Method Article

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

DOI:

10.3791/67079

⸱

November 22nd, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Parasitology Laboratory, School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research and National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de mechanismen om het effect van medicijnen door de malariaparasiet te ondermijnen, is door het transcriptoom opnieuw te bekabelen. Het effect is meer uitgesproken voor doelgenen die behoren tot de familie van de multigenen. Plasmodium falciparum-eiwitkinasen die tot de CDPK-familie behoren, zijn essentieel voor de ontwikkeling van het bloedstadium. Als zodanig worden CDPK's beschouwd als goede doelwitten voor de ontwikkeling van antimalariamiddelen. De chemisch-genetische benadering is in het verleden gebruikt om de functie van eiwitkinasen in hogere eukaryoten op te helderen. Het vereist de vervanging van poortwachterresidu door een ander aminozuur met een andere zijketen door middel van genetische manipulatie. Aminozuursubstitutie op de poortwachterspositie moduleert de activiteit van een eiwitkinase en verandert de gevoeligheid ervan voor een specifieke klasse van verbindingen die bekend staan als bumped kinaseremmers (BKI's) die helpen bij de functionele identificatie van het doelgen. Hier hebben we de chemisch-genetische benadering gebruikt om compensatiemechanismen te begrijpen die zijn geëvolueerd door een gemuteerde parasiet die een hypomorf allel van cdpk1 herbergt. Over het algemeen helpt onze aanpak bij het identificeren van compenserende routes die tegelijkertijd kunnen worden aangepakt om de ontwikkeling van geneesmiddelresistentie tegen individuele kinasen te voorkomen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria is een van de belangrijkste infectieziekten die verantwoordelijk is voor miljoenen doden per jaar, vooral bij kinderen jonger dan5 jaar. Er is geen klinisch beschikbaar vaccin tegen malaria. Bovendien is bekend dat Plasmodium falciparum, de dodelijkste menselijke malariaparasiet, resistentie heeft verworven tegen het eerstelijnsmedicijn artemisinine 2,3,4,5. Er is een dringende noodzaak om nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen en nieuwe strategieën te identificeren die snel kunnen worden ingezet om de verspreiding van artemisinineresistentie wereldwijd te voorkomen. Een beter begrip van het werkingsmechanisme van geneesmiddelen en de moleculaire basis van compensatieroutes kan helpen bij het bedenken van betere strategieën om de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen te voorkomen.

Eiwitkinasen die behoren tot de familie van calciumafhankelijke eiwitkinasen (CDPK's) zijn cruciaal in veel stadia van de ontwikkeling van parasieten tijdens erytrocytaire, seksuele en pre-erytrocytaire stadia6. Tijdens ongeslachtelijke replicatie van P. falciparum, CDPK5 staat erom bekend een cruciale rol te spelen bij het verlaten van merozoïeten uit volwassen schizonten7. Voorwaardelijke deletie van CDPK5 staat schizonten niet toe om merozoïeten in de bloedbaan af te geven, wat leidt tot de dood van de parasiet. Het moleculaire mechanisme van CDPK5-gemedieerde uittreding van parasieten wordt niet volledig begrepen en wordt verondersteld proteïnekinase G (PKG) als stroomopwaartse regulator te betrekken 7,8. CDPK7 is essentieel voor de rijping van ringstadiumparasieten tot trofozoiet9. CDPK4 is een ander lid van de CDPK-familie dat van cruciaal belang is voor de ontwikkeling van de seksuele fase bij muggen. Het is betrokken bij meerdere stappen tijdens het exflagellatieproces en is daarom van cruciaal belang voor de vorming van vrije, beweeglijke, mannelijke gameten 10,11,12,13. CDPK1 fosforylaatcomponenten van het binnenmembraancomplex en rhoptry14,15. Bovendien resulteert voorwaardelijke deletie van CDPK1 in hypofosforylering van eiwitten die betrokken zijn bij invasie van RBC16. Van CDPK1 is aangetoond dat het de afvoer van apicale organellen tijdens het invasieproces reguleert17. CDPK1 helpt ook bij het verlaten van merozoïeten uit geïnfecteerde RBC door SERA5-protease te fosforyleren18. Gefosforyleerd CDPK1 is bij voorkeur gelokaliseerd aan het apicale uiteinde van merozoiet, waar het kan interageren met andere parasieteiwitten die nodig zijn voor het invasieproces19,20. CDPK1 is ook betrokken bij de vorming van mannelijke en vrouwelijke gameten, wat een cruciale stap is voor de overdracht van malaria en de seksuele ontwikkeling van de parasiet bij muggen.

De chemisch-genetische benadering is van oudsher gebruikt voor de identificatie van functionele rollen van zoogdierkinasen22,23. De aanpak maakt gebruik van de vervanging van een residu op de poortwachterpositie door een aminozuur van een andere zijketen. De verandering van poortwachterresidu moduleert de grootte van een aangrenzende ATP-pocket die op zijn beurt de toegankelijkheid van chemische verbindingen, bumped kinaseremmers (BKI's) genaamd, naar het mutante enzym verandert in vergelijking met het wildtype. Vervanging van een volumineus residu op de poortwachterpositie door een kleiner residu geeft toegang tot BKI's, terwijl omgekeerde substitutie het kinase resistent maakt tegen BKI's. In sommige gevallen wordt de vervanging van poortwachtersresidu geassocieerd met een afname van de kinase-activiteit van het doelenzym, waardoor de modificatie intolerant wordt voor functionele studies24,25. Het negatieve effect van gatekeeper-substitutie op de enzymactiviteit kan worden omgekeerd door suppressormutatie te genereren op een tweede plaats in het intolerante kinase25. Een chemische-genetische benadering is gebruikt om de functie van Apicomplexan-eiwitkinasen te bestuderen. Het wildtype CDPK4 dat een kleiner poortwachterresidu bevatte, werd selectief geremd door gebumpte kinaseremmers BKI-1 en 1294, wat leidde tot een blokkade in de mannelijke gametogenese en de ontwikkeling van oöcysten11,12. Vervanging van een klein poortwachterresidu in CDPK4 door een volumineus methionineresidu leidde tot een afname van BKI-gemedieerde remming bij exflagellatie11. CDPK1 van Toxoplasma gondii, een Apicomplexan-parasiet die nauw verwant is aan de malariaparasiet, bleek betrokken te zijn bij de beweeglijkheid en invasie van gastheercellen door tachyzoïeten26,27. Een kleinere poortwachterszak van het wildtype TgCDPK1 werd benut om specifieke remmers te ontwerpen die de pathogenese van de ziekte in diermodellen verminderden 28,29. Betrokkenheid van P. Falciparum Proteïnekinase G (PKG) in de late schizogonische ontwikkeling en gametenvorming werd aangetoond door de activiteit van het enzym te remmen met behulp van specifieke farmacologische remmers30,31. Substitutie van threonine op de poortwachterspositie door glutamine (T618Q) verminderde de gevoeligheid van het mutante enzym voor de remmers aanzienlijk, wat resulteerde in normale gametogenese en progressie van schizont naar ring30,31.

De meeste van de eerdere studies hebben gebruik gemaakt van een chemisch-genetische benadering voor de functionele karakterisering van doelkinasen 11,12,22,23,26,30,31 We hebben deze benadering echter aangenomen om de ontwikkeling van compensatiemechanismen te begrijpen bij parasieten die een hypomorf allel van een eiwitkinase herbergen. We toonden eerder aan dat substitutie van wild-type gatekeeper residu in CDPK1 door methionine (T145M) resulteert in ~ 47% afname van het transfosforyleringspotentieel van het mutante enzym32. Een mutante parasiet die het hypomorfe allel van cdpk1 (cdpk1t145m) bevat, is vooraf aangepast voor de verminderde activiteit van CDPK1 door transcriptionele herbedrading van andere CDPK-familieleden. Wij zijn van mening dat deze strategie in het algemeen kan worden gebruikt om de compensatiemechanismen op te helderen in mutante parasieten die hypomorfe allelen van essentiële eiwitkinasen bevatten. Andere kinasen die de functie van het doelkinase gedeeltelijk compenseren, kunnen tegelijkertijd met het doelkinase worden geremd om de ontwikkeling van geneesmiddelresistentie tegen individuele kinasen te voorkomen. Dit kan dienen als een betere strategie voor malariabestrijding.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De P. falciparum parasiet stam (NF54) werd verkregen van Alvaro Molina Cruz 21,32,33. O+ menselijke rode bloedcellen die voor de parasietencultuur werden gebruikt, werden verkregen van het Rotary Blood Centre, New Delhi, India. De plasmiden, pL6eGFP en pUF1, werden verkregen van Jose-Juan Lopez-Rubio. DSM267 werd verkregen van Margaret A. Phillips en Pradipsinh K. Rathod. WR99210 werd verzorgd door Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Opbouw van plasmide voor expressie van recombinant CDPK1 in Escherichia coli

