Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67081

⸱

19 juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering Department, Northeastern University, 2Bioengineering Department, Northeastern University, 3Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI), UMR CNRS, Sorbonne Universités, Université de Technologie of Compiègne (UTC), 4Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 5Neuroscience Department, Albert Einstein College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We hebben een afstembaar substraat op basis van gelatine gesynthetiseerd en gekarakteriseerd voor het kweken van vasculaire endotheelcellen (EC's) onder relevante vasculaire stromingsomstandigheden. Dit biomimetische oppervlak repliceert zowel fysiologische als pathologische omstandigheden, waardoor de studie van mechanische krachten op het EC-gedrag mogelijk wordt en ons begrip van vasculaire gezondheid en ziektemechanismen wordt bevorderd.

Samenvatting

We presenteren een innovatief in vitro model gericht op het onderzoeken van de gecombineerde effecten van weefselstijfheid en schuifspanning op de functie van endotheelcellen (EC), die cruciaal zijn voor het begrijpen van de vasculaire gezondheid en het ontstaan van ziekten zoals atherosclerose. Van oudsher hebben studies de effecten van schuifspanning en substraatstijfheid op EC's onafhankelijk van elkaar onderzocht. Dit geïntegreerde systeem combineert deze factoren echter om een nauwkeurigere simulatie van de mechanische omgeving van het vaatstelsel te bieden. Het doel is om EC-mechanotransductie te onderzoeken over verschillende weefselstijfheidsniveaus en stromingsomstandigheden met behulp van menselijke EC's. We beschrijven het protocol voor het synthetiseren van gelatinemethacrylaat (GelMA) hydrogels met afstembare stijfheid en het bezaaien ervan met EC's om samenvloeiing te bereiken. Daarnaast beschrijven we het ontwerp en de assemblage van een kosteneffectieve stromingskamer, aangevuld met computationele vloeistofdynamicasimulaties, om fysiologische stromingsomstandigheden te genereren die worden gekenmerkt door laminaire stroming en passende schuifspanningsniveaus. Het protocol bevat ook fluorescentie-etikettering voor confocale microscopie, waardoor de beoordeling van EC-reacties op zowel weefselcompliantie als flowomstandigheden mogelijk wordt. Door gekweekte EC's te onderwerpen aan meerdere geïntegreerde mechanische stimuli, maakt dit model uitgebreid onderzoek mogelijk naar hoe factoren zoals hypertensie en veroudering de EC-functie en EC-gemedieerde vaatziekten kunnen beïnvloeden. De inzichten die uit deze onderzoeken worden verkregen, zullen een belangrijke rol spelen bij het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan vaatziekten en bij het ontwikkelen van effectieve behandelstrategieën.

Inleiding

Endotheel, dat het binnenoppervlak van bloedvaten bekleedt, speelt een cruciale rol bij het behoud van de vasculaire gezondheid. Endotheelcellen (EC's) staan centraal bij het reguleren van verschillende cardiovasculaire functies, waaronder vaattoonregeling, selectieve permeabiliteit, hemostase en mechanotransductie 1,2. Onderzoek heeft EC-disfunctie stevig in verband gebracht met een primaire rol bij de ontwikkeling van atherosclerose. EC's ondervinden met name verschillende mechanische krachten op de grensvlakken waar ze interageren met de bloedstroom en onderliggende vaatweefsels 3,4. Verschillende onderzoeken hebben EC-disfunctie in verband gebracht met abnormale veranderingen in mechanische factoren binnen de vasculaire omgeving, zoals de vloeistofschuifspanning door de bloedstroom en weefselstijfheid 5,6,7.

