Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67094

⸱

21 februari 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In dit artikel

Samenvatting

Lucht-vloeistof interfacecultuur wordt vaak gebruikt om pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen door primaire normale menselijke bronchiale epitheelcellen te differentiëren die de apicale zijde van de longluchtweg nabootsen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bepalen van de kwaliteit door de biofysische eigenschappen te monitoren, zoals ciliaire functie en membraanintegriteit.

Samenvatting

Het differentiëren van primaire longluchtwegepitheelcellen in de lucht-vloeistofinterface (ALI) is een populaire techniek om een meercellig pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen dat de apicale zijde van de longluchtweg nabootst. Hoewel de differentiatie van primaire longluchtwegcellen wordt verwacht, biedt de beoordeling van biofysische eigenschappen zoals ciliaire functie en membraanondoordringbaarheid een kwaliteitsbeoordeling van het luchtwegepitheel en garandeert het de betrouwbaarheid van het experiment. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van meercellig pseudogestratificeerd luchtwegepitheel in ALI-cultuur en beoordelen we twee belangrijke biofysische eigenschappen: ciliaire functie en membraanondoordringbaarheid. Om de ciliaire functie te bepalen, hebben we de ciliaire beweging van een 4 weken durend gedifferentieerd luchtwegepitheel vastgelegd met behulp van een hogesnelheidscamera die is bevestigd aan een omgekeerde microscoop, gevolgd door het kwantificeren van de ciliaire slagfrequentie (CBF) met behulp van het Simon Amon Video Analysis (SAVA) -systeem. We hebben ook de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) gemeten met behulp van een volt-ohmmeter om de integriteit van de epitheliale barrière van het luchtwegepitheel te bepalen.

Inleiding

Chronische aandoeningen van de luchtwegen zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD) en cystische fibrose zijn wereldwijd enkele van de belangrijkste gezondheidsproblemen1. De prevalentie van luchtwegaandoeningen veroorzaakt door virussen zoals het menselijke influenza A-virus, het respiratoir syncytieel virus (RSV) en het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) veroorzaken ook een economische en volksgezondheidslast2. Daarom is er een enorme behoefte aan het ontwikkelen van behandelingsregimes voor aandoeningen van de luchtwegen die leiden tot onomkeerbare schade aan het ademhalingsweefsel. Het respiratoire epitheelweefsel zelf is niet alleen betrokken bij de zuurstofopname, maar vormt ook een barrière om het lichaam te beschermen tegen binnendringende ziekteverwekkers en gevaarlijke chemicaliën3. Het respiratoire epitheel heeft een complexe cellulaire organisatie die bestaat uit drie hoofdceltypen: trilhaarcellen, slijmbekercellen en basale cellen. Onlangs is er een rapport verschenen over de aanwezigheid van nieuwe maar zeldzame ionocytcellen in het luchtwegepitheel4. Het complexe weefsel functioneert op een gecoördineerde manier om aangeboren immuunresponsen te bieden, zoals secretie van antimicrobiële peptiden, afgifte van cytokines om een adaptieve immuunrespons te activeren en mucociliaire klaring5. Het ontbreken van een geschikt luchtwegmodel is een van de obstakels voor de studie van luchtweginfecties en de ontwikkeling van behandelingen.

