Methodenartikel

Een muismodel voor vasculaire cognitieve stoornissen en dementie op basis van naaldgeleide asymmetrische bilaterale stenose van de gemeenschappelijke halsslagader

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67092

⸱

22 november 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Pittsburgh, 2Geriatric Research Education and Clinical Center, VA Pittsburgh Healthcare System, 3School of Arts & Sciences, Washington University in St. Louis, 4Animal Imaging Center, University of Pittsburgh

In dit artikel

Samenvatting

De naaldmethode van asymmetrische bilaterale stenose van de gemeenschappelijke halsslagaderstenose wordt voorgesteld om een muismodel te creëren voor vasculaire cognitieve stoornissen en dementie. Het resulteert in resultaten op langere termijn in vergelijking met eerder gevestigde modellen en is compatibel met live MRI. Visuele weergave die de procedure demonstreert, biedt een leidraad voor het beheersen van de operatie.

Samenvatting

Vasculaire cognitieve stoornissen en dementie (VCID) zijn het gevolg van vasculair hersenletsel. Gezien de hoge incidentie van VCID, die naar verwachting zal blijven stijgen naarmate de bevolking ouder wordt, is het van cruciaal belang om een robuust diermodel voor de ziekte op te stellen. Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor het creëren van een muismodel van VCID dat is gebaseerd op asymmetrische bilaterale gemeenschappelijke stenose van de halsslagader, die menselijke chronische cerebrale hypoperfusie nabootst veroorzaakt door atherosclerose van de halsslagader.

In het kort worden gemeenschappelijke halsslagaders (CCA's) afgebonden aan naalden van verschillende diktes (32 G voor de rechter CCA en 34 G voor de linker CCA) met behulp van 7-0 zijden hechtingen, gevolgd door onmiddellijke verwijdering van de naald. De resterende hechtringen veroorzaken aanhoudende vermindering van de bloedstroom en langdurige cognitieve stoornissen geassocieerd met beschadiging van de witte stof, micro-infarcten en reactieve gliose, waardoor de pathogenese van VCID nauw wordt nagebootst. Belangrijk is dat in dit naaldmodel de klinische representaties niet na verloop van tijd terugkeren, wat zorgt voor betrouwbare cognitieve stoornissen op de lange termijn. Bovendien was het overlevingspercentage 24 weken na de operatie 81,6%, wat hoger is in vergelijking met de andere gevestigde modellen van VCID met een vergelijkbaar niveau van vermindering van de bloedstroom.

Bijkomende voordelen zijn onder meer lage materiaalkosten en compatibiliteit met MRI om hersenletsel bij levende dieren te monitoren, aangezien er geen metaal wordt geïmplanteerd. De belangrijkste uitdaging bij het gebruik van het naaldmodel van VCID is de vereiste voor het ontwikkelen van geavanceerde chirurgische vaardigheden, aangezien CCA's van muizen een diameter van minder dan 0,6 mm hebben en zeer kwetsbaar zijn. Hoogwaardige visuele weergave van de operatie zal onderzoekers dus helpen deze techniek onder de knie te krijgen en ons begrip van VCID te vergroten, wat mogelijk kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische modaliteiten om de verwoestende cognitieve achteruitgang die gepaard gaat met VCID te verminderen.

Inleiding

Vasculaire cognitieve stoornissen en dementie (VCID) is de tweede belangrijkste oorzaak van cognitieve achteruitgang. Ondanks de onmiskenbare vooruitgang die is geboekt in de richting van het begrijpen van de pathogenese van VCID's en de risicofactoren ervan, blijft het mechanisme van hoe neurovasculaire disfunctie bijdraagt aan de achteruitgang van het cognitieve vermogen vaag. Er zijn een aantal knaagdiermodellen van verschillende complexiteit opgesteld om cerebrale ischemie te induceren om de klinische representaties van menselijke VCID1 na te bootsen. Sommige van deze modellen zijn gebaseerd op het creëren van voorbijgaande cerebrale hypoperfusie; de meeste van hen worden echter gegenereerd door het induceren van chronische cerebrale hypoperfusie, het belangrijkste mechanisme dat leidt tot VCID bij menselijke patiënten2.

Chronische cerebrale hypoperfusie kan worden geïntroduceerd met behulp van bilaterale occlusie van de halsslagader (BCAO), die ernstige, maar vaak fatale gevolgen veroorzaakt, of bilaterale stenose van de halsslagader (BCAS). BCAS wordt meestal uitgevoerd met behulp van een van de volgende twee methoden: door identieke microspoelen rond beide CCA's te plaatsen, wat resulteert in symmetrische stenose3; of door het implanteren van een ameroïde constrictor en een microspoel rond respectievelijk de linker en rechter CCA's, waardoor geleidelijke occlusie en ~50% vermindering van de bloedstroom op de linker en rechter CCA's ontstaat, overeenkomstig4. De nadelen van beide methoden zijn een hoog sterftecijfer als de stenose te ernstig is of als de CCA is afgesloten en onverenigbaarheid met een MRI-scan van levende dieren vanwege de aanwezigheid van metaal in het lichaam. Er zijn ook enkele genetische muismodellen vastgesteld 1,5,6,7,8. Aanvullende opties zijn onder meer cerebrale autosomaal dominante arteriopathie met subcorticale infarcten en leuko-encefalopathie muismodellen 9,10. Desalniettemin bootst geen van de voorgestelde modellen het volledige scala aan ischemische schade na die zich voordoet bij menselijke patiënten, en daarom gaat de zoektocht naar bijgewerkte VCID-modellen door.