  1. Ontwerp het oligonucleotide-primerpaar om het volledige CDS van het cdpk1-gen te amplificeren (PlasmoDB-toetredingsnr. PF3D7_0217500) met behulp van primeranalysesoftware.
    1. Amplificeer het volledige CDS met behulp van DNA-polymerase met genspecifiek oligonucleotidepaar: Pk1fpgex en Pk1rpgex (zie tabel 1) met behulp van cDNA bereid uit Plasmodium falciparum als sjabloon in een reactievolume van 20 μL. Stel de PCR-amplificatievoorwaarden als volgt in: Initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 2 min, (Denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s, Gloeien bij 52 °C gedurende 20 s, Verlenging bij 62 °C gedurende 20 s) x 36, Definitieve verlenging bij 62 °C gedurende 10 min. Bewaar het PCR-product bij 4 °C tot verder gebruik.
  2. Verteer 1 μg van het geamplificeerde PCR-product en 1 μg van het pGEX4T1-expressieplasmide met BamHI (20.000 E/ml) en NotI (20.000 E/ml) restrictie-endonucleasen gedurende 3-4 uur bij 37 °C in een totaal reactievolume van 30 μl.
  3. Om het dubbel verteerde PCR-product en het plasmide te zuiveren, gebruikt u een PCR-opruimset op basis van kolommen en volgt u de instructies van de fabrikant.
  4. Ligate 100 ng dubbel verteerd, gezuiverd pGEX4T1-plasmide met een insert in een vector-tot-insert-molaire verhouding van 1:5 met behulp van 1 μL T4-DNA-ligase in een totaal reactievolume van 10 μL. Incubeer de ligatiereactie bij 16 °C 's nachts.
  5. Transformeren E. Coli DH5α-competente cellen met het geligeerde mengsel volgens het protocol van de fabrikant en plaat op LB-agarplaten die ampicilline bevatten (100 μg/ml).
  6. Screen vier bacteriële klonen verkregen uit de transformatie op de aanwezigheid van het recombinante plasmide door het plasmide te zuiveren met behulp van een mini-plasmidezuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Bevestig het recombinante plasmide door dubbele restrictievertering met behulp van BamHI en NotI, zoals hierboven beschreven in stap 1.3.
  7. Controleer verder de restrictie-spijsverteringspositieve klonen voor de juiste sequentie door middel van Sanger DNA-sequencing. Transformeren E. Coli BLR(DE3) pLysS-competente cellen met het sequentie-geverifieerde plasmideconstruct voor CDPK1-eiwitexpressie.

2. Expressie en zuivering van recombinant CDPK1-eiwit in E. coli

  1. Expressie van recombinant CDPK1
    1. Inoculeer een enkele kloon van E. Coli BLR(DE3) pLysS-stam die het sequentiegeverifieerde plasmideconstruct bevat, in 10 ml LB-medium dat ampicilline bevat (100 μg/ml). Incubeer de cultuur een nacht bij 37 °C met schudden bij 200-250 tpm.
    2. Inoculeer de secundaire cultuur met 1% van de primaire cultuur en laat de bacteriecellen bij 37 °C uitgroeien tot de mid-log-fase. Wanneer de optische dichtheid (OD) van de secundaire cultuur 0,7-0,9 bereikt bij 600 nm, induceert u de expressie van het recombinante CDPK1 over de volledige lengte door 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen en gedurende 10-12 uur bij 24 °C te incuberen.
    3. Oogst na de incubatie de E. coli-cellen door centrifugatie bij 5.000 x g gedurende 10 min. Decanteer het supernatans en bewaar de celkorrel.
    4. Bereid de lysisbuffer voor met de volgende samenstelling: 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,1 mg/ml lysozym, 1 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en een 1x proteaseremmercocktail in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    5. Resuspendeer de celpellet in 10 keer het pelletgewichtsvolume van de lysisbuffer. Sonificeer de celsuspensie gedurende 15 minuten met tussenpozen van 9 s aan, 15 s uit om plaatselijke verhitting te voorkomen die kan leiden tot eiwitdenaturatie.
    6. Centrifugeer het lysaat bij 17.000 x g gedurende 1 uur en incubeer het heldere supernatans met glutathionkorrels een nacht bij 4 °C. Volg het onderstaande protocol om gezuiverd recombinant CDPK1-eiwit te verkrijgen.
  2. Affiniteitschromatografie met behulp van glutathionkorrels voor zuivering van GST-gelabeld CDPK1
    1. Neem 500 μl volledig geresuspendeerde glutathionkorrels voor 250 ml bacteriecultuur en centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Decanteer de supernatant voorzichtig.
    2. Was de korrels met 5 ml bindbuffer (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) en keer om om te mengen.
    3. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal het wassen en centrifugeren 3x-4x.
    4. Voeg de korrels toe aan het lysaat van de bacteriecel en incubeer gedurende 12 uur bij 4 °C met licht schudden (20-30 rpm).
    5. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Het supernatans kan worden bewaard om de hoeveelheid recombinant CDPK1 te schatten die ongebonden blijft.
    6. Was de CDPK1-gebonden kralen minstens 5-6 keer met PBS met 1 mM DTT, gevolgd door een wasbeurt met 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.5.
    7. Elute het gebonden eiwit 2x, eerst met 250 μL elutiebuffer 1 (EB1), gevolgd door 2x met 250 μL elutiebuffer 2 (EB2). De samenstelling van EB1 en EB2 is 10 mM gereduceerd glutathion in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5 en 20 mM verlaagd glutathion in respectievelijk 50 mM Tris, 100 mM NaCl en pH 7,5.
    8. Incubeer de CDPK1-gebonden korrels in elutiebuffers 1 en 2 bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5-10 minuten met behulp van zachte agitatie of end-over-end rotatie.
    9. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en breng het supernatans met het geëlueerde CDPK1-recombinante eiwit voorzichtig over in een apart buisje.
    10. Herhaal stap 2.2.8 en 2.2.9 om 2 eluen te verkrijgen met elk EB1 en EB2.

3. Site-directed mutagenese voor het genereren van recombinante CDPK1 gatekeeper mutante eiwitten

  1. Gebruik het pGEX4T1-plasmide met sequentiegeverifieerd cdpk1-gen . We geven de voorkeur aan hetzelfde plasmide dat werd gebruikt voor de transformatie van de E. coli BLR(DE3) pLysS-stam.
  2. Ontwerp de primers om een poortwachtersmutatie te introduceren in de wildtype cdpk1-gensequentie. Het wild-type gatekeeper residu (T145) wordt gecodeerd door een ACC-codon in het cdpk1-gen . Vervang de threonine-poortwachter door kleine (serine, T145S) en omvangrijke (methionine, T145M) poortwachtersresiduen die worden gecodeerd door respectievelijk AGC- en ATG-codons.
  3. Volg de onderstaande richtlijnen om de voorwaartse en de omgekeerde primers te ontwerpen voor site-directed mutagenese.
    1. Zorg ervoor dat beide primers complementair aan elkaar zijn. Houd 15-20 nucleotiden van niet-gemodificeerde sequentie aan beide zijden van de mutatie. Zorg ervoor dat Tm tussen 50 °C en 55 °C is voor de sequentie, met uitzondering van de gemuteerde locatie.
  4. Gebruik de site-directed mutagenese kit om de gatekeeper mutant constructen van cdpk1 te genereren. Volg de instructies van de fabrikant om de gewenste mutatie te introduceren. De primers die worden gebruikt voor site-directed mutagenese zijn vermeld in tabel 1.
  5. Behandel het reactiemengsel met het enzym 0,5 μL DpnI (20.000 E/ml) om het ouderale, gemethyleerde plasmide te verteren. Incubeer het reactiemengsel bij 37 °C gedurende 3 uur. Transformeer E. coli DH5α-competente cellen met het met DpnI behandelde reactiemengsel.
  6. Screen vier klonen van T145M- en T145S-plasmideconstructies om de introductie van de gewenste mutatie in de cdpk1-gensequentie te verifiëren door middel van DNA-sequencing.
  7. Transformeer de sequentiegeverifieerde plasmiden in de E. coli BLR(DE3) pLysS-stam voor expressie van de recombinante CDPK1 T145M/S-eiwitten zoals beschreven in stap 1.5.
  8. Breng de mutante eiwitten van de CDPK1-poortwachter tot expressie en zuiver ze volgens de stappen die zijn beschreven in sectie 2 voor het wildtype CDPK1-eiwit.