Eerder onderzoek heeft echter beperkte aandacht gekregen om de gecombineerde effecten van weefselstijfheid en schuifspanning op de EC-functie te begrijpen. Om het vermogen te vergroten om onderzoeksresultaten te vertalen naar effectieve behandelingen voor atherosclerose en andere hart- en vaatziekten, is het essentieel om de cellulaire modellen die in het veld worden gebruikt te verbeteren. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het humaniseren van cellulaire modellen door gebruik te maken van menselijke EC's en deze te onderwerpen aan schuifspanning of substraten met verschillende stijfheidsniveaus 8,9,10. De acceptatie en verfijning van cellulaire modellen die dynamische stromingsomgevingen integreren met EC-substraten met instelbare stijfheidseigenschappen is echter langzaam gevorderd. De uitdaging ligt in het ontwerpen van niet-zwellende EC-substraten om veranderingen in de stromingsparameters binnen het stromingskanaal te voorkomen en tegelijkertijd de teelt van intacte en goed hechtende EC-monolagen te vergemakkelijken. Een in vitro model dat in staat is om deze obstakels te overwinnen, zou effectiever onderzoek kunnen vergemakkelijken naar hoe hypertensie, veroudering en flowcondities samen van invloed zijn op EC-mechanotransductie, vasculaire gezondheid en, uiteindelijk, de ontwikkeling van atherosclerose. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om schuifspanning op cellen uit te oefenen en tegelijkertijd de stijfheid van het substraat te beheersen, waaronder roterende platen en microfluïdische apparaten. Bij de roterende plaatmethode worden cellen tussen twee platen geplaatst en wordt schuifspanning uitgeoefend door de roterende beweging van de platen. Deze methode is minder ingewikkeld en biedt een snel model; Het lijdt echter aan ruimtelijke schuifspanningsvariatie, met nul schuifspanning in het midden en maximale schuifspanning aan de periferie11.

Aan de andere kant vertegenwoordigen microfluïdische apparaten de nieuwe generatie gereedschappen met de mogelijkheid om de stijfheid van het substraat en de stromingsomstandigheden te regelen. Deze systemen zijn geschikt voor het nabootsen van microvasculaturen onder laminaire stromingsomstandigheden. Het bestuderen van atherosclerose met dergelijke apparaten is echter onpraktisch, omdat atherosclerose optreedt in grote bloedvaten met een verstoorde stroming11. Dit artikel heeft tot doel een bijdrage te leveren aan het kritische onderzoeksdomein van EC-studies door een kosteneffectief systeem te presenteren dat in staat is om de effecten van variërende stijfheidsniveaus in EC-substraten onder verschillende stromingsomstandigheden te onderzoeken. Het systeem integreert substraten met verschillende stijfheden om pathologische en fysiologische bloedvaten na te bootsen. Dit protocol schetst de methode voor het maken van hydrogels op basis van gelatine zonder zwelling en stijfheidsniveaus van 5 kPa en 10 kPa, die respectievelijk fysiologische en pathologische stijfheid vertegenwoordigen. Bovendien is de constructie van een stromingskamer met parallelle platen die in staat is om deze substraten te integreren, gedetailleerd. Computational fluid dynamics (CFD) werd gebruikt om schuifspanning en stromingsomstandigheden te evalueren. De bereiding van hydrogels voor EC-cultuur en de uitvoering van een 6 uur flow experiment worden beschreven, gevolgd door een bespreking van immunokleuring na het experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Synthese van GelMA

  1. Bereid een 0,2 M-oplossing van watervrij natriumcarbonaat en een 0,2 M-oplossing van natriumbicarbonaat.
  2. Meng 46 ml natriumbicarbonaatoplossing met 15 ml natriumcarbonaatoplossing en voeg 139 ml gedeïoniseerd (DI) water toe. Stel de pH in op 9,5 met behulp van 0,1 M NaOH en HCl indien nodig.
  3. Voeg 10 g type A, 300-bloom gelatine van varkenshuid toe aan 100 ml carbonaat-bicarbonaatbuffer in een concentratie van 10% g/v.
  4. Los de gelatine op met een waterbad van 55 °C terwijl u de oplossing op 700 rpm roert met een magnetische roerder. Eenmaal volledig opgelost, stelt u de pH van de gelatineoplossing in op 9,5 met behulp van 0,1 M NaOH.
  5. Om de methacrylatie op gang te brengen, voegt u druppelsgewijs 938 μl methacrylanhydride (MAH) toe aan de oplossing. Verbeter de initiële verdeling van MAH in de gelatineoplossing door deze op verschillende locaties te injecteren, waaronder verschillende diepten en radiale afstanden vanaf het centrum.
  6. Wikkel het reactievat in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Houd de temperatuur op 55 °C en roer de oplossing gedurende 1 uur met 500 tpm om de reactie te voltooien (figuur 1A)12.
    OPMERKING: De reactie stopt bij een pH lager dan 7,4.
  7. Bereid een bekerglas van 2 l met 1,8 l aceton en een beker van 0,6 l met 0,3 l aceton voor.
  8. Voeg de resulterende GelMA-oplossing druppelsgewijs toe aan het bekerglas van 2 l en roer op 200 tpm om precipitatie op te wekken13. Om de opvang van het neergeslagen product te maximaliseren, plaatst u een roestvrijstalen staaf of spatel als nucleatieplaats voor een gemakkelijkere overdracht.
  9. Breng het product over van de grote beker naar de kleinere beker en laat het 10 minuten staan voordat u doorgaat met de droogstap. De neergeslagen GelMA zou moeten verschijnen als witte vezels.
  10. Verzamel het product op absorberend papier, droog het in een vacuümoven bij kamertemperatuur (RT) en bewaar het bij -20 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Aanvullende details over de chemische karakterisering van het product via proton nucleaire magnetische resonantie (1H NMR) zijn te vinden in een eerder gepubliceerd werk8.

