Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67093

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Samenvatting

Mitochondriale isolatie wordt al tientallen jaren toegepast, volgens procedures die zijn vastgesteld door pioniers op het gebied van moleculaire biologie en biochemie om metabole stoornissen en ziekten te bestuderen. Consistente mitochondriale kwaliteit is noodzakelijk om mitochondriale fysiologie en bio-energetica goed te onderzoeken; Er zijn echter veel verschillende gepubliceerde isolatiemethoden beschikbaar voor onderzoekers. Hoewel verschillende experimentele strategieën verschillende isolatiemethoden vereisen, zijn de basisprincipes en procedures vergelijkbaar. Dit protocol beschrijft een methode die in staat is om goed gekoppelde mitochondriën te extraheren uit verschillende weefselbronnen, waaronder kleine dieren en cellen. De beschreven stappen omvatten orgaandissectie, mitochondriale zuivering, eiwitkwantificering en verschillende kwaliteitscontroles. De primaire maatstaf voor kwaliteitscontrole die wordt gebruikt om hoogwaardige mitochondriën te identificeren, is de respiratoire controleratio (RCR). De RCR is de verhouding tussen de ademhalingsfrequentie tijdens oxidatieve fosforylering en de snelheid in afwezigheid van ADP. Alternatieve maatstaven worden besproken. Hoewel met dit protocol hoge RCR-waarden ten opzichte van hun weefselbron worden verkregen, kunnen verschillende stappen worden geoptimaliseerd om aan de individuele behoeften van onderzoekers te voldoen. Deze procedure is robuust en heeft consequent geresulteerd in geïsoleerde mitochondriën met bovengemiddelde RCR-waarden in diermodellen en weefselbronnen.

Inleiding

Mitochondriën zijn subcellulaire organellen die cytoplasmatische energetische omstandigheden tot stand brengen die zijn geoptimaliseerd voor specifieke celfuncties. Hoewel studies op cellulair, weefsel- en organismeniveau inzicht kunnen geven in de mitochondriale functie, biedt het isoleren van de organellen een niveau van experimentele controle dat anders niet mogelijk is. Mitochondriale isolaties worden uitgevoerd sinds de jaren 1940, waardoor mechanistische studies van metabolisme en ademhaling in een verscheidenheid aan cellen enweefsels mogelijk zijn 1,2. De historische relevantie van mitochondriën is ook goed gedocumenteerd3. Als de belangrijkste producenten van ATP spelen mitochondriën veel sleutelrollen die van vitaal belang zijn voor een optimalecel- en orgaanfunctie. Binnen de mitochondriale matrix worden substraten geoxideerd door de TCA-cyclus, waardoor reducerende equivalenten en mobiele elektronendragers zoals NADH en UQH2 5,6 worden geproduceerd. Cytochroom C is de derde belangrijkste mobiele elektronendrager in het mitochondriale biochemische reactienetwerk7. Deze moleculen worden vervolgens geoxideerd door de transmembraancomplexen van het elektronentransportsysteem (ETS) dat is ingebed in het binnenste mitochondriale membraan8. Redoxreacties van het ETS worden gekoppeld aan protontranslocatie van de matrix naar de intermembraanruimte. Deze processen brengen een elektrochemische protongradiënt tot stand die wordt gebruikt om ADP met Pi te fosforyleren met F1F0 ATP-synthase om ATP 9,10 te produceren. De individuele processen die in elk complex plaatsvinden, kunnen worden onderzocht met respirometrie met hoge resolutie met behulp van elektroden van het Clark-type of zuurstofverbruiksassays met microplaten11,12. Bovendien kunnen ziektemodellen en behandelingen met behulp van geïsoleerde mitochondriën de impact of het belang van de mitochondriale functie bij de progressie van bepaalde pathologieën bepalen. Dit is vruchtbaar gebleken op het gebied van cardiologie, waar veranderingen in de brandstof- en substraatafgifte zijn gebruikt om op te helderen hoe mitochondriale disfunctie hartfalen beïnvloedt 13,14,15,16. Van mitochondriën is ook bekend dat ze de ontwikkeling van andere ziektetoestanden beïnvloeden, zoals diabetes, kanker, obesitas, neurologische aandoeningen en myopathieën17,18. Daarom maakt het gebruik van geïsoleerde of gezuiverde mitochondriën mechanistisch onderzoek mogelijk naar het oxidatieve metabolisme en de ATP-productie in het bronweefsel.