4. In vitro kinase-activiteitsbepaling van CDPK1

OPMERKING: De kinase-activiteit van recombinant wildtype CDPK1 en de poortwachtersmutante eiwitten wordt geëvalueerd door middel van een semisynthetische epitooptagging-benadering zoals beschreven door Allen et al.34.

  1. Incubeer 50 ng recombinant eiwit in de buffer met 50 mM Tris, 50 mM MgCl2, 1x fosfaatremmercocktail met 2 μg myelinebasisch eiwit (MBP) als exogeen substraat van CDPK1 in het totale reactiemengsel van 50 μL.
  2. Afhankelijk van de omstandigheden die de aan- of afwezigheid van calcium vereisen, voegt u respectievelijk CaCl2 of EGTA toe om de uiteindelijke concentratie van elk 2,5 mM in de kinase-analysebuffer te bepalen. Voeg ATPγS toe aan de eindconcentratie van 100 μM aan de buffer om het te gebruiken als bron van de overdraagbare eindfosfaatgroep.
  3. Incubeer het reactiemengsel bij 30 °C in een waterbad gedurende 1 uur, gevolgd door beëindiging van de reactie door toevoeging van 5 mM EGTA. Voeg 5 μl 50 mM p-nitrobenzylmesylaat (PNBM) toe aan het reactiemengsel en laat het gedurende 2 uur bij 20 °C in een waterbad incuberen voor de alkylering van de gefosforyleerde serine- en threonineresiduen in de transfosforylerings-MBP en autogefosforyleerde CDPK1.
  4. Voeg aan het totale reactiemengsel van 55 μl 19 μl 4x SDS-monsterbuffer toe en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C.

5. Western blot-analyse om de thio-gefosforyleerde producten van de in vitro kinasetest te detecteren

  1. Bereid 12% SDS-PAGE gel en laad 15 μL van elk monster. Scheid het reactiemengsel om autogefosforyleerd CDPK1 en getransfosforyleerd MBP te visualiseren.
  2. Breng de gescheiden eiwitten van de SDS-PAGE-gel over naar een PVDF-membraan met behulp van de natte overdrachtsmethode32.
  3. Blokkeer de niet-specifieke plaatsen op het PVDF-membraan door het te incuberen met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl) met 0,05% Tween 20 gedurende 1 uur bij RT.
  4. Incubeer het PVDF-membraan met het primaire antilichaam van het konijn tegen gealkyleerde thiofosforyleerde adducten in een verdunning van 1:2.500 's nachts bij 4 °C in de blokkeringsbuffer.
  5. Was de dep na een nacht incubatie 3x met Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 gedurende elk 10 minuten.
  6. Incubeer de dep verder met secundair antilichaam tegen konijnen van geiten in blokkeerbuffer in een verdunning van 1:5.000 gedurende 1 uur bij RT, gevolgd door wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween 20 bevat.
  7. Bedek de vlek met chemiluminescent substraat door een gelijke verhouding van oplossing A en oplossing B te mengen volgens de instructies van de fabrikant en belicht op röntgenfilm in een donkere kamer om signalen van CDPK1-autofosforylering en MBP-transfosforylering te verkrijgen.

6. Klonen van de gidssequentie voor het targeten van  cdpk1-locus voor de introductie van gatekeeper-substitutie

OPMERKING: De gidssequentie van 20 nucleotiden werd geselecteerd door handmatige curatie en gekloond in pL6eGFP-plasmide op de BtgZI-locatie door de volgende stappen uit te voeren.

  1. Vertering van pL6eGFP met behulp van BtgZI-enzym
    1. Verteer 1 μg pL6eGFP-plasmide35 met 1 μL BtgZI-enzym (5.000 eenheden/ml) gedurende 4 uur bij 60 °C in een reactiemengsel van 20 μl, volgens het protocol van de enzymfabrikant voor reactieomstandigheden.
    2. Laat na de incubatietijd van 4 uur het verteerde plasmide op een 1% agarosegel lopen en snijd het gelstuk (~ 9,8 kb) met het verteerde plasmide weg. Zuiver het verteerde plasmide met behulp van een op kolommen gebaseerde gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Gloeien van oligo's
    1. Reconstitueer de oligonucleotiden (Ck1GUIDEFWD en Ck1GUIDEREV) in DNase/RNase-vrij water om een 100 μM stockoplossing te bereiden.
    2. Combineer 20 μM van elke oligonucleotide in een oplossing die 10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl en 1 mM EDTA bevat. Incubeer het mengsel bij 95 °C in een droog bad gedurende 5 minuten en laat de reactie afkoelen tot kamertemperatuur. Het duurt meestal 1 uur voordat de temperatuur van het reactiemengsel RT bereikt.
    3. Verdun de gegloeide oligonucleotiden tot 0,5 μM in Tris pH 8,0, wat resulteert in een totaal reactiemengselvolume van 100 μl.
  3. Infusie reactie
    1. Combineer 1,5 μL verdunde oligonucleotiden met 100 ng BtgZI-verteerd gelineariseerd plasmide in 5x In-Fusion-enzympremix in een totaal reactievolume van 10 μL om een CDPK1-gids te genereren die pL6CK1G-plasmide bevat.
    2. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 50 °C. Bewaar de reactie bij 4 °C totdat de transformatie van E wordt uitgevoerd. coli.
      OPMERKING: Voor langdurige opslag kan het reactiemengsel worden bewaard bij -20 °C.
  4. Transformatie van E. Coli Stellaire competente cellen
    1. Voeg 2,5 μl van het reactiemengsel toe aan de E. Coli Stellaire competente cellen en ga verder met het transformatieproces volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Leg de getransformeerde competente cellen op de LB-ampicilline (100 μg/ml) plaat en laat de getransformeerde bacteriën een nacht bij 37 °C groeien.
    3. Selecteer de getransformeerde kolonies en extraheer het plasmide met behulp van een in de handel verkrijgbare plasmide miniprep-kit. Volg de instructies van de fabrikant voor plasmidezuivering. Valideer de invoeging van de gids in het plasmide door middel van Sanger-DNA-sequencing.

7. Klonen van de homologie-arm voor reparatie van Cas9-endonuclease-beperkte cdpk1-locus

OPMERKING: Een homologie-arm bestaande uit de SNP's die in de doellocus moeten worden geïntroduceerd, wordt commercieel gesynthetiseerd. We nemen meestal een homologie-arm van 400-1000 bp lang. De homologie-arm bevat stille mutaties in het gids-RNA-gebied en PAM om te voorkomen dat de gemodificeerde locus opnieuw wordt doorgesneden na de incorporatie van de gewenste SNP's. De homologie-arm (overeenkomend met nucleotiden 133 tot 553 van CDPK1), die Met- of Ser-poortwachtermutatie en stille mutaties omvat, wordt geflankeerd door AflII- en SpeI-restrictieplaatsen.

  1. Dubbelverteer 1 μg pL6CK1G en het plasmide met de homologie-arm met behulp van 0,5 μL elk AflII (20.000 E/ml) en SpeI (20.000 E/ml) restrictie-enzymen gedurende 4 uur bij 37 °C in een reactiemengsel van 20 μL.
  2. Voer de volledige reactie van dubbelverteerde plasmiden uit op 1,5 % agarosegel en zuiver de banden die overeenkomen met de homologie-arm en de plasmide-ruggengraat van pL6CK1 met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Verbind de verteerde homologie-arm met 100 ng pL6CK1-plasmide in een vector-tot-insert-verhouding van 1:5 in een totaal reactievolume van 10 μL met behulp van T4-DNA-ligase. Incubeer de ligatiereactie 's nachts bij 16 °C. Transformeer E. coli DH5α-competente cellen met het volledige ligatiemengsel volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Leg de getransformeerde cellen op LB-agarplaten die ampicilline (100 μg/ml) bevatten om positieve transformaties te selecteren. Selecteer enkele kolonies van de LB-ampicillineplaat en zuiver het plasmide met behulp van een plasmide-extractiekit.
  5. Bevestig de kloon op de aanwezigheid van de homologie-arm door het gezuiverde plasmide te verteren met AflII- en SpeI-enzymen onder dezelfde verteringstoestand als beschreven in stap 7.3. Bevestig de dubbele vergistingspositieve klonen verder door Sanger DNA-sequencing om de volledige sequentie van de homologie-arm te valideren.