2. Verzilting van glas

OPMERKING: Het bevestigen van hydrogels aan glazen objectglaasjes zorgt voor een vlak en gelijkmatig oppervlak, wat het hanteren vergemakkelijkt en zorgt voor stabiliteit onder door stroming afgeleide schuifspanning. Het functionaliseren van het glas met 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat is noodzakelijk om de oppervlakte-eigenschappen te verbeteren en de covalente hechting van hydrogels tijdens het polymerisatieproces mogelijk te maken.

  1. Snijd gewone microscoopglaasjes (1 mm dikte) nauwkeurig in stukken die vergelijkbaar zijn met de uiteindelijke hydrogelafmetingen met behulp van een glassnijder. Was de gesneden glaasjes met zeep om oppervlakteverontreinigingen en vuil te verwijderen die de behandeling van het glasoppervlak zouden kunnen belemmeren.
    NOTITIE: Indien nodig, sonicaat de glazen objectglaasjes gedurende 5 minuten in ethanol en laat ze vervolgens aan de lucht drogen.
  2. Bereid een 0,5% oplossing van 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat in absolute ethanol. Bereid een oplossing van 10% ijsazijn in gedistilleerd water. Meng de oplossingen tot een uiteindelijke concentratie van 3% ijsazijn.
    OPMERKING: De ijsazijnzuuroplossing kan in grote hoeveelheden worden bereid en bewaard.
  3. Organiseer de glasplaatjes in een glazen bak om ervoor te zorgen dat de glasoppervlakken niet worden belemmerd. Giet de resulterende oplossing over de glasplaatjes en houd ze ongeveer 5 minuten op een wip bij 80 tpm om de reactie te voltooien. Zorg ervoor dat beide zijden van de glasplaatjes zijn aangepast door eventuele ingesloten luchtbellen te verwijderen.
  4. Nadat de reactie is voltooid, zuigt u de oplossing op en wast u de glasplaatjes 2x met ethanol. Laat de glaasjes aan de lucht drogen en bewaar ze in het donker bij RT.
    LET OP: De glasplaatjes behouden onder deze omstandigheden 1 maand hun wijziging.