Er is geen tekort aan mitochondriale isolatieprotocollen vanwege hun belang in bio-energetisch onderzoek. Daarnaast zijn er zeer specifieke methoden te vinden die zijn afgestemd op subpopulaties van mitochondriën in weefsels en cellen19,20. De procedurele basisstappen zijn vergelijkbaar tussen isolatiemethoden, maar er kunnen variaties worden aangebracht in de buffersamenstelling, homogenisatiestappen en centrifugatiespins om de hoeveelheid en kwaliteit van mitochondriën te verbeteren. Veranderingen in deze aspecten zijn gebaseerd op de metabolische vraag van het weefsel, de algehele orgaanfunctie, de mitochondriale dichtheid en andere factoren. In weefsels zoals de lever en skeletspieren worden draagbare homogenisatoren gebruikt om de mitochondriale integriteit te behouden en schade aan de mitochondriale membranen te beperken21. Bij het isoleren van de nieren suggereren sommige protocollen echter het gebruik van handmatig gestuurde homogenisatie of commerciële kits om betere resultaten te verkrijgen22. Hoewel beide methoden functionele mitochondriën opleveren, kan de kwaliteit van de organellen worden aangetast door de extra tijd die nodig is om isolaties te voltooien met behulp van deze protocollen. Centrifugatie is ook van vitaal belang voor de extractie van mitochondriaal eiwit, omdat het cellulaire componenten zoals kernen en andere organellen scheidt van mitochondriën23. Tijdens het isolatieproces wordt gedebatteerd over de vraag of differentiële of op dichtheid gebaseerde centrifugatie moet worden toegepast om zuiverdere isolatente verkrijgen 24. Hoewel dichtheidscentrifugatie mitochondriën kan scheiden van organellen met een vergelijkbaar soortelijk gewicht, zoals peroxisomen, is het niet goed vastgesteld of mitochondriën van deze methoden de in situ organelfunctie beter vertegenwoordigen in vergelijking met mitochondriën geïsoleerd met behulp van differentiële centrifugatie. Op het gebied van mitochondriale fysiologie heeft centrifugatie op basis van dichtheid de voorkeur en kan deze gemakkelijk worden gewijzigd om de isolaatzuiverheid te vergroten. Of veranderingen in g-krachten, centrifugatieduur en het aantal centrifugatiespins worden opgenomen, moet vóór het experiment worden overwogen vanwege hun invloed op de mitochondriale zuivering. Bovendien verschilt mitochondriale resuspensie, misschien wel de meest cruciale stap tijdens isolatie, sterk tussen studies, met het gebruik van schrapen, mengen op basis van vortex of homogenisatie 23,25,26. Mechanische resuspensie van deze typen kan te schurend zijn en de membraanintegriteit van mitochondriën aantasten. Om deze reden moet voorzichtig worden gewassen om dit te corrigeren. Ondanks de overvloed aan modulaties en voorgestelde methodologieën, zijn er minder uitgebreide protocollen met een hoge reproduceerbaarheid en aanpasbaarheid voor knaagdiermodellen.