8. Zuivering van pL6CK1Met, pL6CK1Ser en pUF1 plasmiden voor transfectie van malariaparasieten

  1. Stel 5 ml primaire culturen van sequentiegeverifieerde klonen van pL6CK1Met, pL6CK1Ser en pUF1 in LB-media die ampicilline bevatten (100 μg/ml) in en incubeer gedurende 10 uur. Breng de primaire cultuur over naar de secundaire cultuur in een verhouding van 1:1000 en incubeer nog 12 uur.
  2. Pelleteer de bacteriecultuur door centrifugeren bij 5000 x g gedurende 10 minuten in een centrifugefles.
  3. Isoleer de plasmiden met behulp van een plasmidezuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant. Los het plasmide-DNA op in DNase/RNase-vrij water voor directe transfectie van de parasiet.

9. In vitro kweek van Plasmodium falciparum en sorbitol synchronisatie voor transfectie

OPMERKING: P. falciparum in vitro kweek in menselijke rode bloedcellen (RBC's) wordt uitgevoerd volgens de methode beschreven door Trager en Jensen36.

  1. Vermeerder NF54-stam van P. falciparum door kweek in O+ humane RBC's bij een hematocriet van 2% in volledig RPMI (cRPMI) medium dat RPMI 1640 bevat, aangevuld met L-glutamine, 25 mM HEPES, 25 mM natriumbicarbonaat en 50 μg/ml hypoxanthine. Vul het medium aan met 0,5 % AlbuMAX II en 10 μg/ml gentamicine en houd de cultuur op 37 °C onder een atmosfeer van 5% O2, 5 % CO2 en 90 % N2.
  2. Voor sorbitolsynchronisatie om ringstadiumparasiet te verkrijgen, pelleteert u de asynchrone parasieten in een conische buis van 50 ml door centrifugatie bij 2.300 x g gedurende 3 minuten bij RT. Gooi de supernatant weg.
  3. Incubeer de geparasiteerde rode bloedcellen met 9 volumes 5% sorbitol gedurende 10 minuten bij 37 °C. Na incubatie worden de rode bloedcellen gedurende 3 minuten gecentrifugeerd bij 2.300 x g en de sorbitol weggegooid.
  4. Was de met sorbitol behandelde parasieten met onvolledige RPMI, iRPMI (RPMI-media zonder albumax en natriumbicarbonaat) en incubeer ze vervolgens in cRPMI. Gebruik de parasieten in het ringstadium in de volgende cyclus voor plasmidetransfectie.

10. Transfectie van ringstadiumparasiet met pL6CK1Met-, pL6CK1Ser- en pUF1-plasmiden

OPMERKING: De volgende stappen worden gebruikt voor de directe transfectie van ringstadiumparasieten met plasmide-DNA.

  1. Bereid 2x cytomixbuffer37 voor door op te lossen in 30 ml water, 240 mM KCl, 0,3 mM CaCl2, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mM K2HPO4/KH2PO4 en 50 mM HEPES. Stel de pH in op 7,6. Stel het uiteindelijke volume in op 50 ml. Filter steriliseer de buffer met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Verdun vervolgens de 2x cytomixbuffer met steriel water om een 1x cytomix-buffer te verkrijgen.
  2. Voeg in een steriele conische buis van 15 ml 100 μl verpakte ringgefaseerde geparasiteerde RBC's toe en was ze 2x met 5 ml 1x cytomixbuffer. Voer de wasbeurten uit door centrifugeren bij 994 x g gedurende 3 minuten bij RT.
  3. Verwijder na het wassen de buffer en voeg 50 μg van elk plasmide (pL6CK1Met/pUF1 voor het genereren van T145M-mutatie en pL6CK1Ser/pUF1 voor het genereren van T145S-mutatie) toe aan de verpakte geparasiteerde RBC's. Voeg vervolgens 2x buffer toe volgens het volume plasmide en pas het volume aan naar 400 μL met 1x bufferconcentratie.
  4. Breng 400 μl van de bovenstaande oplossing over in cuvetten van 0,2 cm voor elke transfectie. Elektroporaat met behulp van de volgende voorwaarden: 0.31 kV, 950 μF en weerstand ingesteld op Oneindig.
  5. Verwijder na elektroporatie de getransfecteerde parasieten uit de cuvet, meng ze met cRPMI en breng ze over in een T25-kolf met een totaal volume van 15 ml. Incubeer de parasieten gedurende 2 uur onder de in stap 9.1 genoemde omstandigheden.
  6. Breng de getransfecteerde parasieten na incubatie over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 3 minuten bij 994 x g . Verwijder het supernatans en was de parasieten met 10 ml onvolledige RPMI. Kweek ze gedurende 2 dagen met verse cRPMI en vul het kweekmedium na 24 uur aan.
  7. Verwijder na 48 uur de cRPMI uit elke kolf en resuspendeer de cultuur in cRPMI met 2 nM WR99210 en 150 nM DSM26738. Breng de cultuur vervolgens over in een T75-kolf door 400 μL verse RBC's toe te voegen. Vul de media dagelijks aan met cRPMI bevattende WR99210 en DSM267 gedurende 7 dagen. Voeg vervolgens om de dag cRPMI toe die beide geneesmiddelen bevat tot dag 14 na de transfectie.
  8. Op dag 14 aliquot 200 μL getransfecteerde cultuur in een 1,5 ml microcentrifugebuis (MCT) voor de bereiding van objectglaasjes. Pellet de cellen door centrifugatie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het supernatans op en breng de cellen over op het objectglaasje. Maak een uitstrijkje met een ander objectglaasje door het in een hoek van 45° te plaatsen.
  9. Fixeer het glaasje in methanol en bereid de Giemsa-vlek voor door deze 1:10 te verdunnen in ultrapuur water. Kleurs de dia vervolgens door deze 20 minuten volledig onder te dompelen in de Giemsa-vlek. Was de glijbaan onder stromend water en droog hem goed af. Bekijk vervolgens het objectglaasje onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 100x door immersieolie aan te brengen.
  10. Zodra de parasieten zijn gevisualiseerd, vult u de media dagelijks aan en laat u ze 2-3 dagen groeien. Verwijder vervolgens de parasieten om de gewenste wijziging in de doelgensequentie op de beoogde locus te verifiëren.
    OPMERKING: Als de parasieten op dag 14 niet zichtbaar zijn, vul dan de media (die beide geneesmiddelen bevatten) na 4 dagen aan. Verminder de parasiet met 30% en voeg vers bloed toe om elke 7 dagen 2% hematocriet te behouden totdat de parasieten weer verschijnen.

11. PCR-verificatie van transgene parasiet met gewenste modificatie van cdpk1-locus

  1. Na 2-3 dagen van parasitaire groei, neem je 500 μL cultuur eruit en breng je deze over in een MCT van 1,5 ml.
  2. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 2.400 x g gedurende 5 min. Lyseer vervolgens de rode bloedcellen door middel van saponinebehandeling.
    1. Voeg voor de saponinebehandeling 10 μl 10% saponineoplossing toe aan 1 ml geresuspendeerde parasietenkorrel en houd deze gedurende 5 minuten op 4 °C. Centrifugeer de cellen bij 2.400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap totdat de roodheid volledig is verdwenen en een zwartgekleurde korrel van parasieten is verkregen.
  3. Was de parasietenkorrel met 1 ml 1x PBS door centrifugeren op 2.400 x g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet daarna in 50 μL DNase/RNasevrij water. Verwarm de geresuspendeerde parasietenkorrel bij 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door centrifugeren bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het supernatans dat parasitair DNA bevat over in een vers buisje.
  4. Gebruik het bovenstaande genetische materiaal om het gen van volledige lengte te PCR-amplificeren met behulp van de primerset ck1f1 en ck1r3wt (zie tabel 1), specifiek gericht op het gebied buiten de homologie-arm zoals hierboven beschreven in stap 1.2. Sequentie van het homologiegebied dat de T145M-mutatie bevat met behulp van de ck1f1-primer .

