In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen

Samenvatting

We hebben een afstembaar substraat op basis van gelatine gesynthetiseerd en gekarakteriseerd voor het kweken van vasculaire endotheelcellen (EC's) onder relevante vasculaire stromingsomstandigheden. Dit biomimetische oppervlak repliceert zowel fysiologische als pathologische omstandigheden, waardoor de studie van mechanische krachten op het EC-gedrag mogelijk wordt en ons begrip van vasculaire gezondheid en ziektemechanismen wordt bevorderd.

Samenvatting

We presenteren een innovatief in vitro model gericht op het onderzoeken van de gecombineerde effecten van weefselstijfheid en schuifspanning op de functie van endotheelcellen (EC), die cruciaal zijn voor het begrijpen van de vasculaire gezondheid en het ontstaan van ziekten zoals atherosclerose. Van oudsher hebben studies de effecten van schuifspanning en substraatstijfheid op EC's onafhankelijk van elkaar onderzocht. Dit geïntegreerde systeem combineert deze factoren echter om een nauwkeurigere simulatie van de mechanische omgeving van het vaatstelsel te bieden. Het doel is om EC-mechanotransductie te onderzoeken over verschillende weefselstijfheidsniveaus en stromingsomstandigheden met behulp van menselijke EC's. We beschrijven het protocol voor het synthetiseren van gelatinemethacrylaat (GelMA) hydrogels met afstembare stijfheid en het bezaaien ervan met EC's om samenvloeiing te bereiken. Daarnaast beschrijven we het ontwerp en de assemblage van een kosteneffectieve stromingskamer, aangevuld met computationele vloeistofdynamicasimulaties, om fysiologische stromingsomstandigheden te genereren die worden gekenmerkt door laminaire stroming en passende schuifspanningsniveaus. Het protocol bevat ook fluorescentie-etikettering voor confocale microscopie, waardoor de beoordeling van EC-reacties op zowel weefselcompliantie als flowomstandigheden mogelijk wordt. Door gekweekte EC's te onderwerpen aan meerdere geïntegreerde mechanische stimuli, maakt dit model uitgebreid onderzoek mogelijk naar hoe factoren zoals hypertensie en veroudering de EC-functie en EC-gemedieerde vaatziekten kunnen beïnvloeden. De inzichten die uit deze onderzoeken worden verkregen, zullen een belangrijke rol spelen bij het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan vaatziekten en bij het ontwikkelen van effectieve behandelstrategieën.

Inleiding

Endotheel, dat het binnenoppervlak van bloedvaten bekleedt, speelt een cruciale rol bij het behoud van de vasculaire gezondheid. Endotheelcellen (EC's) staan centraal bij het reguleren van verschillende cardiovasculaire functies, waaronder vaattoonregeling, selectieve permeabiliteit, hemostase en mechanotransductie ^1,2. Onderzoek heeft EC-disfunctie stevig in verband gebracht met een primaire rol bij de ontwikkeling van atherosclerose. EC's ondervinden met name verschillende mechanische krachten op de grensvlakken waar ze interageren met de bloedstroom en onderliggende vaatweefsels ^3,4. Verschillende onderzoeken hebben EC-disfunctie in verband gebracht met abnormale veranderingen in mechanische factoren binnen de vasculaire omgeving, zoals de vloeistofschuifspanning door de bloedstroom en weefselstijfheid ^5,6,7.

Eerder onderzoek heeft echter beperkte aandacht gekregen om de gecombineerde effecten van weefselstijfheid en schuifspanning op de EC-functie te begrijpen. Om het vermogen te vergroten om onderzoeksresultaten te vertalen naar effectieve behandelingen voor atherosclerose en andere hart- en vaatziekten, is het essentieel om de cellulaire modellen die in het veld worden gebruikt te verbeteren. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het humaniseren van cellulaire modellen door gebruik te maken van menselijke EC's en deze te onderwerpen aan schuifspanning of substraten met verschillende stijfheidsniveaus ^8,9,10. De acceptatie en verfijning van cellulaire modellen die dynamische stromingsomgevingen integreren met EC-substraten met instelbare stijfheidseigenschappen is echter langzaam gevorderd. De uitdaging ligt in het ontwerpen van niet-zwellende EC-substraten om veranderingen in de stromingsparameters binnen het stromingskanaal te voorkomen en tegelijkertijd de teelt van intacte en goed hechtende EC-monolagen te vergemakkelijken. Een in vitro model dat in staat is om deze obstakels te overwinnen, zou effectiever onderzoek kunnen vergemakkelijken naar hoe hypertensie, veroudering en flowcondities samen van invloed zijn op EC-mechanotransductie, vasculaire gezondheid en, uiteindelijk, de ontwikkeling van atherosclerose. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om schuifspanning op cellen uit te oefenen en tegelijkertijd de stijfheid van het substraat te beheersen, waaronder roterende platen en microfluïdische apparaten. Bij de roterende plaatmethode worden cellen tussen twee platen geplaatst en wordt schuifspanning uitgeoefend door de roterende beweging van de platen. Deze methode is minder ingewikkeld en biedt een snel model; Het lijdt echter aan ruimtelijke schuifspanningsvariatie, met nul schuifspanning in het midden en maximale schuifspanning aan de periferie¹¹.