De hierin beschreven methoden schetsen een gedetailleerd, robuust en zeer reproduceerbaar protocol dat gezuiverde, goed gekoppelde mitochondriën oplevert uit hartweefsel van kleine dieren. Zoals aangetoond, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om tegemoet te komen aan de specifieke behoeften van elk experiment en/of laboratoriumomgeving voor het isoleren van mitochondriën uit nieren, lever en gekweekte cellen. Verdere wijzigingen kunnen worden aangebracht om mitochondriën te isoleren uit weefsels en andere dieren die hier niet worden vermeld. Bufferrecepten die voor alle isolaties worden gebruikt, worden verstrekt en kunnen indien nodig worden gewijzigd. Net als bij andere gepubliceerde protocollen worden gemotoriseerde homogenisatie en differentiële centrifugatie geïmplementeerd; Er worden echter aanpassingen gedaan aan zowel de afschuiftijd als de kracht waarmee de monsters worden gecentrifugeerd om consistent mitochondriale isolaten van hoge kwaliteit te leveren, afhankelijk van de isolatiebron. Dit protocol verschilt met name van andere door voorzichtig wassen via pipetteren om gepelleteerde mitochondriën te resuspenderen, wat helpt de integriteit van het mitochondriale membraan te behouden en de algehele functionaliteit van de organellen te behouden. Mitochondriaal eiwit wordt gekwantificeerd door bepaling van het totale eiwit of door het meten van citraatsynthase-activiteit. Het nut en de brede toepasbaarheid van deze isolatiemethode worden verder ondersteund door de waarden van de respiratoire controleratio's (RCR) die worden bereikt in verschillende organismen en weefselbronnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik en de behandeling van alle gewervelde dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde protocollen die zijn beoordeeld en geaccepteerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Michigan State University. Dit protocol is ontworpen met behulp van zowel mannelijke als vrouwelijke Hartley albino cavia's en Sprague Dawley (SD) ratten. Voor de isolatie van cardiale mitochondriën van cavia's werden dieren geofferd op een leeftijd tussen 4-6 weken (300-450 g). Cardiale mitochondriën van SD-ratten van beide geslachten werden verkregen tussen de leeftijd van 10-13 weken (250-400 g). Recepten voor buffers worden beschreven in tabel 1 en moeten van tevoren worden opgesteld. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Voordat u met de isolatie begint, labelt u twee centrifugatiebuisjes van 50 ml als "Spins 1 en 2" en "Spin 3".
  2. Plaats de buisjes, de pas ontdooide isolatiebuffer (IB), de scherpe gehaktschaar, de gemonteerde homogenisatiesonde en een beker van 5 ml of een container van vergelijkbare grootte op ijs.
  3. Plaats de pas ontdooide ademhalingsbuffer (RB) in een incubator om op te warmen voor volgende respiratoire tests.
  4. Koel een gekoelde centrifuge voor op 4 °C.
  5. Zorg ervoor dat alle apparatuur is opgesteld en dat 20 μL 7-15 E/mg protease van Bacillus licheniformis is toegevoegd aan de tube met het label "Spins 1 en 2".
  6. Zet een zwaartekrachtafhankelijk druksysteem op voor perfusie via canulatie met behulp van cardioplegiebuffer (CB, tabel 1), glazen canule en plastic slangen met een afsluitklep eraan.
  7. Schik chirurgische instrumenten en voeg de juiste schaar en tang toe voor dissectie en canulatie van het hart.
    OPMERKING: Al het water moet van zuivere kwaliteit zijn (18,2 MΩ·cm)