3. Hydrogel voorbereiding

  1. Fabriceer hydrogels met behulp van een door redox geïnduceerde polymerisatiemethode voor vrije radicalen.
    1. Monteer tweedelige mallen van polytetrafluorethyleen (PTFE) met de juiste diepte en te openen vensters van 10mm2 om het uiteindelijke substraat vorm te geven. Houd rekening met een krimp van 25% in de hoogte van de hydrogel na polymerisatie tijdens het ontwerpproces. Zorg ervoor dat de mallen plat zijn en stevig zijn vastgemaakt aan de onder- en bovenplaten om lekkage te voorkomen.
      OPMERKING: De afmetingen van de ontworpen mal zijn opzettelijk 10% groter dan de beoogde hydrogelmaat. Dit ontwerp dient meerdere doelen: het voorkomt schade aan de zijkanten bij het scheiden van de matrijs, verbetert de gelijkmatigheid van het oppervlak van de hydrogel door onzuiverheden of luchtbellen naar de zijkanten te duwen, en compenseert de verwachte krimp van 25% na evenwicht als gevolg van het synerese-effect, waarbij sterk verknoopte hydrogels water afstoten na het balanceren, waardoor krimp ontstaat. De krimphoeveelheid is gespecificeerd in het protocol8.
    2. Om ervoor te zorgen dat hydrogels een gelijkmatig oppervlak en een constante hoogte hebben, hangt u gemodificeerde glasplaatjes aan de bovenplaat van de mal, zodat er een smalle opening is voor het injecteren van de polymeeroplossing. Gebruik een afdekglas om de gewijzigde glasplaatjes op te hangen (Figuur 1B).
    3. Om het afdekglas te maken, snijdt u gewoon microscopisch glas dat 20% groter is dan de mal. Bevestig twee afstandhouders aan de korte zijden. Bereken de dikte van de afstandhouder als volgt:
      Dikte afstandhouder = 1,33 x uiteindelijke geldikte + 1 (dikte van het gemodificeerde glas) - diepte van de mal
    4. Breng een dunne laag celcompatibel afdichtingsvet aan op de langere zijden van het afdekglas, op hetzelfde oppervlak waar de afstandhouders zijn bevestigd.
    5. Bevestig het aangepaste glasplaatje aan het afdekglas tussen de twee afstandhouders.
    6. Plaats het afdekglas op de mal zodat de afstandhouders op de mal zitten en het gemodificeerde glas in de mal uitsteekt. Deze opstelling biedt een vrije ruimte van 1,33 van de hoogte van de uiteindelijke hydrogel tussen het gemodificeerde glas en de bodem van de mal.
    7. Los GelMA op in DI-water van 4% en 10% w/v voor respectievelijk 5 kPa en 10 kPa hydrogels en plaats het in een waterbad van 45 °C.
      OPMERKING: GelMA is een warmtegevoelig polymeer en het handhaven van de oplossingstemperatuur op 45 °C voorkomt stolling vóór polymerisatie en vermindert de viscositeit van de oplossing, wat cruciaal is voor het vervaardigen van platte hydrogels.
    8. Voeg TEMED (24 mM voor 5 kPA hydrogel, 6,25 mM voor 10 kPa hydrogel) toe aan de polymeeroplossing en meng grondig.
      OPMERKING: TEMED alleen initieert de polymerisatie niet, dus zorg ervoor dat mallen, pipetten en oplossingen zijn voorbereid voordat u verder gaat.
    9. Voeg APS (24 mM voor 5 kPA hydrogel, 24,5 mM voor 10 kPa hydrogel) toe aan de GelMA-oplossing en meng goed.
      OPMERKING: Het toevoegen van APS initieert de polymerisatie en hydrogels kunnen zich snel vormen, waardoor onmiddellijke actie nodig is om defecte hydrogels te voorkomen. Verdere details over stijfheidsmetingen zijn te vinden in een eerder gepubliceerd werk8.
    10. Pipeteer de resulterende oplossing voorzichtig in de opening tussen het hangende glasplaatje en de mal bij RT en laat deze verknopen. Capillaire kracht drijft de polymeeroplossing in de mal. Voeg geen belletjes toe aan de gels en stop met pipetteren als er een kleine hoeveelheid oplossing in de pipetpunt achterblijft.
      OPMERKING: Tijdens polymerisatie reageren methacrylaatgroepen van GelMA met methacrylaatresiduen op de gemodificeerde glasplaatjes, wat resulteert in de chemische hechting van de hydrogel aan het glas.
    11. Na 15 minuten is de reactie voltooid. Maak het substraat los van de mal met behulp van een scherp voorwerp, zoals een naald, en schuif het substraat weg van het afdekglas om het te scheiden.
    12. Breng de hydrogels over in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaal van 100 mm die is afgesloten met plastic folie en balanceer bij 37 °C om de resterende reactanten en bijproducten te verwijderen.
    13. Aangezien de hydrogel iets groter is dan de uiteindelijke afmetingen, snijdt u overtollige gel aan de zijkanten bij zodat deze overeenkomt met de afmetingen die nodig zijn voor het venster van de stroomkamer.
    14. Gebruik de stroomkamer om de afmetingen van de hydrogel te controleren. Zorg ervoor dat de hydrogel goed in de stroomkamer past zonder openingen tussen de hydrogel en de mal of defecten die de stroompatronen kunnen beïnvloeden. Als er onregelmatigheden in de vorm zijn die het stroompatroon in de stroomkamer kunnen beïnvloeden, wat leidt tot ongunstig celgedrag, bewaar de hydrogel dan voor statische omstandigheden.
    15. Breng vier hydrogels over in een petrischaal met 1x PBS voor sterilisatie.
  2. Steriliseer de hydrogel zoals hieronder beschreven met 70% ethanol.
    1. Bereid 25%, 50% en 70% alcoholoplossingen voor geleidelijke uitdroging van hydrogel.
      OPMERKING: Als geleidelijke uitdroging niet wordt uitgevoerd, kunnen stijvere hydrogels krimpen en breken, terwijl er rimpels kunnen ontstaan op het oppervlak van zachtere hydrogels.
    2. Zuig de 1x PBS-oplossing op uit de petrischaal met hydrogels. Voeg 25% ethanoloplossing toe aan elke petrischaal om de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa gedurende 15 minuten onder te dompelen.
    3. Zuig de 25% alcoholoplossing op. Voeg 50% alcoholoplossing toe aan elke petrischaal om de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa gedurende 15 minuten onder te dompelen.
    4. Zuig de 50% alcoholoplossing op. Voeg een oplossing van 70% alcohol toe aan elke petrischaal en dompel de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa gedurende 5 minuten onder. Plaats de petrischaal op een shaker op 100 rpm.
    5. Laat de hydrogels van 5 kPa 40 minuten ondergedompeld en de hydrogels van 10 kPa gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: Er werd waargenomen dat de hydrogels van 5 kPa vatbaarder waren voor verontreiniging in vergelijking met hydrogels van 10 kPa.
    6. Breng de monsters over naar een plaat met 6 putjes in een bioveiligheidskast en was de hydrogels 2x-3x met steriele PBS.

