NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Samenvatting

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR ¹⁵N, R₁ en R₂ relaxatie en {¹H}-¹⁵N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

Samenvatting

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie maakt het mogelijk om eiwitten in oplossing en onder fysiologische temperaturen te bestuderen. Vaak worden ofwel de amidegroepen van de eiwitruggengraat of de methylgroepen in zijketens gebruikt als verslaggevers van structurele dynamiek in eiwitten. Een studie van de structurele dynamiek van de eiwitruggengraat van bolvormige eiwitten op ¹⁵N gelabelde en volledig geprotoneerde monsters werkt meestal goed voor eiwitten met een molecuulgewicht tot 50 kDa. Wanneer zijketendeuteratie in combinatie met transversale relaxatiegeoptimaliseerde spectroscopie (TROSY) wordt toegepast, kan deze limiet worden verlengd tot 200 kDa voor bolvormige eiwitten en tot 1 MDa wanneer de focus ligt op de zijketens. Wanneer intrinsiek ongeordende eiwitten (IDP's) of eiwitten met intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) worden onderzocht, zijn deze gewichtsbeperkingen niet van toepassing, maar kunnen ze veel verder gaan. De reden hiervoor is dat IDP's of IDR's, die worden gekenmerkt door een hoge interne flexibiliteit, vaak dynamisch worden ontkoppeld. Verschillende NMR-methoden bieden inzichten in atomaire resolutie in de structurele eiwitdynamiek over een breed scala aan tijdschalen, van picoseconden tot uren. Standaard ¹⁵N relaxatiemetingen geven een overzicht van de interne flexibiliteit van een eiwit en karakteriseren de dynamiek van de eiwitruggengraat die wordt ervaren op de snelle tijdschaal van pico tot nanoseconden. Dit artikel presenteert een hands-on protocol voor het opzetten en vastleggen van NMR ¹⁵N R₁, R₂ en heteronucleaire Overhauser effect (hetNOE) experimenten. We tonen voorbeeldige gegevens en leggen uit hoe u deze eenvoudig kwalitatief kunt interpreteren voordat er een meer geavanceerde analyse nodig is.

Inleiding

De functie van een eiwit wordt niet alleen bepaald door zijn driedimensionale structuur, maar ook door zijn structurele dynamiek, die zijn interne flexibiliteit en structurele overgangen tussen verschillende formaties die het eiwit zal aannemen, omvat. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele dynamica van eiwitten in oplossing ^1,2,3 onderzoeken. Recente ontwikkelingen in proton-gedetecteerde vaste-stof NMR maken het ook mogelijk om de eiwitdynamiek in een minder oplosbare toestand te karakteriseren, zoals bijvoorbeeld een lipide dubbellaags membraan ^4,5,6. In oplossing NMR kan de structurele dynamiek van de eiwitruggengraat en eiwitzijketens worden bestudeerd. Voor een bolvormig eiwit kan een structurele dynamicastudie van de eiwitruggengraat worden bereikt tot 50 kDa zodra het eiwit ^{isotopisch 15}N is gelabeld. Wanneer zijketendeuteratie en transversale relaxatiegeoptimaliseerde spectroscopie (TROSY) worden gebruikt, kan deze limiet worden verlengd tot 200 kDa ^7,8. Wanneer de focus ligt op side-chain dynamica, kan het bereik van toegankelijke eiwitten en complexen worden uitgebreid tot 1 MDa ^2,9.

De genoemde gewichtsbeperkingen zijn niet van toepassing op intrinsiek ongeordende eiwitten (IDP's), die vaak een hoge intrinsieke dynamiek vertonen. Meer dan 30% van het eukaryote proteoom bestaat uit IDP's of intrinsiek ongeordende regio's (IDR's)10,11,12,13. Ze spelen een centrale rol in veel cellulaire processen, zoals signaaltransductie en transcriptie¹, en zijn vaak betrokken bij intracellulaire fasescheiding 14,15,16,17. IDP's missen een goed gedefinieerde driedimensionale (3D) native structuur onder fysiologische omstandigheden en hebben een zwak gefunneld of ruig energielandschap^17,18. Vanwege een lage hydrofobiciteit en sterke elektrostatische afstoting verdeeld over de ruggengraat van IDP's of IDR's, ontbreekt een drijvende kracht voor het vouwen naar een stijve structuur¹⁹. IDP's nemen vaak een gevouwen conformatie aan wanneer ze complex zijn met andere bindende partners 10,20,21. Ook breiden posttranslationele modificaties (PTM's) de vouwmogelijkheden van IDP's of IDR's^{uit 22,23}. Misvouwing van IDP's is geïdentificeerd als een oorzaak van verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten 15,24,25,26.

IDP's en IDR's vertonen een hoge interne flexibiliteit 21,27,28. Conformationele ensembles die de variatie van atomaire posities en dihedrale hoeken vertonen, werden afgeleid van moleculaire dynamica, simulaties en beperkingen verkregen uit experimentele gegevens 29,30,31,32. Vanwege de dynamiek en de daaruit voortvloeiende wanorde in de bevroren toestand, maakt de diffuse elektronendichtheid het moeilijk om ze structureel te karakteriseren met behulp van state-of-the-art methoden in de structurele biologie, zoals cryo-EM of röntgenkristallografie. Ook kristallisatieomstandigheden of monstervoorbereidingstechnieken voor experimenten bij cryogene temperaturen kunnen van invloed zijn op de conformationele ruimte die IDP's ervaren. De oplossing NMR werkt echter goed voor zeer dynamische eiwitten en is daarom zeer geschikt voor het onderzoeken van IDP's 16,20,22,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38.

Zoals hierboven geïntroduceerd, biedt oplossing NMR verschillende technieken om de interne eiwitdynamiek over een breed scala aan tijdschalen te bestuderen (Figuur 1), voornamelijk gebaseerd op spinontspanning 31,33,38,39,40,41,42.

Spinrelaxatie van de ¹⁵N-kernen in de amidegroepen van de eiwitruggengraat wordt geïnduceerd door veranderingen in de oriëntatie van de ^{1 H-15}N-bindingshoek als gevolg van interne eiwitdynamiek en collectieve bewegingen (inclusief, indien relevant, rotatiediffusie)27,43,44,45,46,47,48,49,50,51. Op tijdschalen korter dan de rotatiecorrelatietijd τ_R (de tijd die het molecuul nodig heeft om één radiant te draaien, ook wel totale tuimelcorrelatietijd genoemd), zijn de chemische verschuivingsanisotropie (CSA) en de dipolaire koppeling (D) actief en niet gemiddeld door de rotatiediffusie van het eiwit. Interne dynamiek van de eiwitruggengraat, bestaande uit variaties in bindingshoeken, heroriëntaties van bindingen en roterend tuimelen, induceert stochastische fluctuaties van de CSA en dipolaire koppelingstensor, wat resulteert in een variatie van het lokale magnetische veld, wat uiteindelijk leidt tot NMR-spinontspanning 47,48,52,53 . Deze fluctuaties kunnen worden beschreven door een algemene correlatiefunctie. De Fouriertransformatie van de totale correlatiefunctie wordt de spectrale dichtheidsfunctie genoemd. In de semi-klassieke Redfield-relaxatietheorie kunnen de NMR-relaxatiesnelheidsconstanten worden beschreven door lineaire combinaties van deze spectrale dichtheidsfuncties⁵⁴.

Backbone ¹⁵N NMR-relaxatie-experimenten die in het begin van de jaren 1990 zijn ontwikkeld, omvatten ¹⁵N R₁, R_1ρ en {¹H}-¹⁵N nucleaire Overhauser-effectexperimenten, gevoelig voor de snelle picoseconde (ps) nanoseconde (ns) tijdschaal, sneller dan de rotatiecorrelatietijd τ_R van het eiwit 45,55,56,57. Om de dynamiek van de ruggengraat langzamer dan de rotatiecorrelatietijd τ_R te karakteriseren, worden de zogenaamde relaxatiedispersie-experimenten, R_1ρ, en Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) experimenten gebruikt die gevoelig zijn voor microseconde (μs) - milliseconde (ms) dynamiek 44,46,58,59,60,61. Dynamiek langzamer dan microseconden kan worden vastgelegd door ¹⁵N chemische uitwisseling verzadigingsoverdracht (CEST) NMR⁶², uitwisselingsspectroscopie (EXSY, milliseconden naar seconden) of Real-time (RT) NMR (seconden naar uren)^63,64. Het PRE-effect (paramagnetische relaxatieverbetering) van paramagnetische sondes, evenals resterende dipolaire koppelingen (RDC's), kan worden gebruikt om het volledige bereik van ps tot ms-dynamiek 65,66,67,68 te beoordelen.

Figuur 1: Tijdschalen van de dynamiek van de eiwitruggengraat en gevoelig tijdvenster van verschillende NMR-dynamiekexperimenten. NMR biedt een verscheidenheid aan methoden om de dynamiek van de eiwitruggengraat over een breed scala aan tijdschalen te karakteriseren. Verschillende bewegingen die door de eiwitruggengraat worden ervaren, worden aangegeven op hun respectievelijke tijdschalen. De rotatiecorrelatietijd van het eiwit, τ_R, is de tijd die het eiwit nodig heeft voor een totale rotatie (met één straal). Bewegingen sneller dan de rotatiecorrelatietijd van het eiwit, τ_R, kunnen in verband worden gebracht met de interne flexibiliteit van het eiwit. Onder de pijl zijn verschillende NMR-experimenten en hun gevoeligheid voor de respectievelijke tijdschalen aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het onderstaande protocol beschrijft de opzet van NMR-relaxatie-experimenten door Lakomek et ^al.69 en Stief et ^al.70, met behulp van een gevoeligheidsversterkt heteronucleair single quantum coherence (HSQC) detectieschema. Alvorens over te gaan tot de experimentele implementatie, wordt een zeer kort overzicht gegeven van NMR-spinrelaxatie- en NMR-relaxatie-experimenten. Vanwege maatbeperkingen en om dit protocol begrijpelijk te houden, moet dit overzicht simplistisch (en dus onvolledig) blijven.

De longitudinale of spin-roosterrelaxatie, gekenmerkt door de T_1-tijd of de R₁ = 1/ T 1-snelheidsconstante, beschrijft de terugkeer van de magnetisatie naar het Boltzmann-evenwicht. In evenwicht wordt de magnetisatie uitgelijnd langs de as van het buitenste magnetische veld, dat de z-as van het laboratoriumframe definieert. Spectrale dichtheden bij hoge (¹H) en kleine (¹⁵N) Larmor-frequenties (de NMR-resonantiefrequenties, bijv. 600 MHz gedurende ¹uur voor een 14,1 ^{Tesla-magneet}) en lineaire combinaties van deze Larmor-frequenties dragen bij aan de ¹⁵N R 1-relaxatie, die wordt gekenmerkt door de ¹⁵N R_{1-snelheidsconstanten} gemeten in rad·s-1. Bewegingen op tijdschalen zijn omgekeerd aan deze Larmor-frequenties; bewegingen op de tijdschaal van picoseconde tot nanoseconde dragen dus bij aan de relaxatiesnelheidsconstante R₁. Voor moleculen die een totale tuimeling vertonen en waarvoor een rotatiecorrelatietijd kan worden gedefinieerd, toont de R₁ (T₁) curve een maximum (minimum) voor ωτ_R = 1, waarbij de rotatiecorrelatie τ_R en de Larmor-frequentie ω van de spin in aanmerking worden genomen. Als er meerdere Larmor-frequenties bijdragen, is degene met de laagste frequentie de dominante, bijvoorbeeld ω_N in het geval van ¹⁵N R₁. Het fast motion-regime (ωτ_R veel kleiner dan 1) is van toepassing op kleine moleculen die zeer snel tuimelen en voor lage magnetische velden en een lage viscositeit. Het slow motion-regime (ωτ_R veel groter dan 1) is geldig voor grotere moleculen die langzamer tuimelen en voor hoge magnetische velden en hoge viscositeit.

