met 20 ng/ml MCSF toe aan elke kolf. Microglia kunnen nog een of twee keer worden geoogst als de gemengde gliacultuur in stand wordt gehouden.
    3. Centrifugeer de celverzameling bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatans en suspendeer de pellet voorzichtig in 2 ml volledige neurobasale media.
    4. Tel de cellen met een hemocytometer en trypan blauw. Voeg volledige neurobasale media toe tot een eindconcentratie van 2,5 x 105 cellen/ml.
    5. Verwijder 100 μL neurobasale media van de 96-wells neuronale media en voeg 100 μL 2,5 x 105 cellen/ml celsuspensie toe aan zaad 2,5 x 104 microglia per putje van 7,5 x 104 neuronen. Incubeer de cultuur een nacht bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 om microglia te laten bezinken. De co-cultuur kan nu worden gebruikt voor stroomafwaartse experimenten.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een stroomdiagram met de belangrijkste stappen van de gemengde gliacultuur voor microglia is weergegeven in figuur 1A. Over het algemeen worden dunne cellen en overmatig cellulair afval verwacht op dag 1 (Figuur 1B). Tegen dag 4 moet een verhoogd aantal cellen worden waargenomen, vooral bij het genereren van aanhangende astrocyten, zoals aangegeven door hun langwerpige morfologie (Figuur 1C). Een paar microglia kunnen worden waargenomen bovenop de astrocyten of als kleine ronde cellen die in media drijven. Tegen dag 8 zal een confluente laag astrocyten de aanhangende lagen cellen vormen, terwijl microglia zullen verschijnen als ronde en heldere cellen die half aan de astrocyten zijn gehecht of in media drijven (Figuur 1D). Als de microgliadichtheid op dag 8 laag is, kan de cultuur nog enkele dagen voor de oogst worden geïncubeerd.

Een stroomdiagram dat de belangrijkste stappen van de neuronale cultuur laat zien, wordt weergegeven in figuur 2A. In een gezonde cultuur zullen neuronen zich na 1-3 dagen in vitro hechten en neurietprocessen vormen (Figuur 2B). Evenzo zullen neuronen bij het zaaien in een plaat met 96 putjes aanvankelijk rond lijken, maar tegen dag 3 zouden neuronen aanhankelijk moeten worden en neurietprocessen moeten vormen die verbinding maken met naburige neuronen (Figuur 2C). Omgekeerd bevatten ongezonde neuronculturen celklompjes en celresten, die het gevolg kunnen zijn van gebrekkige celdissociatie of verkeerd gebruik van neuronen (Figuur 2D).

Een stroomdiagram met de belangrijkste stappen van het microglia-neuronale co-cultuurprotocol is weergegeven in figuur 3A. Na het toevoegen van 2,5 x 104 microglia aan 7,5 x 104 neuronen, zouden ronde en grote microglia moeten verschijnen bovenop of tussen de neuronen en neurietprocessen (Figuur 3B). Om de microglia-neuronale co-cultuur verder te visualiseren, werden microglia en neuronen alleen of in co-cultuur gelabeld met geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (IBA-1, rood) en tubuline βIII (TUJ1, groen) antilichamen37 voor immunofluorescentiemicroscopie (Figuur 3C-F).

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de primaire microgliacultuur. (A) Stroomschema van de belangrijkste stappen bij het genereren van een gemengde gliacultuur. (B-D) Representatieve 10x helderveldmicroscoopbeelden van gemengde gliacultuur op dag 1 (B), dag 4 (C) en dag 8 (D). Schaal balken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Overzicht van de primaire neuroncultuur. (A) Stroomschema van de belangrijkste stappen bij het genereren van neuronen. (B) Representatieve 10x helderveldmicroscoopbeelden van neuronen gekweekt in T-25-kolven. (C) Representatieve 10x helderveldmicroscoop van neuronen gekweekt in een plaat met 96 putjes. (D) Representatieve 10x helderveldmicroscoop van een ongezond neuronaal cluster in een plaat met 96 putjes. Schaal balken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Overzicht van de cocultuur tussen microglia en neuronen. (A) Stroomschema van de belangrijkste stappen voor de microglia-neuronale cocultuur. (B) Representatieve 10x helderveldmicroscoopbeelden van microglia-neuronale cocultuur in platen met 96 putjes. Schaalbalken: 100 μm. (C,D) Representatieve immunofluorescentiemicroscopiebeelden van neuronen alleen (C), microglia alleen (D), dag 2 neuron en microglia co-cultuur (E), of 12-daagse neuron en microglia co-cultuur (F) in een plaat met 96 putjes. Microglia en neuronen zijn gelabeld met respectievelijk IBA-1 (rood) en tubuline βIII (groen). Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Immunofluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een 25x, 0,8 NA, wateronderdompelingsobjectief met een breedveldfluorescentiemicroscoop. Schaal balken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren en cultiveren van primaire neuronen en primaire microglia van muizen, die vervolgens worden gebruikt om een microglia-neuronale co-cultuur tot stand te brengen die kan worden gebruikt om te bestuderen hoe microglia- en neuroninteracties hun cellulaire gezondheid en functie reguleren. Deze relatief eenvoudige en toegankelijke benadering kan kritische inzichten verschaffen in de mechanismen en functionele resultaten van interacties tussen microglia-neuronen in het CZS.