4. Hydrogels coaten

  1. Bereid een gelatineoplossing van 60 μg/ml door 3 mg gelatine op te lossen in 50 ml steriel PBS (1x met magnesium- en calciumzout). Verwarm de oplossing in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 minuten of tot alle gelatine volledig is opgelost.
  2. Filtreer de coatingoplossing steriel met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm. Zuig de 1x PBS-oplossing op uit elke putplaat en voeg gelatineoplossing toe aan elk putje, zodat elke hydrogel volledig bedekt is. Om het risico op besmetting te minimaliseren, voegt u 40 eenheden/ml penicilline en 10 μg/ml streptomycine toe aan de coatingoplossing.
  3. Incubeer elke putplaat in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 45 min. Was de hydrogels met 1x PBS-oplossing.
  4. Zuig PBS op en voeg celkweekmedia toe.
  5. Bewaar de hydrogels niet langer dan twee dagen in celkweekmedia en incubeer ze in een incubator van 37 °C, 5% CO2 -zaad tot het zaad van de cellen.
    OPMERKING: Ondanks de uitstekende celhechtingseigenschappen van fibronectine, is er bezorgdheid over het gebruik ervan vanwege EC's die endogene fibronectine afzetten in atherosclerotische omstandigheden, wat kan leiden tot een pro-inflammatoire reactie. Om chemisch gestimuleerde celreacties te voorkomen, zien we af van het gebruik van fibronectine. Bovendien toonden Orr et al. aan dat fibronectinecoating, vergeleken met collageen I-coating, atherogene genen opreguleerde. In het bijzonder observeerden ze verhoogde expressieniveaus van intercellulaire adhesiemolecuul 1 (ICAM-1), vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1) en nucleaire factor-κB (NF-κB)14.

5. Zaaicellen op de substraten

  1. Bereid de celsuspensie voor volgens de beschikbare loslatingsprotocollen en tel de cellen met behulp van een hemocytometer8.
  2. Zuig de media grondig op uit de hydrogels. Voeg 50.000 cellen/cm2 toe aan elk monster. Voeg een juiste hoeveelheid celsuspensie toe aan elk monster om celoverloop te voorkomen.
    OPMERKING: Stijvere substraten zijn meer hydrofoob; Minimaliseer daarom de tijd tussen de stappen om de bevochtigbaarheid en de dispersie van de celsuspensie op het substraatoppervlak te verbeteren.
  3. Incubeer hydrogels met celzaad in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 2 uur. Voeg celkweekmedia toe aan de monsters zodra de cellen aan de gels zijn bevestigd.

6. Fabricage van stroomkamers

OPMERKING: De aanpak voor het ontwerpen van de stroomkamer is kosteneffectief en vereist minimale expertise voor fabricage en gebruik.