Dit artikel presenteert een nieuwe chirurgische methode voor het induceren van asymmetrische bilaterale stenose van de gemeenschappelijke halsslagaderstenose (ABCS) bij muizen, waarbij CCA-stenose wordt uitgevoerd met behulp van zijden hechtingen en wordt gecontroleerd door CCA's af te binden aan naalden met verschillende diameters, gevolgd door onmiddellijke verwijdering van de naald11. Als gevolg hiervan worden hechtringen met precieze diameters permanent op de CCA's achtergelaten om chronische stenose te garanderen. Het voordeel van het gebruik van ABCS ten opzichte van een symmetrische methode is dat matige hypoperfusie aan de rechterkant zorgt voor een betere overleving, terwijl een meer uitgesproken hypoperfusie aan de linkerkant zorgt voor neurologische en pathologische representaties op de lange termijn. Dit naaldmodel heeft verschillende voordelen ten opzichte van de traditionele BCAS-modellen11 , zoals aanhoudende resultaten, lagere mortaliteit, ultralage kosten, flexibiliteit en de mogelijkheid om speciale analytische benaderingen te gebruiken.

Om deze voordelen verder uit te werken: drie ligaties veroorzaken een fragment van CCA-stenose in plaats van focuspuntstenose, wat leidt tot aanhoudende hypoperfusie, beschadiging van de witte stof en cognitieve achteruitgang bij ~90% van de muizen. De mortaliteit van de naaldmuizen was ~17%, lager dan die van Hattori's ameroïde restrictor/microcoil model4, die op basis van onze ervaring ~30% mortaliteit heeft gedurende 16 weken. Elk BCAS-model kost doorgaans ongeveer $ 100 vanwege de dure microcoils of ameroïde begrenzers, terwijl het naaldmodel slechts ongeveer $ 1 per muis kost. Bovendien kan de dikte van de naalden worden aangepast afhankelijk van de onderzoeksspecifieke vereisten voor de bloedstroombeperking aan beide zijden. In de variatie die in dit artikel wordt gepresenteerd, bootst het naaldmodel de pathofysiologie na van ernstige halsslagaderstenose, veroorzaakt door unilaterale permanente stenose zonder occlusie, de meest voorkomende weergave van de ziekte in kliniek11. Verder zijn ameroïde restrictors en microcoils die in traditionele BCAS-modellen worden gebruikt, gemaakt van metaal, wat aanzienlijke artefacten kan veroorzaken als in vivo MRI wordt uitgevoerd, ook al wordt het metaal niet in de hersenen maar in de borstkas geïmplanteerd. Het kan moeilijk zijn om te voorspellen hoe de aanwezigheid van metaal de beeldvorming precies zou beïnvloeden.

Over het algemeen is in vivo MRI die wordt uitgevoerd na implantatie van een microspoel meestal eenvoudige anatomische beeldvorming, niet geschikt voor kwantitatieve analyse van meerdere beledigingen, wat zeer wenselijk is voor VCID-onderzoek. Het hier gepresenteerde naaldmodel daarentegen gebruikt alleen zijden hechtingen en is volledig compatibel met elke vorm van in vivo MRI. Dit is om twee redenen belangrijk: (1) MRI is extreem gevoelig voor kleine hersenlaesies, microbloedingen of oppervlakkige siderose12, en heeft dus de voorkeur boven de andere analysemethoden, zoals CT-scan (2) in vivo MRI verdient de voorkeur boven de ex vivo MRI, aangezien VCID-onderzoek ongetwijfeld baat kan hebben bij het volgen van de dynamiek van laesieprogressie/genezing, vooral als reactie op de voorgestelde nieuwe behandelingen. Bovendien kan functioneel (fMRI) worden uitgevoerd in het naaldmodel om kritische inzichten te verschaffen in de integriteit van neurovasculaire koppeling als reactie op cerebrale hypoperfusie. De mogelijkheid om in vivo MRI te gebruiken opent dus een weg voor een diepgaande analyse van de ingewikkelde correlatie tussen de grootte en de locatie van de laesies en de cognitieve functie, evenals neurovasculaire koppeling, vooral in farmacodynamische studies.

Protocol

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Pittsburgh en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Steriele technieken moeten worden gehandhaafd in alle overlevingsoperaties. Twaalf weken oude mannelijke C57BL/6J-muizen met een lichaamsgewicht van 25-30 g werden gebruikt in de gepresenteerde experimenten.

1. Voorbereiding van de materialen en werkruimte

  1. Bereid de naaldfragmenten voor (~4 mm lang; 32 G voor de rechter CCA en 34 G voor de linker CCA). Maak het scherpe uiteinde van de naalden iets bot door het scherpe uiteinde voorzichtig tegen een harde ondergrond te tikken en scheid de naalden voorzichtig van de plastic stukjes met behulp van een naaldhouder. Snijd 7-0 zijden hechtingen voor in stukken van 1-2 cm lang.
  2. Steriliseer chirurgische instrumenten, naaldfragmenten en hechtingen door middel van autoclaveren of een andere geschikte methode.