Aan de andere kant vertegenwoordigen microfluïdische apparaten de nieuwe generatie gereedschappen met de mogelijkheid om de stijfheid van het substraat en de stromingsomstandigheden te regelen. Deze systemen zijn geschikt voor het nabootsen van microvasculaturen onder laminaire stromingsomstandigheden. Het bestuderen van atherosclerose met dergelijke apparaten is echter onpraktisch, omdat atherosclerose optreedt in grote bloedvaten met een verstoorde stroming¹¹. Dit artikel heeft tot doel een bijdrage te leveren aan het kritische onderzoeksdomein van EC-studies door een kosteneffectief systeem te presenteren dat in staat is om de effecten van variërende stijfheidsniveaus in EC-substraten onder verschillende stromingsomstandigheden te onderzoeken. Het systeem integreert substraten met verschillende stijfheden om pathologische en fysiologische bloedvaten na te bootsen. Dit protocol schetst de methode voor het maken van hydrogels op basis van gelatine zonder zwelling en stijfheidsniveaus van 5 kPa en 10 kPa, die respectievelijk fysiologische en pathologische stijfheid vertegenwoordigen. Bovendien is de constructie van een stromingskamer met parallelle platen die in staat is om deze substraten te integreren, gedetailleerd. Computational fluid dynamics (CFD) werd gebruikt om schuifspanning en stromingsomstandigheden te evalueren. De bereiding van hydrogels voor EC-cultuur en de uitvoering van een 6 uur flow experiment worden beschreven, gevolgd door een bespreking van immunokleuring na het experiment.

Protocol

1. Synthese van GelMA

1. Bereid een 0,2 M-oplossing van watervrij natriumcarbonaat en een 0,2 M-oplossing van natriumbicarbonaat.
2. Meng 46 ml natriumbicarbonaatoplossing met 15 ml natriumcarbonaatoplossing en voeg 139 ml gedeïoniseerd (DI) water toe. Stel de pH in op 9,5 met behulp van 0,1 M NaOH en HCl indien nodig.
3. Voeg 10 g type A, 300-bloom gelatine van varkenshuid toe aan 100 ml carbonaat-bicarbonaatbuffer in een concentratie van 10% g/v.
4. Los de gelatine op met een waterbad van 55 °C terwijl u de oplossing op 700 rpm roert met een magnetische roerder. Eenmaal volledig opgelost, stelt u de pH van de gelatineoplossing in op 9,5 met behulp van 0,1 M NaOH.
5. Om de methacrylatie op gang te brengen, voegt u druppelsgewijs 938 μl methacrylanhydride (MAH) toe aan de oplossing. Verbeter de initiële verdeling van MAH in de gelatineoplossing door deze op verschillende locaties te injecteren, waaronder verschillende diepten en radiale afstanden vanaf het centrum.
6. Wikkel het reactievat in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Houd de temperatuur op 55 °C en roer de oplossing gedurende 1 uur met 500 tpm om de reactie te voltooien (figuur 1A)¹².
   OPMERKING: De reactie stopt bij een pH lager dan 7,4.
7. Bereid een bekerglas van 2 l met 1,8 l aceton en een beker van 0,6 l met 0,3 l aceton voor.
8. Voeg de resulterende GelMA-oplossing druppelsgewijs toe aan het bekerglas van 2 l en roer op 200 tpm om precipitatie op te wekken¹³. Om de opvang van het neergeslagen product te maximaliseren, plaatst u een roestvrijstalen staaf of spatel als nucleatieplaats voor een gemakkelijkere overdracht.
9. Breng het product over van de grote beker naar de kleinere beker en laat het 10 minuten staan voordat u doorgaat met de droogstap. De neergeslagen GelMA zou moeten verschijnen als witte vezels.
10. Verzamel het product op absorberend papier, droog het in een vacuümoven bij kamertemperatuur (RT) en bewaar het bij -20 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Aanvullende details over de chemische karakterisering van het product via proton nucleaire magnetische resonantie (¹H NMR) zijn te vinden in een eerder gepubliceerd werk⁸.

2. Verzilting van glas

OPMERKING: Het bevestigen van hydrogels aan glazen objectglaasjes zorgt voor een vlak en gelijkmatig oppervlak, wat het hanteren vergemakkelijkt en zorgt voor stabiliteit onder door stroming afgeleide schuifspanning. Het functionaliseren van het glas met 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat is noodzakelijk om de oppervlakte-eigenschappen te verbeteren en de covalente hechting van hydrogels tijdens het polymerisatieproces mogelijk te maken.

1. Snijd gewone microscoopglaasjes (1 mm dikte) nauwkeurig in stukken die vergelijkbaar zijn met de uiteindelijke hydrogelafmetingen met behulp van een glassnijder. Was de gesneden glaasjes met zeep om oppervlakteverontreinigingen en vuil te verwijderen die de behandeling van het glasoppervlak zouden kunnen belemmeren.
   NOTITIE: Indien nodig, sonicaat de glazen objectglaasjes gedurende 5 minuten in ethanol en laat ze vervolgens aan de lucht drogen.
2. Bereid een 0,5% oplossing van 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat in absolute ethanol. Bereid een oplossing van 10% ijsazijn in gedistilleerd water. Meng de oplossingen tot een uiteindelijke concentratie van 3% ijsazijn.
   OPMERKING: De ijsazijnzuuroplossing kan in grote hoeveelheden worden bereid en bewaard.
3. Organiseer de glasplaatjes in een glazen bak om ervoor te zorgen dat de glasoppervlakken niet worden belemmerd. Giet de resulterende oplossing over de glasplaatjes en houd ze ongeveer 5 minuten op een wip bij 80 tpm om de reactie te voltooien. Zorg ervoor dat beide zijden van de glasplaatjes zijn aangepast door eventuele ingesloten luchtbellen te verwijderen.
4. Nadat de reactie is voltooid, zuigt u de oplossing op en wast u de glasplaatjes 2x met ethanol. Laat de glaasjes aan de lucht drogen en bewaar ze in het donker bij RT.
   LET OP: De glasplaatjes behouden onder deze omstandigheden 1 maand hun wijziging.