  1. Gebruik poly(methylmethacrylaat) voor kamerfabricage om de stroomkwaliteit, de integriteit van hydrogel onder schuifspanning en mogelijke real-time biomarkerstudies tijdens stroomexperimenten visueel te beoordelen. Het ontwerp van de kamer is gemaakt met behulp van CAD-software (computer-aided design). De stroomkamer is aangevraagd voor een patent en details over dit apparaat kunnen in het huidige protocol niet worden bekendgemaakt.
  2. Computationele beoordeling van de stromingscondities in de stromingskamer
    1. Monteer de afzonderlijke componenten van de ontworpen stroomkamer (. SLDPRT-bestanden) om de uiteindelijke kameropstelling te maken.
    2. Trek een lijn langs de middellijn van de stroom die raakt aan het hydrogeloppervlak om de schuifspanning te analyseren. Sluit de inlaat- en uitlaatopeningen om een gesloten regelvolume te definiëren.
    3. Open Flow Simulation via het tabblad Add-Ins in de CAD-software. Open op het tabblad Stroomsimulatie de functie Wizard om de eigenschappen in te voeren. Specificeer het eenheidssysteem en stel de druk en de spanningseenheden in op dyne/cm2.
    4. Controleer de vloeistofstroom en de zwaartekracht in de fysieke kenmerken. Stel de zwaartekracht in op -9.8 in Z-component; X- en Y-componenten moeten nul zijn.
    5. Kies Intern voor analysetype in Geometrieafhandeling. Selecteer Water als de standaardvloeistof.
      OPMERKING: Ga ervan uit dat het medium zich gedraagt als water.
    6. Kies Laminair en Turbulent voor het stromingstype. Definieer de muur als een adiabatische muur en de ruwheid van het invoeroppervlak in Wall Condition.
    7. Stel de temperatuur in de begintoestand in op 37,5 °C (310,65 K). Definieer het rekendomein in Flow Simulation-projecten en zorg ervoor dat het het volledige regelvolume dekt.
    8. Selecteer alle wanden die met de vloeistof communiceren om het subdomein van de vloeistof te definiëren. Wijs in randtoestand het binnenoppervlak van het inlaatdeksel aan als Inlaatvolumestroom en specificeer het debiet (Q) en uniforme stroom. Wijs vervolgens het binnenoppervlak van de afdichting van het uitlaatdeksel toe als statische druk.
    9. Bepaal de globale maasgrootte op basis van de beschikbare rekenkracht. Druk op Uitvoeren om de simulatie te starten.
    10. Bekijk na voltooiing de gewenste resultaten, inclusief schuifspanningsplots en stromingssimulaties.
    11. Herhaal de stappen 6.2.8 tot en met 6.2.10 met verschillende debieten om de toegepaste schuifspanning bij verschillende snelheden te berekenen. Gebruik regressieanalyse om de relatie tussen stroomsnelheid en schuifspanning vast te stellen.
    12. Beoordeel de tolerantie van het systeem voor variaties in hydrogelafmetingen om het realisme van de simulatie te verbeteren.

7. Voer een uniforme laminaire stroom uit

  1. Na het kweken van cellen op de hydrogels van 5 kPa en 10 kPa, zorgt u voor samenvloeiing van de celmonolaag in een incubator van 37 °C, 5% CO2 . Er moet een monolaag cellen op elke hydrogel worden bereikt.
  2. Steriliseer autoclaveerbare componenten van het parallelle plaatstroomkamersysteem (roestvrijstalen schroeven, spatel, pincet, pakking en het mediareservoir) met een zwaartekrachtautoclaafcyclus van 30 minuten. Steriliseer andere onderdelen (acrylcomponenten en reservoirafdichter/dempers) met blootstelling aan UV-licht.
  3. Monteer het stroomkamerapparaat in een bioveiligheidskast. Zet hydrogelmonsters vast in het apparaat en zorg voor uniformiteit. Gebruik een vulmiddel van gelijke grootte als de hydrogels als er onvoldoende monsters beschikbaar zijn voor de stroom.
  4. Maak het binnenoppervlak van de kamer en de hydrogeloppervlakken vooraf nat om luchtbelvorming te minimaliseren en celuitdroging tijdens de montage te voorkomen.
  5. Voeg voldoende media toe aan het inlaatreservoir, zodat 20%-30% van het media bij montage naar het uitlaatreservoir kan stromen. Sluit het inlaatreservoir luchtdicht af met een demper/sealer.
    NOTITIE: Drukopbouw in het inlaatreservoir zorgt voor de stroming en eventuele luchtlekken veranderen de stroomsnelheden. Controleer op defecten aan de sealer als er luchtbellen ontstaan in de buitenste slang.
  6. Stel de uitlaatdemper in op atmosferische druk om het drukverschil vast te stellen. Plaats het apparaat en de reservoirs in een incubator van 37 °C, 5% CO2 . Sluit de slang van het apparaat aan op een peristaltische pomp die buiten de couveuse is geplaatst (Figuur 1C).
  7. Zet de pomp aan om te beginnen met het aanbrengen van 3,6 dyne/cm2. Verhoog het debiet geleidelijk in stappen van 2 ml/min (bijv. bereik 85 ml/min van 65 ml/min na 10 min) tot ongeveer 8 dyne/cm2.
  8. Verhoog het debiet verder met stappen van 2,5 ml/min tot het bereiken van 12 dyne/cm2 schuifspanning.
    OPMERKING: Geef de cellen de tijd om zich aan te passen aan de dynamische toestand, aangezien een snelle toename van de stroomsnelheid cellen kan losmaken en de monolaag kan beschadigen.
  9. Stop na 6 uur de stroom, verwijder het apparaat uit de couveuse en demonteer de stroomkamer. Breng vervolgens hydrogelmonsters over naar een plaat met zes putjes.
  10. Was de monsters met ijskoud PBS en fixeer de cellen voor immunokleuring of lyseer ze voor eiwitisolatie.