Om tot een optimale co-cultuur te komen, vereisen een aantal kritische aspecten in dit protocol extra zorg. Tijdens hersenisolaties (stappen 1.2.6 en 2.2.7) moeten hersenvliezen die aan het oppervlak van zowel de embryonale als de postnatale hersenen zijn bevestigd, volledig worden verwijderd voordat de weefsels worden verzameld. Net als andere neuroglia-protocollen kan onvolledige verwijdering van de hersenvliezen ertoe leiden dat de celcultuur besmet raakt met endotheelcellen of van bloed afgeleide cellen 40,41,42. Bovendien is het bij het kweken van primaire neuronen (stappen 2.3.7 en 3.1.4) van cruciaal belang om een eencellige suspensie te genereren en celklonten te voorkomen voordat neuronen in kolven of platen met 96 putjes worden gezaaid. Neuronale aggregaten zullen niet goed hechten in cultuur en zullen leiden tot overmatige neuronale stress en celdood. Bovendien kan langdurige behandeling van neuronen met trypsine bij een poging om ze te dissociëren van T-25-kolven ongewenste celdood veroorzaken (stap 3.1.2). Om dit te verminderen, kunnen neuronen direct worden gezaaid in platen met 96 putjes met de gewenste celdichtheid na dissociatie van embryonale hersenen (stap 2.3.7). Bovendien werd in dit protocol een 3:1 neuron: microglia-verhouding geselecteerd om gedeeltelijk een verhoogde hoeveelheid microglia weer te geven die aanwezig kan zijn in de micro-omgeving van het CZS tijdens neuro-inflammatie. Als alternatief kan de verhouding van cellen in de co-cultuur worden aangepast per experimentele behoefte. Bovendien kan het tijdstip dat is geselecteerd voor co-cultuurneuronen worden verlengd als men ernaar streeft meer volwassen neuronale toestanden te beoordelen.

Met name bij het dissociëren van neuronen van T-25-kolven naar platen met 96 putjes, kan het gebruik van trypsine alleen leiden tot onvolledige dissociatie en de vorming van celklompjes in plaats van een monolaagcultuur in platen met 96 putjes (Figuur 2D). Om dit probleem aan te pakken, kunnen neuronen worden losgekoppeld van de T-25-kolf met behulp van 1x Versene oplossing die 1 mg/ml DNase I bevat. Andere factoren die bijdragen aan neuronale aggregatie en verminderde levensvatbaarheid zijn onder meer onvolledige trituratie van de celsuspensie, onvoldoende neutralisatie van trypsine met door warmte geïnactiveerde FBS, overmatige centrifugatie of langdurige vorming van celpellets. Daarom zijn het waarborgen van een goede weefseldissociatie en het genereren van een eencellige suspensie van cruciaal belang voor het tot stand brengen van een gezonde co-cultuur van microglia en neuronen.

Dit protocol heeft tot doel microglia-neuronale interacties in vitro te recapituleren om het functionele belang van hun interacties in het CZS beter te begrijpen. Terwijl er andere soorten co-cultuursystemen zijn ontwikkeld, zoals het kweken van individuele celpopulaties op verschillende oppervlakken om onafhankelijke behandeling van twee celpopulaties mogelijk te maken43,44, maakt dit gemengde cultuursysteem direct en nauw contact van microglia en neuronen mogelijk. Bovendien kan dit gemengde cultuursysteem, wanneer het goed wordt onderhouden door middel van halve mediaveranderingen om de 3 dagen, gezond blijven van 12 dagen (figuur 3F) tot mogelijk 3 weken, waardoor langetermijnstudies van neuronale-microglia-interacties mogelijk zijn45.