3. Hydrogel voorbereiding

1. Fabriceer hydrogels met behulp van een door redox geïnduceerde polymerisatiemethode voor vrije radicalen.
   1. Monteer tweedelige mallen van polytetrafluorethyleen (PTFE) met de juiste diepte en te openen vensters van 10^mm2 om het uiteindelijke substraat vorm te geven. Houd rekening met een krimp van 25% in de hoogte van de hydrogel na polymerisatie tijdens het ontwerpproces. Zorg ervoor dat de mallen plat zijn en stevig zijn vastgemaakt aan de onder- en bovenplaten om lekkage te voorkomen.
      OPMERKING: De afmetingen van de ontworpen mal zijn opzettelijk 10% groter dan de beoogde hydrogelmaat. Dit ontwerp dient meerdere doelen: het voorkomt schade aan de zijkanten bij het scheiden van de matrijs, verbetert de gelijkmatigheid van het oppervlak van de hydrogel door onzuiverheden of luchtbellen naar de zijkanten te duwen, en compenseert de verwachte krimp van 25% na evenwicht als gevolg van het synerese-effect, waarbij sterk verknoopte hydrogels water afstoten na het balanceren, waardoor krimp ontstaat. De krimphoeveelheid is gespecificeerd in het protocol⁸.
   2. Om ervoor te zorgen dat hydrogels een gelijkmatig oppervlak en een constante hoogte hebben, hangt u gemodificeerde glasplaatjes aan de bovenplaat van de mal, zodat er een smalle opening is voor het injecteren van de polymeeroplossing. Gebruik een afdekglas om de gewijzigde glasplaatjes op te hangen (Figuur 1B).
   3. Om het afdekglas te maken, snijdt u gewoon microscopisch glas dat 20% groter is dan de mal. Bevestig twee afstandhouders aan de korte zijden. Bereken de dikte van de afstandhouder als volgt:
      Dikte afstandhouder = 1,33 x uiteindelijke geldikte + 1 (dikte van het gemodificeerde glas) - diepte van de mal
   4. Breng een dunne laag celcompatibel afdichtingsvet aan op de langere zijden van het afdekglas, op hetzelfde oppervlak waar de afstandhouders zijn bevestigd.
   5. Bevestig het aangepaste glasplaatje aan het afdekglas tussen de twee afstandhouders.
   6. Plaats het afdekglas op de mal zodat de afstandhouders op de mal zitten en het gemodificeerde glas in de mal uitsteekt. Deze opstelling biedt een vrije ruimte van 1,33 van de hoogte van de uiteindelijke hydrogel tussen het gemodificeerde glas en de bodem van de mal.
   7. Los GelMA op in DI-water van 4% en 10% w/v voor respectievelijk 5 kPa en 10 kPa hydrogels en plaats het in een waterbad van 45 °C.
      OPMERKING: GelMA is een warmtegevoelig polymeer en het handhaven van de oplossingstemperatuur op 45 °C voorkomt stolling vóór polymerisatie en vermindert de viscositeit van de oplossing, wat cruciaal is voor het vervaardigen van platte hydrogels.
   8. Voeg TEMED (24 mM voor 5 kPA hydrogel, 6,25 mM voor 10 kPa hydrogel) toe aan de polymeeroplossing en meng grondig.
      OPMERKING: TEMED alleen initieert de polymerisatie niet, dus zorg ervoor dat mallen, pipetten en oplossingen zijn voorbereid voordat u verder gaat.
   9. Voeg APS (24 mM voor 5 kPA hydrogel, 24,5 mM voor 10 kPa hydrogel) toe aan de GelMA-oplossing en meng goed.
      OPMERKING: Het toevoegen van APS initieert de polymerisatie en hydrogels kunnen zich snel vormen, waardoor onmiddellijke actie nodig is om defecte hydrogels te voorkomen. Verdere details over stijfheidsmetingen zijn te vinden in een eerder gepubliceerd werk⁸.
   10. Pipeteer de resulterende oplossing voorzichtig in de opening tussen het hangende glasplaatje en de mal bij RT en laat deze verknopen. Capillaire kracht drijft de polymeeroplossing in de mal. Voeg geen belletjes toe aan de gels en stop met pipetteren als er een kleine hoeveelheid oplossing in de pipetpunt achterblijft.
       OPMERKING: Tijdens polymerisatie reageren methacrylaatgroepen van GelMA met methacrylaatresiduen op de gemodificeerde glasplaatjes, wat resulteert in de chemische hechting van de hydrogel aan het glas.
   11. Na 15 minuten is de reactie voltooid. Maak het substraat los van de mal met behulp van een scherp voorwerp, zoals een naald, en schuif het substraat weg van het afdekglas om het te scheiden.
   12. Breng de hydrogels over in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaal van 100 mm die is afgesloten met plastic folie en balanceer bij 37 °C om de resterende reactanten en bijproducten te verwijderen.
   13. Aangezien de hydrogel iets groter is dan de uiteindelijke afmetingen, snijdt u overtollige gel aan de zijkanten bij zodat deze overeenkomt met de afmetingen die nodig zijn voor het venster van de stroomkamer.
   14. Gebruik de stroomkamer om de afmetingen van de hydrogel te controleren. Zorg ervoor dat de hydrogel goed in de stroomkamer past zonder openingen tussen de hydrogel en de mal of defecten die de stroompatronen kunnen beïnvloeden. Als er onregelmatigheden in de vorm zijn die het stroompatroon in de stroomkamer kunnen beïnvloeden, wat leidt tot ongunstig celgedrag, bewaar de hydrogel dan voor statische omstandigheden.
   15. Breng vier hydrogels over in een petrischaal met 1x PBS voor sterilisatie.
2. Steriliseer de hydrogel zoals hieronder beschreven met 70% ethanol.
   1. Bereid 25%, 50% en 70% alcoholoplossingen voor geleidelijke uitdroging van hydrogel.
      OPMERKING: Als geleidelijke uitdroging niet wordt uitgevoerd, kunnen stijvere hydrogels krimpen en breken, terwijl er rimpels kunnen ontstaan op het oppervlak van zachtere hydrogels.
   2. Zuig de 1x PBS-oplossing op uit de petrischaal met hydrogels. Voeg 25% ethanoloplossing toe aan elke petrischaal om de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa gedurende 15 minuten onder te dompelen.
   3. Zuig de 25% alcoholoplossing op. Voeg 50% alcoholoplossing toe aan elke petrischaal om de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa gedurende 15 minuten onder te dompelen.
   4. Zuig de 50% alcoholoplossing op. Voeg een oplossing van 70% alcohol toe aan elke petrischaal en dompel de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa gedurende 5 minuten onder. Plaats de petrischaal op een shaker op 100 rpm.
   5. Laat de hydrogels van 5 kPa 40 minuten ondergedompeld en de hydrogels van 10 kPa gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: Er werd waargenomen dat de hydrogels van 5 kPa vatbaarder waren voor verontreiniging in vergelijking met hydrogels van 10 kPa.
   6. Breng de monsters over naar een plaat met 6 putjes in een bioveiligheidskast en was de hydrogels 2x-3x met steriele PBS.

