Hier beschrijven we methoden voor het tatoeëren van volwassen Xenopus laevis (Afrikaanse klauwkikker) met een roterende tattoo-machine. Een goede tatoeage resulteert in donkere, gemakkelijk leesbare cijfers die enkele maanden meegaan en dieren gemakkelijk te onderscheiden maken voor onderzoeks- en registratiedoeleinden.
Methodenartikel
Methoden voor het tatoeëren van Xenopus laevis met een roterende tattoo-machine
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diermodellen vergroten de reikwijdte van biomedisch onderzoek, vergroten ons begrip van ontwikkelings-, moleculaire en cellulaire biologie en stellen onderzoekers in staat om menselijke ziekten te modelleren. Door individuele dieren te registreren en te volgen, kunnen onderzoekers het aantal dieren dat nodig is voor onderzoek verminderen en praktijken verfijnen om het welzijn van dieren te verbeteren. Er bestaan verschillende goed gedocumenteerde methoden voor het markeren en volgen van zoogdieren, waaronder oorponsen en oormerken. Methoden voor het markeren van aquatische amfibieënsoorten zijn echter beperkt, waarbij de bestaande bronnen verouderd, ineffectief of onbetaalbaar zijn. In dit manuscript schetsen we methoden en best practices voor het markeren van Xenopus laevis met een roterende tattoo-machine. Goed tatoeëren resulteert in tatoeages van hoge kwaliteit, waardoor individuen gemakkelijk te onderscheiden zijn voor onderzoekers en een minimaal risico vormen voor de gezondheid van dieren. We belichten ook de oorzaken van tatoeages van slechte kwaliteit, die kunnen resulteren in tatoeages die snel vervagen en onnodige schade toebrengen aan dieren. Deze aanpak stelt onderzoekers en dierenartsen in staat om amfibieën te markeren, waardoor ze biologische replicaten en transgene lijnen kunnen volgen en nauwkeurige gegevens over de diergezondheid kunnen bijhouden.
Inleiding
Diermodellen zijn nuttige hulpmiddelen voor het onderzoeken van vragen met betrekking tot de menselijke gezondheid. In de praktijk vereist biomedisch onderzoek met behulp van diermodellen een zorgvuldige organisatie en onderhoud van een gezonde dierenkolonie. Beste praktijken voor ethische omgang met en veeteelt zijn gericht op het verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor experimenten en het verfijnen van praktijken om dierenwelzijn te waarborgen1. Het geslacht van de klauwkikkers, waaronder Xenopus laevis (X. laevis; Afrikaanse klauwkikker) en Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Westerse klauwkikker), worden gebruikt in biomedisch onderzoek sinds de jaren 1930, toen X. laevis door Zuid-Afrikaanse artsen werd gebruikt om de eerste zwangerschapstests uit te voeren2. Hoewel moderne zwangerschapstests geen kikkers meer nodig hebben, blijft de rol van Xenopus-onderzoek bestaan. Voordelen van het gebruik van Xenopus voor biomedisch onderzoek zijn onder meer hun goed geannoteerde genomen3, het hele jaar door induceerbare ovulatie van grote legsels eieren4 en extern gelegde eieren die vatbaar zijn voor in-vitrofertilisatie. Deze kenmerken maken ze een nuttige aanwinst voor de embryologie en ontwikkeling van gewervelde dieren 5,6,7, fundamentele moleculaire en cellulaire biologie 7,8,9,10 en voor het modelleren van menselijke ziekten 7,11,12,13.
Betrouwbare methoden voor het volgen van individuele Xenopus-dieren zijn essentieel voor het registreren van biologische replicaten en het verbeteren van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid in onderzoek. Omdat Xenopus vaak in groepen worden gehuisvest, kunnen onderzoekers met diermarkering gemakkelijk individuele dieren volgen4. Het bijhouden van een nauwkeurige registratie van dieren kan tijd en middelen besparen en het vermogen om de gezondheid van dieren te volgen verbeteren. Individuele identificatie van dieren kan bijvoorbeeld de organisatorische workflows voor het genereren van transgene Xenopus-lijnen verbeteren, aangezien dit meerdere generaties kikkers vereist met specifieke genotypen die zijn geverifieerd door sequencing14, wat organisatie en individuele identificatie van dieren vereist. Dit is met name het geval wanneer deze mutaties geen gemakkelijk waarneembare volwassen fenotypes hebben. Evenzo profiteert het gebruik van Xenopus-eicellen en -embryo's om de basale cellulaire en ontwikkelingsbiologie te bestuderen van het volgen van individuele dieren. Na het opwekken van de eisprong moeten dieren minimaal 3 maanden rusten om gezondheidscomplicaties zoals het hyperovulatiesyndroom tevoorkomen15. Individuele identificatiemethoden zorgen ervoor dat dieren niet te vaak ovuleren.
