Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel

Samenvatting

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Samenvatting

Mitochondriale isolatie wordt al tientallen jaren toegepast, volgens procedures die zijn vastgesteld door pioniers op het gebied van moleculaire biologie en biochemie om metabole stoornissen en ziekten te bestuderen. Consistente mitochondriale kwaliteit is noodzakelijk om mitochondriale fysiologie en bio-energetica goed te onderzoeken; Er zijn echter veel verschillende gepubliceerde isolatiemethoden beschikbaar voor onderzoekers. Hoewel verschillende experimentele strategieën verschillende isolatiemethoden vereisen, zijn de basisprincipes en procedures vergelijkbaar. Dit protocol beschrijft een methode die in staat is om goed gekoppelde mitochondriën te extraheren uit verschillende weefselbronnen, waaronder kleine dieren en cellen. De beschreven stappen omvatten orgaandissectie, mitochondriale zuivering, eiwitkwantificering en verschillende kwaliteitscontroles. De primaire maatstaf voor kwaliteitscontrole die wordt gebruikt om hoogwaardige mitochondriën te identificeren, is de respiratoire controleratio (RCR). De RCR is de verhouding tussen de ademhalingsfrequentie tijdens oxidatieve fosforylering en de snelheid in afwezigheid van ADP. Alternatieve maatstaven worden besproken. Hoewel met dit protocol hoge RCR-waarden ten opzichte van hun weefselbron worden verkregen, kunnen verschillende stappen worden geoptimaliseerd om aan de individuele behoeften van onderzoekers te voldoen. Deze procedure is robuust en heeft consequent geresulteerd in geïsoleerde mitochondriën met bovengemiddelde RCR-waarden in diermodellen en weefselbronnen.

Inleiding

Mitochondriën zijn subcellulaire organellen die cytoplasmatische energetische omstandigheden tot stand brengen die zijn geoptimaliseerd voor specifieke celfuncties. Hoewel studies op cellulair, weefsel- en organismeniveau inzicht kunnen geven in de mitochondriale functie, biedt het isoleren van de organellen een niveau van experimentele controle dat anders niet mogelijk is. Mitochondriale isolaties worden uitgevoerd sinds de jaren 1940, waardoor mechanistische studies van metabolisme en ademhaling in een verscheidenheid aan cellen en^{weefsels mogelijk} zijn ^1,2. De historische relevantie van mitochondriën is ook goed gedocumenteerd³. Als de belangrijkste producenten van ATP spelen mitochondriën veel sleutelrollen die van vitaal belang zijn voor een optimale^{cel- en} orgaanfunctie. Binnen de mitochondriale matrix worden substraten geoxideerd door de TCA-cyclus, waardoor reducerende equivalenten en mobiele elektronendragers zoals NADH en UQH₂ ^5,6 worden geproduceerd. Cytochroom C is de derde belangrijkste mobiele elektronendrager in het mitochondriale biochemische reactienetwerk⁷. Deze moleculen worden vervolgens geoxideerd door de transmembraancomplexen van het elektronentransportsysteem (ETS) dat is ingebed in het binnenste mitochondriale membraan⁸. Redoxreacties van het ETS worden gekoppeld aan protontranslocatie van de matrix naar de intermembraanruimte. Deze processen brengen een elektrochemische protongradiënt tot stand die wordt gebruikt om ADP met Pi te fosforyleren met F₁F₀ ATP-synthase om ATP ^9,10 te produceren. De individuele processen die in elk complex plaatsvinden, kunnen worden onderzocht met respirometrie met hoge resolutie met behulp van elektroden van het Clark-type of zuurstofverbruiksassays met microplaten^11,12. Bovendien kunnen ziektemodellen en behandelingen met behulp van geïsoleerde mitochondriën de impact of het belang van de mitochondriale functie bij de progressie van bepaalde pathologieën bepalen. Dit is vruchtbaar gebleken op het gebied van cardiologie, waar veranderingen in de brandstof- en substraatafgifte zijn gebruikt om op te helderen hoe mitochondriale disfunctie hartfalen beïnvloedt 13,14,15,16. Van mitochondriën is ook bekend dat ze de ontwikkeling van andere ziektetoestanden beïnvloeden, zoals diabetes, kanker, obesitas, neurologische aandoeningen en myopathieën^17,18. Daarom maakt het gebruik van geïsoleerde of gezuiverde mitochondriën mechanistisch onderzoek mogelijk naar het oxidatieve metabolisme en de ATP-productie in het bronweefsel.