2. Uitvoeren van de operatie

  1. Weeg de muis en wek anesthesie op door de muis 2-3 minuten in een geventileerde kamer te plaatsen met 3% isofluraan in een mengsel van 25% O2 en 72% N2O.
  2. Plaats de muis (buikzijde naar boven) op een verwarmingskussen bedekt met een steriel chirurgisch laken om een constante lichaamstemperatuur (37 °C) te behouden en bevestig een gezichtsmasker voor ventilatie met 1% isofluraan in een mengsel van 25% O2 en 74% N2O. Zet de ledematen van de muis vast met plakband.
  3. Scheer de vacht in de nek met een elektrisch scheerapparaat. Maak het fijne haar schoon met plakband of een toetsenbordstofzuiger.
  4. Desinfecteer de operatieplaats met Betadine Solution (10% jodium). Ontjodium de huid met 70% ethanol. Herhaal de infectie 3x. Zorg ervoor dat het anesthesieniveau voldoende is door niet te reageren op een stevige teenbeknelling (pedaalreflex).
  5. Drapeer het operatiegebied. Maak vervolgens een verticale incisie in de middellijn langs de luchtpijp en scheid de bilaterale schildklieren met een microtang. Trek de huid en het weefsel weg met steriele kleine huidoprolmechanismen.
  6. Gebruik onder de microscoop een hoekig pincet om een van de CCA's voorzichtig bloot te leggen en bot te ontleden van de nervus vagus en de schede. Gebruik steriel water of met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om de incisieplaats nat te maken als de CCA de neiging heeft om aan de tang te blijven plakken. Plaats indien nodig een kleine plastic spuit onder de nek om de houding te ondersteunen.
    OPMERKING: Zorg er extra voor dat u de CCA niet scheurt.
  7. Rijg drie voorgesneden zijden hechtresten (maat 7-0) onder de CCA (1 mm uit elkaar) met een schuin pincet.
  8. Teken een zeer losse dubbele knoop rond de CCA op een van de hechtfragmenten.
    OPMERKING: Het bevochtigen van de operatieplaats en de hechtingen met steriel water of PBS kan helpen bij het leggen van een knoop.
  9. Plaats een stukje naald (32 G voor de rechter CCA en 34 G voor de linker CCA) evenwijdig aan de CCA, in de losse knoop (Figuur 1A). Draai de primaire knoop rond zowel de naald als de CCA voorzichtig aan totdat er geen bloedstroom meer wordt waargenomen en zet deze vast met een secundaire knoop. Trek de naald onmiddellijk naar buiten om de gedeeltelijke bloedstroom te herstellen en knip de uiteinden van de hechtdraad af.
    OPMERKING: De chirurg moet heel voorzichtig zijn met het trimmen van de hechtdraaduiteinden nadat de knopen zijn voltooid. Als u te dicht bij de knoop snijdt, kan de knoop losraken. Bovendien is het van cruciaal belang om de CCA te observeren na het verwijderen van de naald om er zeker van te zijn dat de bloedstroom stroomafwaarts van de knoop nog steeds mogelijk is. Als de CCA er erg bleek uitziet na het verwijderen van de naald, betekent dit dat de CCA te veel is samengedrukt.
  10. Herhaal stap 2.8-2.9 voor de 2een 3ehechtdraad op dezelfde CCA, ongeveer 1 mm uit elkaar (Figuur 1B).
  11. Herhaal stap 2.6-2.10 met de tegenovergestelde CCA met behulp van een naaldfragment van 32 G.
  12. Onderzoek zorgvuldig of beide CCA's efficiënt zijn afgebonden: controleer of alle drie de hechtdraden stevig op hun plaats zijn geknoopt, maar niet zo strak zijn dat ze de bloedstroom volledig blokkeren (controleer of de CCA's niet bleek zijn stroomafwaarts van de knopen). Controleer of de drie hechtbanden op elke CCA ongeveer 1 mm van elkaar verwijderd zijn.
  13. Sluit de huid met behulp van steriele monofilament hechtingen.
  14. Injecteer onmiddellijk na de operatie 100-150 μL ketoprofen (1 mg/ml bouillon; 5 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal om postoperatieve pijn te verlichten. Herhaal deze injectie 24 uur en 48 uur na de operatie.
  15. Plaats de muis op een homeotherme deken bij 37 °C voor continue monitoring gedurende 2 uur voordat u het dier terugbrengt naar de dierenfaciliteit.
    OPMERKING: Voor een schijnprocedure moeten de stappen 2.7-2.12 worden weggelaten.

3. Validatie van het model

OPMERKING: Hersenletsel werd geanalyseerd met in vivo MRI en verder geverifieerd met Luxol fast blue (LFB) kleuring en gedragstests.