Bolvormige gevouwen eiwitten vertonen algehele tuimelen in oplossing en er kan een rotatiecorrelatietijd worden toegewezen. Het concept van totale tuimelen is echter niet langer geldig voor intrinsiek ongeordende eiwitten en verschilt vaak van het toekennen van een enkele rotatiecorrelatietijd. Hier wordt de residu-specifieke interne correlatietijd kritischer.

De beschreven pulssequentie die ¹⁵N R₁ relaxatiesnelheden meet (Figuur 2) is gebaseerd op een gevoeligheidsverbeterd HSQC-uitleesexperiment met een Echo/Anti-Echo-detectie voor kwadratuurdetectie 69,70,71. Korte gradiënten met variabele sterkte en lengte worden gebruikt voor coherentieselectie en verbeterde wateronderdrukking⁷⁰. Gedurende die tijd zal de longitudinale polarisatie van ¹⁵N ontspannen. Langere vervaltijden leiden tot verminderde intensiteiten in de bijbehorende 2D-vlakken van dit pseudo-3D-spectrum (vertragingsdatapunten worden geregistreerd in de derde dimensie). Een luselement, hieronder beschreven, wordt een toenemend aantal keren uitgevoerd voor langere ontspanningstijden. Aangezien kruisgecorreleerde relaxatie tussen de ¹⁵N chemische verschuiving anisotropie (CSA) en de ¹H en ¹⁵N dipolaire koppeling (D) ook actief is tijdens de relaxatievertraging, is een centrale I-BURP-2 180° puls⁷², selectief op de amideprotonen, nodig om de bijdrage te heroriënteren door kruisgecorreleerde relaxatie (die, indien niet opnieuw gefocust, zou leiden tot scheve en foutieve ¹⁵N R₁ snelheidsconstanten).

Figuur 2: NMR-pulssequentieschema's voor het bepalen van de NMR-relaxatiesnelheidsconstanten. (A) ¹⁵N R_1ρ, (B) ¹⁵N R₁ en (C) hetNOY-experiment, met behulp van een HSQC-uitleesschema met verhoogde gevoeligheid^69,70. 90°(x)-pulsen worden gevisualiseerd door smalle rechthoeken en 180°(x)-pulsen door brede rechthoeken, tenzij anders aangegeven. De volgende fasecyclus wordt toegepast: φ₆ = y, y, -y, -y; φ₇ = y, -y, φ_rec = y, -y, -y, y. Kwadratuurdetectie wordt bereikt door de polariteit van gradiënt G5 en de fasecyclus van φ7 (Echo/Anti-Echo-detectie) om te keren. (A) ¹⁵N R_1ρ experiment: De zwarte rechthoekige stelt de spin-lock voor, waarvan de duur varieert om verschillende ontspanningsvertragingen te verkrijgen. De driehoeken voor en na de spin-lock geven de adiabatische vormpulsen aan die de magnetisatie uitlijnen langs de effectieve magnetische veldas B_eff. G₁₀ is een optionele gradiënt om stralingsdemping van de watermagnetisatie tijdens de evolutiefase te voorkomen. (B) ¹⁵N R₁ experiment: Het tussen haakjes geplaatste deel toont het luselement van de sequentie, een n aantal keren herhaald om de gewenste ontspanningsvertraging te evenaren. (C) Het hetNOE-pulsschema is vergelijkbaar met de tweede helft van de R₁- en R_{1ρ-pulsschema's}, namelijk de t_{1-evolutietijd} en het HSQC-detectie-element. 15 N magnetisatie wordt echter direct geëxciteerd zonder enige INEPT. Verzadiging van de protonmagnetisatie (om kruisontspanning tussen ¹uur en ¹⁵N te bereiken) wordt bereikt door een trein van 180 (¹uur) pulsen die gedurende ten minste 5 s worden toegepast. Voor het referentie-experiment wordt een stationaire vertraging van dezelfde lengte (in dit geval 5 s) zonder pulstrein toegepast. G₅ is een optionele gradiënt om stralingsdemping te voorkomen, en de inversie in polariteit van gradiënt G4, in combinatie met fase φ7 = y, -y, -y, y, bereikt kwadratuurdetectie. De stappen van de magnetisatieoverdracht, weergegeven door productoperators, zijn rood gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De relaxatiesnelheidsconstante R₂ beschrijft de relaxatie van transversale polarisatie (in het xy-vlak loodrecht op het externe magnetische veld) als gevolg van verlies van fasecoherentie tussen de spin, wat leidt tot verval van detecteerbare magnetisatie^53,54. De spectrale dichtheidsfunctie bij hoge en kleine frequenties draagt bij aan R₂, vergelijkbaar met R₁. De grootste bijdrage aan R₂ komt echter voort uit de spectrale dichtheid bij een nulfrequentie. Om deze reden is R₂ zeer gevoelig voor het roterende tuimelen, beschreven door de rotatiecorrelatietijd τ_R, die in de orde van grootte van enkele ns ligt voor een klein bolvormig eiwit bij kamertemperatuur. Langzamere backbone-bewegingen in het regime van honderden ps tot lage ns dragen dus het meest bij. Uitwisselingsdynamiek van de ruggengraat die een modulatie van het isotrope deel van de chemische verschuivingstensor van de ¹⁵N-kernen veroorzaakt, voegt in principe een uitwisselingsbijdrage R_2ex toe aan de R 2-snelheidsconstanten 43,44,49,60,61. In de beschreven experimenten wordt de R_2ex-bijdrage onderdrukt door een spin-lock die de dynamiek langzamer heroriënteert dan de inverse cirkelvormige frequentie van de spin-lock. De spin-lock is een lange continue golf radiofrequente puls die de magnetisatie uitgelijnd houdt langs de effectieve magnetische veldas B_eff (de vectorsom van het spin-lock ω₁ veld en de chemische verschuivingsoffset van de ¹⁵N draaggolffrequentie (zie hieronder)). De ontspanning van de magnetisatie die langs de B_1,eff-as is uitgelijnd, wordt R_{1ρ-ontspanning} genoemd, die een R_1-component en een R_2-component heeft. Met behulp van formule (1) kan R₂ worden berekend uit R_1ρ en R₁^44,73:

(1).

De hoek tussen de as van het effectieve magnetische veld B_eff en het externe magnetische veld B₀ is . ω₁ is de RF-amplitude van de spin-lock en Ω de chemische verschuiving offset tussen de ¹⁵N chemische verschuiving van het overeenkomstige residu en de ¹⁵N draaggolffrequentie ^44,73.

Het R_{1ρ-pulsschema} (figuur 2A, ⁷⁰) lijkt sterk op het ¹⁵N R_1-schema , met uitzondering van de relaxatievertraging. Om de ontspanningssnelheden van ¹⁵N R_1ρ te meten, moet de spin-lock actief zijn nadat de magnetisatie is uitgelijnd langs de effectieve veldas B_eff door een adiabatische puls met dezelfde radiofrequentie (RF) amplitude als de spin-lock. De lengte van de spin-lock zal worden gevarieerd om de verschillende ontspanningsvertragingen te verkrijgen.

Het steady-state {¹H}-¹⁵N nucleaire Overhauser-effect (^{1 H-15}N NOE), hierna hetNOE genoemd, is de verhouding tussen de kruisrelaxatiesnelheid en de longitudinale relaxatiesnelheid van ¹⁵N. Het leidt tot een vermindering van de steady-state polarisatie op ¹⁵N als gevolg van kruisontspanning met het proton bij verzadiging van de protonpolarisatie 45,53,54,74,75. De kruisontspanning hangt af van spectrale dichtheidsfuncties van de som en het verschil ^{van de}frequenties 1 H en ¹⁵N Larmor. Daarom is de hetNOE gevoelig voor zowel snelle picoseconde-dynamieken (< 100 ps) als voor ps-ns-dynamieken (vanwege zijn R_{1-afhankelijkheid}). De sequentie⁶⁹ (Figuur 2C) is gebaseerd op een gevoeligheidsverbeterde HSQC-uitlezing met Echo/Anti-Echo-gradiënten voor kwadratuurdetectie. Voor de verzadiging van de protonmagnetisatie en de daaruit voortvloeiende hetNOE wordt de evenwichtsprotonmagnetisatie omgekeerd en vervolgens verzadigd door snel pulserende pulsen van 180° gedurende ongeveer 5 keer de ¹⁵ N T₁. Voor het referentie-experiment is de herstelvertraging gelijk aan de verzadigingsvertraging, maar zonder de ¹H 180°pulstrein. Een extra vertraging van D1 = 2 s wordt toegevoegd voor het referentie-experiment en het experiment met ¹H verzadiging. Beide experimenten worden back-to-back opgenomen en verschillen alleen in het toepassen van ¹H 180°-pulsen (verzadiging) of niet (referentie). De verhouding van de in het experiment geregistreerde spectrale intensiteiten met ¹H-verzadiging gedeeld door de intensiteiten van het referentie-experiment (zonder de 180° protonpulstrein) geeft de {¹H}-¹⁵N NOE (hetNOE) waarde.

Het volgende protocol beschrijft de opzet van NMR-relaxatie-experimenten door Lakomek et ^al.69 en Stief et ^al.70. We richten ons op NMR-pulssequenties met behulp van een gevoeligheidsverbeterd HSQC-detectieschema. De ^{experimenten met 15}N R₁ en R_1ρ worden uitgevoerd zoals in detail beschreven door Stief et al.70, en het hetNOE-experiment wordt beschreven door Lakomek et ^al.69.

Protocol

1. Voorbereiding van NMR-monsters

OPMERKING: Isotopenlabeling van de eiwitten wordt uitgevoerd voor hoger-dimensionale NMR en geavanceerde NMR-experimenten. Wanneer eiwitexpressie in E. coli en eiwitzuivering zijn vastgesteld met behulp van rijke media (bijv. Luria-Bertani [LB] of 2x gistextract tryptonmedium [2YT]) met een opbrengst van enkele milligrammen per liter, is het bereiden van een isotopisch gelabeld NMR-monster meestal relatief eenvoudig.