Er is geen tekort aan mitochondriale isolatieprotocollen vanwege hun belang in bio-energetisch onderzoek. Daarnaast zijn er zeer specifieke methoden te vinden die zijn afgestemd op subpopulaties van mitochondriën in weefsels en cellen^19,20. De procedurele basisstappen zijn vergelijkbaar tussen isolatiemethoden, maar er kunnen variaties worden aangebracht in de buffersamenstelling, homogenisatiestappen en centrifugatiespins om de hoeveelheid en kwaliteit van mitochondriën te verbeteren. Veranderingen in deze aspecten zijn gebaseerd op de metabolische vraag van het weefsel, de algehele orgaanfunctie, de mitochondriale dichtheid en andere factoren. In weefsels zoals de lever en skeletspieren worden draagbare homogenisatoren gebruikt om de mitochondriale integriteit te behouden en schade aan de mitochondriale membranen te beperken²¹. Bij het isoleren van de nieren suggereren sommige protocollen echter het gebruik van handmatig gestuurde homogenisatie of commerciële kits om betere resultaten te verkrijgen²². Hoewel beide methoden functionele mitochondriën opleveren, kan de kwaliteit van de organellen worden aangetast door de extra tijd die nodig is om isolaties te voltooien met behulp van deze protocollen. Centrifugatie is ook van vitaal belang voor de extractie van mitochondriaal eiwit, omdat het cellulaire componenten zoals kernen en andere organellen scheidt van mitochondriën²³. Tijdens het isolatieproces wordt gedebatteerd over de vraag of differentiële of op dichtheid gebaseerde centrifugatie moet worden toegepast om zuiverdere isolaten^{te verkrijgen 24}. Hoewel dichtheidscentrifugatie mitochondriën kan scheiden van organellen met een vergelijkbaar soortelijk gewicht, zoals peroxisomen, is het niet goed vastgesteld of mitochondriën van deze methoden de in situ organelfunctie beter vertegenwoordigen in vergelijking met mitochondriën geïsoleerd met behulp van differentiële centrifugatie. Op het gebied van mitochondriale fysiologie heeft centrifugatie op basis van dichtheid de voorkeur en kan deze gemakkelijk worden gewijzigd om de isolaatzuiverheid te vergroten. Of veranderingen in g-krachten, centrifugatieduur en het aantal centrifugatiespins worden opgenomen, moet vóór het experiment worden overwogen vanwege hun invloed op de mitochondriale zuivering. Bovendien verschilt mitochondriale resuspensie, misschien wel de meest cruciale stap tijdens isolatie, sterk tussen studies, met het gebruik van schrapen, mengen op basis van vortex of homogenisatie 23,25,26. Mechanische resuspensie van deze typen kan te schurend zijn en de membraanintegriteit van mitochondriën aantasten. Om deze reden moet voorzichtig worden gewassen om dit te corrigeren. Ondanks de overvloed aan modulaties en voorgestelde methodologieën, zijn er minder uitgebreide protocollen met een hoge reproduceerbaarheid en aanpasbaarheid voor knaagdiermodellen.

De hierin beschreven methoden schetsen een gedetailleerd, robuust en zeer reproduceerbaar protocol dat gezuiverde, goed gekoppelde mitochondriën oplevert uit hartweefsel van kleine dieren. Zoals aangetoond, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om tegemoet te komen aan de specifieke behoeften van elk experiment en/of laboratoriumomgeving voor het isoleren van mitochondriën uit nieren, lever en gekweekte cellen. Verdere wijzigingen kunnen worden aangebracht om mitochondriën te isoleren uit weefsels en andere dieren die hier niet worden vermeld. Bufferrecepten die voor alle isolaties worden gebruikt, worden verstrekt en kunnen indien nodig worden gewijzigd. Net als bij andere gepubliceerde protocollen worden gemotoriseerde homogenisatie en differentiële centrifugatie geïmplementeerd; Er worden echter aanpassingen gedaan aan zowel de afschuiftijd als de kracht waarmee de monsters worden gecentrifugeerd om consistent mitochondriale isolaten van hoge kwaliteit te leveren, afhankelijk van de isolatiebron. Dit protocol verschilt met name van andere door voorzichtig wassen via pipetteren om gepelleteerde mitochondriën te resuspenderen, wat helpt de integriteit van het mitochondriale membraan te behouden en de algehele functionaliteit van de organellen te behouden. Mitochondriaal eiwit wordt gekwantificeerd door bepaling van het totale eiwit of door het meten van citraatsynthase-activiteit. Het nut en de brede toepasbaarheid van deze isolatiemethode worden verder ondersteund door de waarden van de respiratoire controleratio's (RCR) die worden bereikt in verschillende organismen en weefselbronnen.

Protocol

Het gebruik en de behandeling van alle gewervelde dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde protocollen die zijn beoordeeld en geaccepteerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Michigan State University. Dit protocol is ontworpen met behulp van zowel mannelijke als vrouwelijke Hartley albino cavia's en Sprague Dawley (SD) ratten. Voor de isolatie van cardiale mitochondriën van cavia's werden dieren geofferd op een leeftijd tussen 4-6 weken (300-450 g). Cardiale mitochondriën van SD-ratten van beide geslachten werden verkregen tussen de leeftijd van 10-13 weken (250-400 g). Recepten voor buffers worden beschreven in tabel 1 en moeten van tevoren worden opgesteld. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Experimentele voorbereiding

1. Voordat u met de isolatie begint, labelt u twee centrifugatiebuisjes van 50 ml als "Spins 1 en 2" en "Spin 3".
2. Plaats de buisjes, de pas ontdooide isolatiebuffer (IB), de scherpe gehaktschaar, de gemonteerde homogenisatiesonde en een beker van 5 ml of een container van vergelijkbare grootte op ijs.
3. Plaats de pas ontdooide ademhalingsbuffer (RB) in een incubator om op te warmen voor volgende respiratoire tests.
4. Koel een gekoelde centrifuge voor op 4 °C.
5. Zorg ervoor dat alle apparatuur is opgesteld en dat 20 μL 7-15 E/mg protease van Bacillus licheniformis is toegevoegd aan de tube met het label "Spins 1 en 2".
6. Zet een zwaartekrachtafhankelijk druksysteem op voor perfusie via canulatie met behulp van cardioplegiebuffer (CB, tabel 1), glazen canule en plastic slangen met een afsluitklep eraan.
7. Schik chirurgische instrumenten en voeg de juiste schaar en tang toe voor dissectie en canulatie van het hart.
   OPMERKING: Al het water moet van zuivere kwaliteit zijn (18,2 MΩ·cm)