  1. Beeldvorming van cerebrale bloedperfusie.
    1. Verdoof de muis met 1-1,5% isofluraan. Steriliseer de operatieplaats met Betadine Solution (10% jodium). Ontjodium vervolgens de huid met 70% ethanol.
    2. Zet de schedel van het dier vast in een stereotactisch frame. Maak een saggitale incisie in de hoofdhuid van het frontale naar het achterhoofdsbeen om de schedel bloot te leggen en maak het schedeloppervlak schoon met steriele zoutoplossing.
    3. Plaats een camera van een opgeladen apparaat 10 cm boven de schedel met behulp van een tweedimensionaal laserspikkelsysteem. Plaats een sondehouder over de plaats van de craniectomie en zet deze stevig vast.
    4. Maak bloedperfusiebeelden 5 minuten voor de operatie en onmiddellijk na het losmaken van de naald of 7, 14, 21, 28, 35 en 42 dagen na de operatie.
    5. Sluit de huid met behulp van steriele monofilament hechtingen. Injecteer 100-150 μL ketoprofen (1 mg/ml voorraad; 5 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal om postoperatieve pijn te verlichten. Herhaal deze injectie 24 uur en 48 uur.
  2. In vivo MRI
    1. Verdoof de muizen met 1-1,5% isofluraan, waarbij de ademhaling continu wordt gecontroleerd en de temperatuur op 37 °C wordt gehouden met warme lucht tijdens het verkrijgen van het beeld.
    2. Voer in vivo MRI uit met behulp van een 9.4T-scanner, een 86 mm Tx-spoel en een 4-kanaals hersenontvangerarray van de muis, met de bijbehorende software. Verkrijg na positionerings- en pilotscans T2-gewogen beelden (T2WI) met behulp van een Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement (RARE)-sequentie, met de volgende parameters: Echo Time/Repetition Time (TE/TR) = 40/4.000 ms, gemiddelden = 8.256 × 256 matrix, 16 plakjes met een plakdikte van 0,5 mm, een RARE-factor = 4 en een gezichtsveld (FOV) van 20 x 20 mm.
    3. Verzamel Diffusion Tensor Imaging (DTI)-gegevens met behulp van een echo planaire beeldvorming (EPI)-DTI-beeldvormingssequentie met dezelfde geometrie en parameters als de T2WI, met de volgende uitzonderingen: TR/TE = 2.300/22 ms, acquisitiematrix = 128 x 128, 2 segmenten, 5 A0-afbeeldingen en 30 niet-colineaire diffusiebeelden, Δ/δ = 10/3 ms en een b-waarde = 1.000 s/mm2.
    4. Analyseer DTI-gegevens met behulp van DSI Studio-software (http://dsistudio.labsolver.org/), op zoek naar verschillen in diffusie scalaire parameters (fractionele anisotropie (FA), gemiddelde diffusiviteit (MD), axiale diffusiviteit (AD) en radiale diffusiviteit (RD)). Teken interessegebieden (ROI's) voor het corpus callosum (CC), externe capsule (EC), interne capsule (IC), fimbria, anterieure commissuur (AC), cingulum (Cing), hippocampus (nijlpaard), cortex (C) en striatum (Str) van beide hemisferen.
  3. Luxol fast blue (LFB) kleuring
    1. Bereid hersensecties voor: fixeer de hersenen met 4% PFA gedurende 24 uur en dompel de hersenen vervolgens onder in 30% sucrose totdat de hersenen zinken. Veranker de hersenen in OCT-compound op droogijs. Snijd een 20 μm dikke coronale hersenplak op een glijdende microtoom. Bewaar hersenschijfjes in bewaaroplossing (30% glycerol/30% ethyleenglycol in PBS).
    2. Dompel hersendelen onder in LFB (0,1% alcoholoplossing), houd 's nachts op 56 °C en was met gedestilleerd water.
    3. Incubeer hersensecties in 0,05% lithiumcarbonaat en dehydrateer door middel van graduele alcoholen.
    4. Kleur de secties gedurende 5 minuten met 0,5% cresylviolet, gedifferentieerd met 70% ethanol.
    5. Monteer de bevlekte hersensecties met montagemedium.
  4. Cognitieve functiebeoordeling met een aangepaste Morris waterdoolhoftest
    1. Vul een ronde tank met water (25 °C, diepte 33 cm) en dompel een vierkant ~10 x 10 cm2 plexiglas platform 1,2 cm onder het waterniveau, 31 cm van de noord-, oost-, zuid- of westrand van het zwembad.
      OPMERKING: Dit platform moet gedurende de gehele testduur op dezelfde plaats blijven staan.
    2. Schakel een videocamera aan het plafond in. Plaats een muis in het aquarium (niet laten vallen op waterniveau), met het gezicht naar de muur en beginnend in het noordoosten, zuidoosten, zuidwesten of noordwesten. Laat de muis maximaal 90 seconden zwemmen om een ondergedompeld platform te vinden.
    3. Laat de muis 30 seconden op het ondergedompelde platform blijven als het platform wordt gevonden. Als het platform niet wordt gevonden, plaatst u de muis daar gedurende 30 seconden.
    4. Laat de muis 5 minuten rusten en herhaal de zwemproef (stappen 3.4.2 - 3.4.3) 2x.
    5. Droog de muis af met een doek en plaats hem terug in zijn kooi onder een verwarmingslamp.
    6. Herhaal elke dag drie zwemproeven gedurende 5 opeenvolgende dagen.
    7. Bereken aan de hand van videobeelden de latentie om te ontsnappen (hoe lang duurt het om het platform in elke proef te vinden).
    8. Verwijder op de laatste testdag het platform en noteer de tijd die de muis doorbrengt in het kwadrant, waar het platform zich eerder bevond.

Resultaten

Langdurige asymmetrische cerebrale hypoperfusie
De CCA-bloedstroom werd gemeten voor en onmiddellijk na het losmaken van de naald van de laatste (derde) ligatie, zoals eerder beschreven11. De bloedstroom was verminderd met ~70% in de linker CCA en ~50% in de rechter CCA. Cerebrale bloedperfusie werd dynamisch gecontroleerd met behulp van tweedimensionale laserspikkel. De operatie veroorzaakte cerebrale hypoperfusie in beide hemisferen, waarbij de linkerhersenhelft ernstiger werd aangetast (Figuur 2). Cerebrale hypoperfusie wordt gehandhaafd gedurende ten minste 24 weken na de operatie11.

Lagere sterfte
Het overlevingspercentage voor mannelijke muizen ouder dan 6 weken was 81,6% (Figuur 3); Muizen waren vatbaarder voor overlijden in de eerste week na de operatie.

In vivo MRI detectie van hersenletsel
T2-gewogen beelden toonden hypo- of hyperintense gebieden in de hippocampus (Hippo), externe capsule (EC), interne capsule (IC), corpus callosum (CC) en striatum (Str) bij muizen die een ABCS-operatie ondergingen, wat wijst op hersenletsel (Figuur 4A). Structurele schade werd waargenomen in de directioneel gecodeerde kleurenkaarten (DEC) van DTI van ABCS-muizen in vergelijking met de schijnvertoning (Figuur 4B).