2. Weefseldissectie

  1. Injecteer dieren intraperitoneaal met steriel heparinesulfaat in een dosis van 500 E/kg.
  2. Laat het dier na toediening van de heparine 15 minuten in de inductiekamer zitten. Geef gedurende deze tijd 2 l/min zuiverO2-gas om de dieren volledig van zuurstof te voorzien, ze te kalmeren en eventuele stress te minimaliseren die nadelige gevolgen kan hebben voor het weefsel van interesse.
  3. Start de inductie van de anesthesie door een continue stroom isofluraan van 0,5%. Verhoog na 1 minuut tot 1%. Blijf elke minuut met 1% verhogen totdat 5% is bereikt. Eenmaal op 5%, wacht 1 minuut en controleer het ademhalingspatroon van het dier.
  4. Zodra de ademhaling is vertraagd en moeizaam wordt (ongeveer na 6,5 minuten), schakelt u de isofluraan en de zuurstofstroom uit.
  5. Haal het dier snel uit de inductiekamer en controleer de juiste verdovingsdiepte door in een poot te knijpen en te controleren op de hoornvliesreflex. Als het dier op een van beide prikkels reageert, plaats het dan terug in de inductiekamer, dien de anesthesie opnieuw toe en herhaal de dieptecontrole van de anesthesie.
  6. Zodra de juiste diepte van de anesthesie is bereikt, onthoofdt u snel met een guillotine om de cervicale wervelkolom te beschadigen en plaatst u het liggende lichaam op ijs.
  7. Maak twee parallelle verticale incisies vanaf de sleutelbeenderen die langs de laterale ribbenkast langs de lengte van de thorax lopen. Zorg ervoor dat de incisies diep genoeg zijn om door de ribben op de laterale thorax te snijden, maar vermijd beschadiging van intrathoracale structuren zoals het hart of de grote bloedvaten.
    OPMERKING: Verticale incisiegroottes zijn afhankelijk van het dier dat wordt gebruikt. Als u cavia's en ratten gebruikt, snijd dan tot het middenrif (ongeveer 6,35 cm voor ratten en 11 cm voor cavia's). Als u muizen gebruikt, voer dan een standaard thoracotomieuit 27.
  8. Stel het hart bloot met behulp van een hemostaat om de voorste thorax te verplaatsen en vul de blootgestelde borstholte in met ijs. Deze stap minimaliseert de tijd van warme ischemie en verbetert de levensvatbaarheid van de geïsoleerde organellen.
  9. Gebruik een pincet om de thymus en het hartzakje botweg te ontleden en het hart volledig bloot te leggen.
  10. Oefen met een pincet zachte inferieure tractie uit op het hart om de aorta bloot te leggen en te identificeren. De aorta is het dikste grote vat dat zich vertakt vanuit de basis van het hart. Andere grote bloedvaten, zoals de longader, zijn merkbaar doorschijnender dan de aorta.
  11. Snijd de aorta ongeveer 4-6 mm boven de aortawortel maar onder de vertakkingspunten van de halsslagader.
  12. Kanuleer de aorta en doordrenk het hart28,29 met ijskoude cardioplegie (CB)-oplossing met behulp van een zwaartekrachtafhankelijke drukkop totdat de kransslagaders vrij zijn van bloed en het orgaan geblancheerd lijkt.
    OPMERKING: Voor grote knaagdieren werkt een canulediameter van 1,8-2,2 mm goed, terwijl voor kleinere knaagdieren een diameterbereik van 1,4-1,8 mm wordt aanbevolen. Retro-perfusie mag niet langer dan 15-30 s duren voordat het bloed van de kransslagaders is verdwenen.
  13. Isoleer het ventriculaire myocardium door de boezems, kraakbeenachtig klepweefsel en vetweefsel weg te ontleden.
  14. Doe de ventrikels in een voorgekoeld bekerglas van 10 ml met 0,1-0,2 ml ijskoud IB.
  15. Hak het weefsel fijn met een scherpe chirurgische schaar tot de stukjes ongeveer 1 mm zijn3.