Het markeren en volgen van dieren stelt laboratoriumpersoneel ook in staat om de gezondheidsproblemen van dieren te volgen. Dieren met hetzelfde genotype die ziek worden, kunnen duiden op overmatige inteelt of onverwachte gezondheidsproblemen die verband houden met het transgen. Evenzo kunnen dieren die ziek worden na een recente ovulatie wijzen op problemen met reagentia, materialen of technieken. Door dieren en hun gezondheid te volgen, kunnen laboratoriumpersoneel en dierenartsen opvolgen wanneer er opnieuw zorgen opduiken en preventieve maatregelen nemen om toekomstige ziekten te voorkomen. Bij zoogdieren zijn er tal van identificatiemethoden. Permanente methoden voor muizen zijn onder meer oorponsen, oormerken, tatoeëren en onderhuidse microchips16. Deze kunnen dieren binnen een kolonie of kooi duidelijk en betrouwbaar onderscheiden en kunnen gemakkelijk worden toegediend door laboratoriumpersoneel. Methoden zoals oorponsen zijn minimaal invasief, vereisen slechts één stuk gespecialiseerde apparatuur en werken voor dieren van de meeste leeftijden. Hoewel deze systemen eenvoudig en nuttig zijn voor muizen, brengt het gebruik ervan bij kikkers een unieke reeks uitdagingen met zich mee. Kikkers en andere amfibieën missen een oorschelp (uitwendige oorstructuur). Sommige onderzoekers hebben tags bevestigd aan de kaak, teen of achterpoot van het dier17,18. Deze aanpak resulteerde in verschillende problemen: kaakpenningen veroorzaakten irritatie en geagiteerde kikkers probeerden met hun voorpoten tags los te trekken17. Teenlabels doorboorden de banden tussen de tenen, belemmerden de beweging en brachten het risico met zich mee om verloren te gaan. Amfibieën hebben dus hun eigen identificatiemethoden nodig. Historisch gezien is het knippen van tenen ook gebruikt om amfibieën te markeren 17,19. De teen wordt geknipt met een scherpe schaar en het dier is te herkennen aan de lengte van de tenen aan de voor- en achterpoten of aan de hoek waaronder de teen is teruggegroeid (bij salamanders). Deze methode brengt echter de ethische bezorgdheid met zich mee dat het knippen van de tenen de beweging van het dier kan belemmeren17. Bovendien kan dit bloedingen veroorzaken en een risico op infectie met zich meebrengen. Een ander gevestigd markeringssysteem zijn huidautografts, waarbij huid van een deel van de kikker wordt genomen en chirurgisch aan een ander deel wordt bevestigd. Er wordt bijvoorbeeld een methode beschreven voor het markeren van de rug of schouder van een kikker met behulp van een lichtgekleurd huidtransplantaat vanaf de borst20. Huidtransplantaties brengen ook beperkingen en risico's met zich mee: de procedure is invasief en introduceert het risico van Aeromonas hydrophila-infectie of rood been, een mogelijk dodelijke aandoening; volledige genezing van het autotransplantaat duurt maximaal 6 weken; En met de beschreven methoden kunnen slechts 6 kikkers bij elkaar worden gehuisvest vanwege de beperkte plaatsen om een autotransplantaat20 te plaatsen.