1. Gebruik voor isotopenetikettering M9 minimale media voor genexpressie, waarbij ¹⁵N-ammoniumchloride de enige stikstofbron is en ¹³C-verrijkte glucose de enige koolstofbron.
2. Voor eiwitzuivering volgt u het standaardprotocol dat in het laboratorium is vastgesteld voor het betreffende eiwit.
   OPMERKING: De resultatensectie toont representatieve resultaten voor een IDP, het monomere SNARE-eiwit Synaptobrevin-2 (1-96). NMR-isotopenetikettering van Synaptobrevin-2 is uitgevoerd zoals beschreven in⁷⁰. Voor metingen met een zeer hoge precisie wordt het gebruik van lage_D2O-concentraties, minder dan 5%, aanbevolen. Dit komt door het deuteriumisotoopeffect, dat kan worden waargenomen in Hahn-Echo ¹⁵N T₂ en bij laagfrequente ¹⁵N CPMG-relaxatiedispersie-experimenten (hier niet besproken), maar slechts een minimale impact heeft in ¹⁵N R_{1ρ-experimenten} (waar het voornamelijk wordt geheroriënteerd)⁷⁶.

2. Voorbereidingen voor het uitvoeren van de NMR-relaxatie-experimenten op de spectrometer

OPMERKING: De beschreven NMR-relaxatie-experimenten zijn specifiek voor Bruker-spectrometers. Ze zijn getest op cryogene sondes met drievoudige resonantie en kamertemperatuur van ¹H, ¹⁵N en ¹³C en Avance Neo-consoles die worden bediend door de Bruker-software Topsin 3.6 of hoger.

1. Volg de voorzorgsmaatregelen.
   1. Doe een veiligheidsbriefing voordat u aan de NMR-spectrometer gaat werken.
   2. Controleer de vermogensspecificaties van de gebruikte spectrometer van de sonde en kies een geschikte pulslengte en pulsvermogen voor elke puls, bijvoorbeeld door de consistentie te vergelijken met de Topspin "prosol"-tabelitems.
2. Importeer de pulssequenties.
   1. Download de NMR-pulsprogramma's van de hieronder aangegeven website of van de uitgebreide Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) repository (bmrbig102) naar de directory /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user van de computer die de NMR-spectrometer bedient. Pas de topspin-versie (hier: topspin4.1.4 aan op de betreffende versie die op de spectrometer is geïnstalleerd).
   2. Download de NMR-vormige pulsen van de hieronder aangegeven website of van de uitgebreide Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) repository (bmrbig102) naar de directory /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user van de computer die de NMR-spectrometer bedient. Pas de topspin-versie (hier: topspin 4.1.4 aan de betreffende versie aan die op de spectrometer is geïnstalleerd).
3. Kalibreer de spectrometer en het monster.
   1. Stel de gewenste temperatuur in. Pas voor temperatuurkalibratie de protocollen van de faciliteit toe. Gebruik bijvoorbeeld een Methanol-d4-monster en interpreteer het waargenomen chemische verschuivingsverschil met behulp van de webapplicatie NMR-thermometer (https://chem.ch.huji.ac.il/nmr/software/thermometer.html); zie^{ook 77}.
   2. Plaats het monster (plus een extra 5% D₂O voor het slot) en wacht ongeveer 10 minuten om het monster in evenwicht te laten komen. Vergrendel het deuteriumsignaal (²H) (commando: vergrendelen, selecteer H₂O+D₂O).
   3. Stem de ¹H-, ¹⁵N- en ¹³C-kanalen op elkaar af en stem ze af, bijvoorbeeld met behulp van de atma- of atmm-routine. Als er geen automatische matching- en tuning-eenheid is geïnstalleerd, koppelt en stemt u de sonde handmatig af met behulp van het wob-commando.
   4. Voer shimming uit voor een homogeen B_0-veld , bijv. met behulp van de topshim-routine tg.
4. Kalibreer de pulslengte van 90° (¹uur).
   1. Gebruik het zg-experiment. Gebruik getprosol om de sondeparameters te importeren. Kies een korte duur van 5 μs voor P1. Controleer en corrigeer indien nodig het gespecificeerde vermogensniveau van de sonde voor PLW1.
   2. Start het experiment met zg. Verwerk de gegevens met efp. Pas de fase aan met .ph zodat de basislijn gelijkmatig is en het NMR-signaal van de waterresonantie in fase is.
   3. Schat een puls van 360° (¹uur) door een gewone puls of een puls van ongeveer 90° (¹uur) te nemen (bijv. uit de vermelde spectrometerspecificaties) en deze te vermenigvuldigen met een factor vier. Voer het experiment uit en verwerk het.
      OPMERKING: De gekozen duur is te lang als het signaal positief is en te kort als het negatief is. De 360° (¹H) puls is de nulovergang.
   4. Pas de pulslengte dienovereenkomstig aan. Doe dit iteratief om de nulovergang te vinden. Deel de verkregen waarde door vier. Dat zal de puls van 90° (¹H) zijn.
      OPMERKING: Een alternatief voor de beschreven 360°-methode is de pulscal-routine , die vanaf de opdrachtregel kan worden gestart en een geautomatiseerde pulskalibratie van ¹uur mogelijk maakt.
5. Kalibreer de draaggolffrequentie O1 op de waterresonantie.
   1. Kopieer het zg-experiment door edc in de opdrachtregel te typen naar een nieuw experimentnummer. Typ rpar om de parametersets te openen (aanvullende figuur 1A).
   2. Zoek naar de parameterset ZGPR. Klik op de parameterset ZGPR (Aanvullende Figuur 1A), klik op Lezen, kies "getprosol" uitvoeren en klik op OK (Aanvullende Figuur 1B).
   3. Verander P1 in de gekalibreerde pulslengte van 90° (¹H). Kies een verzadigingslengte van D1 = 2 s en een pulsvermogen van PLW9 van 50 dB. Zet de versterking van de ontvanger (rg) op 16. U kunt ook de aanpassing van de ontvangerversterking uitvoeren door rga te typen en de ontvangerversterking in te stellen op de opgegeven waarde (maar vermijd "overloop van de ontvangerversterking").
   4. Typ gs in de opdrachtregel om te starten voor een herhaalde, continue acquisitie. Ga naar het acquisitievenster en wijzig de O1 om het FID-gebied dat wordt gedomineerd door het watersignaal te verkleinen (aanvullende afbeelding 2).
   5. Klik onder de markering om de O1 te verlagen en klik boven de markering om deze te verhogen. Gebruik de gevoeligheidsknop om de stapgrootte te wijzigen. Sla de huidige O1 op; Close stopt de herhaalde acquisitie (aanvullende figuur 2).
6. Kalibreer de pulslengte van 90° (¹⁵N).
   1. Kopieer het zg-experiment naar een nieuw experimentnummer (type edc). Typ rpar om de parameterset af te lezen HSQCFPF3GPPHWG om het pulsprogramma te wijzigen in een ^{1 H-15}N HSQC-experiment. Gebruik de optie Parameters P1, O1 en PLW1 behouden (aanvullende afbeelding 1).
   2. Typ getprosol 1H 1H) pulslengte in μs> <90° (¹H) pulssterkte in db> op de opdrachtregel om de sondeparameters te importeren. Stel het aantal scans (NS) in op 8 en de dummyscans (DS) op 2.
      OPMERKING: < > geeft hier de in te stellen waarden aan. Bijvoorbeeld: getprosol 1H 8,5 -11,79.
   3. Voer de eerste stap van het experiment uit door zg in de opdrachtregel te typen. Kopieer de eerste stap naar een nieuw experimentnummer met rser 1 . Verwerk de data met efp en faseer het spectrum met .pH. Gebruik de eerste stap (1D-experiment) van het experiment voor de volgende stappen.
      OPMERKING: De < > het gekozen nummer voor het nieuwe experiment opgeven, bijvoorbeeld rser 1 101.
   4. Typ ased in de opdrachtregel om de pulssequentieparameters van het 1D-experiment te openen. Klik op de E in de regel PULPROG (zie aanvullende figuur 3A) om de editor van het pulsprogramma te openen.
   5. Gebruik de volgende workflow om de pulsreeks onder een nieuwe naam op te slaan: Klik op Bestand (linkerbovenhoek), Opslaan als, voer de nieuwe naam in en klik op OK. Klik vervolgens op PULPROG instellen op de dataset (zie aanvullende figuur 3B) en klik op OK.
   6. Wijzig de originele ^{1 H-15}N HSQC-sequentie (opgeslagen onder een nieuwe naam, zie 2.6.4.) door de 90° (¹⁵N) na de evolutieperiode t₁ (vóór de terugoverdracht) te vermenigvuldigen met een factor 2 (de 90° (¹⁵N) puls is nu 180° (¹⁵N)). Druk op Ctrl S om de pulsreeks op te slaan. Stel de pulslengte in op 90° (¹⁵N) (P21) zodat het NMR-signaal van de eerste stap verdwijnt (bij de nulovergang) (aanvullende figuur 3B).
   7. Open het ^{1 H-15}N HSQC-experiment (2D-experiment) en voer de gekalibreerde pulslengte van 90° (¹⁵N) in (P21). Typ getprosol 1H ¹H) pulslengte in μs> <90° (¹H) pulssterkte in db> 15N ¹⁵N) pulslengte in μs> <90° (¹⁵N) pulssterkte in db> op de opdrachtregel.
7. Bepaal de spectrale breedtes en toe-eigening van acquisitietijden.
   1. In het acquisitieparametervenster voor het ^{1 H-15}N HSQC-experiment (typ eda in de opdrachtregel), past u de spectrale breedte (acquisitieparameter SW) en het aantal dimensiestappen in directe en indirecte dimensies (acquisitieparameter TD) aan.
      1. Kies voor SW, 16 ppm in de directe (¹H) en 30 ppm in de indirecte (¹⁵N) dimensie. Kies voor TD, 2048 in de directe (¹H) en 512 in de indirecte (¹⁵N) dimensie.
   2. Verkrijg het ^{1 H-15}N HSQC-experiment.
      1. Controleer of alle signalen van belang worden gedetecteerd en of er geen aliasing-artefacten in het spectrum aanwezig zijn. Verander de O3P als het midden van het spectrum niet past bij het midden van de eiwitsignaalverdeling langs de ¹⁵N-as.
      2. Verhoog de SW als het spectrale venster te klein is. Verhoog de TD om een hogere FID-resolutie te krijgen (controleer de sondespecificaties voor de maximale duur van de ontkoppeling).
         OPMERKING: Dit is de algemene opzet en het startpunt voor het opzetten van NMR-ontspanningsexperimenten. Het wordt aanbevolen om het ^{1 H-15}N HSQC-experiment aan het begin en einde van de gehele reeks experimenten op te nemen en, voor langere experimentele tijden, ook tussendoor om de integriteit van het monster te controleren.

3. Implementatie van de NMR-versoepelingsexperimenten

OPMERKING: De NMR-relaxatiepulssequenties (Figuur 2) zijn beschikbaar op https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences of op de uitgebreide Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) repository (bmrbig102).