8. Immunokleuring opstelling voor confocale microscopie met hoge vergroting

OPMERKING: Om de efficiëntie van het onderzoek te verhogen, werd een methode ontwikkeld voor het immunokleuring van kleine porties hydrogels, waardoor het mogelijk wordt om meerdere biologische doelen in een enkel monster te onderzoeken.

  1. Bereid biopsieponsen of favoriete snijgereedschappen voor met een diameter van 3 of 4 mm.
  2. Gebruik een pipetpuntdoosje als kleurkamer. Bevochtig de kamer om de verdamping van de kleuroplossing tijdens langdurige incubatie te beheersen door een natte papieren handdoek op de bodem van de pipetpuntdoos te leggen.
  3. Verminder het verbruik van antilichamen door kleine oplossingspools te creëren voor individuele monsters. Bedek het rek van de tipbox met transparante folie en druk de film voorzichtig met een vingertop tegen de gaten in het rek om kuiltjes te maken. Vul de kuiltjes met 70 μL PBS.
  4. Breng een individuele hydrogel over in een lege petrischaal en snijd deze met een biopsiepons of een snijgereedschap naar keuze. Gebruik een microscoop om een representatief monstergebied te snijden. Snijd een volle gelcilinder om confocale microscopieproblemen te voorkomen.
  5. Plaats de gesneden hydrogelmonsters in kuiltjes die in stap 8.3 zijn gemaakt. Voer de kleuring uit volgens het standaardprotocol15. Verkrijg na de laatste kleuring een siliconenrubberen vel dat overeenkomt met de dikte van de hydrogel.
    OPMERKING: Gebruik bij voorkeur een vel met één plakzijde voor een betere afdichting. In deze studie werden actinevezels gekleurd met behulp van een fluorescerend secundair antilichaam geconjugeerd aan phalloidine in een verdunning van 1:20.
  6. Snijd het rubberen vel in vierkanten van 15 mm x 15 mm. Pons een gat van 6 mm met behulp van een biopsiepons of een snijgereedschap naar keuze.
  7. Maak een monsterhouder door het rubber op een microscopie-dekglaasje (nr. 1.5) te bevestigen. Voeg 10 μL natte montagemedia toe aan de kuiltjes terwijl het monster nog aanwezig is en incubeer het 10-15 minuten in het donker.
    OPMERKING: Voor deze studie bevatten de montagemedia 0,9 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) om het kleuringsprotocol te verkorten.
  8. Haal het monster uit de kleurkamer en plaats het in de container die in stap 8.7 is gemaakt. Breng 1-2 μL montagemedia aan op het monster.
    OPMERKING: De hoeveelheid montagemedia is van invloed op de beeldkwaliteit bij sterke vergrotingen. Te veel of onvoldoende montagemedia kunnen de helderheid van het beeld in gevaar brengen.
  9. Plaats er nog een dekglaasje op en druk voorzichtig om ervoor te zorgen dat het monster in contact komt met het glas. Bewaar de monsters bij 4 °C in het donker tot microscopiebeeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont de experimentele opstelling en schetst het proces van GelMA-synthese door middel van een methacrylatiereactie. Het resulterende product werd vervolgens gebruikt om het hydrogelsubstraat te fabriceren, waarop EC's werden gezaaid. Vervolgens werden de cellen in de stroomkamer gebracht voor een 6 uur durend stromingsexperiment bij 12 dyne/cm2.

1H NMR-spectroscopie werd gebruikt om het succes van de methacrylatiereactie te beoordel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het vasculaire systeem is een dynamische omgeving waar verschillende krachten het cellulaire gedrag aanzienlijk beïnvloeden. Het bestuderen van biologische gebeurtenissen bij hart- en vaatziekten zonder rekening te houden met deze krachten zou onnauwkeurig zijn. Cellulaire modellen die in staat zijn om de vasculaire mechanische omgeving na te bootsen, zijn dus cruciaal. Onderzoekers hebben al aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het benadrukken van het effect van deze krachten op cellulair gedrag11

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er een voorlopige octrooiaanvraag (nr. 63/634.853) is ingediend met de titel Stroomkamer met een mechanisch afstembaar substraat, en dat er geen andere concurrerende belangen bestaan.