Minder invasieve markeermethoden zijn onder meer glasparels en transponderchips17,19. Bij de glaskralenmethode worden glaskralen op een kleine hechting geregen en in de huid van de kikker genaaid. Dit zorgt voor een grotere variabiliteit dan autotransplantaten van de huid, met ten minste 60 onderscheidende kleurencombinaties. Het risico bestaat echter dat de hechting loskomt en ertoe leidt dat de kralen verloren gaan. Als alternatief kan een microchip-transponder onder de huid in de dorsale lymfezak van de kikker worden geïmplanteerd. Dit wordt beschouwd als de meest permanente markeringsmethode en maakt het mogelijk om een potentieel oneindig aantal dieren individueel te identificeren en te catalogiseren. Dit is echter ook de duurste methode, omdat individuele microchips duur zijn en een grote kolonie kostbaar zou zijn om te markeren. Microchips hebben ook een speciale scanner nodig om19 te lezen. Een veelgebruikte benadering voor de identificatie van Xenopus is het verwijzen naar de natuurlijke kleuren en patronen van dieren. Dit werkt vooral goed voor kikkers zoals X. laevis, die duidelijke patronen hebben die gedurende de volwassenheid blijven bestaan. Deze patronen kunnen echter in de loop van de tijd veranderen door stress, en de kleur kan er anders uitzien wanneer kikkers worden verplaatst tussen transparante en getinte containers15. Bovendien is deze identificatiemethode minder bruikbaar voor X. tropicalis, die minder duidelijke markeringspatronen heeft in vergelijking met X. laevis, of voor albinodieren, die geen kleurmarkeringen hebben21. Zelfs voor soorten met duidelijke markeringen kan laboratoriumpersoneel de plaatsing en grootte van markeringen anders interpreteren, wat kan leiden tot fouten bij de identificatie. Hierdoor is het fotograferen van dieren het meest betrouwbaar in combinatie met een aanvullende identificatiemethode. Daarom proberen we Xenopus-dieren te markeren en te identificeren met behulp van een techniek die gemakkelijk te herkennen, permanent en minimaal invasief is.
Er zijn beperkte gepubliceerde bronnen die methoden beschrijven voor het tatoeëren van amfibieën. Tatoeëren is beschreven naast andere merktechnieken, waaronder warmtemerken, zilvernitraatmerken en vriesmerken17. In dezelfde bron werd tatoeëren gedaan door cijfers te tekenen met een 27G injectienaald, en het proces werd opgemerkt dat het geen infectie veroorzaakte, in tegenstelling tot de andere merktechnieken, waarbij een draad werd gebruikt die in een cijfer of een ander teken werd gevormd. In een andere bron werd een elektrische tatoeagemachine (beschreven als een vibrerende naald) gebruikt om kikkers te markeren, maar er werden weinig details gegeven over de techniek17,19. De auteurs waarschuwen dat door de beschermende slijmlaag van de kikker te verstoren, deze procedure het risico op rode benen verhoogt. Hoewel er geen markerings- of identificatiemethode is die zowel volledig niet-invasief (zoals foto's) als permanent (zoals microchips) is, biedt tatoeëren een effectief compromis. Tatoeëren is relatief eenvoudig in vergelijking met andere technieken, zoals autotransplantaten van de huid. Bijkomende voordelen zijn onder meer een kleinere leercurve en relatief goedkope apparatuur. Het tatoeëren van wateramfibieën brengt bepaalde uitdagingen met zich mee, die onderzoekers kunnen intimideren en een succesvolle markering van dieren kunnen belemmeren. Dit artikel is bedoeld om onderzoekers goed gedocumenteerde methoden te bieden voor het tatoeëren van volwassen Xenopus met een roterende tattoo-machine.
Protocol
Alle beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Dartmouth College.
1. Installatie van de apparatuur
OPMERKING: Een workflow voor de procedure en een voorbeeldopstelling van de bank zijn inbegrepen (Afbeelding 1).
- Sluit het tattoo-pistool en het voetpedaal aan op de voeding. Plaats het voetpedaal onder het werkoppervlak.
- Het tatoeëerpistool in elkaar zetten
- Draai met een inbussleutel of inbusschroevendraaier de schroeven in de handgreep los (Figuur 2A, rood omcirkeld).
- Steek de plastic punt helemaal in de handgreep. Draai de schroef vast om hem op zijn plaats te houden.
- Steek de metalen buis in de achterkant van de handgreep (Figuur 2A). Dit wordt aangepast, dus steek het er tot de helft van de lengte in. Draai de schroef vast om hem op zijn plaats te houden.
- Steek een tatoeagenaald door de achterkant van de handgreep zodat deze comfortabel in de plastic punt aan de voorkant van de handgreep zit (Figuur 2B).
- Schuif de achterkant van de naald en de metalen buis door de buisklem. Stel de metalen buis zo af dat de naald comfortabel in de plastic punt past (Figuur 2B). Draai de buisklem met de hand vast totdat de buis niet meer kan bewegen (Figuur 2C).
- Verwijder de zwarte O-ring en haak de naald aan de rotorarm; plaats de O-ring terug om de naald op zijn plaats te bevestigen (Figuur 2C).