Kwantitatieve analyses toonden aan dat ABCS-muizen een significant lagere fractionele anisotropie (FA) vertoonden in linker Hippo, IC, anterieure commissuur (AC), cingulum (Cg) en Fimbria (Fi) in vergelijking met schijnvertoning (P < 0,05 versus schijnvertoning), wat wijst op een compromis van de microstructuur van de witte stof in de linkerhersenhelft (paneel linksboven, figuur 4C). FA in de rechter Cg en Fi in ABCS-muizen waren ook verminderd (P < 0,05 versus schijnvertoning). FA in het linker IC en Fi waren significant lager dan die van het rechter in ABCS-muizen (P < 0,05, links versus rechts).

Evenzo werd een significant lagere axiale diffusiviteit (AD) vertoond in de linker EC, IC, Str en Fi bij ABCS-muizen in vergelijking met schijnvertoning, wat wijst op axonale beschadiging (paneel rechtsboven, figuur 4C (P < 0,05 versus schijnvertoning)). Alleen de linker Str vertoonde een gemiddelde diffusiviteitsvermindering (MD) bij ABCS-muizen in vergelijking met schijnvertoning (paneel linksonder, figuur 4C). Verschil in radiale diffusiviteit (RD) werd waargenomen in linker CC, Str en Fi bij ABCS-muizen (paneel rechtsonder, figuur 4C), wat wijst op ontsteking en verhoogde cellulariteit in deze regio's13.

Asymmetrisch hersenletsel in de twee hemisferen en schade in de witte stofgebieden in de linkerhersenhelft
Hersenletsel werd bovendien geanalyseerd met LFB-kleuring met behulp van de eerder beschreven procedure14 (Figuur 5). Beelden met een lager vermogen toonden lichtere blauwe kleuring in EC en Str, wat wijst op demyelinisatie in deze regio's. High-definition beelden toonden aan dat schijnmuizen goed georganiseerde en gemyeliniseerde axonen vertoonden met lineair georiënteerde oligodendrocyten in EC; axonen verdwenen echter en doordringende, blauw gekleurde cellen werden waargenomen in EC bij ABCS-muizen. Schijnmuizen vertoonden diepblauw gevlekte en goed georganiseerde vezelbundelstructuren in Str. Vezelbundels kleurden echter lichter en kleiner en hun integriteit werd aangetast; sommige vezelbundels werden gevacuoliseerd in ABCS-muizen. Vezelbundels waren vervormd en de interbundelmatrix was significant verdikt in AC bij ABCS-muizen. Samenvattend veroorzaakt ABCS-chirurgie axonale demyelinisatie en schade; Schade aan de witte stof komt voornamelijk voor in de linkerhersenhelft.

Leer- en geheugenstoornissen
De ABCS-operatie met de naald resulteerde in een aanzienlijke leerstoornis, zoals blijkt uit een langere tijd om een ondergedompeld platform te vinden (latentie om te ontsnappen) tijdens een Morris-waterdoolhoftest (Figuur 6). Deze handicap gold ten minste 24 weken na de operatie. Het geheugen werd ook aanzienlijk beïnvloed, zoals blijkt uit een verminderde tijd die in het doelkwadrant werd doorgebracht nadat het platform was verwijderd.

figure-results-1
Figuur 1: Stappen van naaldchirurgie om ABCS te creëren. (A) De linker CCA wordt blootgelegd en drie zijden hechtingen worden onder de CCA geregen. Op een van de hechtfragmenten wordt een losse knoop getekend en de naald wordt evenwijdig aan de CCA geplaatst. (B) Drie hechtringen zijn ongeveer 1 mm uit elkaar geplaatst. Afkortingen: ABCS = asymmetrische bilaterale gemeenschappelijke stenose van de halsslagader; CCA = gemeenschappelijke halsslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Persisterende asymmetrische cerebrale hypoperfusie in het ABCS-model van de naald. Dynamische monitoring van de bloedstroom in de hersenen na de operatie. Aanhoudende cerebrale hypoperfusie kan worden waargenomen in beide hemisferen, die aan de linkerkant dieper is. Zwarte sterretjes geven hypoperfusiegebieden aan. Afkorting: ABCS = asymmetrische bilaterale gemeenschappelijke stenose van de halsslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Overlevingspercentage na ABCS-operatie met naald. De operatie resulteerde in een overlevingspercentage van 81,6% gedurende 6 weken; Het overlijden trad voornamelijk op tijdens de eerste postoperatieve week. Afkorting: ABCS = asymmetrische bilaterale gemeenschappelijke stenose van de halsslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: In vivo MRI-detectie van hersenletsel in het naald-ABCS-model. (A) Representatieve T2-gewogen beelden van schijn- en ABCS-muizen. Rode pijlpunten geven hypo- of hyperintense gebieden aan. (B) Representatieve DEC-kaart van in vivo DTI 2 weken na naald ABCS-operatie. De kleuren geven de richting van de hoofdas van de diffusieas aan (rood = links/rechts, groen = dorsaal/ventrale en blauw = rostraal/caudaal). (C) Kwantitatieve analyse bij schijn- en ABCS-muizen (eenrichtings-ANOVA). * staat voor p < 0,05 ABCS versus schijnvertoning (linkerhersenhelft). # staat voor p < 0,05 links versus rechts. & vertegenwoordigt p < 0,05 ABCS versus schijnvertoning (rechterhersenhelft). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM; n = 4 voor schijnvertoning, n = 4 voor ABCS-muizen. Afkortingen: ABCS = asymmetrische bilaterale gemeenschappelijke stenose van de halsslagader; Nijlpaard = hippocampus; EC = uitwendige capsule; IC = inwendige capsule; CC = corpus callosum; Str = striatum; DEC = directioneel gecodeerde kleur; DTI = diffusietensor beeldvorming; FA = fractionele anisotropie; MD = gemiddelde diffusie; AD = axiale diffusie; RD = radiale diffusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve LFB-kleuring van hersenplakjes 6 weken na de ABCS-operatie van de naald. (A) Beelden met een laag vermogen van LFB-kleuring van schijn- en ABCS-muizen. Witte vakken geven de locatie aan die overeenkomt met afbeeldingen met een hogere definitie in B. (B) High-definition beelden (200x) van EC (bovenpaneel) en Str-locaties 1 en 2 (middenpaneel) en AC (onderpaneel). Zwarte pijlpunt toont een normale vezelbundel. Blauwe pijlpunten wijzen naar een beschadigde vezelbundel. Rode pijlpunten duiden gevacuoliseerde vezels aan. Schaalbalken = 1 mm (A), 100 μm (B). Afkortingen: ABCS = asymmetrische bilaterale gemeenschappelijke stenose van de halsslagader; LFB = Luxol snel blauw; EC = uitwendige capsule; Str = striatum; AC = anterieure commissuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Ruimtelijk leren en geheugenbeoordeling in waterdoolhoftest. Ruimtelijk leren werd beoordeeld (A) 3 weken en (B) 24 weken na de operatie door de tijd te meten om het platform op opeenvolgende dagen te lokaliseren. Het geheugen werd beoordeeld (C) 4 weken en (D) 24 weken na de operatie door de tijd te meten die in het doelkwadrant werd doorgebracht nadat het platform was verwijderd. De operatie resulteerde in langdurige verstoring van cognitieve functies. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, *p < 0,05 naald versus schijnvertoning; **p < 0,01 versus schijnvertoning; in twee richtingen ANOVA en Neuman-Keuls post hoc. n = 10 voor schijnvertoning, n = 10 voor naaldgroepen. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Weng et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende methoden van VCID-inductie beschreven met behulp van asymmetrische CCA-stenose, en ze delen allemaal een belangrijke en kritieke chirurgische stap-isolatie van de CCA van de nervus vagus en de schede en blootstelling van de CCA om deze toegankelijk te maken voor stenose. Hoewel we visuele begeleiding van goede kwaliteit bieden over de chirurgische blootstelling van CCA's voorafgaand aan ligatie, willen we onderzoekers ook opdragen om aanvullende video's over CCA-isolatie te bekijken die online beschikbaar zijn in de context van andere muizen- en rattenoperaties 15,16,17,18. Er moet extra op worden gelet dat de CCA niet wordt samengedrukt of gescheurd, aangezien dit de belangrijkste slagader is die de hersenen van zuurstofrijk bloed voorziet.