3. Mitochondriale zuivering en kwantificering van eiwitten

  1. Breng het gehakte weefsel over in de voorgekoelde centrifugebuis met het label "Spins 1 en 2" die de protease-oplossing bevat.
  2. Voeg ijskoud IB toe tot een eindvolume van 25 ml.
  3. Gebruik een gemotoriseerde draagbare rotor-statorhomogenisator om het weefsel met 18.000 tpm op ijs gedurende 20-25 s te verspreiden.
  4. Centrifugeer gehomogeniseerd weefsel in een buisje met het opschrift "Spins 1 en 2" bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  5. Gooi het supernatans (dat protease bevat) weg door het in de afvalfles te gieten en spoel de pellet voorzichtig af met 5 ml IB om resterend protease te verwijderen.
  6. Nadat u de spoeling hebt weggegooid, resuspendeert u de pellet met verse ijskoude IB tot een eindvolume van 25 ml door middel van een zachte draaikolk.
  7. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  8. Verwijder het supernatans (bevat mitochondriën) door het voorzichtig in een voorgekoelde buis van 50 ml met het label "Spin 3" te gieten. Zorg er tijdens het gieten voor dat het losse bovenste gedeelte van de pellet niet losraakt. Als alternatief kan een transferpipet of stripette worden gebruikt om het supernatant op te vangen.
  9. Centrifugeer het supernatans bij 8000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  10. Gooi het resulterende supernatans weg en behoud de mitochondriën-bevattende pellet.
  11. Gebruik een pluisvrij doekje om overtollig supernatant van de binnenwand van de buis te absorberen en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Houd de pellet zoveel mogelijk op 4 °C op ijs.
  12. Om de mitochondriën te resuspenderen, voegt u 80 μL ijskoude IB toe aan de bodem van de buis. Resuspendeer de pellet voorzichtig door IB herhaaldelijk over de pellet te wassen.
  13. Om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan, stelt u een micropipet in om op te zuigen en tussen 40-60 μL volume af te geven.
  14. Naarmate de mitochondriale pellet zich verspreidt, verhoogt u het volume van de micropipet om de gepelleteerde mitochondriën efficiënt te resuspenderen. Raak de pellet niet aan met de pipetpunt en maak geen luchtbellen.
  15. Eenmaal geresuspendeerd, brengt u de mitochondriën over in een voorgekoelde microcentrifugebuis en labelt u deze als standaard mitochondriën. Noteer het totale resuspensievolume.
  16. Om de mitochondriale eiwitconcentratie in het monster te bepalen, voert u een totale eiwittest uit met behulp van de bekende BCA- of Bradford-eiwittests zoals gedefinieerd in de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Een alternatieve of aanvullende strategie om de opbrengst te beoordelen, is het bepalen van de citraatsynthase-activiteit. Ter referentie: de mitochondriale inhoud kan worden gekwantificeerd door het protocol te volgen dat is beschreven in Vinnakota et al.30.

4. Kwaliteitscontrole

  1. Verdun in een voorgekoelde microcentrifugebuis de mitochondriale voorraad tot de gewenste werkconcentratie met IB.
    OPMERKING: Mitochondriale voorraden worden verdund tot 40 mg/ml om te werken met een eindconcentratie van 0,1 mg/ml voor respirometrietests bij gebruik van isolaten uit hartweefsel.
  2. Spoel oxygraafkamers, stoppen en injectiespuiten van microliter tien keer af met gedestilleerd water om ze schoon te maken voordat ze worden gebruikt in respirometrietests.
  3. Om de levensvatbaarheid en kwaliteit van mitochondriale isolaten te testen, laadt u 2,3 ml ademhalingsbuffer (RB) in oxygraafkamers en laat u het zuurstofverbruikssignaal ongeveer 10 minuten in evenwicht zijn bij 37 °C of wanneer de snelheid in de buurt van 0 ligt.
  4. Zodra het signaal in evenwicht is, duwt u de stoppers naar beneden en zuigt u de overtollige buffer op die uit het capillair van de stop komt.
  5. Voeg 1 mM EGTA toe met behulp van een injectiespuit van een microliter om eventueel achtergebleven calcium in de buffers of het mitochondriale monster te cheleren.
  6. Voeg 5 mM natriumpyruvaat en 1 mM L-malaat toe om de ademhaling te stimuleren.
  7. Voeg na de toevoeging van substraten een bolus van verdunde mitochondriën toe om de werkconcentratie te bereiken en de ademhaling gedurende 5 minuten te laten plaatsvinden. Deze periode wordt LEAK of State 2 ademhaling genoemd.
  8. Voeg na 5 minuten een bolus van 500 μM ADP toe om de ademhaling in toestand 3 op gang te brengen, ook wel OXHPOS genoemd, en laat de mitochondriën ademen tot anoxie.
  9. Bereken de respiratoire controleratio (RCR) door de maximale snelheid van zuurstofverbruik tijdens toestand 3 te delen door de snelheid van zuurstofverbruik net voor de toevoeging van ADP in toestand 2 (zie figuur 1).
    OPMERKING: Een alternatieve RCR-uitdrukking van 1 - 1/RCR kan ook worden gebruikt als kwaliteitsmaatstaf, die wordt begrensd tussen 0 en 1; het maakt het echter moeilijk om de kwaliteit te onderscheiden met behulp van deze metriek wanneer de RCR 10 > (zie figuur 2).
  10. Spoel kamers en stoppen 10 keer met zuiver water om de oxygraaf schoon te maken voor volgende tests. Als de respirometrie is voltooid, vult u de kamers met 70% ethanol en plaatst u de stoppen in de kamers tot het volgende gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na voltooiing van de mitochondriale isolatie moeten de kwaliteit en functionaliteit van de isolaten worden getest door het zuurstofverbruik (JO2) te kwantificeren met behulp van respirometrie met hoge resolutie. Om dit te doen, werden mitochondriale voorraden verdund tot 40 mg/ml om werkconcentraties van 0,1 mg/ml in 2 ml RB mogelijk te maken voor alle respirometrietesten met behulp van geïsoleerde cardiale mitochondriën. De ademhaling werd gevoed door 5 mM natriumpyr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het volgen van de methoden die beknopt in dit protocol worden beschreven, zorgt voor de isolatie van goed gekoppelde mitochondriën uit het hartweefsel van kleine knaagdieren, naast andere weefseltypen en bronnen. In totaal duurt het proces in totaal 3-3,5 uur, waarbij al het dierlijk weefsel, de monsters en de isolaten zoveel mogelijk op het ijs bij 4 °C moeten blijven om de afbraak te beperken. Deze procedure is robuust en kan op verschillende manieren worden gewijzigd om beter aan te s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er niets te onthullen valt.