Hoewel de relatieve eenvoud van het co-cultuursysteem gunstig is voor de toegankelijkheid, is een belangrijke beperking van deze benadering dat de tweedimensionale celcultuur de weefselomgeving van het CZS niet volledig vertegenwoordigt. Inderdaad, een tri-cultuur van microglia, neuronen en astrocyten blijkt in vivo neuro-inflammatoire respons betrouwbaarder na te bootsen dan microglia of astrocyt-neuronale co-cultuur46,47. Bovendien zijn recente ontwikkelingen in hersenorganoïde systemen met microglia en andere gliacellen, waaronder astrocyten en oligodendrocyten, geschikter voor het bestuderen van driedimensionale (3D) weefselarchitectuur en interacties van het CZS48. Evenzo blijkt een menselijk 3D-tricultuursysteem bestaande uit neuronen, microglia en astrocyten effectief te zijn bij het modelleren van de ziekte van Alzheimer49. Andere menselijke microglia-neuron co-culturen kunnen fysiologisch relevanter zijn voor studies naar neurodegeneratieve ziekten. De co-cultuur van microglia en motorneuronen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen50 kan bijvoorbeeld nuttig zijn voor het bestuderen van ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose51. Desalniettemin, gezien de relatieve overvloed en lage kosten van het genereren van primaire neuronen en microglia van muizen, kan het beoordelen van microglia-neuronale cocultuur in platen met 96 putjes een hoge doorvoerbenadering zijn voor het bestuderen van de mechanismen en functionele implicaties van microglia-neuronale interacties. Stroomafwaartse assays kunnen bestaan uit het gebruik van live celbeeldvorming om cellulaire functionele veranderingen in realtime te bepalen, RNA-sequencing om cellulaire transcriptionele veranderingen te bepalen, immunofluorescentiemicroscopie om cellulaire fenotypische veranderingen te bepalen, massaspectrometrie om cellulaire en proteomische veranderingen te bepalen, of enzymgekoppelde immunosorbenttest en western blot om eiwit te meten dat wordt uitgescheiden in de co-cultuursupernatant.

Aangezien microglia belangrijke mediatoren zijn van de gezondheid en ziekten van het CZS, kan deze co-cultuur ook worden gebruikt om het effect van ziektegerelateerde moleculen en verbindingen op microglia-neuronale bidirectionele communicatie te onderzoeken. In de context van MS kunnen geactiveerde microglia een destructieve rol spelen, wat bijdraagt aan de verslechtering van de pathologie52,53. Ze kunnen bijvoorbeeld pro-inflammatoire cytokines en reactieve zuurstofsoorten afscheiden en de activering van astrocyten bevorderen45. Dit protocol kan helpen om de schadelijke rol van microglia verder te onderzoeken door microglia in de co-cultuur te behandelen met inflammatoire cytokines die verhoogd zijn bij MS en door de resultaten van de gezondheid van neuronen te beoordelen. Als alternatief is deze microglia-neuronale co-cultuur gebruikt om het beschermende effect van microglia op neuronen aan te tonen als reactie op geoxideerde fosfatidylcholine, een oxidatief product dat is ontdekt in MS54. Bovendien hermodelleert neuronale apoptose de genexpressie van microglia tijdens de ontwikkeling door de overleving van microglia en fagocytose te bevorderen55. Daarom kan dit protocol ook helpen bij het bepalen van de impact van neuronale dood op het fenotype en de functie van microglia.

Samenvattend beschrijft dit protocol het genereren en co-cultiveren van primaire van muizen afgeleide neuronen en microglia in vitro. De microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet in platen met 96 putjes kan een high-throughput-benadering zijn om de mechanismen en functie van microglia-interacties met neuronen te ondervragen in de context van de gezondheid en ziekte van het CZS, waaronder MS.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JP erkent financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het University of Saskatchewan College of Medicine. YD erkent financiële steun van het University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) en Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Figuur 1A, Figuur 2A en Figuur 3A zijn gemaakt met BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm Petri dish Fisher 07-202-011Steriele
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401
Dissection microscopeVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacytometerHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 21083027
Macrophage colony stimulating factor Peprotech315-02
Micro-ForcepsRWDF11020-11Geautoclaveerd/Steriele
Non-essential amino acidsCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide SigmaP3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
Spring scissorsRWDS11008-42Geautoclaveerd/Steriele
Surgical bladeFeather08-916-5DSteriele
T-25 flasksFisher10-126-9
T-75 flasks Fisher13-680-65
Tissue forcepsCodman30-4218Geautoclaveerd/Steriele
Tissue scissorsRWDS12052-10Geautoclaveerd/Steriele
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Trypsin (2.5%)ThermoFisher Sci15090046
Widefield Immunofluorescence MicroscopeZeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Co cultuur van microglia en neuronengemengde gliacultuurisolatie van hersenhomogenaatimmunofluorescentiemicroscopielive imagingRNA assayseiwitassaysinteracties tussen neuronen en microglia

Gerelateerde artikelen