1. Stel de ¹⁵N R_1ρ experiment.
   1. Kopieer het HSQC-experiment (type edc) naar een nieuwe map. Typ ased en verander het pulsprogramma in het ¹⁵N R_1ρ experiment door op de drie puntjes van de parameterregel PULPROG in de pulssequentieparameters te klikken (ased, zie aanvullende figuur 3A). Dubbelklik op het pulsprogramma, klik op PULPROG instellen op dataset (zie aanvullende figuur 3B) en klik op OK.
      OPMERKING: Er kunnen enkele foutmeldingen verschijnen. Sluit deze berichten.
   2. Typ gpnam in de opdrachtregel om alle ontbrekende gradiëntvormen (gpnam1- gpnam9) in te voegen zoals beschreven in de pulssequentie (aanvullende afbeelding 4).
   3. Typ vplist in de opdrachtregel. Klik op de drie puntjes (Aanvullende Figuur 5A), Bestand (linkerbovenhoek) en Nieuw (Aanvullende Figuur 5B).
   4. Typ een naam voor een nieuwe dummy-vplist en druk op OK. Maak de dummy vplist (5m, 65m, 25m, 45m, 15m, 55m, 35m, 10m; een nieuwe rij voor elke vplist-vermelding). Druk op Ctrl S om de lijst op te slaan en sluit het venster van de vplist (aanvullende figuur 5C).
   5. Dubbelklik op de naam van de nieuw aangemaakte vplist (aanvullende figuur 5B).
      OPMERKING: Dit is nodig om compilatiefouten in de pulssequentie te voorkomen. De desbetreffende vermeldingen van de vplist zullen hieronder verder worden bepaald (punt 3.1.29).
   6. Typ ased om de parameters van de pulssequentie te openen (aanvullende afbeelding 6). Voer alle ontbrekende gradiëntsterktes en gradiëntlengtes in zoals aangegeven in de pulssequentie (aanvullende figuur 6D).
   7. Voer voor de lusteller L₃ (aantal complexe punten in de indirecte dimensie) 1/2 van de ¹⁵N TD-invoer in het acquisitieparametervenster (eda) in. Voer voor de lusteller L₆ het aantal geregistreerde ontspanningsgegevenspunten in dat wordt gebruikt om de ontspanningscurve aan te passen.
      OPMERKING: Dit nummer L₆ komt overeen met het aantal vplist-inzendingen, hier: 8 (aanvullende figuur 6A).
   8. Stel de adiabatische TanhTan_half.nl-puls, gedownload van de hierboven aangegeven website, in als de vorm van de ¹⁵N SP8-puls. Stel de adiabatische TanhTan_2nd.nl-puls van de website in als de vorm van de ¹⁵N SP9-puls (aanvullende figuur 6C).
   9. Stel de P8-ingang in op de lengte van de adiabatische TanhTan-puls - voldoende lang om de adiabaticiteit van de puls te garanderen; hier wordt P8 = 3000 μs gekozen (aanvullende figuur 6C).
   10. Stel de ¹⁵N ontkoppeling (CPDPRG 3) in op een garp ontkoppelingsschema. Gebruik voor de duur van de ontkoppeling PCPD3 200 μs (aanvullende figuur 6C).
   11. Stel de herstelvertraging van de scan in op minimaal D1 = 2 s of langer.
       OPMERKING: Voor de keuze van een geschikte herstelvertraging, zie de sectie Discussie.
   12. Stel de dummyscans (DS) in op minimaal 64 voor het laatste experiment (tijdens de installatie is DS = 4 voldoende om tijdsredenen). Gebruik als uitgangspunt een aantal scans (NS) van 4; gebruik veelvouden van 4 als de signaal-ruisverhouding (SNR) te laag is (aanvullende figuur 6A).
   13. Stel de O1 in op de gekalibreerde draaggolffrequentie van stap 2.5. Stel de O2P in op 176 ppm en kopieer de O3P van het ^{1 H-15}N HSQC-experiment (aanvullende figuur 6A-C).
   14. Stel de pulslengte P7 in op de pulslengte van 90° (¹⁵N) die in stap 2.6 is gekalibreerd. Kopieer ook het pulsvermogensniveau van de puls van 90° (¹⁵N) van stap 2.6 naar PLW3 en PLW7 (aanvullende afbeelding 6C).
   15. Stel de pulslengte P1 en P19 in op de in stap 2.4 berekende pulslengte van 90° (¹H). (Aanvullende figuur 6B).
   16. Stel het aantal stappen in de indirecte dimensie TD in = l₃ * 2 * l₆ (eda of typ td in de opdrachtregel).
       OPMERKING: Alle hier beschreven pulssequentieparameters zijn bovendien geannoteerd in de pulssequentie.
   17. Stel de vormpuls SP5 in op een I-BURP2-vorm (Iburp2.1000). Stel de pulslengte P15 in op 2000 μs. Open de weergave van het vormgereedschap door te klikken op de E naast de I-BURP2-vormpuls in het parametervenster Topspin pulsequentie (ased) (aanvullende afbeelding 6B).
   18. Simuleer de vormpuls met de juiste lengte door op de knop NMR-simulatie starten te klikken. Controleer de gevormde pulslengte [μs] (= 2000 μs) en de rotatiehoek [°] (= 180°) in het simulatievenster. Klik op Start NMR-SIM (aanvullende figuur 7A).
   19. Controleer het excitatiebereik en kies de juiste I-BURP2-pulslengte om de ^spectraledispersie van 1 uur van het eiwit te dekken, maar vermijd tegelijkertijd excitatie van het water. Stel P15 in op de gevormde pulslengte van het simulatievenster met de beste gesimuleerde IBURP-2-puls (aanvullende afbeelding 7B).
       OPMERKING: De juiste lengte wordt gekozen als de I-BURP2 het hele amidegebied prikkelt (> 95% effectiviteit). Om een I-BURP2-puls met een andere lengte te simuleren, sluit u het excitatieprofielvenster en bewerkt u de gevormde pulslengte in het simulatievenster. Klik op Start NMR-SIM. Pulsen met een kortere lengte hebben een breder excitatiebereik in Hz.
   20. Stel SPOFFS5 in om de draaggolffrequentie van de I-BURP2-puls te wijzigen en verschuif het excitatiebereik naar links of rechts om te voorkomen dat de I-BURP2-puls de watermagnetisatie raakt en verstoort (aanvullende afbeelding 6B).
   21. Om het juiste vermogensniveau van de gevormde puls te bepalen, opent u het Bruker-vormgereedschap, klikt u op de knop NMR-simulatie starten en stelt u de I-BURP2-pulslengte in op Gevormde pulslengte [μs]. Onthoud de overeenkomstige lengte van een zachte rechthoekige puls van 90° (¹H), zichtbaar in het simulatievenster bij de overeenkomstige 90° vierkante puls [μs] (aanvullende figuur 7A).
   22. Typ calcpowlev. Gebruik de harde puls van 90° (¹H) (P1) in microseconden als referentielengte (aanvullende afbeelding 8B) en de zachte rechthoekige puls van 90° (¹H) die overeenkomt met de I-BURP2-puls in microseconden als de nieuwe lengte (aanvullende afbeelding 8A). Onthoud het vermogensverschil Δ in dB tussen de harde puls van 90° (¹H) en de zachte rechthoekige puls (aanvullende figuur 8C). Kopieer de pulssterkte van de harde puls van 90° (¹H) in dB naar SPW5 en voeg het in het geheugen opgeslagen verschil Δ in dB toe (aanvullende figuur 6B).
   23. Om het vermogensniveau van de spin-lock te bepalen, berekent u de overeenkomstige pulslengte van 90° (¹⁵N) van de spin-lock. Gebruik de formule: 90° (¹⁵N) pulslengte in s = 0,25 / (spin-lock vermogen in Hz).
   24. Bereken met calcpowlev het vermogensverschil Δ in dB tussen het vermogen van de spin-lock en de 90° (¹⁵N) harde puls (P7). Nieuw: 90° (¹⁵N) pulslengte van de spin-lock in μs (aanvullende figuur 8A). Ref: harde pulslengte van 90° (¹⁵N) in μs (aanvullende figuur 8B). Kopieer het vermogensniveau PLW7 van de 90° (¹⁵N) harde puls in dB naar het spin-lock vermogensniveau PLW8 (aanvullende afbeelding 6C) en voeg het berekende vermogensverschil Δ in dB toe (aanvullende afbeelding 8C).
   25. Kopieer het vermogensniveau van de spin-lock PLW8 naar de vermogensniveaus SPW8 en SPW9. (Aanvullende figuur 6C).
   26. Om het vermogensniveau van de ¹⁵N-ontkoppeling te bepalen, berekent u met calcpowlev het vermogensverschil Δ tussen het vermogen van de 90° (¹⁵N) ontkoppelingspuls (PCPD3) en de 90° (¹⁵N) harde puls (P7). Nieuw: PCPD3 in μs (200) (aanvullende figuur 8A). Ref: harde pulslengte van 90° (¹⁵N) in μs (aanvullende figuur 8B). Kopieer het vermogensniveau PLW7 van de 90° (¹⁵N) harde puls in dB naar het ontkoppelingsniveau PLW31 (aanvullende afbeelding 6C) en voeg Δ in dB toe (aanvullende figuur 8C).
   27. Als u temperatuurcompensatie wilt gebruiken, neemt u #define TEMP_COMPENSATION op (door de puntkomma in de pulsvolgorde te verwijderen). Stel P18 in op de maximale duur van de spin-lock die wordt gebruikt in het experiment ¹⁵N R_1ρ .
       OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de temperatuurcompensatie voor de eerste proef van het experiment uit te schakelen.
   28. In het geval van ^{monsters met het}label N ¹³C, neem # op om LABEL_CN in het pulsprogramma te definiëren (door de puntkomma in de pulssequentie te verwijderen). Stel P4 in op de pulslengte berekend met de formule in⁷⁸. Het komt bijvoorbeeld overeen met 23,70 μs bij 600 MHz en 11,85 μs bij 1200 MHz. Typ calcpowlev om het vermogensverschil in dB te berekenen tussen P4 en de (¹³C) harde puls. Kopieer het (¹³C) harde pulsvermogen in dB naar PLW4 en voeg de Δ in dB toe. Kopieer PLW4 naar PLW2 (aanvullende figuur 6B).
   29. Bepaal de ontspanningsvertragingen voor de juiste bemonstering.
       1. Voer de eerste acht FID's uit (in geval L₆ = 8) en verwerk deze (rser < nieuw experimentnummer>). Kies de vermeldingen in de vplist dat de piekintensiteit van het experiment met de langste vertraging afneemt tot ten minste 1/e (ca. 37%), maar niet minder dan 25% in vergelijking met het experiment met de kortste vertraging (dat als referentie dient).
       2. Pas de resterende vermeldingen van de vplist aan om een gelijkmatige steekproef van de intensiteitsdalingen te bereiken tussen de FID met de langste vertraging en de FID met de kortste vertraging. Lees de OPMERKING en de vermogensspecificaties van de sonde.
          OPMERKING: De langzaam ontspannende residuen zullen de eerste FID domineren. Pas de resterende vermeldingen van de vplist aan om een gelijkmatige steekproef van de intensiteitsdalingen tussen de eerste en tweede FID te bereiken. Overschrijd het maximaal toegestane spin-lock-vermogen en de lengte van de sonde niet (raadpleeg de handleiding van de sonde en de specificaties van de sonde). Controleer in het geval van temperatuurcompensatie P18 (maximale spin-lock-duur), aangezien de totale spin-lock-duur van P18 wordt toegepast, opgesplitst tussen de ontspanningsvertraging en temperatuurcompensatie. Het houdt tijd (ontspanningsvertraging) + tijd (temperatuurcompensatie) vast = const = P18. Voor een 2 kHz spin-lock geven we er de voorkeur aan om een spin-lock duur van niet meer dan 65 ms te overschrijden, met behulp van een herstelvertraging (D1) van 2 s. In dat geval moet een compromis worden gesloten tussen de maximale spin-lock duur en de langste relaxatievertraging ten gunste van de maximaal toegestane spin-lock duur. In het geval van langere D1-herstelvertragingen kunnen langere spin-lock-krachten van toepassing zijn. Wat telt, is de totale vermogensafzetting in de sonde in de loop van de tijd. Als een langere duur van de spin-lock nodig is, verhoog dan de spin-lock lengtes alleen in kleine stappen en let op het vergrendelingssignaal. Als vuistregel geldt dat u het vergrendelingsniveau in het bovenste derde deel van uw vergrendelingsdisplay aanpast. Als het vergrendelingsniveau tijdens de uitvoering van de pulssequentie met meer dan twee vierkanten afneemt, is het spin-lock-vermogen dat in de sonde wordt afgezet te groot.
   30. Typ rga in de opdrachtregel om de versterking van de ontvanger te bepalen. Voor een goede signaal-ruisverhouding streeft u naar een ontvangerversterkingswaarde (rg) tussen 128 en 256, wat een goede wateronderdrukking bewijst.
       OPMERKING: Een ontvangerversterking tussen 128 en 256 die niet kan worden bereikt, duidt op een te sterk watersignaal. In dat geval worden het gradiëntvermogen en de duur voorzichtig aangepast totdat de versterking van de ontvanger is bereikt. Zie ook de sectie Discussie.
   31. Start een testrun van het ¹⁵N R_{1ρ-experiment} door zg in de opdrachtregel te typen. Controleer of het watersignaal goed onderdrukt is voor alle vertragingen (1 t/m 8, in geval van 8 vertragingen in de vplist). Controleer ook stap 9, de tweede stap van het kwadratuurdetectieschema (Echo/Anti-Echo).
2. Zet het ¹⁵N R₁ experiment op.
   1. Kopieer het ¹⁵N R_1ρ experiment en verander het pulsprogramma in het ¹⁵N R₁ experiment.
   2. Typ vclist, genereer een vclist en voer de dummy-vclist in die wordt beschreven in⁷⁰: 0, 24, 6, 20, 4, 16, 8, 12; een nieuwe rij voor elk VCLIST-item).
   3. Open ased. Controleer de gradiëntlengtes en sterktes. Verander GPZ9 naar 14%.
   4. Controleer pulslengtes, pulsvormen en pulssterktes (de juiste waarden hadden moeten zijn gekopieerd van het ¹⁵N R_{1ρ-experiment} ).
   5. Gebruik in het geval van ^{monsters met het label 15}N¹³C #define LABEL_CN in het pulsprogramma.
   6. Neem voor het gebruik van temperatuurcompensatie #define TEMP_COMPENSATION.
   7. Voer de eerste acht FID's uit (in geval L₆ = 8) en verwerk deze (rser < nieuw experimentnummer>). Kies de vermeldingen in de vclist dat de piekintensiteit van het experiment met de langste vertraging afneemt tot ten minste 1/e (ca. 37%) maar niet minder dan 25% in vergelijking met het experiment met de kortste vertraging. Pas de resterende vermeldingen van de vplist aan om een gelijkmatige steekproef van de intensiteitsdalingen te bereiken tussen de FID met de langste vertraging en de FID met de kortste vertraging.
      OPMERKING: Alleen even nummers zijn toegestaan voor vclist-inzendingen.
3. Zet het {¹H}-¹⁵N NOE-experiment op.
   1. Kopieer het ontspanningsexperiment ^{van 15}N R₁ en verander de pulssequentie in het {¹H}-¹⁵N NOE-pulsschema.
   2. Stel de lengte van de verzadigingsperiode in met de lussenteller L₈. De afstand tussen pulsen van 180° (¹H) is 22 ms⁷⁹ (2* 1 / J_NH). Om de meest nauwkeurige resultaten te bereiken, gebruikt u een verzadigingsperiode van ongeveer 5 keer de ¹⁵N T₁ (¹⁵N) van het eiwit. Hier: 5 s. Dat zou overeenkomen met L8 = 230.
      OPMERKING: Het gedeelte Discussie geeft aanvullend advies over het kiezen van de verzadigingsperiode/herstelvertraging.
   3. Verander de lengte en sterkte van de gradiënten zoals beschreven in het pulsschema. Gebruik sinus.20 gradiëntvormen.
   4. Stel het aantal stappen in de indirecte dimensie gelijk aan TD = l₃ * 2 * 2
   5. Gebruik in het geval van ^{monsters met het label 15}N¹³C #define LABEL_CN en -DLABEL_CN als ZGOPTNS.
   6. Voer de pulsschema's uit door zg in de opdrachtregel te typen.