4. Hydrogels coaten

1. Bereid een gelatineoplossing van 60 μg/ml door 3 mg gelatine op te lossen in 50 ml steriel PBS (1x met magnesium- en calciumzout). Verwarm de oplossing in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 minuten of tot alle gelatine volledig is opgelost.
2. Filtreer de coatingoplossing steriel met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm. Zuig de 1x PBS-oplossing op uit elke putplaat en voeg gelatineoplossing toe aan elk putje, zodat elke hydrogel volledig bedekt is. Om het risico op besmetting te minimaliseren, voegt u 40 eenheden/ml penicilline en 10 μg/ml streptomycine toe aan de coatingoplossing.
3. Incubeer elke putplaat in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ gedurende 45 min. Was de hydrogels met 1x PBS-oplossing.
4. Zuig PBS op en voeg celkweekmedia toe.
5. Bewaar de hydrogels niet langer dan twee dagen in celkweekmedia en incubeer ze in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ -zaad tot het zaad van de cellen.
   OPMERKING: Ondanks de uitstekende celhechtingseigenschappen van fibronectine, is er bezorgdheid over het gebruik ervan vanwege EC's die endogene fibronectine afzetten in atherosclerotische omstandigheden, wat kan leiden tot een pro-inflammatoire reactie. Om chemisch gestimuleerde celreacties te voorkomen, zien we af van het gebruik van fibronectine. Bovendien toonden Orr et al. aan dat fibronectinecoating, vergeleken met collageen I-coating, atherogene genen opreguleerde. In het bijzonder observeerden ze verhoogde expressieniveaus van intercellulaire adhesiemolecuul 1 (ICAM-1), vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1) en nucleaire factor-κB (^NF-κB)14.

5. Zaaicellen op de substraten

1. Bereid de celsuspensie voor volgens de beschikbare loslatingsprotocollen en tel de cellen met behulp van een hemocytometer⁸.
2. Zuig de media grondig op uit de hydrogels. Voeg 50.000 cellen/cm2 toe aan elk monster. Voeg een juiste hoeveelheid celsuspensie toe aan elk monster om celoverloop te voorkomen.
   OPMERKING: Stijvere substraten zijn meer hydrofoob; Minimaliseer daarom de tijd tussen de stappen om de bevochtigbaarheid en de dispersie van de celsuspensie op het substraatoppervlak te verbeteren.
3. Incubeer hydrogels met celzaad in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ gedurende 2 uur. Voeg celkweekmedia toe aan de monsters zodra de cellen aan de gels zijn bevestigd.

6. Fabricage van stroomkamers

OPMERKING: De aanpak voor het ontwerpen van de stroomkamer is kosteneffectief en vereist minimale expertise voor fabricage en gebruik.

1. Gebruik poly(methylmethacrylaat) voor kamerfabricage om de stroomkwaliteit, de integriteit van hydrogel onder schuifspanning en mogelijke real-time biomarkerstudies tijdens stroomexperimenten visueel te beoordelen. Het ontwerp van de kamer is gemaakt met behulp van CAD-software (computer-aided design). De stroomkamer is aangevraagd voor een patent en details over dit apparaat kunnen in het huidige protocol niet worden bekendgemaakt.
2. Computationele beoordeling van de stromingscondities in de stromingskamer
   1. Monteer de afzonderlijke componenten van de ontworpen stroomkamer (. SLDPRT-bestanden) om de uiteindelijke kameropstelling te maken.
   2. Trek een lijn langs de middellijn van de stroom die raakt aan het hydrogeloppervlak om de schuifspanning te analyseren. Sluit de inlaat- en uitlaatopeningen om een gesloten regelvolume te definiëren.
   3. Open Flow Simulation via het tabblad Add-Ins in de CAD-software. Open op het tabblad Stroomsimulatie de functie Wizard om de eigenschappen in te voeren. Specificeer het eenheidssysteem en stel de druk en de spanningseenheden in op dyne/cm².
   4. Controleer de vloeistofstroom en de zwaartekracht in de fysieke kenmerken. Stel de zwaartekracht in op -9.8 in Z-component; X- en Y-componenten moeten nul zijn.
   5. Kies Intern voor analysetype in Geometrieafhandeling. Selecteer Water als de standaardvloeistof.
      OPMERKING: Ga ervan uit dat het medium zich gedraagt als water.
   6. Kies Laminair en Turbulent voor het stromingstype. Definieer de muur als een adiabatische muur en de ruwheid van het invoeroppervlak in Wall Condition.
   7. Stel de temperatuur in de begintoestand in op 37,5 °C (310,65 K). Definieer het rekendomein in Flow Simulation-projecten en zorg ervoor dat het het volledige regelvolume dekt.
   8. Selecteer alle wanden die met de vloeistof communiceren om het subdomein van de vloeistof te definiëren. Wijs in randtoestand het binnenoppervlak van het inlaatdeksel aan als Inlaatvolumestroom en specificeer het debiet (Q) en uniforme stroom. Wijs vervolgens het binnenoppervlak van de afdichting van het uitlaatdeksel toe als statische druk.
   9. Bepaal de globale maasgrootte op basis van de beschikbare rekenkracht. Druk op Uitvoeren om de simulatie te starten.
   10. Bekijk na voltooiing de gewenste resultaten, inclusief schuifspanningsplots en stromingssimulaties.
   11. Herhaal de stappen 6.2.8 tot en met 6.2.10 met verschillende debieten om de toegepaste schuifspanning bij verschillende snelheden te berekenen. Gebruik regressieanalyse om de relatie tussen stroomsnelheid en schuifspanning vast te stellen.
   12. Beoordeel de tolerantie van het systeem voor variaties in hydrogelafmetingen om het realisme van de simulatie te verbeteren.