- Stel de spanning op de voeding zo in dat er voldoende stroom is om de huid te doorboren, maar niet zo krachtig dat het moeilijk te controleren is. Zodra de voeding is aangesloten en aangesloten, drukt u op het voetpedaal om ervoor te zorgen dat de machine werkt. Zorg ervoor dat u de naald niet op uzelf of ander personeel richt.
OPMERKING: De tattoo-machine die in dit protocol wordt gebruikt, werkt het beste tussen 6.0 en 9.0 V, maar dit kan variëren tussen tattoo-machines en spanningsvoedingen en moet empirisch worden bepaald. - Vul de dop van een microcentrifugebuisje van 1,5 ml of een meegeleverde plastic inktpot met zwarte tatoeage-inkt tot ongeveer driekwart vol.
2. Anesthesie
- Bereid de anesthesie voor in een tank die groot genoeg is om een volwassen vrouwelijke X. laevis kikker onder te dompelen.
- Voeg met kikkerveilig (chloorvrij) water tricaïne toe tot de eindconcentratie van 1,5 g/L en natriumbicarbonaat tot de eindconcentratie van 3,5 g/L. Meng om op te lossen. De pH van deze oplossing is 7,15.
LET OP: Tricaïne is irriterend.
- Voeg met kikkerveilig (chloorvrij) water tricaïne toe tot de eindconcentratie van 1,5 g/L en natriumbicarbonaat tot de eindconcentratie van 3,5 g/L. Meng om op te lossen. De pH van deze oplossing is 7,15.
- Dompel één kikker onder in de anesthesietank. Zorg ervoor dat de straal ondergedompeld blijft in de tricaïne-oplossing totdat deze verdoofd is (7-8 min).
- Om te controleren of de kikker volledig verdoofd is, pak je hem op, houd je hem ondersteboven en knijp je stevig in één voet. Als de kikker niet terugdeinst of reageert, kan hij worden getatoeëerd.
- Als kikkers consequent meer dan 10 minuten nodig hebben om verdoofd te worden, bereid dan verse tricaïne-oplossing gebufferd met natriumbicarbonaat.
OPMERKING: Kikkers mogen niet langer dan 30 minuten in tricaïneoplossing15 doorbrengen.
3. Tatoeëren
LET OP: Voordat je een levend dier tatoeëert, kan het handig zijn om te oefenen op een stuk fruit met een stevige schil (zoals een citroen of banaan).
- Bereid een hersteltank voor de kikkers voor voordat u gaat tatoeëren. Vul een tank met 10-15 L vers kikkerveilig water en voeg een piepschuimeiland toe. Dit biedt de kikker een oppervlak om wakker te worden zonder te verdrinken.
NOTITIE: Een piepschuimeiland kan worden gemaakt met behulp van het deksel van een piepschuim koude zeecontainer die in een zak met ritssluiting is geplaatst. - Leg de verdoofde kikker op zijn rug op een droge papieren handdoek of bankpapier (Figuur 3A). Gebruik ongebleekt (bruin) keukenpapier voor alle werkzaamheden met kikkers.
- Veeg met een droge, pluisvrije doekje het water en het slijm van de borst van de kikker weg.
- Zoek met de vingers het borstbeen in het midden van de borst van de kikker en houd met de niet-dominante hand de huid strak.
- Het markeren van de kikker
- Houd het gemonteerde tatoeagepistool verticaal ten opzichte van het werkoppervlak en dompel de naald in de inkt (Figuur 3B).
- Houd het gemonteerde tatoeagepistool verticaal en druk de punt van de naald op de huid van de kikker voordat u het voetpedaal indrukt. Trek lijnen op de huid van de kikker terwijl je gelijkmatige druk uitoefent.
OPMERKING: Een kleine bloeding of roodheid is normaal, evenals een lichte vervelling van de huid. - Als de naald vast komt te zitten aan de huid van de kikker, verwijder dan overtollige inkt of huid van de naald met een doekje. Overtollige inkt is normaal tijdens het tatoeëren.
- Als de borst van de kikker bedekt is met te veel inkt om het gemarkeerde gebied duidelijk te zien (Figuur 3C), verwijder dan overtollige inkt met kikkerveilig water en een doekje (Figuur 3C'). Veeg vervolgens vocht weg met een droog doekje en ga door met inkten.