Een andere cruciale stap van de operatie die onder de knie moet worden gekregen, is het trekken van een losse knoop en deze verder aanspannen rond de CCA met de naald, gevolgd door het verwijderen van de naald. We raden ten zeerste aan om deze stap alleen met de naald te oefenen voordat u deze probeert uit te voeren bij een verdoofde muis. Dit maakt het mogelijk om delicate tangbewegingen onder de knie te krijgen en manipulaties met de hechtingen te perfectioneren zonder het risico te lopen de muis te bezeren. De knoop moet goed worden vastgezet zonder uit elkaar te vallen tijdens het verwijderen van de naald, strak genoeg om de naald vast te houden, maar los genoeg om de naald met een tang van de geknoopte hechtdraad te kunnen schuiven.

Belangrijk is dat we ontdekten dat een enkele ligatie van elke CCA niet voldoende is om de bloedstroom betrouwbaar te verminderen en om cerebrale hypoperfusie op lange termijn te behouden11. Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn dat een enkele ligatie puntstenose veroorzaakt, die waarschijnlijk een lokale drukverhoging veroorzaakt, wat leidt tot een verhoogde snelheid van de bloedstroom om de vermindering van de bloedstroom te compenseren. We raden aan om drie ligaties ~1 mm uit elkaar uit te voeren om een fragment van stenose te creëren. Een bijkomend voordeel van het gebruik van drie ligaties is dat de knopen dienen als rijsmechanisme voor het geval een van de knopen losraakt tijdens het extra verwijderen van de naald. Inderdaad, een fragment van stenose veroorzaakt door drie afzonderlijke ligaties van dezelfde CCA verhoogt de modelconsistentie, wat leidt tot aanhoudende cerebrale hypoperfusie bij ongeveer 90% van de muizen. Bovendien bootst fragmentstenose CCA-stenose veroorzaakt door atherosclerose bij menselijke patiënten nauwkeuriger na in vergelijking met focuspuntstenose, waardoor de klinische relevantie van het naaldmodel toeneemt.

We raden ten zeerste aan om de naald onmiddellijk te verwijderen na het voltooien van de eerste ligatie om ervoor te zorgen dat de CCA-bloedstroom gedeeltelijk is hersteld, en pas daarna achtereenvolgens over te gaan op de tweede en derde ligatie. Het wordt niet aanbevolen om alle drie de ligaties af te werken met de naald in alle drie de knopen, omdat dit de tijd van volledige obstructie van de bloedstroom aanzienlijk zou verlengen. Meestal raden we niet meer dan 1 minuut volledige CCA-occlusie aan voordat de naald wordt verwijderd. Deze aanbeveling is gebaseerd op het rapport dat muizen geen tekenen van functionele beperkingen vertoonden na 3 sessies van 60 s occlusie van beide CCA's19. In ons model werkt de chirurg aan één CCA tegelijk, wat vergevingsgezinder is dan de occlusie van beide CCA's tegelijk, maar we raden toch aan om deze tijdlijn te volgen om artefacten uit te sluiten die worden veroorzaakt door langdurige occlusie in plaats van chronische hypoperfusie aan beide kanten.