4. Verwerking en analyse van de geregistreerde NMR-experimenten

OPMERKING: Spectra zijn opgenomen met behulp van een Bruker-systeem. De verwerking wordt uitgevoerd met behulp van een Unix- of Linux-besturingssysteem. Spectraverwerking en data-analyse werden uitgevoerd met behulp van NMRPipe⁸⁰ en python3. De NMRPipe software is te downloaden bij https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/index.html. Op NMRPipe gebaseerde verwerkingsscripts worden gedownload van de website: https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences of van de uitgebreide Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) repository (bmrbig102). Het wordt aanbevolen om NMRPipe te gebruiken. Als NMRPipe niet beschikbaar of gewenst is, kunnen alternatieven zoals CCPN⁸¹ of SPARKY (SPARKY 3, of zijn opvolgers NMRFAM-SPARKY⁸² of POKY⁸³ ) worden gebruikt.

1. Verwerken en analyseren ¹⁵N R₁ experiment.
   OPMERKING: De volgende commando's worden uitgevoerd in een Unix Terminal.
   1. Kopieer de bestanden in de gedownloade directory R1_processing naar de directory met de experimentele R1-gegevens (werkdirectory).
   2. Maak de bestanden uitvoerbaar met het terminalcommando: > chmod u+x *.com
   3. Voer > bruker uit om de NMRPipe Conversion Utility te openen en het fid.com bestand te genereren. Klik op Parameters lezen. Wijzig het aantal dimensies in twee als er drie dimensies worden geteld en klik nogmaals op Parameters lezen . Klik vervolgens op Script wissen, Script bijwerken en Script opslaan (aanvullende afbeelding 9).
      OPMERKING: Als de frequentie van de draaggolf niet correct is, wijzigt u de middenpositie PPM nadat u voor de tweede keer op Parameters lezen hebt geklikt.
   4. Voer > ./fid.com uit
   5. Converteer de vclist in een vplist met ms-vermeldingen: vertraging in ms = 40 ms * invoer van vclist. Gebruik > cp vclist vplist en bewerk de vplist.
   6. Gebruik > ./split.com om de pseudo-3D-gegevens op te splitsen in acht 2D-bestanden.
   7. Bewerk de tauValues (vplist-waarden in volgorde van de vplist) en de idxExpmt-waarden (volgorde van tauValues met betrekking tot de tijd) in nmrproc.com (aanvullende figuur 10).
   8. Gebruik > /nmrproc.com om de ruwe gegevens van alle acht 2D-spectra te verwerken.
   9. Gebruik > nmrDraw om de spectra te tekenen.
      1. Gebruik het referentiespectrum (eerste invoer in vplist) voor deze stappen. Schakel over naar dat spectrum door de z-dimensie te wijzigen in één (linkerbovenhoek). Pas het contourniveau aan met behulp van de + en - naast de Factor-knop . Teken het spectrum opnieuw met de knop Tekenen.
      2. Gebruik een contourniveau waar alle signalen van belang kunnen worden herkend met slechts een paar signalen die afkomstig zijn van de ruis (het contourniveau bevindt zich aan de rand van het ruisniveau) (aanvullende figuur 11).
   10. Corrigeer de spectrumfase, type v voor verticale 1D-signaalprojectie en h voor horizontale 1D-signaalprojectie. Pas de fase aan met P0 en P1 (aanvullende afbeelding 11), onthoud het faseverschil en corrigeer de fase in de nmrproc.com (aanvullende afbeelding 10).
       OPMERKING: Als het spectrum wordt omgedraaid in de ¹⁵N-dimensie, verwijder dan de -neg in de regel: | nmrPipe -fn FT -neg \ (aanvullende figuur 10).
   11. Sluit nmrDraw en verwerk opnieuw met > nmrproc.com. Voor Peak picking (nadat het spectrum correct is gefaseerd en het referentiespectrum wordt weergegeven met een contourniveau waarop alle pieken aanwezig zijn), typt u K (shift + k), drukt u op Detect en klikt u op Opslaan. (Aanvullende figuur 11).
   12. Kopieer een pieklijst naar de werkdirectory en verander -assName in ass.com in de naam van de pieklijst (aanvullende figuur 12).
       LET OP: Een voorbeeld van een piekenlijst in het juiste formaat is te vinden op https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences
       en bij de uitgebreide opslagplaats van de Biologische Magnetische Resonantie Bank (BMRB) (bmrbig102).
   13. Voer > ./ass.com uit om de spectra toe te wijzen. Controleer de opdracht die het script voorstelt voor de verschillende pieken. Gebruik de linkermuisknop om pieken toe te wijzen en de rechtermuisknop om pieken ongedaan te maken. Gebruik de knop Volgende om naar het volgende aminozuur te gaan en Vorige om naar het vorige aminozuur te gaan (aanvullende afbeelding 13).
       OPMERKING: Het contourniveau kan worden gewijzigd met + en - in de rechterbovenhoek. Gebruik de knop Tekenen om het spectrum opnieuw te tekenen met het nieuwe contourniveau (aanvullende afbeelding 13).
   14. Klik na het voltooien van de opdracht op Opslaan en vervolgens nogmaals op Opslaan . Klik daarna op Afsluiten, Annuleren en Afsluiten (aanvullende afbeelding 13).
   15. Voer > python3-NoneDeleter.py uit om relax.tab te maken, die alleen informatie over toegewezen pieken bevat.
   16. Voer > ./relax.com uit om het autofit.com script te genereren.
   17. Voer > ./autoFit.com uit om een Fourier-interpolatie uit te voeren en pseudo-verhoudingen van de verschillende vertragingstijden voor elk aminozuur te genereren (axt.tab en nlin.tab worden gegenereerd).
   18. Voer > ./model.com uit om het modelExp.com script te genereren op basis van de gegevens in nlin.tab.
   19. Voer > /modelExp.com uit om de evolutiecurve van elk residu aan te passen aan een niet-lineair Least-Squares Optimization-model.
   20. Voer > bash summary.tcl -in relax.tab > t1.tab uit. Negeer een mogelijke foutmelding: GDB Let op: 21 ontbrekende waarden in het tabelbestand kunnen voorkomen.
   21. Kopieer t1.tab naar een nieuw gemaakte map R1R2.
2. Verwerk en analyseer het ¹⁵N R_1ρ experiment.
   1. Kopieer de bestanden in de gedownloade directory R1rho_processing naar de directory met de experimentele R_1ρ-gegevens (werkdirectory).
   2. Voer > chmod u+x *.com
   3. Voer > bruker uit om de NMRPipe Conversion Utility te openen en het fid.com-bestand te genereren. Zie ook de verwerking van de ^{spectra van 15}N R₁ .
   4. Voer > ./fid.com uit
   5. Voer > ./split.com uit om de pseudo-3D-gegevens op te splitsen in acht 2D-bestanden.
   6. Voer > ./nmrproc.com uit (Bewerk de tauValues [vplist-waarden] en de idxExpmt vooraf) om de ruwe gegevens van alle acht 2D-spectra te verwerken (aanvullende figuur 10).
   7. Voer > nmrDraw uit om de spectra te tekenen en de pieken te kiezen. Gebruik het referentiespectrum (eerste invoer in vplist) voor deze stappen. Volg dezelfde procedure als voor het experiment ¹⁵N R₁ .
   8. Kopieer een pieklijst naar de werkdirectory en verander -assName in ass.com in de naam van de pieklijst (aanvullende figuur 12).
   9. Voer > ./ass.com uit en volg dezelfde procedure als voor het ¹⁵N R₁ experiment.
   10. Voer > python3-NoneDeleter.py uit om relax.tab te maken, die alleen informatie over toegewezen pieken bevat.
   11. Voer > ./relax.com uit
   12. Voer > ./autoFit.com uit
   13. Voer > ./model.com uit
   14. Voer > ./modelExp.com uit
   15. Voer > bash summary.tcl -in relax.tab uit > t1rho. tab. Mogelijke foutmelding negeren: GDB Let op: 21 ontbrekende waarden in het tabelbestand kunnen voorkomen.
   16. Kopieer de volgende kop in het bestand t1rho.tab (de waarden kunnen worden verkregen uit het fid.com-bestand) (aanvullende figuur 14):
       OPMERKING 600MHz voor T1rho
       OPMERKING -yOBS = 60.818 (zet hier de waarde gevonden in fid.com)
       OPMERKING -yCAR = 119,06 (zet hier de waarde gevonden in fid.com)
   17. Voer > ./extract_PPM.com uit om een tabel te genereren met de naam fusionOffset.tab die de offset van de piekfrequentie van ¹⁵N bevat ten opzichte van de draaggolffrequentie (die nodig is om de hoek θ te berekenen voor de extractie van R_2-gegevens uit de R₁ - en R_1ρ-gegevens ).
3. Vat de ontspanningsgegevens samen.
   1. Kopieer de t1rho.tab en de fusionOffset.tab naar de directory R1R2.
   2. Kopieer het script crtR1p.tcl in de directory R1R2, pas de spectrometerfrequentie en het spin-lock-vermogen aan en voer bash crtR1p.tcl uit | sort -n > R1R2.tab. (Aanvullende figuur 15). R1R2.tab bevat de gemonteerde R_1ρ snelheidsconstanten, theta-hoek, R 2-snelheidsconstanten en R 1-snelheidsconstanten.
4. Verwerk en analyseer het hetNOE-experiment.
   1. Kopieer de bestanden in de gedownloade directory NOE_processing naar de experimentele NOE-datadirectory (werkmap).
   2. Voer > chmod u+x *.com
   3. Voer > bruker uit om de NMRPipe Conversion Utility te openen en het fid.com bestand te genereren. Klik op Parameters lezen. Wijzig het aantal dimensies in twee als er drie dimensies zijn geteld en druk nogmaals op Parameters lezen . Druk vervolgens op Script wissen, Script bijwerken en Script opslaan.
   4. Voer > ./fid.com uit
   5. Voer > ./split.com uit (Een vplist met twee ingangen (0, 1) moet eerder worden aangemaakt)
   6. Voer > ./ft2.com uit
   7. Voer > nmrDraw uit om het spectrum te tekenen en kies de pieken in het referentiespectrum (z-dimensie = 1). Extraheer en onthoud de ruis (druk op T = shift + t). Fasecorrectie en piekpicking volgen dezelfde procedure als het ¹⁵N R_1-experiment .
   8. Kopieer een pieklijst naar de werkmap en verander -assName in ass.com in de naam van de pieklijst (aanvullende figuur 12)
   9. Voer > ./ass.com uit om de spectra toe te wijzen. Volg dezelfde procedure als beschreven voor het ¹⁵N R₁ experiment.
   10. Voer > python3 NoneDeleter.py uit om relax.tab te maken.
   11. Voer > ./script.com uit
   12. Voer > ./autoFit.com uit
   13. Verander de ruis in error_hetnoe.tcl.
   14. Voer > bash uit error_hetnoe.tcl |sort -n > hetNOE.tab