OPMERKING: Een knijpfles kikkerveilig water kan worden bereid voordat u gaat tatoeëren. - Ga door met het inkten van hetzelfde gebied totdat er donkere, leesbare cijfers overblijven na het wegvegen van overtollige inkt (Figuur 3D). In plaats van de hele markering of het nummer in één streek te tekenen, maakt u herhaaldelijk kleinere streken, vooral voor bochten.
4. Herstel
- Maak een papieren handdoek nat met kikkerveilig water en leg deze plat op het piepschuimeiland (Figuur 4A).
- Kikkers terugbrengen naar staande tanks
- Leg de kikker op de buik naar beneden op de handdoek met het gezicht naar het water (Figuur 4B). Vouw de helft van het keukenpapier over de achterste helft van de kikker en maak de bovenkant van de kikker nat met de gevouwen handen. Zodra een kikker uit de narcose komt (ongeveer 1 uur na het tatoeëren), gaan ze zelfstandig het water in en zwemmen ze normaal.
- Breng kikkers na 24 uur terug naar langdurige huisvesting, zodra de tatoeage volledig is genezen.
5. Reiniging en onderhoud van apparatuur
- Hergebruik en autoclaveren van tatoeagenaalden
- Spoel de naalden af met 100% isopropanol en gedeïoniseerd water om de inkt los te maken en schrob de resterende inkt weg die niet is opgelost.
- Plaats de naalden na het schrobben in een metalen autoclaafhouder of wikkel ze in aluminiumfolie en autoclaaf gedurende 30 minuten op een droogcyclus.
- Als er inkt op stukken van de tattoo-machine of andere apparatuur zit, veeg deze dan af met 100% ethanol en keukenpapier.
- De verdovingsoplossing heeft een uiteindelijke tricaïneconcentratie van ongeveer 0,5%. Gooi dit weg in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor het beheer van gevaarlijk afval.
- Opslag en onderhoud van apparatuur
- Bewaar de tattoo-machine indien mogelijk in een droge ruimte. Overtollig vocht beschadigt de elektrische componenten en verkort de levensduur van de machine.
- Om de tattoo-machine in goede staat te houden, controleert u het lager op de rotor (Figuur 2C) om er zeker van te zijn dat het niet is losgeraakt door trillingen22. Deze kan worden vastgedraaid met een inbussleutel of inbusschroevendraaier.
- Smeer ongeveer één keer per maand het lager op de rotorarm met een dik smeervet22.
- Op sommige tattoo-machines kan de rotorarm vast komen te zitten en niet trillen. Om dit te corrigeren, draait u de rotorarm of drukt u de veer samen zodat de naald in de neergelaten positie staat (Figuur 2C).
Resultaten
Tatoeages van hoge kwaliteit hebben donkere, leesbare strepen op de borst van de kikker en kunnen duidelijk worden onderscheiden op enkele meters afstand (Figuur 5A). Over het algemeen zijn grotere cijfers en markeringen beter voor de leesbaarheid, maar langere namen en nummers kunnen kleiner worden gemaakt om comfortabel op de borst van de kikker te passen. De levensduur van tatoeages is moeilijker te beoordelen, maar kikkertatoeages van hoge kwaliteit moeten minstens 3-6 maanden donker en leesbaar blijven (Figuur 5D-D'). Zodra een tatoeage is vervaagd, kan deze met dezelfde techniek worden bijgewerkt.
Een slechte techniek is niet schadelijk voor dieren, maar kan resulteren in tatoeages die snel vervagen (Figuur 5B), wat leidt tot frequentere retouches. Overijverig tatoeëren kan bloedingen en roodheid veroorzaken, en het plaatsen van een kikker in een verkeerde zijligging kan onbedoelde verdrinking veroorzaken.
De kwaliteit van de tatoeages en de doeltreffendheid van de techniek kunnen in de maanden na het tatoeëren worden beoordeeld (Figuur 5E). Zolang er na de herstelperiode inkt op de kikker zit, wordt een tatoeage als succesvol beschouwd.