Hoewel dit naaldmodel het mogelijk maakt om de diameters van de geknoopte hechtingen aan te passen door naalden met verschillende diameters te gebruiken (op basis van lichaamsgewicht of de specifieke vereisten van bloedstroombeperking), hadden muizen in onze ervaring hogere overlevingskansen wanneer hypoperfusie in de rechterhersenhelft matig was in plaats van ernstig. Aan de andere kant veroorzaakte aanhoudende ernstige hypoperfusie in de linkerhersenhelft pathologische en neurologische resultaten op de lange termijn. Daarom raden we aan om een asymmetrische ligatie uit te voeren door een dikkere naald te gebruiken om de rechter CCA te ligate (wat matige hypoperfusie in de rechterhersenhelft veroorzaakt) en een dunnere naald om de linker CCA te ligate (wat ernstige hypoperfusie in de linkerhersenhelft veroorzaakt).

Ten slotte moeten onderzoekers zich ervan bewust zijn dat verschillende muizenstammen verschillende resultaten kunnen opleveren van de ischemische of traumatische belediging, voornamelijk als gevolg van verschillen in cerebrale vasculaire anatomie20,21. Aangezien veel studies tegenwoordig de generatie van nieuwe transgene muizen vereisen, moet de achtergrondstam zorgvuldig worden overwogen als BCAO-chirurgie in enig stadium van het experimentele ontwerp nodig is. Zowel C57BL/6- als SV129-stammen zijn bijvoorbeeld een veel voorkomende achtergrondkeuze voor het genereren van transgene dieren voor onderzoek naar beroertes21. Het is echter goed gedocumenteerd dat C57BL/6-muizen veel gevoeliger zijn voor ischemie in vergelijking met de andere geteste stammen, waaronder SV129-muizen20,21. Er zijn zelfs aanwijzingen dat het effect van de muizenstam zelfs belangrijker kan zijn dan het effect van de techniek die wordt gebruikt om VCID21 te induceren. Het wordt dus van cruciaal belang om de achtergronden van de muis consistent te houden tijdens alle experimenten waarbij ischemisch hersenletsel bij knaagdieren wordt induceerd. Belangrijk is dat onderzoekers de efficiëntie van de operatie-uitkomst bij levende dieren kunnen evalueren met behulp van neurologische scoresystemen22 met een score van 0,5 als inclusiecriterium. Hersenletsel kan verder worden bevestigd met behulp van Iba1-immunokleuring, die zeer gevoelig is voor hersenbeschadiging, zelfs na een lichte focale beschadiging.

Samenvattend is het belangrijk om te onthouden dat VCI een complexe term is die vele klinische representaties en oorzaken onder dezelfde paraplu verenigt. Daarom moeten onderzoekers altijd in gedachten houden welk model moet worden geselecteerd op basis van de VCI-aspecten die ze willen bestuderen. Er kan nooit één universeel model zijn voor alle VCI-manifestaties. CCA-stenosemodellen beperken de bloedstroom uit de belangrijkste slagaders ernstig, waardoor patiënten met arteriosclerotische stenose worden nagebootst. De nieuwe naaldmethode voor het creëren van asymmetrische BCAS bij C57BL/6J-muizen is een betrouwbare methode om VCID na te bootsen die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de eerder gerapporteerde methoden (met name hoge flexibiliteit, lage mortaliteit, langetermijnresultaten, minimale kosten en live MRI-monitoring). Vanwege de voordelen ten opzichte van de andere modellen kan het worden gebruikt om onze kennis van VCID-progressie verder te vergroten en als basis te dienen voor het screenen van potentiële therapeutische middelen om de progressie van VCID te genezen of te vertragen. Net als bij andere gerapporteerde methoden van BCAS, vereist het naaldmodel geavanceerde chirurgische vaardigheden die na verloop van tijd onder de knie kunnen worden gekregen, waarbij deze visuele demonstratie als leidraad wordt gebruikt.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door National Institutes of Health/NINDS-beurzen RF1NS117509 (G. Cao) en VA Merit Review-beurzen BX003923 en BX006454 (G. Cao).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL-seringpompBD309659IP-injectie van ketoprofen
2.5 mm stompe retractor tipsKent Scientific CorporationSURGI-5016-22 nodig
Andis Ion T-Blade Pet TrimmerAndisBTF3Om vacht te scheren
Betadine-oplossing Avrio Health L.P.NDC 67618-150-17
Gevlochten zijden hechtdraad, 5-0Teleflex Medical106-SVoor het hechten van de huid
Gevlochten zijden hechtdraad, 7-0Teleflex Medical103-SVoor het ligaren van CCA's
CameraMed Associates, IncVID-CAM-MONO-7Voor modelvalidatie
dekglasFisherbrand12-541-012Voor modelvalidatie
cresyl violetThermo ScientificC581-25Voor modelvalidatie
Dispensing Tip, Naald, Flex, 34 Gauge, 1/4" OALJensen GlobalJG34-0.25HPXVoor de linker CCA
DSIStudiohttps://dsi-studio.labsolver.org; voor DTI-gegevensanalyse
Dumont-pincet; Patroon #1Roboz Surgical Instrument CoRS-49602 nodig
Dumont-pincet; Patroon #5, 45 graden hoekRoboz Surgical Instrument CoRS-50582 nodig
EthanolFisher Scientific64-17-5Verdund tot 70%
ethyleenglycolThermo ScientificE178-4Voor modelvalidatie
Ogenaad, Grootte #4; 3/8 Cirkel, Snijrand, 11 mm KoordliggingRoboz Surgical Instrument CoRS-7981-4Voor het hechten van de huid
E-Z Anesthesia Classic SystemE-Z systemsEZ-7000
glycerolThermo ScientificAAA16205APVoor modelvalidatie
Homeothermische bewakingssysteemHarvard BioscienceK 022258
Beeldvormingssysteem EVOS FL AutoLife TechnologiesAMAFD2000Voor modelvalidatie
IsofluraanCovetrus11695-6777-2
KetoprofenZoetis5487
Leica M320 F12 kliniek en operatiemicroscoopLeicaM320 F12
Lidocaine en Prilocaine Cream, USP 2.5%/2.5%PadagisNDC 0574-2042-30Generische versie van EMLA-crème
lithiumcarbonaatThermo ScientificL119-500Voor modelvalidatie
Luxol fast blueThermo ScientificAC212170250Voor modelvalidatie
microscoopglazenFisherbrand12-550-403Voor modelvalidatie
MicrotoomLeicaSM2010RVoor modelvalidatie
Morris Water Maze met het verborgen platformMaze Engineershttps://maze.conductscience.com/portfolio/morris-water-maze/
M-Prove Draagbare WeegschaalSartoriusAY711Weegschalen voor het wegen van de muis
MRI met ParaVision 6.0.1 BrukerAV3HD 9.4TVoor modelvalidatie
Multi gas flow meter Aalborg InstrumentsGMR2-010334voor laagstroomsnelheid gasmenging (N2O en O2)
Nano Ultra Fine Pen Needles - 32G 4mmBD58320883Voor de rechter CCA
O.C.T.Thermo Scientific23-730-571Voor modelvalidatie
Paraformaldehyde, 4%Thermo ScientificJ61899.AKVoor modelvalidatie
PBSThermo ScientificBP399500Voor modelvalidatie
PeriCam PSI Systeem met Aperiflux sondehouder Perimed IncPeriCam PSI HRVoor modelvalidatie
permountThermo ScientificSP15-100Voor modelvalidatie
Rond handvattang; Micro-naaien met vastbinden Platform; GebogenRoboz Surgical Instrument CoRS-5264Om te helpen bij het snijden en hechten van de huid
Kleine dierwarmtelamp, 75 WattMorganville ScientificHL0100Voor modelvalidatie
Kleine katoenen applicatorsFisher Scientific23-400-118
Veer-schaar - 8mm snijrandFine Science tools15024-10
Student Halsey NaaldhouderFine Science tools91201-133 nodig: 2 voor het vasthouden van huid retractors en 1 voor het hechten van de huid
SucroseThermo ScientificA15583.36Voor modelvalidatie
Universele camera-plafondbevestigingMed Associates, IncENV-598Voor modelvalidatie
waterbadVWR89032-226Voor modelvalidatie