2. Weefseldissectie

1. Injecteer dieren intraperitoneaal met steriel heparinesulfaat in een dosis van 500 E/kg.
2. Laat het dier na toediening van de heparine 15 minuten in de inductiekamer zitten. Geef gedurende deze tijd 2 l/min zuiver_O2-gas om de dieren volledig van zuurstof te voorzien, ze te kalmeren en eventuele stress te minimaliseren die nadelige gevolgen kan hebben voor het weefsel van interesse.
3. Start de inductie van de anesthesie door een continue stroom isofluraan van 0,5%. Verhoog na 1 minuut tot 1%. Blijf elke minuut met 1% verhogen totdat 5% is bereikt. Eenmaal op 5%, wacht 1 minuut en controleer het ademhalingspatroon van het dier.
4. Zodra de ademhaling is vertraagd en moeizaam wordt (ongeveer na 6,5 minuten), schakelt u de isofluraan en de zuurstofstroom uit.
5. Haal het dier snel uit de inductiekamer en controleer de juiste verdovingsdiepte door in een poot te knijpen en te controleren op de hoornvliesreflex. Als het dier op een van beide prikkels reageert, plaats het dan terug in de inductiekamer, dien de anesthesie opnieuw toe en herhaal de dieptecontrole van de anesthesie.
6. Zodra de juiste diepte van de anesthesie is bereikt, onthoofdt u snel met een guillotine om de cervicale wervelkolom te beschadigen en plaatst u het liggende lichaam op ijs.
7. Maak twee parallelle verticale incisies vanaf de sleutelbeenderen die langs de laterale ribbenkast langs de lengte van de thorax lopen. Zorg ervoor dat de incisies diep genoeg zijn om door de ribben op de laterale thorax te snijden, maar vermijd beschadiging van intrathoracale structuren zoals het hart of de grote bloedvaten.
   OPMERKING: Verticale incisiegroottes zijn afhankelijk van het dier dat wordt gebruikt. Als u cavia's en ratten gebruikt, snijd dan tot het middenrif (ongeveer 6,35 cm voor ratten en 11 cm voor cavia's). Als u muizen gebruikt, voer dan een standaard thoracotomie^{uit 27}.
8. Stel het hart bloot met behulp van een hemostaat om de voorste thorax te verplaatsen en vul de blootgestelde borstholte in met ijs. Deze stap minimaliseert de tijd van warme ischemie en verbetert de levensvatbaarheid van de geïsoleerde organellen.
9. Gebruik een pincet om de thymus en het hartzakje botweg te ontleden en het hart volledig bloot te leggen.
10. Oefen met een pincet zachte inferieure tractie uit op het hart om de aorta bloot te leggen en te identificeren. De aorta is het dikste grote vat dat zich vertakt vanuit de basis van het hart. Andere grote bloedvaten, zoals de longader, zijn merkbaar doorschijnender dan de aorta.
11. Snijd de aorta ongeveer 4-6 mm boven de aortawortel maar onder de vertakkingspunten van de halsslagader.
12. Kanuleer de aorta en doordrenk het hart^28,29 met ijskoude cardioplegie (CB)-oplossing met behulp van een zwaartekrachtafhankelijke drukkop totdat de kransslagaders vrij zijn van bloed en het orgaan geblancheerd lijkt.
    OPMERKING: Voor grote knaagdieren werkt een canulediameter van 1,8-2,2 mm goed, terwijl voor kleinere knaagdieren een diameterbereik van 1,4-1,8 mm wordt aanbevolen. Retro-perfusie mag niet langer dan 15-30 s duren voordat het bloed van de kransslagaders is verdwenen.
13. Isoleer het ventriculaire myocardium door de boezems, kraakbeenachtig klepweefsel en vetweefsel weg te ontleden.
14. Doe de ventrikels in een voorgekoeld bekerglas van 10 ml met 0,1-0,2 ml ijskoud IB.
15. Hak het weefsel fijn met een scherpe chirurgische schaar tot de stukjes ongeveer 1 mm zijn³.

3. Mitochondriale zuivering en kwantificering van eiwitten

1. Breng het gehakte weefsel over in de voorgekoelde centrifugebuis met het label "Spins 1 en 2" die de protease-oplossing bevat.
2. Voeg ijskoud IB toe tot een eindvolume van 25 ml.
3. Gebruik een gemotoriseerde draagbare rotor-statorhomogenisator om het weefsel met 18.000 tpm op ijs gedurende 20-25 s te verspreiden.
4. Centrifugeer gehomogeniseerd weefsel in een buisje met het opschrift "Spins 1 en 2" bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
5. Gooi het supernatans (dat protease bevat) weg door het in de afvalfles te gieten en spoel de pellet voorzichtig af met 5 ml IB om resterend protease te verwijderen.
6. Nadat u de spoeling hebt weggegooid, resuspendeert u de pellet met verse ijskoude IB tot een eindvolume van 25 ml door middel van een zachte draaikolk.
7. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
8. Verwijder het supernatans (bevat mitochondriën) door het voorzichtig in een voorgekoelde buis van 50 ml met het label "Spin 3" te gieten. Zorg er tijdens het gieten voor dat het losse bovenste gedeelte van de pellet niet losraakt. Als alternatief kan een transferpipet of stripette worden gebruikt om het supernatant op te vangen.
9. Centrifugeer het supernatans bij 8000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
10. Gooi het resulterende supernatans weg en behoud de mitochondriën-bevattende pellet.
11. Gebruik een pluisvrij doekje om overtollig supernatant van de binnenwand van de buis te absorberen en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Houd de pellet zoveel mogelijk op 4 °C op ijs.
12. Om de mitochondriën te resuspenderen, voegt u 80 μL ijskoude IB toe aan de bodem van de buis. Resuspendeer de pellet voorzichtig door IB herhaaldelijk over de pellet te wassen.
13. Om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan, stelt u een micropipet in om op te zuigen en tussen 40-60 μL volume af te geven.
14. Naarmate de mitochondriale pellet zich verspreidt, verhoogt u het volume van de micropipet om de gepelleteerde mitochondriën efficiënt te resuspenderen. Raak de pellet niet aan met de pipetpunt en maak geen luchtbellen.
15. Eenmaal geresuspendeerd, brengt u de mitochondriën over in een voorgekoelde microcentrifugebuis en labelt u deze als standaard mitochondriën. Noteer het totale resuspensievolume.
16. Om de mitochondriale eiwitconcentratie in het monster te bepalen, voert u een totale eiwittest uit met behulp van de bekende BCA- of Bradford-eiwittests zoals gedefinieerd in de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Een alternatieve of aanvullende strategie om de opbrengst te beoordelen, is het bepalen van de citraatsynthase-activiteit. Ter referentie: de mitochondriale inhoud kan worden gekwantificeerd door het protocol te volgen dat is beschreven in Vinnakota et ^al.30.