Resultaten

Hieronder vindt u enkele voorbeeldige NMR-relaxatiegegevens die zijn vastgelegd op het vesiculaire SNARE-eiwit Synaptobrevin-2 (1-96), vaak VAMP2 (vesikel geassocieerd eiwit 2) genoemd. Voor het vastleggen van de NMR-gegevens gebruikten we een monster van 171 μM ¹⁵N Synaptobrevin-2 (1-96) (hierna Syb-2 genoemd) in een buffer van 50 mM MES (pH 6.0) met 150 mM NaCl, 0.1 mM TCEP en 1 mM EDTA. Alle experimentele gegevens werden geregistreerd bij 278,15 K met behulp van een volume van 250 μL gevuld in een NMR-monsterbuisje van 3 mm. Experimenten werden uitgevoerd met een Bruker 600 MHz AVANCE III HD-spectrometer uitgerust met een Bruker 5 mm QCI ¹H, ¹⁵N, ¹³C, ³¹P cryoprobe met viervoudige resonantie.

Figuur 3 toont de residuspecifieke ¹⁵N R₁ en R₂ relaxatiesnelheidsconstanten die passen bij de NMR-relaxatiecurven die zijn verkregen uit de NMR-relaxatie-experimenten. Op de y-as worden de respectievelijke relaxatiesnelheidsconstanten uitgezet voor de individuele residuen langs de eiwitsequentie (op de x-as). Ook worden ^{1 H-15}N heteronucleaire NOE-waarden (hetNOE) getoond die zijn geëxtraheerd uit de intensiteitsverhoudingen van de verzadigde en niet-verzadigings- (referentie) experimenten van de ^{1 H-15}N heteronucleaire NMR-meting.

Heteronucleaire NOE-gegevens en ¹⁵N R 2-snelheidsconstanten zijn gemakkelijker te interpreteren dan ¹⁵N R_1-gegevens. Daarom beginnen we met hen.

Heteronucleaire NOE:
Heteronucleaire {¹H}-¹⁵N NOE zijn gevoelig voor interne dynamiek op de snelle picoseconde tijdschaal (<100 ps, vanwege de afhankelijkheid van kruisontspanning) maar ook voor ps - ns dynamiek (vanwege de R₁ afhankelijkheid) en kunnen waarden aannemen die meestal tussen 0 en (iets minder dan) 1 liggen voor gevouwen eiwitten. Bij hogere velden zullen ze systematisch hoger zijn (maar altijd lager dan 1).

Ze beschrijven de interne flexibiliteit van het eiwit. Wanneer hetUNOE-waarden bij dezelfde veldsterktes worden vergeleken, geldt het volgende: Hoe kleiner de {¹H}-¹⁵N NOE, hoe dynamischer het respectieve residu is. Voor IDP's worden typisch kleine residu-specifieke {¹H}-¹⁵N NOE waargenomen, bijvoorbeeld in de orde van grootte van 0,5 en kleiner bij 600 MHz. Negatieve {¹H}-¹⁵N NOE worden echter ook gevonden voor IDP's, zelfs tot -2 bij 500 MHz. Voor monomere Syb-2 wordt {¹H}-¹⁵N NOE gemeten in een bereik van 600 MHz tussen -0,5 voor de N-terminus en 0,5 voor het C-terminale linkerdomein. De waarden nemen geleidelijk toe van het N- naar het C-eindpunt, wat wijst op een geleidelijk afnemende flexibiliteit/toenemende stijfheid (figuur 3C).

¹⁵N R₂ snelheidsconstanten
¹⁵ okt.N R 2-snelheidsconstanten zijn gevoelig voor ps-ns-dynamieken die de oriëntatie van de N-H-bindingsvector moduleren door het algehele tuimelen van het eiwit, de beweging van de peptidevlakken en de torsie van de dihedrale hoeken van de ruggengraat. Anders dan de {¹H}-¹⁵N NOE-waarden en R_1, worden de ¹⁵N R 2-snelheidsconstanten gedomineerd door de J(0) spectrale dichtheid die geassocieerd is met het algehele (rotatie) tuimelen van het eiwit. Daarom worden voor bolvormige gevouwen eiwitten de ¹⁵N R 2-snelheidsconstanten in grootte geschaald op basis van de totale tuimelen en de grootte van het eiwit. Voor echte IDP's kan geen globale rotatiecorrelatietijd worden toegewezen. Toch kan een ketenlengte-afhankelijke langzame correlatietijd worden vastgesteld⁸⁴, zoals verwacht voor polymeren, maar residu-specifieke interne dynamica heeft een grotere impact op de ¹⁵N R₂ snelheidsconstanten. Binnen hetzelfde eiwit maken ¹⁵N R 2-snelheidsconstanten het mogelijk om structuren te onderscheiden van niet-gestructureerde regio's met verschillende interne residu-specifieke mobiliteit. Hoe kleiner de waargenomen snelheidsconstante ^{van 15}N R₂, des te mobieler is het respectieve residu. Hoge snelheidsconstanten van ¹⁵N R₂ zijn kenmerkend voor secundaire structuurelementen, zoals α-helices of β-strengen. Lage R 2-relaxatiesnelheidsconstanten zijn kenmerkend voor lus- en intrinsiek ongeordende regio's. Voor monomere Syb-2 (1-96) zien we over het algemeen lage ¹⁵N R 2-snelheidsconstanten die consistent zijn met het intrinsiek ongeordende karakter ervan. De interne stijfheid neemt toe (de mobiliteit neemt af) van de N-terminus tot aan het C-terminale linkerdomein voordat deze afloopt naar de flexibele C-terminus (Figuur 3B).

¹⁵N R₁ snelheidsconstanten
De R 1-relaxatiesnelheden zijn gevoelig voor picoseconde (ps) en snellere nanoseconde (ns) dynamiek. Hun directe interpretatie van interne dynamiek is echter complexer dan de vorige. Er is een veld T₁ (R₁) minimum (maximum) wanneer T₁ wordt uitgezet als functie van de rotatiecorrelatie τ_R: T_1min bij τ_{R, min} = 1/ ω. Voor snel tuimelende moleculen met een τ_R < τ_{R, min}, bijv. kleine moleculen of kleine bolvormige eiwitten, duiden lagere R 1-snelheidsconstanten op een verhoogde dynamiek van de eiwitruggengraat (hetzelfde als voor R₂). In het geval van grotere eiwitten, met τ_R > τ_{R, min}, is het tegenovergestelde, en hogere R 1-relaxatiesnelheidsconstanten vertegenwoordigen een verhoogde dynamiek (tegengesteld aan R₂).