12. Beperking van de verdunning voor het verkrijgen van klonale transgene parasieten

  1. Verdun na sequentieverificatie de getransfecteerde parasietcultuur tot een eindconcentratie van 1 parasiet per 200 μl. Voeg vervolgens 100 μL van de verdunde cultuur toe aan de putjes van een weefselkweekplaat met 96 putjes. Voer de volgende stappen uit (12.2-12.4) om 1 parasiet/200 μL te bereiken.
  2. Bereid 10 ml geparasiteerde rode bloedcellen met 2% hematocriet. Schat het percentage parasitemie van de cultuur met behulp van de hierboven beschreven Giemsa-kleuringsmethode. Tel vervolgens het totale aantal RBC's in een verdunde cultuur van 1:100 met behulp van een hemocytometer.
    Totaal aantal rode bloedcellen/ml = Gemiddeld aantal getelde rode bloedcellen x verdunningsfactor x 104
    Aantal geparasiteerde rode bloedcellen/ml = (percentage parasitemie x totaal aantal rode bloedcellen/ml)/100
  3. Bereid 1:10.000 verdunning van geparasiteerde rode bloedcellen voor door de initiële cultuur 2x serieel te verdunnen (1:100 verdunning elk).
  4. Voeg een geschikt volume (in microliters) van de verdunde cultuur toe om in totaal 50 parasieten in 10 ml media te verkrijgen, zorg voor 2% hematocriet. Voeg vervolgens 100 μL van het medium met 50 parasieten toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes. Plaats de plaat in een luchtdichte secador gespoeld met gemengd gas (samenstelling zoals hierboven beschreven in stap 9.1) en incubeer bij 37 °C. Vervang de media na elke 2 dagen.
  5. Vervang de media elke 7e dag door cRPMI met 2% hematocriet totdat de parasieten verschijnen.
    1. Kantel de plaat met 96 putjes in een hoek van 45° en laat de RBC's tot rust komen. Verwijder met een serologische pipet voorzichtig de media uit elk putje en observeer een kleurverandering naar geel in putjes die parasieten bevatten, in contrast met de roze kleur van media in parasietvrije putjes. Deze kleurverandering treedt op doordat de parasieten het medium verzuren.
  6. Nadat u de kleurverandering hebt waargenomen, haalt u een kleine hoeveelheid cultuur uit de put die kleurverandering vertoont en bereidt u een uitstrijkje voor op een objectglaasje, waarbij u het labelt met een nummer dat overeenkomt met de positie van de put. Kleur het objectglaasje met Giemsa-kleuring en bekijk het onder een microscoop zoals hierboven beschreven.
  7. Breng de inhoud van het putje over in een T25-kolf waar parasieten onder de microscoop zijn waargenomen. Laat de parasieten 4-5 dagen in de T25-kolf groeien en vul de media om de dag aan.
  8. Zodra de parasitemie 2-3% bereikt, extraheert u 500 μL parasietcultuur. Vervolgens saponine-lyseren van de rode bloedcellen en doorgaan met het extraheren van genetisch materiaal van de parasiet met behulp van de methode beschreven in sectie 11.
  9. Om de generatie van klonale transgene parasieten te bevestigen, zet u een PCR-reactie op zoals hierboven beschreven in stap 1.1.1 en stuurt u het PCR-product op voor DNA-sequencing om de introductie van de gewenste SNP's in de doellocus te bevestigen.

13. Transcriptie-analyse met behulp van Real-Time PCR

  1. Percoll/Sorbitol zuivering en synchronisatie van de parasieten
    1. Bereid een Percoll/Sorbitol Gradient39,40 voor door achtereenvolgens 3 ml van elk 70% in lagen aan te brengen, gevolgd door 40% oplossingen van percoll/sorbitol in een conische buis van 15 ml.
    2. Laag voorzichtig 1-2 ml parasietcultuur die voornamelijk de parasiet in het schizontstadium van WT en CDPK1 T145M bevat, bovenop de gradiënt.
    3. Centrifugeer de gradiënt bij 2.300 x g gedurende 15 minuten bij RT met behulp van de deversnelling die is ingesteld op 4 in centrifuge in een zwenkbare bakrotor.
    4. Verzamel de middelste ring met trofozoiet- en schizontstadia van de parasiet van het grensvlak van de gradiënt in een verse kegelvormige buis van 50 ml.
    5. Was de parasieten door een gelijk volume van 9:1 (cRPMI:10xPBS) toe te voegen en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten op 994 x g om de parasieten te pelleteren.
    6. Was de pellet opnieuw met een oplossing van 19:1 (cRPMI: 10xPBS) en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten op 994 x g .
    7. Voeg elke parasietkorrel toe aan afzonderlijke kolven die cRPMI met 2% hematocriet bevatten (voorgeïncubeerd bij 37 °C). Incubeer de kolven gedurende 4 uur onder de omstandigheden zoals hierboven beschreven in stap 9.1 om de invasie van merozoïeten uit de verrijkte schizonten in verse rode bloedcellen mogelijk te maken.
    8. Behandel de parasieten na 4 uur met sorbitol zoals hierboven beschreven in stappen 9.2-9.4 om sterk gesynchroniseerde 0-4 uur ringstadiumparasieten te verkrijgen.
    9. Incubeer de gesynchroniseerde parasieten gedurende 44 uur na de sorbitolbehandeling om het 44 - 48 uur schizont-stadium van de parasiet te verkrijgen.
  2. RNA-isolatie uit schizonten van zowel WT- als CDPK1 T145M-parasieten
    1. Oogst de WT- en CDPK1 T145M-parasieten 44-48 uur na de invasie. Was de parasietenkorrels met 1x PBS op 994 x g gedurende 5 minuten op 4 °C.
    2. Resuspendeer de parasietpellets in 1 ml 1x PBS en behandel ze met saponine om de omringende rode bloedcellen te lyseren zoals beschreven in stap 11.2.1.
    3. Resuspendeer de parasietpellet in 1 ml RNA-extractiereagens en bewaar bij -80 °C tot verdere verwerking.
    4. Ontdooi de bevroren pellet bij 15-30 °C voor volledige dissociatie van nucleoproteïnecomplexen.
    5. Voeg 200 μL chloroform per ml RNA-extractiereagens toe en schud de buisjes krachtig met de hand gedurende 15 s. Incubeer 2-3 minuten bij RT.
    6. Centrifugeer het mengsel bij 16.200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. RNA blijft uitsluitend in de kleurloze bovenste waterige laag achter. Isoleer RNA met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant.
  3. cDNA-synthese uit het RNA van WT en CDPK1 T145M-parasiet
    1. Behandel de RNA-bevattende monsters met een DNA-verwijderingskit volgens de instructies van de fabrikant om besmettend DNA te verwijderen.
    2. Synthese cDNA uit de geïsoleerde RNA-monsters met behulp van een cDNA-synthesekit volgens het protocol van de fabrikant. We gebruiken willekeurige hexameerprimers voor het omgekeerde transcriptieproces in plaats van oligo-dT-primers.
    3. Zorg voor NO-RT-controles (reacties die worden opgezet zonder toevoeging van het reverse transcriptase-enzym) voor elk RNA-monster dat wordt gebruikt voor cDNA-bereiding om de overdracht van genomische DNA-besmetting van gezuiverd RNA tijdens de cDNA-bereiding uit te sluiten.
    4. Test het cDNA door een gensegment met een tussenliggende intronische sequentie te amplificeren, zoals het cdpk1-gen van volledige lengte, om genomische DNA-besmetting uit te sluiten. Gebruik de PCR-conditie zoals beschreven in stap 1.1.1.
  4. Transcriptie-expressieanalyse van WT- en CDPK1 T145M-parasiet
    1. Gebruik het cDNA bereid uit de WT- en CDPK1 T145M-parasieten om transcriptie-expressieanalyse van 11 verschillende genen uit te voeren via real-time PCR. De 11 doelgenen omvatten 7 leden van de CDPK-familie en 4 kinasen die betrokken zijn bij de invasie van RBC (zie Tabel 2 voor genen en bijbehorende primers die worden gebruikt voor real-time PCR).
    2. Ontwerp primers met behulp van software voor het synthese van primers. Amplificeer ongeveer 120 bp van elk geselecteerd gen met behulp van genspecifieke primers met vergelijkbare smelttemperaturen.
    3. Amplificeer doelgenen met behulp van een voormengsel en laat de plaat draaien op een real-time PCR-systeem met behulp van de volgende cyclusparameters: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s, gloeien bij 52 °C gedurende 20 s en extensie bij 62 °C gedurende 30 s.
    4. Normaliseer het expressieniveau van elk gen met behulp van twee huishoudgenen, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) en threonine tRNA-ligase (ThrRS)32. Bereken de relatieve expressie van elk doelkinase in de CDPK1 T145M-parasiet in vergelijking met de WT-controle.
    5. Voer de statistische analyse uit met behulp van het statistische analysepakket R. U kunt ook andere analysesoftware gebruiken.
      OPMERKING: Wereldwijde transcriptomics-methoden zoals RNA-Seq of microarray zijn superieure benaderingen voor het verkrijgen van een breder beeld van transcriptoomherbedrading bij mutante parasieten in vergelijking met WT.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recombinant WT CDPK1 wordt tot expressie gebracht als een fusie-eiwit met een N-terminale glutathion S-transferase (GST)-tag en gezuiverd met behulp van GST-affiniteitschromatografie. Het gezuiverde CDPK1-eiwit werd gedetecteerd via Western blot met behulp van anti-CDPK1- en anti-GST-antilichamen (Figuur 1). Het threonine-gatekeeper-residu (T145) in WT CDPK1 werd vervangen door Met en Ser met behulp van plaatsgerichte mutagenese om respectievelijk CDPK1T145M en CDPK1T145S mutante recombinante eiwitten te genereren (Figuur 2). In vitro kinasetest werd uitgevoerd om de kinase-activiteit van alle recombinante CDPK1-eiwitten te evalueren. De kinase-activiteit werd getest met behulp van een semisynthetische epitooptagging-benadering34 door de thio-fosfaatestergroep te detecteren met behulp van een specifiek antilichaam in een Western blot-formaat (Figuur 3). De impact van gatekeeper-substitutie op de autofosforyleringsactiviteit van CDPK1 en de transfosforylering van MBP gebruikt als exogeen substraat van CDPK1 werd beoordeeld door de intensiteit van de respectieve autofosforylerings- en transfosforyleringsbanden te kwantificeren. Mutant CDPK1 met methionine-poortwachter behield ~ 53% transfosforyleringsactiviteit, terwijl de aanwezigheid van een serine op de poortwachterpositie leidde tot volledige opheffing van substraattransfosforylering (Figuur 3). SNP's die leiden tot gatekeeper-substitutie van Thr naar Met (T145M) werden gemanipuleerd in de endogene cdpk1-locus via CRISPR-Cas9 met behulp van een twee-plasmidesysteem (Figuur 4 en Figuur 5). Gemuteerde parasieten met T145S-substitutie konden niet worden gegenereerd, mogelijk als gevolg van het dodelijke effect van de Ser poortwachter op de CDPK1-activiteit. De CDPK1T145M mutante parasieten werden gesubkloneerd met behulp van de beperkende verdunningsmethode en de gatekeeper-substitutie werd bevestigd door middel van Sanger-sequencing om de generatie van de CDPK1T145M mutante parasiet te verifiëren. Transcriptieniveaus van 11 verschillende kinasen, waaronder 7 leden van de CDPK-familie en 4 andere kinasen die betrokken zijn bij de late schizogonische ontwikkeling van de parasiet, werden getest met behulp van real-time PCR (Figuur 6). De expressieniveaus van 11 verschillende kinasen werden vergeleken tussen de CDPK1T145M mutante en wild-type (WT) parasieten, genormaliseerd naar de huishoudgenen. De transcriptie-expressie van CDPK-familieleden was veranderd in de CDPK1T145M mutant in vergelijking met de WT-parasiet (Figuur 6). Transcripten die een hogere expressie in de CDPK1T145M mutant laten zien, kunnen de functie van CDPK1 in de CDPK1T145M mutante parasiet compenseren.