4. Kwaliteitscontrole

1. Verdun in een voorgekoelde microcentrifugebuis de mitochondriale voorraad tot de gewenste werkconcentratie met IB.
   OPMERKING: Mitochondriale voorraden worden verdund tot 40 mg/ml om te werken met een eindconcentratie van 0,1 mg/ml voor respirometrietests bij gebruik van isolaten uit hartweefsel.
2. Spoel oxygraafkamers, stoppen en injectiespuiten van microliter tien keer af met gedestilleerd water om ze schoon te maken voordat ze worden gebruikt in respirometrietests.
3. Om de levensvatbaarheid en kwaliteit van mitochondriale isolaten te testen, laadt u 2,3 ml ademhalingsbuffer (RB) in oxygraafkamers en laat u het zuurstofverbruikssignaal ongeveer 10 minuten in evenwicht zijn bij 37 °C of wanneer de snelheid in de buurt van 0 ligt.
4. Zodra het signaal in evenwicht is, duwt u de stoppers naar beneden en zuigt u de overtollige buffer op die uit het capillair van de stop komt.
5. Voeg 1 mM EGTA toe met behulp van een injectiespuit van een microliter om eventueel achtergebleven calcium in de buffers of het mitochondriale monster te cheleren.
6. Voeg 5 mM natriumpyruvaat en 1 mM L-malaat toe om de ademhaling te stimuleren.
7. Voeg na de toevoeging van substraten een bolus van verdunde mitochondriën toe om de werkconcentratie te bereiken en de ademhaling gedurende 5 minuten te laten plaatsvinden. Deze periode wordt LEAK of State 2 ademhaling genoemd.
8. Voeg na 5 minuten een bolus van 500 μM ADP toe om de ademhaling in toestand 3 op gang te brengen, ook wel OXHPOS genoemd, en laat de mitochondriën ademen tot anoxie.
9. Bereken de respiratoire controleratio (RCR) door de maximale snelheid van zuurstofverbruik tijdens toestand 3 te delen door de snelheid van zuurstofverbruik net voor de toevoeging van ADP in toestand 2 (zie figuur 1).
   OPMERKING: Een alternatieve RCR-uitdrukking van 1 - 1/RCR kan ook worden gebruikt als kwaliteitsmaatstaf, die wordt begrensd tussen 0 en 1; het maakt het echter moeilijk om de kwaliteit te onderscheiden met behulp van deze metriek wanneer de RCR 10 > (zie figuur 2).
10. Spoel kamers en stoppen 10 keer met zuiver water om de oxygraaf schoon te maken voor volgende tests. Als de respirometrie is voltooid, vult u de kamers met 70% ethanol en plaatst u de stoppen in de kamers tot het volgende gebruik.

Resultaten

Na voltooiing van de mitochondriale isolatie moeten de kwaliteit en functionaliteit van de isolaten worden getest door het zuurstofverbruik (J_O2) te kwantificeren met behulp van respirometrie met hoge resolutie. Om dit te doen, werden mitochondriale voorraden verdund tot 40 mg/ml om werkconcentraties van 0,1 mg/ml in 2 ml RB mogelijk te maken voor alle respirometrietesten met behulp van geïsoleerde cardiale mitochondriën. De ademhaling werd gevoed door 5 mM natriumpyruvaat en 1 mM L-malaat in aanwezigheid van 1 mM EGTA, een calciumchelator, en werd gedurende 5 minuten in evenwicht gebracht om de ademhaling in toestand 2 tot stand te brengen. Tijdens deze toestand moet het zuurstofverbruik gemiddeld 45-55 pmol/ml/s of 27-33 nmol/mg/min bedragen. Houd rekening met het elektrodeafhankelijke zuurstofverbruik en voer indien nodig de juiste achtergrondcorrecties uit. Oxidatieve fosforylering (toestand 3) wordt na 5 minuten geïnitieerd door een bolus van 500 μM ADP. Substraattoevoegingen en representatieve tracering worden gedetailleerd beschreven in figuur 1. Functionele mitochondriën zullen een onmiddellijke toename van J_O2 hebben na de toevoeging van ADP, die varieert volgens de weefselbron, zoals weergegeven in figuur 2. Zonder het gebruik van EGTA heeft restcalcium variabele effecten op de maximale snelheden van J_O2 tijdens OXPHOS, afhankelijk van de mitochondriale concentratie, de beschikbaarheid van het substraat en andere omgevingsfactoren. De samenstelling van de buffer is belangrijk voor het behoud van de integriteit en functionaliteit van het mitochondriale membraan. Alle bufferrecepten die in het protocol worden genoemd, worden verder beschreven in tabel 1 en kunnen worden gebruikt voor alle mitochondriale preparaten die hierin worden beschreven.