Figuur 3: NMR-relaxatiegegevens. Gegevens werden geregistreerd en geëvalueerd volgens het hierboven beschreven protocol en de workflow. (A) Residuspecifieke ¹⁵N R₁ relaxatiesnelheidsconstanten langs de eiwitruggengraat van Syb2 (1-96). (B) ¹⁵N R₂ relaxatiesnelheidsconstanten, berekend op basis van R_1ρ en R₁ gegevens met behulp van formule (1). (C) hetNOE-overdrachtssnelheden langs de ruggengraat van Syb2 (1-96). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Inlezen van NMR-parameters. De interface van macro rpar wordt weergegeven. (A) Overzicht van alle parametersets. Het rode vak markeert de zoekbalk. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Dubbelklik om een parameterset te kiezen. (B) Overzicht van parameters die kunnen worden geïmporteerd in het huidige experiment. Opties om getprosol uit te voeren of om specifieke parameters van het huidige experiment te behouden, zijn gemarkeerd met rode vakken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 2: Positionering van de ¹H draagfrequentie voor een optimale wateronderdrukking. De interface van macro gs wordt weergegeven. Terwijl het experiment wordt herhaald, is het mogelijk om verschillende parameters van het experiment te wijzigen. De marker kan hier worden gebruikt om de gekozen parameter tijdens de acquisitie te wijzigen. Als u boven de markering klikt, wordt de parameter verhoogd met de waarde die is opgegeven onder "gevoeligheid". De gevoeligheidsschakelaar kan worden gebruikt om de stapgrootte van de markering aan te passen. Aan de rechterkant is de live FID zichtbaar. Voor kalibratie van de O1 is het doel om het FID-gebied gemarkeerd met een rood vak te minimaliseren, aangezien de FID meestal wordt gedomineerd door het watersignaal. De verkleining van het FID-gebied gaat hand in hand met een verminderd watersignaal en een verbeterde wateronderdrukking. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Een nadere beschouwing van de ^{1 H-15}N HSQC-pulssequentie en de acquisitieparameters ervan. (A) Pulssequentieparameters van het ^{1 H-15}N HSQC-experiment HSQCFPF3GPPHWG. Klik op "E" om het venster van de pulsprogramma-editor te openen in B. (B) Pulse-programma-editor van het ^{1 H-15}N HSQC-experiment HSQCFPF3GPPHWG. De becommentarieerde lijn (lijn 91) met een ¹⁵N 90° puls toont de originele lijn voor een ^{1 H-15}N HSQC experiment. In lijn 92 wordt de ¹⁵N 90° puls veranderd in een ¹⁵N 180° puls. Deze verandering maakt van het ^{1 H-15}N HSQC-experiment een kalibratiepulsprogramma voor de 90° ¹⁵N harde pulskalibratie. Als u pulssequenties wilt bewerken, slaat u de sequentie eerst onder een nieuwe naam op. Gebruik de volgende werkstroom: Klik op Bestand, Opslaan als, voer de nieuwe naam in, klik op OK en klik op PULPROG instellen op de gegevensset. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Instellen van de gradiënten. De interface van de gpnam-macro om gradiëntvormen, lengtes en sterktes te wijzigen, wordt weergegeven. Om de gebruikte pulssequentieparameterinterface te openen, moeten alle gradiëntvormen GPNAM worden ingevoerd. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Instellen van de versoepelingsvertragingen. Interface van de vplist-macro (identiek aan de vclist-macro). (A) Interface om een vplist te kiezen. Door op de drie puntjes te klikken, opent interface B. (B) Interface om een vplist te kiezen door DoubleClick, of een nieuwe lijst te maken door te klikken op Bestand, en Nieuw. (C) De interface wordt geopend door een nieuwe lijst te maken of een bestaande lijst te bewerken. De lijst kan worden opgeslagen door op Bestand en Opslaan te klikken. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Pulssequentieparameters van het 15N R1ρ-experiment. (A-D) Alle essentiële parameters die in het protocol moeten worden gewijzigd, zijn gemarkeerd met rode vakjes en de bijbehorende stappen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 7: Interface van de shapetool-macro . Een I-BURP2 (gebruikt in de experimenten) wordt geopend als een vormpuls. (A) Parameters van de geselecteerde vormpuls. Door op de met een rood vak gemarkeerde knop NMR-simulatie starten te klikken, worden de simulatieparametervensters geopend met de simulatieparameters Gevormde pulslengte [μs] (= 2000 μs) en de Rotatiehoek [°] (= 180°). Als u op de knop Start NMR-SIM klikt, wordt het (B)-simulatievenster geopend, dat de inversiebandbreedte van de I-BURP2-puls toont. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Interface van de macroberekening. (A) Invoervenster voor de pulslengte van de puls waarvan het vermogen moet worden berekend. (B) Invoervenster van de referentiepuls (meestal de 90° harde puls). (C) Het resultaatvenster toont het verschil in pulssterkte in dB tussen een puls met de nieuwe pulslengte en een puls met de referentiepulslengte. Let op: Dit verschil is alleen geldig als beide pulslengtes overeenkomen met dezelfde puls wat betreft vorm en rotatiehoek. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 9: NMR-spectraverwerking: Interface van de NMRPipe-conversietool. Als u op Parameters lezen klikt, worden de parameters van het experiment automatisch gelezen. Het conversiescript wordt aan de rechterkant weergegeven. Alle parameters kunnen individueel worden ingesteld. Na het wijzigen van parameters met behulp van Clear Script, wordt het bijwerken van hetscript aanbevolen. Klik op Script opslaan om het script op te slaan onder fid.com, zoals rechts weergegeven. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 10: Het nmrproc.com bestand voor spectrale verwerking. De code die in het nmrproc.com bestand wordt gebruikt om de onbewerkte gegevens in NMRPipe-formaat te verwerken, wordt weergegeven. De invoer tauValues en de invoer idxExpmt moeten worden ingesteld voordat ze worden verwerkt. De tau-waarden komen overeen met de vplist-vermeldingen in ms voor het ¹⁵N R_{1ρ-experiment} (vclist-waarden herberekend in ms voor het ¹⁵N R_1-experiment ). Wat de duur van hun ontspanningsvertraging betreft, komen de idxExpmt-vermeldingen overeen met de volgorde van de vplist-vermeldingen (vclist-vermeldingen voor het 15N R1-experiment). In het script zijn de posities om de fase van het spectrum te veranderen gemarkeerd met rode vakken. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 11: weergave van NMR-spectra en piekpicking. Een overzicht van nmrDraw met een open spectrum wordt getoond. Gebruik de + en - om de factor te wijzigen, wat gepaard gaat met een verandering in het contourniveau. Het veranderen van de Z-dimensie maakt het mogelijk om te schakelen tussen het HSQC-experiment met verschillende ontspanningsvertragingen. Gebruik Draw om het spectrum opnieuw te tekenen met de gewijzigde parameters. De P0-schuifregelaar en P1-schuifregelaar maken veranderingen in de fase van het spectrum mogelijk. Deze fasewijzigingen worden niet opgeslagen in de verwerkte gegevens; De faseverandering moet handmatig in het nmrproc.com-bestand worden ingevoerd en het nmrproc.com-bestand moet opnieuw worden uitgevoerd. Met de macro Piekdetectie kunt u de spectrumpieken op het ingestelde contourniveau kiezen. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 12: Semi-geautomatiseerde NMR-piektoewijzing met NMRDraw. De code van het ass.com bestand wordt weergegeven en moet worden uitgevoerd om de toewijzing van het NMR-signaal te starten. Verander -assName in de pieklijst van gegenereerde interesses. Deze pieklijst moet hetzelfde formaat hebben als de bijgevoegde pieklijst ass.syb2.hn_1200.tab in de map piekenlijst (in de zip-map die is gedownload op https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences). Het rode cijfer verwijst naar de betreffende stap in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 13: Visuele NMR-piek en toewijzingsinspectie. De interface van de opdrachtmacro wordt geopend door ass.com uit te voeren. Gebruik de linkermuisknop om pieken toe te wijzen en de rechtermuisknop om pieken ongedaan te maken. Gebruik Next om naar het volgende aminozuur te gaan en Prev om naar het vorige aminozuur te gaan. Met + en - kan het contourniveau worden gewijzigd met behulp van Draw, waarmee het spectrum opnieuw wordt getekend. Met behulp van de werkstroom: Afsluiten, Opslaan en Afsluiten slaat de opdracht op en beëindigt het programma. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 14: Extractie van de ¹⁵N R₂ snelheidsconstanten uit R_1ρ en R₁ gegevens. Stap 1. De inhoud van het bestand t1rho.tab wordt weergegeven. Een code gemarkeerd met een rood vak moet worden toegevoegd voordat de R_2-tarieven worden berekend op basis van de R_1ρ-tarieven . Het rode cijfer verwijst naar de betreffende stap in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 15: Extractie van de ¹⁵N R₂ snelheidsconstanten uit R_1ρ en R₁ gegevens. Stap 2. De inhoud van het bestand crtR1p.tcl wordt weergegeven. Alvorens uit te voeren, moeten de vermeldingen in het rode vak worden gewijzigd zoals beschreven in het protocol. De rode cijfers verwijzen naar de respectievelijke stappen in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschreef de opzet van NMR ¹⁵N relaxatie-experimenten door Lakomek et ^al.69 en Stief et ^al.70. We hebben ons gericht op NMR-pulssequenties met behulp van een gevoeligheidsverbeterd HSQC-detectieschema. De ^{experimenten met 15}N R₁ en R_1ρ worden uitgevoerd zoals in detail beschreven door Stief et al.70, en het hetNOE-experiment wordt beschreven door Lakomek et ^al.69.

Bij het opzetten van de NMR-relaxatie-experimenten is de ¹⁵N R_1ρ de meest kritische, omdat het kiezen van een te lange maximale relaxatieperiode of een te hoge RF-amplitude van de spin-lock de sonde kan beschadigen. Voor de relaxatieperiode is het wenselijk om de volledige vervalcurve gelijkmatig van 100% intensiteit tot 25% intensiteit (vergeleken met het referentie-experiment) te bemonsteren. Voor langzaam ontspannende eiwitten, zoals IDP's, met een lange ¹⁵N T₂ keer, zal het vaak niet betaalbaar zijn om de vervalcurve volledig te bemonsteren, omdat de krachtafzetting in de sonde moet worden beperkt.