Figuur 1: Protocolworkflow en bankopstelling. (A) Workflow en timing. (1) Kikkers worden 7-8 minuten verdoofd in een oplossing van 1,5 g/L tricaïne en 3,5 g/L natriumbicarbonaat, pH 7,15, opgelost in kikkerveilig water. Terwijl de ene kikker wordt getatoeëerd, kan een tweede kikker op het dek in de anesthesietank worden geplaatst. Er kan slechts één kikker tegelijk in tricaïne-oplossing zijn. (2) Kikkers brengen ongeveer 10 minuten buiten het water door om getatoeëerd te worden. De tijd is afhankelijk van de grootte van de tatoeage en de ervaring van het laboratoriumpersoneel. (3) Bewusteloze kikkers worden 30-45 minuten op piepschuim gelegd om verdrinking te voorkomen en afgedekt met een natte papieren handdoek om te voorkomen dat ze uitdrogen. (4) Na het tatoeëren brengen kikkers 24 uur door met herstellen in vers kikkerveilig stilstaand water. Zodra ze hersteld zijn, kunnen kikkers worden teruggebracht naar hun kolonie. (B) Bankopstelling voor een voorbeeldwerkruimte. De tatoeëerwerkruimte, een ongebleekte papieren handdoek, is gecentreerd op de bank. De tattoo-machine en de voedingsspanning bevinden zich links van de papieren handdoek. Deze worden aan de dominante kant van het personeel geplaatst (het personeel is linkshandig). Een inktpot en tatoeage-inkt worden in de buurt van de voedingsspanning geplaatst en uit de weg van de tatoeëerwerkruimte. Het voetpedaal zit aan dezelfde kant als de voedingsspanning. Door op dit voetpedaal te drukken, wordt de roterende beweging geregeld. Pluisvrije doekjes en een knijpfles met kikkerveilig water bevinden zich rechts van het keukenpapier. Deze worden gebruikt om overtollige inkt van de huid van de kikker te verwijderen tijdens het tatoeëren. Een inbussleutel wordt gebruikt om schroeven in de tattoo-machine vast en los te draaien. Dit wordt gebruikt om de tattoo-machine te monteren en te demonteren. De anesthesietank en extra papieren handdoeken worden ook tijdens het tatoeëren op de bank bewaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Montage van de tatoeagemachine. (A) Afbeelding van de tatoeëernaald, handgreep en aanverwante onderdelen gedemonteerd. De schroeven op de metalen handgreep zijn rood omcirkeld. (B) Afbeelding van de tatoeagenaald die op de juiste manier in de handgreep is gemonteerd. (C) Afbeelding van de tatoeëernaald en de handgreep die in het tatoeagepistool zijn gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Positionerings- en referentiebeelden voor het tatoeëren van kikkers. (A) Afbeelding van een kikker die met de voorkant naar boven op een papieren handdoek ligt. De pijl wijst naar het borstbeen van de kikker. (B) Afbeelding van laboratoriumpersoneel dat kikker inkt. (C) Afbeeldingen van getallen tijdens het inkten, voor (C) en nadat (C') overtollige inkt is weggespoeld. (D) Afbeelding van de tatoeage van de kikker onmiddellijk na het inkten, vóór herstel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Herstel na de tatoeage. (A) Piepschuim eiland. Het deksel van de piepschuimen ijsbox wordt in een zak met ritssluiting geplaatst. (B) Kikkers in stabiele zijligging na het tatoeëren. Op piepschuimeilanden passen meestal 1 of 2 kikkers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van representatieve resultaten. (A) Een verse tatoeage 24 uur na het tatoeëren. (B) Technieken van slechte kwaliteit. In (B) was de tattoo-machine niet goed gemonteerd, maar was hij nog steeds in staat om te draaien. Deze foto is 4 maanden na het tatoeëren genomen. In (B') was de tatoeëermachine niet goed gemonteerd en kon deze niet draaiend bewegen. Deze foto is 6 maanden na het tatoeëren genomen. (C) Onjuist gemonteerde tattoo-machine. De metalen buis en plastic punt zijn niet aanwezig en de metalen handgreep is niet correct bevestigd aan de rest van de tattoo-machine. Elastiekje schaadt de roterende beweging (D) Voor (D) en na (D') van een kikker die is getatoeëerd met een goede techniek en de juiste opstelling van de apparatuur. (D) werd onmiddellijk na het tatoeëren genomen en (D') werd 4 maanden na het tatoeëren genomen. (E) Kwantitatieve gegevens van de resultaten van het tatoeëren van kikkers. Van de getatoeëerde kikkers had 100% zichtbare tatoeages direct na het tatoeëren, 100% had ze 24 uur na het tatoeëren en 91% had ze 4 maanden na het tatoeëren. n = 58 kikkers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Het tatoeëren van mensen is een kunstvorm die duizenden jaren teruggaat, en zolang mensen zichzelf hebben getatoeëerd, hebben ze ook dieren getatoeëerd of gebrandmerkt. De apparatuur en technieken voor het markeren van dieren, met name zoogdieren, zijn goed ingeburgerd, goed gedocumenteerd en breed toegankelijk. Hoewel het markeren van dieren oorspronkelijk bedoeld was om vee te onderscheiden en diefstal af te schrikken23, is de rol ervan in biomedisch onderzoek net zo belangrijk geworden.