Succesvolle isolatie van mitochondriën wordt aangegeven door het verkrijgen van RCR-waarden die binnen het gegeven bereik liggen voor elke soort en weefselbron, zoals weergegeven in tabel 2. Op basis van de gegevens die met behulp van dit protocol zijn verzameld, moeten RCR's bij het isoleren van cardiale mitochondriën van cavia's, ratten of muizen respectievelijk ≥16, ≥8 en ≥5 zijn. Als ze worden geïsoleerd uit de lever of nier van ratten, moeten RCR's ≥6 zijn, terwijl RCR's uit cellen als acceptabel worden beschouwd als ze hoger zijn dan 3,8. Als de RCR-waarden onder deze bereiken vallen of als er kwalitatieve verschillen zijn in de respirometrietraceringen, wordt aanbevolen om een aanvullende test met nieuwe RB en substraten uit te voeren om problemen met contaminatie uit te sluiten. Hoewel de 1-1/RCR-transformatie waarden tussen 0 en 1 begrenst, wordt deze metriek niet geadviseerd bij het vergelijken van mitochondriale kwaliteit tussen geslachten of soorten wanneer de RCR-waarde groter is dan 10. Om deze reden werden tijdens alle experimenten standaard RCR-waarden (State 3/State 2 of OXPHOS/LEAK) gekwantificeerd. Informatie over modulaties die in dit protocol kunnen worden aangebracht om mitochondriën beter te isoleren van muizenharten, lever, nieren en cellen, wordt gedetailleerd beschreven in Tabel 3.

Figuur 1: Regio's die van belang zijn voor kwaliteitscontrolecontroles met behulp van respirometrie met hoge resolutie. De ademhalingskamers werden belast met 2 ml RB en mochten bij 37 °C in evenwicht komen tot het zuurstofverbruik in de buurt van 0 lag. Eenmaal in evenwicht gebracht, werd 1 mM EGTA, een calciumchelator, toegevoegd samen met 5 mM natriumpyruvaat en 1 mM L-malaat. Na de toevoeging van deze substraten werden mitochondriën toegevoegd met de gewenste werkconcentratie (0,1 mg/ml) en 5 minuten laten ademen om adem in toestand 2 te bereiken (geel). Na 5 minuten werd 500 μM ADP toegevoegd om de ademhaling in toestand 3 te initiëren (rood). RCR's werden bepaald door het gemiddelde van de snelheden van het zuurstofverbruik die werden aangeduid door de rode en gele vakken om toestand 3 met toestand 2 te vergelijken. Toestand 4 wordt aangeduid met het groene vak en vertegenwoordigt de periode van extramitochondriale ATPase-hydrolysatie van ATP en kan worden gebruikt om de integriteit van het buitenmembraan in cytochroom C-assays te beoordelen. De weergegeven gegevens zijn verzameld met behulp van SD-hartmitochondriën van ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve J_{O2-traceringen} en respiratoire controleratio's voor dier- en weefselbronnen. De kwaliteit van geïsoleerde mitochondriën werd getest door het zuurstofverbruik te kwantificeren met behulp van respirometrie met hoge resolutie. De ademhaling werd gevoed door 5 mM natriumpyruvaat en 1 mM L-malaat in aanwezigheid van 1 mM EGTA. Mitochondriën en substraten mochten 5 minuten ademen om de ademhaling van toestand 2 te stabiliseren. De maximale snelheden van zuurstofverbruik na de toevoeging van ADP werden vergeleken met toestand 2 van zuurstofverbruik vóór ADP om de ademhalingscontroleratio's (RCR's) voor elk weefsel te berekenen. De mitochondriale kwaliteit werd verder beoordeeld door de 1-1/RCR-waarden te berekenen zoals gekenmerkt door de P-L-regelefficiëntienormen. Staafdiagrammen rechts van elke tracering geven mannelijke (blauw) en vrouwelijke (groen) gemiddelde RCR- en 1-1/RCR-waarden ± SD aan voor een bepaald weefsel. (A), (B) en (C) verwijzen naar gegevens die zijn verzameld met behulp van respectievelijk cavia's, Sprague Dawley (SD) ratten en Friend leukemievirus B (FVB) muizenharten. (D) en (E) geven de resultaten van SD-rattenlever en -nieren weer, terwijl (F) verwijst naar HEK293-cellen. De drie grotere leverkwabben werden verzameld, terwijl beide nieren werden gebruikt voor isolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Buffer recepten. Cardioplegiebuffer (CB), isolatiebuffer (IB) en ademhalingsbuffer (RB) die tijdens het isolatieproces worden gebruikt, moeten van tevoren worden bereid volgens de vermelde instructies. CB kan maximaal een maand worden bewaard bij 4 °C, terwijl IB en RB 4 maanden kunnen worden bewaard bij -80 °C. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Analyse van de ademhalingscontroleratio. Mitochondriale isolatie voor functionele analyses werd uitgevoerd over een breed scala aan soorten en weefselbronnen in zowel mannelijke als vrouwelijke knaagdieren en HEK293-cellen. De steekproefomvang van elk geslacht, weefselbron en soort wordt gedetailleerd weergegeven, samen met de gemiddelde RCR- en 1-1/RCR-waarden ± SD. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Aanbevolen modulaties volgens het mitochondriale isolatieprotocol voor verschillende weefsels om de eiwitopbrengst te verhogen. Veranderingen in hoeveelheden protease en centrifugaties worden weergegeven afhankelijk van de weefselbron. Gemiddelde hoeveelheden totaal eiwit (mg) werden berekend op basis van de resultaten van de BSA-eiwittest en het resuspensievolume van de uiteindelijke mitochondriale pellet. Waarden worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SD. Vetgedrukte instructies in de centrifugatiekolom geven aan of de supernatant moet worden weggegooid, behouden of samengevoegd. Weggooien verwijst naar het weggooien van het supernatans in een container voor biologisch afval, terwijl retentie en pooling verwijzen naar het overbrengen van het supernatans naar de volgende centrifugatiebuis of het verzamelen voor de laatste centrifuge. Meer informatie over wijzigingen in het protocol is te vinden in de sectie discussie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het volgen van de methoden die beknopt in dit protocol worden beschreven, zorgt voor de isolatie van goed gekoppelde mitochondriën uit het hartweefsel van kleine knaagdieren, naast andere weefseltypen en bronnen. In totaal duurt het proces in totaal 3-3,5 uur, waarbij al het dierlijk weefsel, de monsters en de isolaten zoveel mogelijk op het ijs bij 4 °C moeten blijven om de afbraak te beperken. Deze procedure is robuust en kan op verschillende manieren worden gewijzigd om beter aan te sluiten bij experimentele doelen en gebruikte modellen. Een modulatie die tijdens het weefseldissectieproces kan worden gemaakt, is de uitsluiting van heparine. Heparine wordt toegediend om de vorming van bloedstolsels³¹ te voorkomen, maar is niet nodig als het hart snel genoeg wordt gecanuleerd en geperfundeerd (binnen 1,5 minuut na onthoofding). Bovendien wordt perfusie van het hart met behulp van CB aanbevolen voor grotere knaagdieren, dus bij het werken met muizenharten of andere organen wordt geadviseerd om IB-wasbeurten op te nemen vóór het hakken en de eerste homogenisatie. Deze stap zorgt ervoor dat bloed dat uit het dissectieproces wordt overgedragen, wordt weggegooid. Andere veranderingen zijn onder meer veranderingen in de homogenisatie- en centrifugatiesnelheden om de mitochondriale eiwitopbrengst te verhogen. Degenen die hierboven zijn beschreven, zijn voor het isoleren van cardiale mitochondriën van cavia's en ratten. Belangrijk is dat dit protocol kan worden aangepast om mitochondriën te isoleren uit lever, nieren, muizenharten en cellen van knaagdieren. Aanbevolen wijzigingen in het volume van protease, homogenisatie en centrifugatie op basis van specifieke weefseltypes en dieren worden verder beschreven in Tabel 3.