7. Voer een uniforme laminaire stroom uit

1. Na het kweken van cellen op de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa, zorgt u voor samenvloeiing van de celmonolaag in een incubator van 37 °C, 5% CO_{2 .} Er moet een monolaag cellen op elke hydrogel worden bereikt.
2. Steriliseer autoclaveerbare componenten van het parallelle plaatstroomkamersysteem (roestvrijstalen schroeven, spatel, pincet, pakking en het mediareservoir) met een zwaartekrachtautoclaafcyclus van 30 minuten. Steriliseer andere onderdelen (acrylcomponenten en reservoirafdichter/dempers) met blootstelling aan UV-licht.
3. Monteer het stroomkamerapparaat in een bioveiligheidskast. Zet hydrogelmonsters vast in het apparaat en zorg voor uniformiteit. Gebruik een vulmiddel van gelijke grootte als de hydrogels als er onvoldoende monsters beschikbaar zijn voor de stroom.
4. Maak het binnenoppervlak van de kamer en de hydrogeloppervlakken vooraf nat om luchtbelvorming te minimaliseren en celuitdroging tijdens de montage te voorkomen.
5. Voeg voldoende media toe aan het inlaatreservoir, zodat 20%-30% van het media bij montage naar het uitlaatreservoir kan stromen. Sluit het inlaatreservoir luchtdicht af met een demper/sealer.
   NOTITIE: Drukopbouw in het inlaatreservoir zorgt voor de stroming en eventuele luchtlekken veranderen de stroomsnelheden. Controleer op defecten aan de sealer als er luchtbellen ontstaan in de buitenste slang.
6. Stel de uitlaatdemper in op atmosferische druk om het drukverschil vast te stellen. Plaats het apparaat en de reservoirs in een incubator van 37 °C, 5% CO_{2 .} Sluit de slang van het apparaat aan op een peristaltische pomp die buiten de couveuse is geplaatst (Figuur 1C).
7. Zet de pomp aan om te beginnen met het aanbrengen van 3,6 dyne/cm². Verhoog het debiet geleidelijk in stappen van 2 ml/min (bijv. bereik 85 ml/min van 65 ml/min na 10 min) tot ongeveer 8 dyne/cm².
8. Verhoog het debiet verder met stappen van 2,5 ml/min tot het bereiken van 12 dyne/^cm2 schuifspanning.
   OPMERKING: Geef de cellen de tijd om zich aan te passen aan de dynamische toestand, aangezien een snelle toename van de stroomsnelheid cellen kan losmaken en de monolaag kan beschadigen.
9. Stop na 6 uur de stroom, verwijder het apparaat uit de couveuse en demonteer de stroomkamer. Breng vervolgens hydrogelmonsters over naar een plaat met zes putjes.
10. Was de monsters met ijskoud PBS en fixeer de cellen voor immunokleuring of lyseer ze voor eiwitisolatie.

8. Immunokleuring opstelling voor confocale microscopie met hoge vergroting

OPMERKING: Om de efficiëntie van het onderzoek te verhogen, werd een methode ontwikkeld voor het immunokleuring van kleine porties hydrogels, waardoor het mogelijk wordt om meerdere biologische doelen in een enkel monster te onderzoeken.

1. Bereid biopsieponsen of favoriete snijgereedschappen voor met een diameter van 3 of 4 mm.
2. Gebruik een pipetpuntdoosje als kleurkamer. Bevochtig de kamer om de verdamping van de kleuroplossing tijdens langdurige incubatie te beheersen door een natte papieren handdoek op de bodem van de pipetpuntdoos te leggen.
3. Verminder het verbruik van antilichamen door kleine oplossingspools te creëren voor individuele monsters. Bedek het rek van de tipbox met transparante folie en druk de film voorzichtig met een vingertop tegen de gaten in het rek om kuiltjes te maken. Vul de kuiltjes met 70 μL PBS.
4. Breng een individuele hydrogel over in een lege petrischaal en snijd deze met een biopsiepons of een snijgereedschap naar keuze. Gebruik een microscoop om een representatief monstergebied te snijden. Snijd een volle gelcilinder om confocale microscopieproblemen te voorkomen.
5. Plaats de gesneden hydrogelmonsters in kuiltjes die in stap 8.3 zijn gemaakt. Voer de kleuring uit volgens het standaardprotocol¹⁵. Verkrijg na de laatste kleuring een siliconenrubberen vel dat overeenkomt met de dikte van de hydrogel.
   OPMERKING: Gebruik bij voorkeur een vel met één plakzijde voor een betere afdichting. In deze studie werden actinevezels gekleurd met behulp van een fluorescerend secundair antilichaam geconjugeerd aan phalloidine in een verdunning van 1:20.
6. Snijd het rubberen vel in vierkanten van 15 mm x 15 mm. Pons een gat van 6 mm met behulp van een biopsiepons of een snijgereedschap naar keuze.
7. Maak een monsterhouder door het rubber op een microscopie-dekglaasje (nr. 1.5) te bevestigen. Voeg 10 μL natte montagemedia toe aan de kuiltjes terwijl het monster nog aanwezig is en incubeer het 10-15 minuten in het donker.
   OPMERKING: Voor deze studie bevatten de montagemedia 0,9 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) om het kleuringsprotocol te verkorten.
8. Haal het monster uit de kleurkamer en plaats het in de container die in stap 8.7 is gemaakt. Breng 1-2 μL montagemedia aan op het monster.
   OPMERKING: De hoeveelheid montagemedia is van invloed op de beeldkwaliteit bij sterke vergrotingen. Te veel of onvoldoende montagemedia kunnen de helderheid van het beeld in gevaar brengen.
9. Plaats er nog een dekglaasje op en druk voorzichtig om ervoor te zorgen dat het monster in contact komt met het glas. Bewaar de monsters bij 4 °C in het donker tot microscopiebeeldvorming.