Het lucht-vloeistof interface (ALI) model wordt een belangrijk instrument voor onderzoek naar aandoeningen van de luchtwegen6. Het is een effectief in vitro longluchtwegmodel, aangezien de primaire longluchtwegcellen differentiëren tot een pseudogestratificeerd luchtwegepitheel dat bestaat uit ten minste drie soorten cellen die zich over het algemeen aan de apicale zijde van de luchtwegen bevinden. Ten eerste bedekken trilhaarcellen het grootste deel van de apicale zijde van de luchtwegen en dragen ze bij aan de mucociliaire klaring. Ten tweede produceren slijmbekercellen slijm en zijn ze de grootste cellen die samen met ciliaire cellen aan de apicale zijde van de luchtwegen verblijven. Ten derde bevinden basale cellen zich in de basale laag van de luchtwegen en zijn het de voorlopercellen die differentiëren tot verschillende epitheelcellen 5,7. Hoewel ionocyten en tuftcellen zeldzaam zijn in het luchtwegepitheel, kunnen ze ook een rol spelen bij de ciliaire functie en membraanpermeabiliteit4. Deze techniek verschilt van de traditionele ondergedompelde celcultuur, die de in vivo longomgeving niet nabootst. Aangezien ALI wordt geproduceerd uit primaire epitheelcellen die zijn afgeleid van gezonde mensen, patiënten met astma en COPD, biedt het een meer divers platform voor het bestuderen van reacties op infectie en pathofysiologie van de ziekte.

De gezondheidsbeoordeling van de door ALI ontwikkelde culturen is een essentieel aspect om te monitoren, om de levensvatbaarheid, functionaliteit en fysiologische relevantie van de gekweekte cellen te waarborgen. Het vergroot het vertrouwen in de integriteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van ALI-culturen. Zoals eerder gepubliceerd, heeft onze groep de integriteit van de ALI-cultuur geëvalueerd door twee biofysische parameters te beoordelen: ciliaire functie door ciliaire slagfrequentie (CBF) te kwantificeren en integriteit van de epitheliale barrière door transepitheliale elektrische weerstand (TEER) te bepalen6,7,8. Mucociliaire klaring (MCC) is een van de belangrijke kenmerken van het luchtwegepitheel dat door trilhaarcellen wordt gedragen. Gespecialiseerde organellen, cilia genaamd, op het oppervlak van trilhaarcellen, kloppen in metachronale golven om de luchtwegen vrij te maken van infecties en ingeademde deeltjes die vastzitten in de slijmlaag van het luchtwegepitheel. Effectieve MCC is volledig afhankelijk van de juiste ciliaire activiteit9. Een goede CBF is een indicatie van een gezond, intact luchtwegepitheel; daarom levert monitoring van de CBF voor ALI-culturen waardevol inzicht in de integriteit van het epitheel10. Hoewel er meerdere manieren zijn om CBF te kwantificeren, bijvoorbeeld high-speed videomicroscopie11 en fase-opgeloste Doppler optische coherentietomografie12, vereist elke methode technische expertise en gespecialiseerde apparatuur. In dit protocol bieden we een eenvoudigere en minder technische manier om CBF van het gedifferentieerde luchtwegepitheel te kwantificeren. We hebben ook een methode beschreven voor het kwantificeren van TEER van hetzelfde epitheel, die de integriteit en barrièrefunctie van epitheelweefsels aangeeft13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol moet worden uitgevoerd in een steriele toestand onder een bioveiligheidsniveau 2 laminaire stromingskap (bioveiligheidskast). Al het medium en de oplossingen moeten vóór gebruik worden ontdooid bij 37 °C. Centrifugeren moet worden uitgevoerd bij 4 °C. Alle materialen die in het experiment worden gebruikt, moeten steriel zijn. De primaire cellen (geanonimiseerde donor) werden verkregen in samenwerking met Dr. Kristina Bailey van het University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE. De primaire cellen zijn afkomstig van geanonimiseerde donoren en de cellen vallen niet onder de NIH Human Subject. De cellen werden verkregen in het kader van een goedgekeurde Material Transfer Agreement (MTA) tussen de University of North Dakota, Grand Forks, ND, en UNMC, Omaha, NE. Hier hebben we 4 NHBE-cellen gebruikt. Hoewel ook werd aangetoond dat NHBE-cellen met een hogere doorgang (tot passage 8) differentiëren tot luchtwegepitheel, gebruiken we routinematig passage vier NHBE-cellen omdat er geen duidelijk verschil is in transcriptieprofielen van het hele genoom tussen de passages 1 tot 4 6,14.