figure-results-1
Figuur 1: Karakterisering van recombinant wildtype (WT) PfCDPK1 over de volledige lengte. WT CDPK1-eiwit van volledige lengte, gefuseerd met N-terminaal glutathion S-transferase (GST)-label, werd gezuiverd door affiniteitschromatografie en gescheiden op 10% SDS-PAGE. CDPK1 migreerde naar de voorspelde molecuulmassa van ~ 87 kDa, zoals te zien is in de Coomassie Brilliant Blue R-250 gekleurde polyacrylamidegel. Recombinant eiwit gescheiden op de SDS-PAGE werd overgebracht naar een PVDF-membraan en verwerkt voor Western blot-analyse met anti-CDPK1- en anti-GST-antilichamen. Met beide antilichamen werd een band gedetecteerd die overeenkomt met de recombinante CDPK1 over de volledige lengte op SDS-PAGE, wat de identiteit van het eiwit bevestigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Karakterisering van gezuiverde recombinante CDPK1 gatekeeper mutante eiwitten. (A) Uitlijning van de primaire aminozuursequentie van TgCDPK1 en PfCDPK1 (Plasmodb toetredingsnr. PF3D7_0217500). Threonine op positie 145 van PfCDPK1 komt overeen met glycine 128, de poortwachterspositie in TgCDPK1 (rood gemarkeerd). (B) Cartoonistische weergave van het restant van de poortwachter (rood gemarkeerd) gecodeerd door tripletcodon ACC (zwarte cirkel) in WT CDPK1. Substitutie van het gatekeeper-residu door plaatsgerichte mutagenese om recombinante mutante CDPK1-eiwitten te genereren met Met (geel gemarkeerd) in CDPKT145M en Ser (blauw gemarkeerd) in CDPKT145S. (C) SDS-PAGE profiel van recombinant WT en mutante eiwitten van CDPK1. De recombinante WT- en gatekeeper-mutante eiwitten werden gezuiverd door GST-affiniteitschromatografie en gescheiden op SDS-PAGE. Alle recombinante eiwitten voldoen aan het verwachte molecuulgewicht van ~87 kDa. M- moleculaire gewichtsladder. (D) Karakterisering van recombinant CDPK1 WT en mutante eiwitten door middel van Western blotting. De recombinante WT- en gatekeeper-mutante eiwitten van CDPK1 werden gescheiden op SDS-PAGE en overgebracht naar het PVDF-membraan voor Western blotting. Banden die overeenkomen met de recombinante WT- en mutante CDPK1-eiwitten over de volledige lengte op SDS-PAGE werden gedetecteerd met anti-CDPK1- en anti-GST-antilichamen, wat de identiteit van alle recombinante eiwitten bevestigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Gatekeeper-substitutie in CDPK1 leidt tot een afname van de kinase-activiteit van mutante enzymen. (A) Cartoonistische weergave van de semi-synthetische epitoop-tagging-benadering voor het detecteren van kinase-activiteit van het CDPK1-eiwit. Alleen de transfosforyleringsactiviteit is hier afgebeeld. CDPK1-eiwit thiofosforyleert een exogeen substraat (S, massief groen vierkant) in aanwezigheid van ATPγS (solide gele driehoek), een bron van overdraagbare terminale thiofosfaatgroep). Het thiofosgefosforyleerde residu wordt gealkyleerd door behandeling met p-nitrobenzylmesylaat (PNBM), waarbij een thiofosfaatester wordt gevormd die vervolgens wordt gedetecteerd met een antilichaam dat specifiek gealkyleerde thiofosfaatadduct herkent. (B) In vitro kinase-activiteitstest met behulp van een semisynthetische epitooptagging-benadering werd gebruikt om het effect van poortwachtersubstitutie op het autofosforylerings- en transfosforyleringspotentieel van recombinante CDPK1-mutante eiwitten te testen. Alle recombinante eiwitten vertonen calciumafhankelijke kinase-activiteit. Autofosforylering van CDPK1 en transfosforylering van myelinebasisch eiwit (MBP), een exogeen substraat, was alleen duidelijk in aanwezigheid van calciumchloride (Ca2+), terwijl er geen fosforylering werd gedetecteerd in aanwezigheid van EGTA, een specifieke chelator vanCa 2+- ionen. De poortwachtermutanten vertonen een verminderde autofosforyleringsactiviteit, terwijl de transfosforylering van MBP in CDPK1T145S volledig werd opgeheven. CDPK1T145M behoudt het transfosforyleringspotentieel (~ 53 %) zoals eerder gerapporteerd32. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Constructie van plasmiden voor het introduceren van SNP's op poortwachterspositie in cdpk1 locus met behulp van CRISPR-Cas9. Een gidssequentie van 20 nucleotiden die overeenkomen met 432 tot 451 bp werd gekloond in de BtgZI-restrictieplaats in pL6eGFP-plasmide om pL6CK1G te genereren. Een homologie-arm (421 bp) met de gewenste SNP's (T145M of T145S, corresponderend codon weergegeven in groen) samen met schildmutaties (weergegeven in rood) werd gekloond in pL6CK1G binnen AflII- en SpeI-restrictie-enzymplaatsen om respectievelijk pL6CK1GT145M en pL6CK1GT145M te genereren. Schildmutaties voorkomen dat de gewijzigde locus na de gewenste bewerking opnieuw wordt gesneden. Cas9-endonuclease gecodeerd in een tweede plasmide, pUF1 wordt naar de doellocatie binnen cdpk1-locus geleid met behulp van gids-RNA dat tot expressie wordt gebracht uit pL6CK1GT145M/S-plasmide . Cas9 introduceert een dubbele strengbreuk in de doelplaats naar de 5'-kant van de PAM-sequentie. De DSB wordt gerepareerd met behulp van een homologie-arm in het pL6CK1GT145M/S-plasmide . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Schematische weergave van P. falciparum transfectie met CRISPR-plasmiden voor de introductie van poortwachtersmutatie (T145M) in cdpk1-locus . i) Asynchroon P. Falciparum Culture wordt behandeld met sorbitol om gesynchroniseerde ringstadiumparasieten te verkrijgen. ii) Gesynchroniseerde parasieten in het ringstadium worden ingenomen in een elektroporatiecuvet, samen met pL6CK1G, T145M/S en pUF1-plasmiden geresuspendeerd in bufferoplossing. iii) De parasieten worden geëlektropoleerd met 310 volt, 950 μF en oneindige weerstand. iv) Na transfectie worden de parasieten overgebracht in een T25-kolf met vers compleet RPMI-medium (cRPMI) en gedurende 48 uur gekweekt. Na 48 uur worden de getransfecteerde parasieten overgeschakeld op cRPMI, aangevuld met de geneesmiddelen WR99210 en DSM267 en geëxpandeerd in de T75-kolf. v) Op dag 14 worden de objectglaasjes geprepareerd en gekleurd met behulp van Giemsa-beitsing. vi) Vervolgens wordt het bloeduitstrijkje gevisualiseerd onder een lichtmicroscoop om de aanwezigheid van geparasiteerde RBC's te beoordelen. vii) Bij visualisatie mogen de parasieten groeien in aanwezigheid van medicijnen. Vervolgens worden de parasieten verwerkt om de sjabloon voor PCR- en DNA-sequencing te verkrijgen voor verificatie van de gewenste wijziging van de beoogde cdpk1-locus . viii) Na de verificatie worden klonale transgene parasieten verkregen door een beperkende verdunning in te stellen in een plaat met 96 putjes. ix) Klonale transgene parasieten uit positieve putten worden overgebracht naar T25-kolven en laten groeien. x) Klonale transgene parasieten worden verder gevalideerd door PCR en de aanwezigheid van gewenste SNP's op de poortwachterspositie door middel van DNA-sequencing en analyse van het chromatogram. Het cijfer is gewijzigd van32. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Schematische weergave van de stappen die worden gebruikt voor transcriptieanalyse van doelgenen door middel van real-time PCR (RT-PCR). i) P. Falciparum-cultuur met overwegend rijpe parasieten in het schizontstadium wordt verkregen door behandeling met sorbitol in dezelfde cyclus. ii) De parasieten worden voorzichtig gelaagd op een gradiënt van 70/40 Percoll/sorbitol in een conische buis van 15 ml voor verrijking van volwassen schizont-stadiumparasieten. iii) De zwartgekleurde ring in de interfase van 40 % en 70 % persoonlijk/sorbitol wordt overgebracht naar een vers buisje van 50 ml, verwerkt en geresuspendeerd in cRPMI. De verrijkte parasieten in het schizont-stadium worden geïncubeerd met verse RBC's die bij 37 °C worden gepre-incubeerd voor invasie. iv) De parasieten worden gedurende 4 uur gekweekt en vervolgens behandeld met 5 % sorbitol om sterk gesynchroniseerde 0-4 uur ringstadiumparasieten te verkrijgen. v) De parasieten worden verder gekweekt voor een extra 44 uur post-sorbitol behandeling om sterk gesynchroniseerde 44-48 uur schizont stadium parasieten te verkrijgen. vi) De gesynchroniseerde parasieten worden behandeld met saponine om ze vrij te maken van de RBC's en opgeslagen in RNA-extractiereagens. Totaal RNA wordt geïsoleerd uit de RNA-extractie geresuspendeerde parasieten. vii) cDNA wordt bereid uit het geïsoleerde RNA. viii) Een real-time PCR-experiment wordt opgezet met de cDNA-sjabloon om de doelgenen te amplificeren met behulp van genspecifieke primers. De plaat wordt uitgevoerd op een real-time PCR-systeem. ix) De transcriptie-expressiegegevens worden geanalyseerd met behulp van analysesoftware. De grafiek geeft differentiële transcriptie-expressieniveaus weer van 11 kinasen in CDPK1 T145M-parasieten in vergelijking met het wildtype (WT). Dit cijfer is gewijzigd van32. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De naam van het genPrimer sequentie
PK1fpgexATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgexATGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATCACAAATTTTGTGCATC
Ck1T145SGTTTGATGTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTAAATAAAAATATTTCTTTCTCCAAAAACATCAAAC
CK1T145MGTTTGATGTTTGAAGAATAAGAAATATTTTATTTAATTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTAAATAAAAATATTTCTCTTCAAAAACATCAAAC
Ck1GUIDEFWDTAAGTATATAATATTAACCGAATTTGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA
Ck1GUIDEREVTTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA
ck1f1 zei: ATTTTCTTTTCTGAACGTAACATG
ck1r3wtTGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