Resultaten

Figuur 1 toont de experimentele opstelling en schetst het proces van GelMA-synthese door middel van een methacrylatiereactie. Het resulterende product werd vervolgens gebruikt om het hydrogelsubstraat te fabriceren, waarop EC's werden gezaaid. Vervolgens werden de cellen in de stroomkamer gebracht voor een 6 uur durend stromingsexperiment bij 12 dyne/cm².

¹H NMR-spectroscopie werd gebruikt om het succes van de methacrylatiereactie te beoordelen (figuur 2A). De aanwezigheid van een methylgroep bij 1,9 ppm en een vinylpiek tussen 5,4-5,6 ppm in GelMA bevestigde succesvolle methacrylatie. Bovendien geeft de afname van de lysinepiek bij 3 ppm in GelMA het verbruik van lysineresiduen aan, die worden vervangen door methacrylaatresiduen 12,13,16. De stijfheid van GelMA-hydrogels werd geëvalueerd met behulp van een compressietest, waaruit bleek dat de compressiemoduli toenamen met de GelMA-concentraties (Figuur 2B). Hydrogels bestaande uit 4% en 8% (w/v) GelMA werden gebruikt om respectievelijk fysiologische (5 kPa) en pathologische (10 kPa) matrixstijfheden na te bootsen⁸.

De stroomkamer is ontworpen om kosteneffectief te zijn en gemakkelijk te steriliseren, door gebruik te maken van acrylpolymeer dat UV-bestendig is. De transparantie vergemakkelijkt real-time monitoring van hydrogels en stromingscondities tijdens experimenten. Ontworpen met drie verschillende lagen, minimaliseert de kamer het risico op beschadiging van hydrogel tijdens het laden of lossen: de bodemplaat zorgt voor een stevige basis, de middelste laag biedt zijdelingse ondersteuning voor de hydrogels en de bovenplaat, langs de pakking, creëert de vrije ruimte die nodig is voor de vloeistofstroom (Figuur 3A). Computersimulaties werden uitgevoerd met behulp van CFD om de stromingscondities en schuifspanning in de kamer te beoordelen. De volgende vergelijking - schuifspanning = 0,0558 x debiet - berekende de uitgeoefende schuifspanning op de cellen op basis van het debiet als input (Figuur 3B). Met name veranderingen in materiaaleigenschappen, zoals stijfheid, veranderden de schuifspanning in de simulaties niet. Om rekening te houden met verschillen in de grootte van de hydrogel in de uiteindelijke experimentele opstelling, werden de hydrogels opzettelijk iets kleiner gemaakt in het rekenmodel. Er werd een opening van 0,5 mm gecreëerd tussen één kant van de hydrogels en de middelste plaatwanden van de kamer, loodrecht op de stroomrichting. Deze configuratie maakte het mogelijk om de effecten van schuifspanningen in deze openingen te analyseren. Hoewel onregelmatigheden in de schuifspanning werden waargenomen op spleetlocaties (Figuur 3B), bleef hun impact beperkt tot een klein gebied grenzend aan spleten, waarbij het resterende hydrogeloppervlak een uniforme schuifspanning ondervond (Figuur 3C). Deze inzichten suggereren het weggooien van cellen van de randen van hydrogels om de potentiële impact van turbulente regio's te minimaliseren. Het is vermeldenswaard dat een hogere schuifspanning, tot 15 dyne/cm², experimenteel werd toegepast op EC's gezaaid op hydrogels van 5 kPa en 10 kPa zonder lekkage in het apparaat (gegevens niet inbegrepen). Het verder verhogen van de schuifspanning kan echter mogelijk leiden tot celloslating en hydrogelfalen, wat de noodzaak van zorgvuldige optimalisatie van experimentele omstandigheden benadrukt.

Om zaadcellen een monolaag te laten vormen, is het cruciaal om een hogere celdichtheid te gebruiken dan in traditionele culturen. Het is aangetoond dat een lage zaaidichtheid de vorming van monolagen op zachtere hydrogels belemmert⁸. Bovendien verbetert het voorcoaten van hydrogels met gelatine vóór het zaaien van cellen de initiële celaanhechting en verspreiding op zachtere hydrogels. Het is echter belangrijk op te merken dat het gunstige effect van deze coating tijdelijk is, omdat het in de eerste plaats de initiële interactie tussen de cellen en het substraat vergemakkelijkt.

Figuur 4 laat zien hoe stijfheid en schuifspanning de vorming van actinevezels beïnvloeden. Onder schuifspanning vormden zich dikkere spanningsvezels, wat wijst op een sterkere hechting aan het oppervlak. In zachtere monsters waren er meer perifere actinevezels, die indicatoren zijn van fysiologische omstandigheden. In EC's op stijvere substraten kan de aanwezigheid van sterkere stressvezels en minder perifere vezels echter mogelijk leiden tot EC-disfunctie¹⁷. Deze gegevens bevestigen de effectiviteit van het gepresenteerde systeem bij het moduleren van EC-gedrag.