1. Primaire celcultuur

OPMERKING: Zorgvuldige omgang met de primaire cellen is cruciaal. Het hele protocol moet zware behandeling en overmatig pipetteren van de primaire cellen vermijden.

  1. Voeg met behulp van een steriele serologische pipet 5 ml collageen toe aan een weefselkweekschaaltje van 100 mm (TC) om het schaaltje voor te coaten. Incubeer de TC-schaal met collageen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten.
  2. Zuig met behulp van een steriele serologische pipet het collageen uit de TC-schaal op en vervang het door 8 ml voorontdooid volledig luchtwegepitheelcelmedium (AEC) aangevuld met 2% (v/v) penicilline-streptomycine en 1% (v/v) amfotericine B (Tabel 1).
  3. Ontdooi één injectieflacon (met 5 x 105 cellen) primaire normale humane bronchiale epitheelcellen (NHBE) in een waterbad bij 37 °C.
  4. Voeg met een steriele serologische pipet van 5 ml druppelsgewijs 1 ml voorontdooid volledig AEC-medium toe aan de cellen om de NHBE-cellen te acclimatiseren en verzamel alle cellen in een steriel conisch buisje van 15 ml.
  5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 212 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het medium voorzichtig uit de tube en suspendeer de cellen in de overgebleven mediumdruppels in de tube door zachtjes te tikken.
    OPMERKING: Overmatig en hard tikken moet worden vermeden.
  6. Voeg met behulp van een steriele serologische pipet van 5 ml langzaam 2 ml volledig AEC-medium toe aan de geresuspendeerde cellen en verzamel alle cellen.
  7. Voeg de cellen toe aan de plaat die vooraf is toegevoegd met 8 ml volledig AEC-medium. Beweeg de TC-schaal zijwaarts om de cellen in de schaal gelijkmatig te verdelen.
  8. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 85%-95% vochtige CO2 -celkweekbroedmachine. Bekijk na 24 uur de NHBE-cellen onder de microscoop op 10x of 20x voor hun hechting aan de TC-schaal en groei. Als de cellen in het medium zijn gesuspendeerd, zijn er dode cellen te zien.
  9. Zuig na 48 uur het oude medium uit de TC-schaal op met een steriele serologische pipet.
  10. Voeg met behulp van een steriele serologische pipet 10 ml voorverwarmd, volledig AEC-medium toe aan de cellen. Voeg de media langzaam toe aan een hoek; Vermijd direct gieten over de bovenkant van de cellen.
  11. Verander de volledige AEC-media elke 48 uur totdat de cellen 95%-100% samenvloeien.