Na de vorming van de gezuiverde mitochondriale pellet uit de laatste centrifugatiestap, moeten mitochondriën opnieuw worden gesuspendeerd in voorgekoeld IB. Het volume van de toegevoegde IB is afhankelijk van de grootte van de mitochondriale pellet, maar is ongeveer 80 μL voor cavia's en ratten. Bij isolatie uit muizenharten wordt 60 μL IB toegevoegd voor resuspensie. Bij het voor het eerst isoleren van mitochondriën wordt geadviseerd om kleinere hoeveelheden IB toe te voegen om de voorraadoplossing niet te verdunnen. Vanwege de consistentie van de mitochondriale pellets die worden gevormd na het zuiveren van monsters uit de lever en de nieren, hoeft er veel minder IB (20 μL) te worden toegevoegd voor resuspensie. Andere methoden suggereren het gebruik van mechanische resuspensie via schrapen dat schurend kan zijn voor mitochondriale membranen en de algehele integriteit kan verminderen^32,33. Bij gebruik van dit protocol wordt geadviseerd om de pellet voorzichtig te wassen met IB om de kwaliteit van de mitochondriën te verbeteren. Zorg er tijdens dit proces voor dat er geen belletjes ontstaan of dat de korrel met de punt van de pipet wordt verstoord, omdat dit kan leiden tot het scheuren van het membraan en het verkeerd vouwen van eiwitten³⁴. Door alleen tot aan de eerste stop van de pipet te duwen, kunt u de kans op het vormen van luchtbellen verkleinen. De pipet moet voorzichtig worden gewassen totdat de hele pellet in suspensie is. Het totale resuspensierendement moet 150-200 μL zijn voor cardiale mitochondriën van cavia's en ratten en er lichtbruin uitzien. Meer geconcentreerde monsters hebben een donkerdere tint bruin en kunnen na kwantificering van het mitochondriale eiwit worden verdund om in het gewenste werkconcentratiebereik te passen.