Figuur 1: Overzicht van de huidige studie. (A) GelMA-synthese. Gelatine werd chemisch gemodificeerd tot gelatinemethacrylaat (GelMA) door een reactie tussen gelatine en methacrylanhydride (MAH) bij 55 °C. Het product werd vervolgens neergeslagen in aceton en onder vacuüm gedroogd. (B) Fabricage van hydrogel. Het afdekglas werd voorbereid door afstandhouders aan te brengen. Vervolgens werd het gemodificeerde glas op het afdekglas bevestigd. Het afdekglas werd op de mal geplaatst, waarbij de afstandhouders zorgden voor de gewenste afstand tussen het gemodificeerde glas en de bodem van de mal. De GelMA-oplossing met initiatiefnemers werd toegevoegd aan de opening tussen het gemodificeerde glas en de mal, polymeriserend om een hydrogel te vormen die covalent aan het gemodificeerde glas is gebonden. (C) Stroming experiment. De resulterende hydrogel werd gebruikt om EC's te zaaien. Na het vormen van een monolaag ondergingen de cellen een 6 uur durend stromingsexperiment bij een schuifspanning van 12 dyne/cm². Deze figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: ¹H-NMR spectra voor gelatine en GelMA pre-polymerisatie. (A) Raadpleeg de vakken met stippellijnen voor relevante pieken. Methacryloylpieken (d.w.z. vinyl- en methylgroepen) verschenen na de chemische modificatie van gelatine, terwijl de lysinegroep werd gebruikt om de mate van substitutie na de chemische reactie te kwantificeren¹⁸. (B) Young's modulus van de hydrogels werd gemeten door een compressietest, en 4% (w/v) GelMA-hydrogels werden beschouwd als fysiologische substraten en 10% (w/v) werd beschouwd als pathologisch substraat (n=4, gemiddelde ± SEM). Dit cijfer is gewijzigd van⁸. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Ontwerp van de stroomkamer met parallelle platen en computersimulatie. (A) Drie afzonderlijke platen werden gebruikt om de kans op beschadiging van de hydrogels tijdens het laden of lossen te verkleinen; Waar de bodemplaat een steunvlak vormde, bood het middenoppervlak zijdelingse ondersteuning voor de hydrogels en vormden de bovenplaat en pakking de vrije ruimte voor de vloeistof om te stromen. (B) De stroomkamer onderging computationele simulaties¹¹. Wanneer het debiet 215 ml/min is, is de schuifspanning langs de getekende lijn ongeveer 12 dyne/^cm2, wat de fysiologische schuifspanning vertegenwoordigt. (C) De invloed van de spleet van 0,5 mm is beperkt tot een klein gebied naast de spleet. Het resterende oppervlak van de hydrogel ondervindt een gelijkmatige schuifspanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Schuifspanning en stijve hydrogel verhogen de vorming van spanningsvezels. Meer perifere actinevezels worden gevormd in EC's op 5 kPa-monsters onder stroom. Sterkere stressvezels werden gevormd wanneer de cellen werden blootgesteld aan schuifspanning op 10 kPa hydrogels, wat de effectiviteit van het model op het gedrag van EC aantoont. Pijlen geven perifeer actine aan en de sterretjes geven gestreste vezels aan. Schaalbalk = 10 μm (Blauw: DAPI, Rood: Actinevezels). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het vasculaire systeem is een dynamische omgeving waar verschillende krachten het cellulaire gedrag aanzienlijk beïnvloeden. Het bestuderen van biologische gebeurtenissen bij hart- en vaatziekten zonder rekening te houden met deze krachten zou onnauwkeurig zijn. Cellulaire modellen die in staat zijn om de vasculaire mechanische omgeving na te bootsen, zijn dus cruciaal. Onderzoekers hebben al aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het benadrukken van het effect van deze krachten op cellulair gedrag¹¹. Om het gedrag van cellen onder zowel pathologische als fysiologische omstandigheden in het menselijk lichaam te begrijpen, is het echter essentieel om nauwkeurigere modellen te ontwikkelen die meer lijken op de omgeving van het bloedvat. Daarom wilden we een systeem ontwikkelen dat de bloedvatomgeving nauwkeuriger nabootst met behoud van toegankelijkheid en gebruiksvriendelijkheid.

Het model kan gecontroleerde stromingsafgeleide schuifspanning toepassen op menselijke cellen op substraten met verschillende stijfheidsniveaus, waardoor omstandigheden worden geproduceerd die dichter bij de fysiologische realiteit liggen in vergelijking met bestaande modellen. GelMA werd in dit model gesynthetiseerd en gebruikt om aan de volgende criteria te voldoen: 1) afstembare mechanische eigenschappen, 2) niet-zwellingsgedrag, 3) celcompatibiliteit en adhesie, en 4) het vermogen om vasculaire cellen in te bedden om de bloedvaten nauwkeuriger te modelleren. De aanpasbaarheid van mechanische eigenschappen werd bereikt door de biopolymeerconcentratie⁸ te variëren om fysiologische en pathologische omstandigheden na te bootsen. Het tweede criterium was het niet-zwellingsgedrag. Het is van cruciaal belang om een niet-zwellende ondergrond te hebben om consistente stroomkamerafmetingen, gerelateerde stromingsomstandigheden en schuifspanning op de cellen te behouden. GelMA met een hoge mate van methacrylatie vertoonde niet-zwellende eigenschappen, waardoor de vorm en de gladheid van het oppervlak van de hydrogel gedurende het hele experiment behouden^{bleven 8}. Belangrijk is dat de concentratie en stijfheid geen invloed hadden op het zwellingsgedrag, wat het model vereenvoudigde doordat er geen afzonderlijke aanpassingen nodig waren voor elke experimentele groep. Het derde criterium was celadhesie, omdat een goede hechting nodig is om celloslating te voorkomen en de integriteit van de monolaag te behouden. GelMA zorgde voor celadhesie, waardoor er minder extra stappen nodig waren om celadhesieve moleculen aan het substraat te conjugeren, wat essentieel is voor veel biopolymeren. Bovendien werd het vermogen van GelMA voor celinkapseling overwogen, hoewel dit in deze studie niet direct werd getest. Het celinkapselingspotentieel heeft aanwijzingen voor het ondersteunen van 3D-celcultuur en het integreren van cellagen, zoals vasculaire gladde spiercellen of pericyten, om de nauwkeurigheid van het model te verbeteren¹⁹. Bovendien is de synthese van GelMA kosteneffectief en vereist het minimale apparatuur, waardoor het een uitstekende kandidaat is als biomateriaal voor de fabricage van substraten 20,21,22.