Dankbetuigingen

We willen Daniel A. Beard en Kalyan C. Vinnakota bedanken voor hun fundamentele bijdragen aan dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door NSF CAREER-subsidie MCB-2237117.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glazen bekerVoor orgaan dissectie en fijnhakken
50 mL centrifugebuizenCentrifugatie
Adenosine 5'-difosfaat monokaliumzout dihydraatSigma A5285Respirometrie-assays
BSA-eiwitasey-kitThermo ScentificPI23225Mitochondriale eiwitkwantificering
DextroseSigma DX0145Voor buffer (CB)
Ethyleenglycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur Sigma E4378Voor buffers (CB en IB) en respirometrie-assays
Glazen canuleRadnotiPerfusie van hart van cavia's en ratten
Heparine natrium varkensslijmvliesSigma SRE0027-250KUDierlijke IP-injectie
Hoge-resolutie respirometerClark-type elektrode; oxygraaf met 2 mL kamers
Inductiekamer
IsofluraanSigma 792632Anesthesie
L-appelzuurSigma 02288-50GRespirometrie-assays
Magnesiumchloride hexahydraatSigma M9272Voor buffer (RB)
MannitolSigma MX0214Voor buffer (IB)
Microliter spuitenGroottes variërend van 5–50 µL
Microplate readerMoet in staat zijn om te incuberen bij 37 °C 
MOPSSigma 475898Voor alle buffers
O2 tank
OMNI THQ HomogenisatorOMNI International 12-500Vergelijkbare rotor stator homogenisatoren zullen werken
pipettenVolumes van  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
KaliumchlorideSigma P3911Voor buffers (RB en CB)
Kaliumfosfaat dibasischSigma 795496Voor buffers (IB en RB)
Protease van Bacillus licheniformisSigma P5459
NatriumchlorideSigma S9888Voor buffer (CB)
NatriumpyruvaatFisher bioreagentsBP356-100Respirometrie-assays
SucroseSigma 8510-OPVoor buffer (IB)
Chirurgisch dissectiekitAfhankelijk van dier en weefselbron
Centrifuge op tafelMoet afkoelen tot 4 °C 

Referenties

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Mitochondriële zuiveringrespiratoire controlratioeiwitkwantificeringorgaandissectiebio-energetische verstoringcalciumfosfaatgranuleshartfalenmitochondriële fysiologie
Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.