Standaard eiwittesten met behulp van BSA zijn optimaal voor mitochondriale eiwitkwantificering³⁵. Eiwittests moeten worden uitgesteld en geïncubeerd voor de aanbevolen duur en temperaturen zoals gedefinieerd in het protocol van de fabrikant. Voor geïsoleerde mitochondriën zorgt incubatie bij 37 °C gedurende 30 minuten voor een goed verspreide kleurontwikkeling en nauwkeurige eiwitkwantificering. Bij het kwantificeren van de totale hoeveelheid eiwit wordt in eerste instantie aanbevolen om de geresuspendeerde mitochondriën en IB te verdunnen in verhoudingen van 1:50, 1:100 en 1:200 om ervoor te zorgen dat de resultaten van de eiwittest binnen het kalibratiebereik liggen. Verdere details over het uitvoeren van eiwittests met BSA als standaard worden verstrekt in de kit van de fabrikant, dus de hierin vermelde aanbevelingen zijn mogelijk niet van toepassing. Er moet ook een CS-test worden uitgevoerd om de mitochondriale inhoud in elk monster te bepalen. Deze test is goed ingeburgerd en maakt verdere normalisatie mogelijk bij het bestuderen van biologische verschillen tussen mitochondriale subtypes³⁶.

Na de bepaling van het eiwit moet de mitochondriale voorraad worden verdund om de gewenste uiteindelijke werkconcentratie voor respirometrietests te bereiken. Mitochondriën geïsoleerd uit cavia's en rattenharten worden verdund tot 40 mg/ml en 5 μL van deze voorraad wordt toegevoegd aan de ademhalingskamer om te resulteren in een werkconcentratie van 0,1 mg/ml. Bij isolatie uit enkelvoudige muizenharten of uit nieren en lever is verdunning van de mitochondriale voorraad mogelijk niet nodig. Grotere hoeveelheden mitochondriën kunnen ook worden toegevoegd om de gewenste concentraties te verkrijgen. Snelheden van zuurstofverbruik tijdens toestand 2 die tussen 35-55 pmol/ml/s liggen, zijn acceptabel voor de meeste respirometrie-analyses²⁸. Details met betrekking tot de manier waarop RCR's worden uitgevoerd en geanalyseerd, worden toegelicht in figuur 1 en het gedeelte met representatieve resultaten; Het is echter belangrijk op te merken dat de ademhaling wordt gevoed door pyruvaat en malaat. Andere substraatomstandigheden, zoals succinaat en rotenon, zullen resulteren in verschillende RCR-waarden, aangezien de P/O-verhouding en andere bio-energetische variabelen anders zijn³⁷. Het gebruik van pyruvaat en malaat als respiratoire brandstoffen leidt tot een bijna maximale omzet in de TCA-cyclus en de productie van reducerende equivalenten; maximale TCA-cyclusactiviteit en gekoppelde ETS-functie worden echter verkregen met 5 mM pyruvaat, 1 mM L-malaat en 20 mM succinaat. Bij het stimuleren van oxidatieve fosforylering om het zuurstofverbruik tijdens toestand 3 te kwantificeren, wordt ADP toegevoegd in concentraties die ten minste 10 keer zo hoog zijn als de geschatte K_D voor ADP van de adeninenucleotidetranslocator³⁸. Dit kan worden bereikt door bolussen groter dan 350 μM ADP, en daarom werd 500 μM gebruikt in alle experimentele tests. Als de duur van toestand 3 te kort is, kunnen lagere mitochondriale concentraties worden gebruikt om deze te verlengen. Voor verdere analyse van de ademhaling kunnen modulaties worden gemaakt in de concentratie van ADP die in het systeem wordt geïntroduceerd om beter te passen bij experimentele parameters³⁹. Bij de eerste ontwikkeling van dit protocol werd een cytochroom C-test gebruikt om de integriteit van het buitenmembraan van de mitochondriale isolaten^{te beoordelen 40}. Als de RCR-waarden onder het verwachte bereik liggen, voer dan de cytochroom C-test uit om te beoordelen of de schade aan het buitenmembraan significant is. Om dit te doen, voegt u 10 μM cytochroom C toe aan de ademhalingskamer en bevestigt u dat de toename van de ademhaling lager is dan 5 of 10% van de toestand 4-snelheid. De verwachte bereiken zijn afkomstig uit eerder gepubliceerde studies en zijn soort-, weefsel- en substraatspecifiek. Als de toevoeging van cytochroom c de ademhaling van toestand 4 boven de 10% stimuleert, kan de laatste 8.000 x g centrifuge worden herhaald om beschadigde mitochondriën te verwijderen. Dat gezegd hebbende, kan schade aan de buitenzijde van het membraan deel uitmaken van een fenotype van de ziekte, en daarom moet de cytochroom C-test met dat in gedachten worden geïnterpreteerd⁴¹. Zodra consistent hoge RCR-waarden met lage (<10%) cytochroom C-gestimuleerde effecten zijn verkregen, wordt deze test alleen nodig en geadviseerd als RCR-waarden buiten aanvaardbare bereiken liggen. Als de cytochroom C-test <10% is en de RCR-waarden buiten het verwachte bereik liggen, zoals beschreven in tabel 2, herhaal dan de respirometrietest met nieuwe RB na 10 keer wassen met gedestilleerd water. Als er nog steeds verlaagde percentages worden waargenomen, moeten nieuwe reagentia (pyruvaat, malaat, EGTA en ADP) worden gemaakt om het probleem te diagnosticeren. Bovendien kunnen cytochroom C-assays worden uitgevoerd door middel van ELISA's en het gebruik van mitochondriale kleurstoffen zoals TMRE ^33,42. Afhankelijk van het weefseltype en de bron kunnen deze opties beter geschikt zijn voor het bepalen van de integriteit van het buitenmembraan.