Dankbetuigingen

De auteurs betuigen hun dankbaarheid aan Robert Egan voor zijn hulp bij het vervaardigen van de stroomkamer. De auteurs bedanken Lucas McCauley voor zijn hulp tijdens de experimenten. Daarnaast willen ze de kernfaciliteiten van het Institute for Chemical Imaging of Living Systems (CILS) van de Northeastern University erkennen voor het verlenen van toegang tot confocale microscopen. De auteurs erkennen de financiële steun die wordt verleend door de National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 toegekend aan SB) en de National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 aan SB en CMMI 1846962 aan EE).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)Invitrogen15524-010Hydrogel Fabricage
3-(Trimethoxysilyl)Propyl MethacrylateSigma-Aldrich440159Glass Salinization
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting mediaVector LaboratoriesH-1200Immunoskleuring
AcetonThermo Fisher ScientificsA18-4GelMA Synthese
Alexa Fluor 555 Phalloidin Cell Signaling Technology8953SImmunoskleuring
Ammonium Persulfaat (APS)Bio-Rad1610700Hydrogel Fabricage
Heldere kras- en UV-bestendige gietacrylplaat (45/64'')McMaster-CARR8560K165Flow Chamber Fabricage
Confocale MicroscoopCarl Zeiss Meditex AGZeiss LSM 800Immunoskleuring
Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Spuiten zonder naaldenFisher  22-031-375Flow Experiment
EC groeikit American Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-041Celcultuur
Ethanol 200 ProofDecon Labs2701Glass Salinization
Gelatine Type A (300 bloom) uit varkenshuidSigma-AldrichG1890GelMA Synthese
Glazuur AzijnzuurThermo Fisher Scientifics9526-33Glass Salinization
Hoogzuivere hoge temperatuur siliconenrubberplaatMcMaster-Carr87315K74Flow Chamber Fabricage
Human Umbilical Vein Endotheelcellen (HUVEC)American Type Culture Collection (ATCC)PSC-100-010Celcultuur
M3x30mm Machineschroeven Hex Socket Ronde Kop Schroef 304 Roestvrijstalen Bevestigingen Bouten 20 stuksUxcellB07Q5RM2TPFlow Chamber Fabricage
Masterflex L/S Digital Drive met Easy-Load® 3 Pompkop voor Precisiebuizen; 115/230 VACVWR#MFLX77921-65Flow Experiment 
Masterflex L/S Precisiepompbuis, Puri-Flex, L/S 25; 25 ftVWR#MFLX96419-25Flow Experiment 
Methacrylzuuranhydride (MAH)Sigma-Aldrich276685GelMA Synthese
ParaformaldehydeThermo Fisher Scientifics043368.9MCelcultuur
Fosfaat-gebufferde Saline (PBS)Gibco14080-055Algemeen
NatriumbicarbonaatFisher ChemicalS233-3GelMA Synthese
NatriumcarbonaatFisher ChemicalS263-500GelMA Synthese
SOLIDWORKS educatieve versie
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023SolidWorksN/AFlow Chamber Ontwerp
Vasculair basaal mediumAmerican Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-030Celcultuur

Referenties

  1. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  2. Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies. Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).
  3. Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. Mechanotransduction at the cell-matrix interface. Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).
  4. Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. Mechanotransduction and the glycocalyx. J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).
  5. Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).
  6. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events. Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).
  7. Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. Endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).
  8. Hamrangsekachaee, M., et al. Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).
  9. Mensah, S. A., et al. Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity. FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).
  10. Russell-Puleri, S., et al. Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38. Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).
  11. Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).
  12. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  13. Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system. Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).
  14. Orr, A. W., et al. The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis. J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).
  15. Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).
  16. Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications. Materials. 11 (8), 1374(2018).
  17. Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. Cortical actin dynamics in endothelial permeability. Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).
  18. Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels. Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).
  19. Jin, Q., et al. Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process. Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).
  20. Villard, P., et al. Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications. Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).
  21. Bencherif, S. A., et al. Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels. J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).
  22. Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives. Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).
  23. James, B. D., Allen, J. B. Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments. ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).
  24. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), e4688(2012).
  25. Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate. J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).
  26. Geemen, D. v, et al. F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).
  27. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Comm Biol. 4 (1), 764(2021).
  28. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).
  29. Inglebert, M., et al. The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton. Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).
  30. Noria, S., et al. Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress. Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).
  31. Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing. Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

endotheelcellenschuifspanningGelMA-hydrogelsflowkamerlaminaire stromingconfocale microscopiemechanotransductievaatziekten
In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.