2. Lucht-vloeistof interface cultuur

  1. Voeg met behulp van een P200-pipet 100 μL collageen toe aan een voorgecoate transwell-insert van 6,5 mm met een polyestermembraan met een poriën van 0,4 μm (hierna inserts genoemd) en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
  2. Zuig met een steriele serologische pipet het medium op uit de confluente NHBE-cellen.
  3. Voeg 5 ml 1x Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) met een steriele serologische pipet toe aan een hoek van de TC-schaal.
  4. Draai de plaat voorzichtig rond om de cellen te wassen en zuig de 1x DPBS op met een steriele serologische pipet. Zorg ervoor dat cellen op geen enkele stap tijdens het protocol uitdrogen.
  5. Voeg met behulp van een serologische pipet 5 ml trypsinLE toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C in een vochtige CO2 -celkweekreactor totdat alle cellen van de bodem van de plaat zijn gedissocieerd.
  6. Verzamel met behulp van een steriele serologische pipet alle cellen in een conische buis van 15 ml. Voeg met een steriele serologische pipet 3 ml trypsine toe aan het TC-schaaltje en verzamel eventuele resterende cellen.
  7. Pellet de cellen door centrifugeren bij 212 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het medium weg en tik zachtjes op het buisje om de cellen in de overgebleven trypsinedruppels in het buisje te suspenderen.
  8. Voeg met behulp van een serologische pipet 2 ml volledig AEC-medium toe aan de geresuspendeerde cellen.
  9. Tel de cellen met behulp van een hemacytometer of geautomatiseerde cellenteller.
  10. Verdun de cellen met volledige AEC-media, waarbij elke insert 5 x 104 cellen ontvangt in een volume van 200 μl.
  11. Breng de inzetstukken met een steriele tang over naar een leeg putje in een kweekschaaltje met 24 putjes.
  12. Voeg met behulp van een P1000-pipet 500 μl volledige AEC-media toe aan de basale put van de plaat.
  13. Breng met een steriele tang de inzetstukken terug naar de basale put met toegevoegde volledige AEC-media.
  14. Voeg met een P200-pipet 5 x 104 geresuspendeerde NHBE-cellen in 200 μl van het volledige AEC-medium toe aan de apicale zijde van de insert. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 85% - 95% vochtige CO2 -celkweekoven.
  15. Observeer de cellen na 24 uur onder de microscoop om te zien of ze een samenvloeiende laag in de put hebben gevormd.
    OPMERKING: Als de cellen geen confluente laag vormen, vervang dan het basale AEC-medium elke 48 uur door vers, volledig AEC-medium totdat de cellen een confluente monolaag vormen. Breng tijdens het verwisselen van basale media de inzetstukken met een steriele tang over naar het lege putje. Zuig het oude medium op met een P1000-pipet, voeg vers medium toe en plaats de inzetstukken terug in het nieuwe, volledige AEC-medium.
  16. Zodra de cellen samenvloeien, brengt u de inzetstukken over naar een leeg putje met een steriele tang. Zuig met een P1000-pipet al het basale AEC-medium op.
  17. Voeg met een P1000-pipet 500 μL vers compleet lucht-vloeistof interfacedifferentiatie (ALI) medium aangevuld met 2% (v/v) penicilline-streptomycine en 1% (v/v) amfotericine B toe aan de basale put.
  18. Breng de inserts over naar de basale put met toegevoegd compleet ALI-medium met behulp van een steriele tang. Zuig met een P200-pipet het apicale AEC-medium voorzichtig op uit de put.
    OPMERKING: De apicale zijde mag niet worden toegevoegd met het volledige ALI-medium. Zuig het AEC-medium voorzichtig op vanaf de apicale zijde om celloslating te voorkomen.
  19. Incubeer de cellen bij 37 °C in een vochtige CO2 -celkweekoven. Breng de inserts na 48 uur met een steriele tang over in een leeg putje.
  20. Zuig met een P1000-pipet het oude medium op en voeg vers 500 μL volledig ALI-medium toe.
  21. Plaats met een steriele tang de inserts terug in het putje met vers medium. Blijf het volledige ALI-medium elke 48 uur verversen tot dag 28 (vier weken).
  22. Voeg op dag 28 met behulp van een P200-pipet 100 μL 1x DPBS toe aan de apicale zijde van de inserts en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een vochtige CO2 -celkweekoven. Zuig de 1x DPBS aan met een P200 pipet.
    OPMERKING: DPBS moet worden toegevoegd door op de muur te gieten in plaats van rechtstreeks naar de cellen. Vermijd tijdens het opzuigen van DPBS het aanraken van het epitheel en krachtig pipetteren, omdat eventuele schade aan het epitheel de integriteit van het epitheel (weefselachtig) in gevaar kan brengen.
  23. Evalueer vanaf de 2eweek van differentiatie de slijmproductie door onder de microscoop een mogelijke donkerdere laag als gevolg van slijm op het epitheel waar te nemen. Het overtollige slijm kan worden verwijderd door DPBS-wassen. Voeg kort 200 μL 1x DPBS toe aan de apicale zijde van de inserts op een plaat met 24 putjes en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C in een vochtige CO2 -celkweekoven. Verwijder DPBS en houd de plaat op 37 °C in een vochtige CO2 -celkweekoven.