Tabel 1: Lijst van primers die in het onderzoek zijn gebruikt.

Naam van het genVoorwaartse primerOmgekeerde primer
CDPK1 (PF3D7_0217500)GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATCATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)GGAACAGGAGAATTTACAACGACTGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGGCAGCGTCCATTGTAAG
ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)ATACTTCTCTCAGGGTGCCCCTTATCACTAATTTTTTT
GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAGTATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCGATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)AGTCCTAAAAAAGATATA
TAAAGAACTAGGTAGTAG		TTTAAAAATAATCTCTCCCCACAACCC
PKA (PF3D7_0934800)AATCATCCATTTTGTAAATTTACATGGCTTTTTTTTCTTTAAA
AATGTAAAAAATTCTCC
PKG (PF3D7_1436600)AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGCCATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACGGAGAGCGCAATTAGCCATATTG
PI3K (PF3D7_0515300)CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAGATCACATTTTTTATACTT
ATTATCATCACATTTGTT
GAPDH (PF3D7_1462800)GGAAGGAAAGATATCGAAGTAGGGGTTACCTCACATGG
Hartslag (PF3D7_1126000)CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTTTAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

Tabel 2: Lijst van doelgenen (PlasmoDB-identificatienummer) samen met de sequentie van de primers die worden gebruikt voor de real-time PCR-analyse.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De generatie van een mutante transgene parasiet die een hypomorf allel van cdpk1 bevat, is gebaseerd op de in vitro kinase-activiteitsgegevens met recombinante enzymen. Het is beter om zoveel mogelijk mutante recombinante eiwitten met verschillende poortwachtersresiduen te genereren. Aangezien het genoom van P. falciparum zeer AT-rijk is, is de expressie van recombinante eiwitten in E. coli kan codonoptimalisatie vereisen. Dit zal helpen bij een uitgebreide evaluatie van gatekeeper-substitutie op de kinase-activiteit van het mutante enzym. Gatekeeper-substitutie die resulteert in de vermindering van het transfosforyleringspotentieel wordt geselecteerd voor het genereren van een transgene parasiet met allelische uitwisseling. Tegelijkertijd moet een poortwachtersubstitutie die de transfosforyleringsactiviteit van het kinase volledig opheft, als negatieve controle worden beschouwd. Een andere belangrijke overweging bij het genereren van de allelische uitwisselingsparasiet is het introduceren van een synonieme mutatie samen met de testmutatie en de negatieve controle. Het genereren van de parasiet die een synonieme mutatie in de cdpk1-locus bevat, dient als een belangrijke interne controle om technische fouten bij het introduceren van de testmutatie uit te sluiten. Bovendien kan de transgene parasiet die een synonieme mutatie draagt, worden gebruikt als controle voor alle vergelijkende studies in plaats van de WT-parasiet.