Referenties

  1. Tuo, Q. Z., Zou, J. J., Lei, P. Rodent models of vascular cognitive impairment. J Mol Neurosci. 71 (5), 1-12 (2021).
  2. Zhou, Z., et al. Deeper cerebral hypoperfusion leads to spatial cognitive impairment in mice. Stroke Vasc Neurol. 7 (6), 527-533 (2022).
  3. Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
  4. Hattori, Y., et al. A novel mouse model of subcortical infarcts with dementia. J Neurosci. 35 (9), 3915-3928 (2015).
  5. Janson, J., et al. Increased risk of type 2 diabetes in Alzheimer disease. Diabetes. 53 (2), 474-481 (2004).
  6. Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
  7. Miao, J., et al. Cerebral microvascular amyloid beta protein deposition induces vascular degeneration and neuroinflammation in transgenic mice expressing human vasculotropic mutant amyloid beta precursor protein. Am J Pathol. 167 (2), 505-515 (2005).
  8. Moechars, D., et al. Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem. 274 (10), 6483-6492 (1999).
  9. Wallays, G., et al. Notch3 Arg170Cys knock-in mice display pathologic and clinical features of the neurovascular disorder cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2881-2888 (2011).
  10. Cognat, E., Cleophax, S., Domenga-Denier, V., Joutel, A. Early white matter changes in CADASIL: evidence of segmental intramyelinic oedema in a pre-clinical mouse model. Acta Neuropathol Commun. 2, 49(2014).
  11. Weng, Z., et al. A novel needle mouse model of vascular cognitive impairment and dementia. J Neurosci. 43 (44), 7351-7360 (2023).
  12. Biesbroek, J. M., Biessels, G. J. Diagnosing vascular cognitive impairment: Current challenges and future perspectives. Int J Stroke. 18 (1), 36-43 (2023).
  13. Winklewski, P. J., et al. Understanding the physiopathology behind axial and radial diffusivity changes-what do we know. Front Neurol. 9, 92(2018).
  14. Jing, Z., et al. Neuronal NAMPT is released after cerebral ischemia and protects against white matter injury. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (10), 1613-1621 (2014).
  15. Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. J Vis Exp. (95), e50472(2015).
  16. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia. J Vis Exp. (75), e4387(2013).
  17. Lee, D., et al. A murine model of ischemic retinal injury induced by transient bilateral common carotid artery occlusion. J Vis Exp. (165), (2020).
  18. Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. J Vis Exp. (69), e4124(2012).
  19. Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia. J Vis Exp. (75), e4387(2013).
  20. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  21. Wellons, J. C., et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Res. 868 (1), 14-21 (2000).
  22. Cao, G., et al. In Vivo delivery of a Bcl-xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis. J Neurosci. 22 (13), 5423-5431 (2002).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muismodel voor dementiechronische cerebrale hypoperfusieletsel van de witte stofMRI hersencanMorris water mazemuis met cognitieve beperkingennaaldgeleide stenosediffusietensorbeeldvorming

Gerelateerde artikelen