3. Bepaling van de ciliaire slagfrequentie

OPMERKING: Voor de bepaling van CBF bij 37 °C (indien nodig) moet de microscoop een incubator voor de omgevingskamer hebben die 5% CO2 levert bij 37 °C en vochtigheid.

  1. Zet de microscoop met de aangesloten computer en de omgevingskamer aan. Open de deur van de kamer om de plaat met de inzetstukken op de microscooptafel te plaatsen.
  2. Zodra de plaat op het podium is geplaatst, sluit u de kamer. Beweeg met behulp van de bedieningsknop van de microscooptafel de plaat om de inzetstukken in beeld te brengen.
  3. Selecteer de lens met een vergroting van 20x in de fasecontrastmodus. Bekijk de plaat door het oculair van de microscoop en stel de cel scherp met behulp van de afstemknop.
  4. Klik op het computerscherm op het SAVA-systeempictogram . Het SAVA-programma moet worden geïnstalleerd op de computer die op de microscoop is aangesloten.
  5. Klik in de software-interface op Experiment configureren. Klik op het volgende tabblad op Experiment maken.
  6. Er verschijnt een nieuw tabblad, met details over de map waarin de gegevens worden opgeslagen in de Mapnaam van experiment invoeren en experimentdetails in Experimentbeschrijving invoeren en vervolgens op OK klikken.
  7. Klik op Het experiment dat is gemaakt en wordt weergegeven in de directory onder de experimenten.
  8. Klik op Wijzigen en geef voorbeelddetails op in de voorbeeldbeschrijving. Klik op Toevoegen en vervolgens op Afsluiten om dit tabblad te verlaten.
  9. Selecteer in de hoofdsoftware-interface op de experimentsleuf het experiment dat is gemaakt in het vervolgkeuzemenu op de hoofdinterface.
  10. Klik op Video opnemen en bewaak de ciliaire beatfrequentie (CBF) op het computerscherm. Het scherm toont een gefocuste ciliaire beweging.
  11. Neem voor elke insert 6 verschillende willekeurige velden op gedurende 2,1 s met 120 frames per seconde. Klik op Video opslaan om de CBF-gegevens te controleren.
  12. Om gegevens te analyseren, klikt u op Video analyseren op de software-interface. Klik op het volgende tabblad op OK.
  13. Klik op het volgende tabblad op Alles analyseren. Download de spreadsheet die voor elk experiment in de SAVA-gegevensverzamelingsmap van de computer op de computer wordt gegenereerd.
  14. Neem de Gaussiaanse gemiddelde frequentie voor de presentatie van gegevens.

4. Kwantificering van transepitheliale elektrische weerstand

OPMERKING: TEER-kwantificering heeft vloeistof nodig aan de apicale zijde van het luchtwegepitheel. Om dit protocol vast te stellen, voegt u 100 μL 1x DPBS toe aan de apicale zijde van het luchtwegepitheel in de inserts die al het basale medium (experimenteel) of 500 μL 1x DPBS bevatten.