De stromingskamer met parallelle plaat wordt vaak gebruikt om schuifspanning op cellen uit te oefenen, maar wordt van oudsher alleen gebruikt met glazen dekglaasjes of stijve materialen. Dergelijke materialen missen echter fysiologische relevantie²³. Daarentegen hebben microfluïdische apparaten meer geometrische complexiteit en zachtere substraten geïntroduceerd door gebruik te maken van op polymeer gebaseerde materialen. Deze apparaten kunnen het stroomregime echter vaak niet nauwkeurig regelen, en hun kleine afmetingen beperken hun vermogen tot het bestuderen van slechts een klein aantal cellen, waardoor de experimentele resultaten worden beperkt¹¹. Het voorgestelde apparaat combineert de voordelen van beide systemen door endotheelcellen monolayer gezaaide hydrogels te integreren met een stroomkamer die nauwkeurig gecontroleerde schuifspanning uitoefent.

Het apparaat heeft aangetoond dat het in staat is om zowel van stroming afgeleide als van vaste stoffen afgeleide mechanische krachten te integreren. Wanneer gedurende 6 uur een schuifspanning van 12 dyne/^cm2 werd toegepast, werd een vorming van cytosolische stressvezels waargenomen, in tegenstelling tot het overwicht van perifeer actine in de zachtere substraatgroep. Dit is in lijn met veel rapporten die aantonen dat er minder stressvezels worden gevormd wanneer EC's worden gekweekt op zachtere oppervlakken 24,25,26,27. Aan de andere kant kan laminaire stroming resulteren in prominente vorming van stressvezels. Het is aangetoond dat de cytoskeletale respons op flowcondities begint binnen 1 uur na blootstelling aan de flow, maar een opmerkelijk langere tijd vereist om de reorganisatie te voltooien 28,29,30. Het perifere actinenetwerk is essentieel voor verschillende EC-functies, waaronder cel-celadhesie en barrièrefunctionaliteit¹⁷. Het opreguleren van dit netwerk in een gezonde experimentele groep in vergelijking met de pathologische groep met uitgebreide stressvezels keurt de succesvolle modellering van gezonde en zieke aandoeningen door het apparaat goed.

Een nadeel van dit apparaat is de kans op schade aan de hydrogels, wat de stroom zou kunnen verstoren en het slagingspercentage van experimenten zou kunnen verminderen. Dit probleem komt voornamelijk voort uit aanvankelijke defecten in de hydrogels, die onder schuifspanning kunnen verergeren, wat leidt tot het loslaten van het monster en gedeeltelijke stroomobstructie. Daarom moeten de stappen van de monstervoorbereiding, inclusief polymerisatie, equilibratie en snijden, zorgvuldig worden uitgevoerd om extra schade aan de monsters te voorkomen. Een andere uitdaging in dit systeem is het bereiken en behouden van de integriteit van de monolaag. Hoewel het coaten van de hydrogels met gelatine de initiële celhechting kan verbeteren, toonde ons eerdere werk aan dat deze coating geen invloed heeft op de celproliferatie⁸. Om de vorming van monolagen te verbeteren, vooral gezien het feit dat de celproliferatie langzamer verloopt op zachtere hydrogels³¹, is het daarom gunstig om de zaaidichtheid te verhogen. Bovendien kunnen de cellen loskomen als gevolg van de schuifspanning die wordt veroorzaakt door de vloeistofstroom. Daarom is het van cruciaal belang om het debiet geleidelijk te verhogen, zodat de cellen voldoende tijd hebben om zich aan te passen aan de nieuwe omgevingsomstandigheden.

Concluderend vertegenwoordigt het apparaat een aanzienlijke vooruitgang in het nauwkeuriger simuleren van de vasculaire omgeving vanwege het vermogen om tegelijkertijd zowel van vloeistof afgeleide als van vaste stoffen afgeleide mechanische krachten te simuleren. Het biedt een uitgebreid platform voor het bestuderen van EC-gedrag onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Deze veelzijdigheid maakt het een waardevol hulpmiddel voor het vergroten van ons begrip van vasculaire biologie en ziekteprogressie. Dit model kan bijdragen aan een verscheidenheid aan onderzoeken, waaronder mechanobiologie, atherosclerose, ontwikkeling van kankermetastasen, vasculaire weefselmanipulatie en angiogenese, en medicijnafgifte en screening.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Hydrogel Fabricage
3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate	Sigma-Aldrich	440159	Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media	Vector Laboratories	H-1200	Immunoskleuring
Aceton	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthese
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8953S	Immunoskleuring
Ammonium Persulfaat (APS)	Bio-Rad	1610700	Hydrogel Fabricage
Heldere kras- en UV-bestendige gietacrylplaat (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Flow Chamber Fabricage
Confocale Microscoop	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunoskleuring
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Spuiten zonder naalden	Fisher	22-031-375	Flow Experiment
EC groeikit	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Celcultuur
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Glass Salinization
Gelatine Type A (300 bloom) uit varkenshuid	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthese
Glazuur Azijnzuur	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Glass Salinization
Hoogzuivere hoge temperatuur siliconenrubberplaat	McMaster-Carr	87315K74	Flow Chamber Fabricage
Human Umbilical Vein Endotheelcellen (HUVEC)	American Type Culture Collection (ATCC)	PSC-100-010	Celcultuur
M3x30mm Machineschroeven Hex Socket Ronde Kop Schroef 304 Roestvrijstalen Bevestigingen Bouten 20 stuks	Uxcell	B07Q5RM2TP	Flow Chamber Fabricage
Masterflex L/S Digital Drive met Easy-Load® 3 Pompkop voor Precisiebuizen; 115/230 VAC	VWR	#MFLX77921-65	Flow Experiment
Masterflex L/S Precisiepompbuis, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment
Methacrylzuuranhydride (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthese
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Celcultuur
Fosfaat-gebufferde Saline (PBS)	Gibco	14080-055	Algemeen
Natriumbicarbonaat	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthese
Natriumcarbonaat	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthese
SOLIDWORKS educatieve versie
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Ontwerp
Vasculair basaal medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Celcultuur