Voor de ¹⁵N radiofrequentie (RF) amplitude geldt: theoretisch geldt: hoe hoger de RF-amplitude, ν_spin-lock, hoe beter, omdat meer uitwisselingsprocessen kunnen worden geheroriënteerd. Als vuistregel geldt dat uitwisselingsprocessen die langzamer zijn dan 1 / (2π ν_spin-lock ) opnieuw kunnen worden gefocust. Er zijn echter beperkingen voor RF-vermogen van toepassing. In onze hand zouden we bijvoorbeeld een maximale spin-lock-periode van 65 ms niet overschrijden wanneer een RF-amplitude van 2 kHz wordt toegepast om aan de veilige kant te blijven. Tegelijkertijd moet de spin-lock RF-amplitude bij een 600 MHz-spectrometer hoger zijn dan 1 kHz, bijvoorbeeld 1,4 kHz bij 600 MHz, wat voldoende is gebleken voor het kleine bolvormige eiwit gb3⁶⁹. Om de spectrale breedtes te dekken en off-resonantie-effecten bij hogere veldsterktes te voorkomen, moet de overeenkomstige RF-amplitude meeschalen met het magnetische veld, bijvoorbeeld 1,5 keer hoger bij 900 MHz (ν_spin-lock  2 kHz). Het moet echter binnen de beperkingen van de sonde blijven. (Raadpleeg de lokale lijst met beperkingen van het spectrometervermogen en neem contact op met uw NMR-faciliteitsmanager voor advies.)

Voor de keuze van de afstand tussen het referentie-experiment (verkorte vertraging) en de langste vertragingsperiode (bepaald door de hierboven besproken factoren), geven we de voorkeur aan een gelijke afstand tussen de datapunten van de ontspanningsvertraging en kiezen we een aantal van 8 (indien de toegewezen meettijd en signaal-ruisverhouding dit toelaten). De eerste stap (en de volgende) wordt gedomineerd door de meest intense (en vaak langzaamst ontspannende) residuen. Daarom kunnen de NMR-signalen van verschillende residuen in de eiwitsequentie, afhankelijk van het dynamische bereik van het eiwit, al vervallen zijn na de gekozen maximale relaxatieperiode. Door vertragingspunten gelijkmatig uit elkaar te plaatsen, zorgen we ervoor dat de relaxatiecurves van de snel ontspannende residuen ook worden gedekt door een voldoende aantal datapunten die de relaxatiecurve bemonsteren.

Ook is een goede keuze van herstelvertraging essentieel om nauwkeurige ontspanningsgegevens te krijgen en langdurige schade aan de sonde te voorkomen. We kiezen voor een herstelvertraging van minimaal D1 = 2 s om eventuele schade aan de sonde te voorkomen. Voor nauwkeurige resultaten moet de longitudinale polarisatie van het eiwit ¹H en ¹⁵N ook voldoende tijd krijgen om terug te keren naar evenwicht of op zijn minst een stabiele, stabiele toestand. De ¹H T₁ varieert meestal tussen 1 s en 4 s bij 600 MHz voor een klein of middelgroot eiwit (tot 20 kDa); voor grotere eiwitten en hogere velden zal de ¹H T₁ verder toenemen. Voor het kleine bolvormige eiwit gb3 vonden we D1 = 3,5 s voldoende voor de ^{experimenten met 15}N R₁ en R_1ρ . Voor de kleine IDP Syb-2 die in dit protocol wordt gepresenteerd, hebben we onlangs aangetoond dat D1 = 2 s voldoende was⁷⁰.

De ¹⁵N hetNOE heeft de laagste gevoeligheid, aangezien de excitatie begint op ¹⁵N en er geen ^{1 H-15}N INEPT aan het begin van de pulssequentie wordt toegepast. Verder moeten de verzadigingsperiode van ¹uur en de herstelvertraging van ¹⁵N 5 keer ¹⁵N T₁ zijn om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. Terwijl voor de hier gepresenteerde IDP Syb-2 een verzadigings-/herstelvertraging van 5 s plus een extra D1-herstelvertraging van 2 s (in totaal 7 s) voldoende was, kan deze tijd voor grotere eiwitten en/of gedeutereerde eiwitten aanzienlijk langer zijn, bijvoorbeeld 10 s of langer. Als de kwalitatieve gegevens echter goed genoeg zijn, kan een lichte systematische verschuiving worden geaccepteerd. In dat geval kunnen al bij 3 keer ¹⁵N T₁ redelijke resultaten worden verkregen, aangezien 95% van de verzadiging wordt bereikt. In dat geval zullen de resulterende hetNOE-waarden een systematische offset naar hogere waarden vertonen.

In dit protocol werkten we met volledig geprotoneerd ¹⁵N Syb-2, wat het meest kostenefficiënt is. Deuteratie van de zijketen wordt aanbevolen om het aantal ontspanningspaden te verminderen en te werken met de meest geïsoleerde ^{1 H-15}N ruggengraat amide spinparen. Als we ^{echter 15}N²H Syb-2 en ¹⁵N syb-2 vergelijken, zien we slechts zeer weinig verschillen tussen gedeutereerde en volledig geprotoneerde monsters⁷⁰. Voor praktische doeleinden worden NMR-relaxatiegegevens vaak geregistreerd op de dubbel of drievoudig gelabelde monsters (¹⁵N¹³C of ²H¹⁵N¹³C). De besproken NMR-pulssequenties zijn in staat om de J-koppelingsevolutie tussen ¹³C met ¹H of ¹⁵N-kernen te heroriënteren. Het is duidelijk dat ook de ontspanningsroutes zullen toenemen wanneer ¹³C-etikettering wordt geïntroduceerd. In onze handen is de geïntroduceerde fout, als die er al is, echter om praktische redenen minder dan 5% en kan deze acceptabel zijn wanneer alleen kwalitatieve gegevens nodig zijn.

Bij het werken met eiwitten van verschillende grootte voor detectie, is er vaak de vraag of moet worden gekozen voor gevoeligheidsversterkte HSQC-gedetecteerde experimenten⁷⁰ of TROSY-gedetecteerde experimenten⁶⁹. Voor kleine eiwitten bieden de gevoeligheidsverbeterde HSQC-gedetecteerde NMR-experimenten een tweevoudige winst in signaal-ruisverhouding (op voorwaarde dat een goede wateronderdrukking kan worden verkregen). Voor grotere eiwitten zullen de TROSY-gedetecteerde experimenten het winnen. De break-even is ongeveer 20 kDa voor gevouwen eiwitten. Voor IDP's, waarvoor lage R 2-snelheidsconstanten kunnen worden verkregen die ruwweg lineair toenemen met toenemende ketenlengtes, kan het break-even worden verschoven naar hogere molecuulgewichten. Voor praktische doeleinden raden we aan om bij twijfel zowel de gevoeligheidsverhoogde HSQC-gedetecteerde als de TROSY-gedetecteerde experimenten uit te voeren. Kies vervolgens degene die in de eerste stap de beste signaal-ruisverhouding geeft.

De discussie over het al dan niet kiezen van de gevoeligheidsversterkte HSQC-gedetecteerde of TROSY-gedetecteerde experimenten is alleen van toepassing wanneer signaal-ruisverhouding het belangrijkste criterium is. Wanneer de kleinste lijndiktes en de hoogste resolutie nodig zijn, zal TROSY altijd winnen. TROSY biedt ook altijd de beste wateronderdrukking, omdat er minder protonpulsen en geen protonontkoppeling nodig zijn. We verwijzen naar het eerder gepubliceerde artikel⁶⁹ voor een uitgebreidere bespreking.

Nog een opmerking over de kwestie van de wateronderdrukking. Hoewel het instellen van de ontvangerversterking (rg) op 16 voldoende kan zijn op Bruker Avance NEO-consoles, is een ontvangerversterking in het bereik van 128-256 meestal wenselijk voor (oudere) Bruker Avance-consoles. De haalbare rg (bepaald door het Bruker-commando rga) wordt vaak verkregen uit de intensiteit van het restwatersignaal tot het ruisniveau. Een slechte wateronderdrukking zal altijd extra ruis in de spectra introduceren. Dus zelfs als een rg = 16 kan worden bereikt op een Bruker Avance NEO-console, kan het resterende watersignaal aanzienlijk bijdragen aan het ruisniveau. Daarom zou de signaal-ruisverhouding worden verlaagd. Daarom raden we aan om te streven naar een rg-niveau van 128-256. De gepresenteerde pulssequenties⁷⁰ zijn getest op 600 MHz en 1200 MHz. Beide veldsterktes werken met dezelfde gradiëntopstelling, zoals beschreven in de pulssequentie. We raden ze in ieder geval aan als een goed startpunt voor verdere optimalisatie.

Zoals vermeld in de inleiding, bestrijken de besproken NMR-relaxatie-experimenten alleen het tijdsbereik van picoseconde tot nanoseconde. Voor inzichten in de dynamiek van microseconden tot milliseconden verwijzen we naar relaxatiedispersie-experimenten, CPMG-experimenten, en een uitbreiding van de R_{1ρ-experimenten} met veranderende spin-lock-amplitudes (of draaggolffrequenties) worden gebruikt 44,46,58,59,60,61,85,86 . Dynamiek langzamer dan microseconden kan worden vastgelegd ¹⁵N CEST (chemische uitwisselingsverzadigingsoverdracht) NMR⁶², uitwisselingsspectroscopie (EXSY, milliseconden naar seconden) of RT (realtime) NMR (seconden naar uren)^63,64. Het PRE-effect (paramagnetische relaxatieverbetering) van paramagnetische sondes, evenals resterende dipolaire koppelingen (RDC's), kan worden gebruikt om het volledige bereik van ps tot ms-dynamiek 65,66,67,68 te beoordelen.

Al deze experimenten hebben alleen betrekking op de dynamiek van de ruggengraat. Om de dynamiek van de zijketen te onderzoeken, introduceerden Kay en collega's nog een overvloed aan NMR-experimenten, die informatie verstrekten over de dynamiek van de zijketen voor eiwitten tot 1 MDa ^2,87.

Om meer kwantitatief inzicht te krijgen in de dynamiek van de eiwitruggengraat, is een gecombineerde analyse van alle drie de NMR-parameters, ¹⁵N R₁, R₂ en hetNOE, noodzakelijk - soms met zelfs nog verdere parameters, zoals kruisgecorreleerde relaxatiesnelheidsconstanten. Er zijn verschillende geavanceerde analysemethoden ontwikkeld. De zogenaamde modelvrije benadering is op grote schaal toegepast in biomoleculaire NMR 43,88,89,90,91. Ook het in kaart brengen van spectrale dichtheid kan waardevolle inzichten opleveren 55,92,93. Hoewel dit krachtige analysemethoden zijn voor bolvormige eiwitten met een goed gedefinieerde rotatiecorrelatietijd, is hun toepasbaarheid beperkt voor IDP's. Een gevouwen domein is nodig om een rotatiecorrelatietijd te definiëren³⁹. Dit kan gedeeltelijk worden omzeild wanneer correlatiefunctie C(t) kan worden gemodelleerd door de som van exponentieel vervallende functies in het geval dat de verschillende betrokken tijdschalen goed kunnen worden gescheiden 23,31,84. Bij gebrek aan een goed gedefinieerde rotatiecorrelatietijd zijn alternatieve benaderingen met een verdeling van correlatietijden, bijvoorbeeld de IMPACT-analyse⁹⁴ of de DETECTOR-analyse ^95,96, een alternatief. Bovendien is een gecombineerde analyse van NMR-relaxatiegegevens en MD-simulaties ook veelbelovend voor IDP's⁹⁷; momenteel hebben we nog steeds te maken met bemonsterings- en krachtveldbeperkingen voor volledige atoomsimulaties van grotere IDP's^31,98.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bruker 600 MHz AVANCE III HD spectrometer	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	NMR-experimenten uitgevoerd