Hoewel er geen grote beperkingen zijn aan het feit dat dit protocol wordt gebruikt om cardiale mitochondriën te isoleren, is het belangrijk op te merken dat bepaalde overwegingen moeten worden gemaakt bij het gebruik van deze methoden. De kwaliteit van mitochondriale isolaten wordt sterk beïnvloed door de temperatuur en de tijd die nodig is om zowel het hart te doordringen als de gezuiverde pellet te resuspenderen. Bekendheid met deze processen kan dus vereist zijn om RCR's te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met de hier gerapporteerde processen. Bovendien is de samenstelling van de buffers en oplossingen die tijdens het isolatieproces worden gebruikt belangrijk, omdat deze rechtstreeks van invloed is op de mitochondriale integriteit en functie⁴³. Buffers vermeld in Tabel 1 worden verstrekt als referentie en hebben de isolatie van goed gekoppelde mitochondriën over een verscheidenheid aan weefselbronnen mogelijk gemaakt, maar er kunnen wijzigingen worden aangebracht om de hoeveelheid chloride in ademhalingsanalyses te beperken, omdat dit de translocatie van adeninenucleotides en de ETS-functie kan verstoren²⁸. De samenstelling van de buffer kan ook worden gewijzigd om de mitochondriën van de lever beter te isoleren. Aangezien de lever een hoog vetzuurgehalte heeft, wordt geadviseerd om het orgaan en het gehakte weefsel te wassen met een buffer met verhoogde BSA-concentraties als RCR's buiten het verwachte bereik worden waargenomen. Hoewel de kwaliteit van mitochondriale isolaten verkregen uit leversecties goed gekoppeld en consistent is, kan deze verandering resulteren in een verbeterde organelfunctie. Er moet ook worden erkend dat de isolatie van mitochondriën uit cellen met behulp van deze methoden een grote hoeveelheid gekweekte cellen vereist, wat een mogelijke beperking vormt. Bovendien is dit protocol niet specifiek ontworpen voor cellulaire isolaten, maar is het succesvol gebleken wanneer het wordt geïmplementeerd. Daarom kunnen gerichte isolatiemethoden voor gekweekte cellen beter nuttig zijn. Als alternatief, om de mitochondriale kwaliteit te beoordelen, kunnen onderzoekers kiezen voor fluorescerende sondes om RCR's te berekenen. Spectrofluorometrische methoden zijn een populaire keuze, vooral als er kleinere hoeveelheden eiwit worden geëxtraheerd^44,45.

Over het algemeen kan dit protocol worden gebruikt om goed gekoppelde cardiale mitochondriën consequent te isoleren van kleine dieren zoals cavia's en ratten. Het kan gemakkelijk worden aangepast om de eiwitopbrengst te verhogen door de homogenisatiesnelheden, centrifugatietijden en het aantal spins te wijzigen om mitochondriale isolatie van muizenharten, lever, nieren en cellen mogelijk te maken. Bovendien is dit protocol algemeen en robuust genoeg om de mitochondriale functie van niet-zoogdiersoorten zoals zeeprik⁴⁶ te onderzoeken, en om structurele analyse uit te voeren met behulp van klassieke en cryo-elektronenmicroscopie ^40,47. Hoewel veel recente studies zich richten op de verkenning van mitochondriaal gedrag in intacte cel- en weefselsystemen, onthult de breedte en diepte van de informatie die met behulp van deze methoden uit geïsoleerde mitochondriën wordt gehaald, effecten op metabolomics, oxidatieve stress en ATP-productie die nooit zonder verdienste zullen zijn. De isolatie van goed gekoppelde mitochondriën stelt onderzoekers in staat om belangrijke aspecten van de ontwikkeling en progressie van de ziekte te onderzoeken die anders niet mogelijk zijn in modellen met hele cellen. Vanwege de veelzijdigheid van dit protocol kunnen veranderingen in mitochondriale energetica die worden waargenomen bij pathologieën zoals hart- en vaatziekten, diabetes en neurologische aandoeningen worden onderzocht met behulp van de hierin beschreven methodologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glazen beker			Voor orgaan dissectie en fijnhakken
50 mL centrifugebuizen			Centrifugatie
Adenosine 5'-difosfaat monokaliumzout dihydraat	Sigma	A5285	Respirometrie-assays
BSA-eiwitasey-kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondriale eiwitkwantificering
Dextrose	Sigma	DX0145	Voor buffer (CB)
Ethyleenglycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur	Sigma	E4378	Voor buffers (CB en IB) en respirometrie-assays
Glazen canule	Radnoti		Perfusie van hart van cavia's en ratten
Heparine natrium varkensslijmvlies	Sigma	SRE0027-250KU	Dierlijke IP-injectie
Hoge-resolutie respirometer			Clark-type elektrode; oxygraaf met 2 mL kamers
Inductiekamer
Isofluraan	Sigma	792632	Anesthesie
L-appelzuur	Sigma	02288-50G	Respirometrie-assays
Magnesiumchloride hexahydraat	Sigma	M9272	Voor buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	Voor buffer (IB)
Microliter spuiten			Groottes variërend van 5–50 µL
Microplate reader			Moet in staat zijn om te incuberen bij 37 °C
MOPS	Sigma	475898	Voor alle buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenisator	OMNI International	12-500	Vergelijkbare rotor stator homogenisatoren zullen werken
pipetten			Volumes van  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Kaliumchloride	Sigma	P3911	Voor buffers (RB en CB)
Kaliumfosfaat dibasisch	Sigma	795496	Voor buffers (IB en RB)
Protease van Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Natriumchloride	Sigma	S9888	Voor buffer (CB)
Natriumpyruvaat	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometrie-assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	Voor buffer (IB)
Chirurgisch dissectiekit			Afhankelijk van dier en weefselbron
Centrifuge op tafel			Moet afkoelen tot 4 °C