We hebben een twee-plasmide-systeem gebruikt voor het genereren van de poortwachter-mutantparasiet32,35. De efficiëntie van het introduceren van de SNP in de doellocus kan echter worden verhoogd door een enkel plasmidesysteem te gebruiken in plaats van een twee-plasmidesysteem41. In het enkelvoudige plasmidesysteem zijn alle kritieke elementen die nodig zijn voor CRISPR-Cas9-gemedieerde genbewerking opgenomen in een enkel plasmide in plaats van twee. Het enkelvoudige plasmide codeert voor Cas9-endonuclease, transcribeert sgRNA bestaande uit tracrRNA en het gids-RNA, en bevat een homologie-arm voor de reparatie van de dubbelstrengsbreuk die door het Cas9-endonuclease op de doelplaats wordt geïntroduceerd. In een twee-plasmidesysteem worden de parasieten samen met beide plasmiden getransfecteerd. Aangezien het aantal parasieten dat beide plasmiden tegelijkertijd ontvangt in een systeem met twee plasmiden laag zal zijn in vergelijking met een systeem met één plasmide, is de efficiëntie van CRISPR-gemedieerde genbewerking lager in een systeem met twee plasmiden in vergelijking met een systeem met één plasmide. Als alternatief kan ook een zelfmoord-reddingsstrategie42 worden gebruikt, waarbij de homologie-arm wordt geleverd als een lineair fragment of in een plasmide zonder een medicijnselectiemarker (reddingsplasmide). Het Cas9-endonuclease en het sgRNA-coderingsgids-RNA worden geleverd in een plasmide met een geneesmiddelselectiecassette (zelfmoordplasmide). Aangezien een lineair fragment of een plasmide zonder een medicijnselectiecassette meer kans heeft om verloren te gaan tijdens de replicatie van parasieten, moet de dubbelstrengsbreuk die door het Cas9-endonuclease in de doellocus wordt geïntroduceerd, gemakkelijk worden gerepareerd met behulp van de homologie-arm die voor een beperkte duur beschikbaar kan zijn. Deze strategie heeft enkele voordelen ten opzichte van een systeem met twee plasmiden, omdat het efficiënter is en het niet nodig is om de homologie-arm in een ander plasmide te subklonen. Andere variaties van CRISPR-Cas9-genbewerking kunnen ook worden overwogen voor de introductie van SNP in de doellocus43.

We hebben handmatig het gidsgebied geselecteerd voor de introductie van T145M-substitutie in de cdpk1-locus . Een geschikte gidsvolgorde voor het introduceren van dubbelstrengsbreuk in de doellocus kan worden geselecteerd met behulp van verschillende gratis beschikbare online software zoals Chopchop44, CRISPOR45, CCTop46, Cas-OFFinder47. Deze software biedt niet alleen de efficiëntie van elke gidssequentie, maar biedt ook de off-target en specificiteitsscores, die het slagingspercentage van een CRISPR-Cas9-gemedieerd genbewerkingsexperiment verhogen.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de transfectie van malariaparasieten. We gebruiken ringstadiumparasieten voor transfectie-experimenten48,49, maar het vooraf laden van RBC's met plasmiden is ook met succes gebruikt voor parasiettransfectiestudies50. Bij deze methode worden RBC's getransfecteerd met plasmiden onder een specifieke reeks parameters door middel van elektroporatie en worden ze vervolgens gebruikt voor infectie met gezuiverde parasieten in een laat stadium. De parasieten dringen RBC's binnen die vooraf zijn geladen met plasmiden. Tijdens hun groei in de RBC's die vooraf zijn geladen met plasmiden, neemt de parasiet plasmide-DNA op via een onbekend mechanisme50. Er is een andere methode die kan worden gebruikt voor de transfectie van parasieten die zeer volwassen gezuiverde parasieten in het schizont-stadium vereist voor directe transfectie met de plasmiden. Het instrument dat wordt gebruikt voor de transfectie van de gezuiverde schizonten is 4D-nucleofector51. De keuze voor een transfectiemethode varieert tussen verschillende onderzoeksgroepen, afhankelijk van de beschikbare middelen en het slagingspercentage. Het is een goed idee om na te gaan welke van de drie methoden voor een groep werken en dat te gebruiken voor volgende transfectie-experimenten. Twee methoden kunnen achtereenvolgens worden toegepast om de transfectie-efficiëntie verder te verhogen. In de eerste transfectiestap kan bijvoorbeeld gebruik worden gemaakt van parasieten in het ringstadium, gevolgd door de toevoeging van verse RBC's die vooraf zijn geladen met de plasmiden.

We selecteerden slechts een paar genen voor transcriptieanalyse in de CDPK1T145M parasieten in vergelijking met de controle op basis van eerdere literatuur of de aanwezigheid van leden van de CDPK-familie. Om echter een uitgebreid beeld te krijgen van de wereldwijde transcriptionele herbedrading in de transgene parasiet die een hypomorf allel van CDPK1 bevat, kunnen benaderingen zoals RNA-Seq of microarray worden gebruikt.

De methode die in deze studie wordt gebruikt, kan worden toegepast op andere kinasen van de malariaparasiet om de ontwikkeling van compensatiemechanismen onder druk van geneesmiddelen te begrijpen. De informatie die met deze techniek wordt verkregen, kan nuttig zijn bij de strategische inzet van combinatiegeneesmiddelen om de ontwikkeling en verspreiding van resistentie tegen geneesmiddelen te voorkomen. Het richten op twee of meerdere kinasen die functionele complementatie vertonen, is een betere strategie dan het richten op individuele kinasen voor malariabestrijding en -eliminatie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de ondersteuning en faciliteiten die beschikbaar zijn via de Central Instrumentation Facility, School of Life Sciences, JNU. De financiële steun van het Departement Biotechnologie (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) aan AB wordt ook dankbaar erkend. We danken Jose-Juan Lopez-Rubio voor het verstrekken van pL6eGFP- en pUF1-plasmiden. De subsidieverstrekker heeft geen rol bij de voorbereiding en beslissing om het werk te publiceren. MS is een ontvanger van een JRF-SRF Fellowship van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).">World Health Organization. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).
  2. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).">Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).
  3. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).">Rosenthal, P. J., et al. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).
  4. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).">Woodrow, C. J., White, N. J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).
  5. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).">Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., Fairhurst, R. M. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).
  6. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).">Sharma, M., et al. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).
  7. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).">Dvorin, J. D., et al. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).
  8. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).">Absalon, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).
  9. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).">Kumar, P., et al. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).
  10. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).">Kumar, S., et al. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).
  11. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).">Ojo, K. K., et al. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).
  12. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).">Ojo, K. K., et al. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).
  13. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).">Fang, H., et al. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).
  14. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).">Green, J. L., et al. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).
  15. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).">Ekka, R., Gupta, A., Bhatnagar, S., Malhotra, P., Sharma, P. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).
  16. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).">Kumar, S., et al. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).
  17. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).">Bansal, A., et al. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).
  18. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).">Iyer, G. R., et al. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).
  19. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).">Alam, M. M., et al. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).
  20. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).">More, K. R., et al. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).
  21. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).">Bansal, A., et al. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).
  22. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).">Hengeveld, R. C., et al. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).
  23. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).">Bishop, A. C., et al. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).
  24. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).">Alaimo, P. J., Knight, Z. A., Shokat, K. M. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).
  25. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).">Zhang, C., et al. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).
  26. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).">Ojo, K. K., et al. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).
  27. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).">Lourido, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  28. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).">Rutaganira, F. U., et al. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).
  29. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).">Lourido, S., et al. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).
  30. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).">McRobert, L., et al. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).
  31. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).">Taylor, H. M., et al. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).
  32. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).">Bansal, A., et al. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).
  33. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).">Bansal, A., Molina-Cruz, A., Brzostowski, J., Mu, J., Miller, L. H. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).
  34. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).">Allen, J. J., et al. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).
  35. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).">Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).
  36. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).">Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  37. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).">van den Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).
  38. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).">Coteron, J. M., et al. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).
  39. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).">Krugliak, M., Ginsburg, H. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).
  40. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).">Ginsburg, H., Landau, I., Baccam, D., Mazier, D. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).
  41. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).">Zhang, W. W., Lypaczewski, P., Matlashewski, G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).
  42. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).">Lu, J., et al. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).
  43. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).">Sharma, M., Bansal, A. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).
  44. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).">Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  45. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).">Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  46. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).">Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  47. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).">Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  48. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).">Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. H., Su, X. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).
  49. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).">Fidock, D. A., Wellems, T. E. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).
  50. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).">Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).
  51. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).">Moon, R. W., et al. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Malaria ParasiteCompensatory PathwaysProtein KinasesCDPK FamilyChemical GeneticsHypomorphic AlleleCRISPR Cas9 EditingDrug ResistanceKinase InhibitionTranscriptional Rewiring

Related Articles