Een voordeel van het tatoeëren van amfibieën is dat tatoeages binnen 24 uur genezen en dat goede tatoeages enkele maanden blijven zitten (Figuur 5D'). Tatoeëren biedt meerdere voordelen voor de huisvesting en het houden van amfibieën. Tatoeages stellen onderzoekers en veterinair personeel in staat om individuele dieren gemakkelijk te onderscheiden met behulp van nummers die gemakkelijk te zien en te interpreteren zijn, zelfs in tanks met donkerdere tinten19. Deze procedure kan ook worden uitgevoerd op elke volwassen kikker, in vergelijking met autotransplantaten van de huid, die niet worden aanbevolen voor kikkers ouder dan 2 jaar15 jaar. Het belangrijkste is dat tatoeëren het mogelijk maakt om een groot aantal dieren te identificeren, met ten minste drie vingers die comfortabel op de borst van X. laevis passen (Figuur 5A).
In vergelijking met het bevestigen van kralen of labels, laat tatoeëren niets achter dat eraf kan vallen en veroorzaakt het beperkte irritatie17. Bovendien zorgt tatoeëren voor meer veelzijdigheid dan andere merktechnieken, waarvoor een draad in het merk moet worden gevormd. De procedure zelf is veel minder storend dan autotransplantaten van de huid, omdat er geen weefsel wordt verwijderd. Net als autotransplantaten is tatoeëren echter ook gedeeltelijk invasief en brengt het een klein risico op letsel of infectie met zich mee. Dit is een noodzakelijk onderdeel van het markeren van elk dier, maar het is belangrijk voor onderzoekers om op hun hoede te zijn voor overmatig bloeden tijdens het tatoeëren en dieren te controleren op A. hydrophilia-infectie . Dit kan worden voorkomen door voor, tijdens en na het tatoeëren een schone werkruimte te behouden en door ervoor te zorgen dat tatoeages volledig zijn genezen voordat dieren worden teruggebracht naar hun kolonie. Bij het schrijven en ontwikkelen van dit artikel is geen van de kikkers blijvend gewond geraakt of gestorven door tatoeages. Een beperking van deze procedure is dat deze alleen is getest op volwassen kikkers ouder dan 1 jaar. Tot nu toe zijn er nog geen kikkertjes getatoeëerd met dit protocol. Bovendien is deze procedure niet geoptimaliseerd voor X. tropicalis, die een donkere verkleuring op hun borst hebben en tatoeages minder waarneembaar maken21. In de toekomst kan dit tatoeageprotocol worden bijgewerkt om overwegingen voor X. tropicalis op te nemen.
Aangezien de habitat van Xenopus aquatisch4 is, is het normaal dat deze tatoeages na verloop van tijd vervagen. De noodzaak om tatoeages vaak te vervangen is gedocumenteerd in menselijke liptatoeages in de mond, die sneller vervagen dan epidermale tatoeages vanwege continu contact met speeksel en dranken24. De levensduur van een tatoeage is echter grotendeels afhankelijk van de tatoeagetechniek. Een slechte techniek kan het gevolg zijn van een onjuist gemonteerde tattoo-machine (Figuur 4C) of suboptimale instellingen voor de spanningsvoorziening. Een te lage spanning voorkomt dat de naald de huid binnendringt, wat resulteert in vage vlekken of lijnen. Als u de spanning te hoog instelt, veroorzaakt dit onnodige schade aan het dier. Een andere veel voorkomende bron van slecht tatoeëren komt van een onjuiste positionering van de naald of druk terwijl het personeel het tatoeagepistool vasthoudt. Tatoeëren met te weinig druk heeft hetzelfde effect als het te laag instellen van de spanning en zal resulteren in een vage tatoeage die snel vervaagt (Figuur 5B'). Tijdens het tatoeëren kan het voelen alsof de naald over de huid van de kikker scheert in plaats van deze te doorboren. Tatoeëren met te veel druk zal resulteren in merkbare of oncontroleerbare bloedingen. Het beste tatoeëren wordt geduldig en methodisch gedaan door in korte secties te inkten en lijnen met zware, consistente druk te volgen.
Over het algemeen wegen de voordelen van het markeren van dieren door tatoeage bij amfibieën op tegen de nadelen. Individuele tracking van Xenopus in biomedisch onderzoek maakt wetenschappelijke nauwkeurigheid mogelijk bij het volgen van biologische replicaten, stelt onderzoekers en veterinair personeel in staat om het welzijn van individuele dieren te beoordelen en zorgt voor de juiste frequentie van de ovulatie om de gezondheid van het dier op lange termijn te behouden. Wat betreft de 3 V's van dierproeven - verfijning, vermindering en verwijdering - is dit protocol het meest relevant voor verfijning en vermindering1. Het markeren van kikkers maakt het voor onderzoekers en dierenartsen gemakkelijker om gezondheidsproblemen op te sporen en zorgt ervoor dat kikkers voldoende rusttijd krijgen tussen de experimenten. Dit verfijnt het onderzoeksproces door te zorgen voor een hogere kwaliteit van de gegevens en monsters die van dieren zijn verzameld, en door de veehouderij- en verzorgingspraktijken te verfijnen. Het helpt ook de reproduceerbaarheid in experimenten te verbeteren. Bovendien kunnen dieren door het markeren ervan worden hergebruikt, waardoor het totale aantal benodigde dieren wordt verminderd. Kikkers die eieren van bijzonder hoge kwaliteit leggen of die het meest bruikbaar zijn in andere experimenten, kunnen worden gemarkeerd en geïdentificeerd als beter geschikt voor onderzoek. Als kikkers consequent niet bruikbaar zijn voor experimenten, kunnen ze worden geïdentificeerd en uit de kolonie worden verwijderd, wat middelen en ruimte bespaart. Het doel van dit artikel is om de beste praktijken bij het tatoeëren van amfibieën te documenteren en Xenopus-laboratoria te voorzien van een gedetailleerd, gemakkelijk toegankelijk tatoeageprotocol. Deze praktijk is nog niet gemeengoed in het Xenopus-veld , deels omdat de bestaande gepubliceerde bronnen beperkt zijn. Deze bron stelt onderzoekers in staat om dieren veilig en effectief te markeren, de registratie van grote kolonies te verbeteren en het gebruik van amfibieën in biomedisch onderzoek te verfijnen.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Dankbetuigingen
We danken het Center for Comparative Medicine and Research van Dartmouth College voor het dagelijks houden van de dieren die in dit protocol worden gebruikt. We bedanken ook Leah Jacob en Adwaita Bose voor hun hulp bij het testen van het protocol en het fotograferen van dieren. Ten slotte bedanken we het laboratorium van Ann Miller voor hun training in de praktijk van het tatoeëren. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R00 GM147826 aan J.L.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3 needle round liners | Worldwide Tattoo Supply | 1203RLB | Steril verpakt |
| 5 Needle Round Disposable ULTRA | Worldwide Tattoo Supply | HTIPRS5-U | Steril verpakt |
| 5 needle round liners | Worldwide Tattoo Supply | 1205RLB | Steril verpakt |
| 7 needle round liners | Worldwide Tattoo Supply | 1207RLB | Steril verpakt |
| Clip Cord | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Foot pedal | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Inkpots | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Kimwipes, delicate task wipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| RCA Connection | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Scream Ink Pitch Black, 1oz | Worldwide Tattoo Supply | SI101 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Stainless steel grips | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH2-SET | |
| Styrofoam island | N/A | N/A | Dit is het deksel van een styrofoam koude verzendcontainer |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate) | Sigma-Aldrich | E10521 | VOORZICHT: IRRITATIE |
| Unbleached paper towels | Grainger | 2U229 | Papieren handdoeken MOETEN ongebleekt zijn, bleek is giftig voor amfibieën |
| Voltage Supply | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Wash bottle (with frog-safe water) | Fisher Scientific | FB0340923T | Kikkerveilig water is gedechloreerd, pH 7,0-8,5, geleidbaarheid 1200-1800 uS |
| X. laevis volwassen vrouwtje | Xenopus1 | N/A | |
| Zip-top plastic bag | N/A | N/A | Deze zak moet groot genoeg zijn om het styrofoam eiland te bevatten |
Referenties
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
- Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
- Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
- Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
- Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
- Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
- Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
- Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
- Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
- Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
- Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
- Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
- Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
- Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
- Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
- Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
- Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
- Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
- Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
- Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
- Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).
Herprints en machtigingen