  1. Zet de EVOM2 volt ohmmeter aan met de aan/uit-schakelaar. Sluit de testweerstand aan op de EVOM2 in de INPUT-sleuf.
  2. Bewaak de meting op het EVOM2-scherm. Als het boven of onder de 1000 is, moet het worden gekalibreerd. Draai met een tang de ADJ-schakelaar op de EVOM2 volt ohmmeter totdat deze een uniforme waarde van 1000 aangeeft.
  3. Neem een leeg inzetstuk voor experimentele controlemeting. Voeg met behulp van een P200-pipet 100 μL 1x DPBS toe aan de apicale zijde van de lege insert, terwijl 500 μL 1x DPBS wordt toegevoegd aan de basale zijde met een P1000-pipet.
  4. Koppel de testweerstand los en sluit de STX2-elektrode aan op de INPUT-sleuf op EVOM2. Reinig de STX2-elektrode voorzichtig met 70% ethanol.
  5. Plaats de STX2-elektrode in de emptyinsert met 1x DPBS, waarbij u de kortere elektrodepoot op het apicale deel van elke insert houdt en de langere elektrodepoot op het basale deel.
  6. Registreer de stabiele meting op het EVOM2-scherm, aangezien de meting kan fluctueren als gevolg van beweging of andere onbepaalde redenen.
  7. Plaats de STX2-elektrode in het inzetstuk met 28-daags gedifferentieerd epitheel, waarbij u het kortere elektrodebeen op het apicale deel van elk inzetstuk en het langere elektrodebeen op het basale deel in het medium houdt.
  8. Noteer de stabiele meting op het EVOM2-scherm. Voer verschillende onafhankelijke metingen uit om een betrouwbaar gemiddelde te berekenen. Trek de achtergrond (lege insteekmeting) af van de experimentele insteekwaarde voor berekening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We evalueerden zowel de ciliaire functie als de membraanondoordringbaarheid van het luchtwegepitheel verkregen door het differentiëren van primaire NHBE-cellen van twee onafhankelijke geanonimiseerde donoren (twee niet-rokende, gezonde volwassenen of volwassenen met COPD, vrouwen boven de 50 jaar). Voor het bepalen van de ciliaire functie bepaalden we de CBF van het 28-daagse gedifferentieerde luchtwegepitheel. We zagen dat CBF ten minste 3 Hz bereikte voor beide luchtwegepitheel, wat ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Humaan primair luchtwegepitheel (ALI-cultuur) wordt steeds vaker gebruikt als in-vitrolongmodel voor biologische beoordelingen om functies en mechanismen te onderzoeken en het gebruik van dieren te verminderen14. ALI heeft verschillende voordelen ten opzichte van elke monolaagse ondergedompelde cultuur. Het biedt bijvoorbeeld een weefselachtig pseudogestratificeerd luchtwegepitheel dat de apicale zijde van de longluchtweg nabootst

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door NIH P20GM113123 en UND SMHS-pilotsubsidie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x DPBSThermo Fisher Scientific, USA14190-144
Airway Epithelial Cell Growth MediumPromoCell, GermanyC-21060
Amphotericin BThermo Fisher Scientific, USA15290-026
EVOM2 volt OhmmeterWorld Precision Instruments, USANiet van toepassing
Heparine oplossingSTEMCELL technologies, USA07980
Hydrocortison stockSTEMCELL technologies, USA07926
Microscope: Leica DMI8 (Leica microscoop) met 120f/sec hogesnelheidscamera (Basler) gekoppeld aan de microscoop. Microscoop ook vastgezet met stage chamber incubator i8.Leica, USANiet van toepassing
Penicilline-StreptomycineCorning, USA30-002-CI
PneumaCult-ALI basismediumSTEMCELL technologies, USA05002
PureColAdvanced BioMatrix, USA5005
Sisson-Ammons videoanalyse (SAVA) systeem. Software V.2.1.15Amson Engineering, USANiet van toepassing

Referenties

  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States. Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).
  3. LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae. Front Immunol. 11, 3(2020).
  4. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  5. Calven, J., Ax, E., Radinger, M. The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis. Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).
  6. Talukdar, S. N., et al. RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening. Virus Res. 327, 199060(2023).
  7. Osan, J., et al. Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease. Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).
  8. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  9. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).
  10. Rhee, C. S., et al. Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells. Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).
  11. Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues. Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).
  12. Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography. Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).
  13. Yuksel, H., Turkeli, A. Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood. Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).
  14. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  15. Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium. STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).
  16. Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition. J Virol. 97 (7), e0039423(2023).
  17. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Front Pediatr. 2, 111(2014).
  18. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1, 14(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lucht-vloeistofinterfaceciliaire slagfrequentietransepitheliale elektrische weerstandpseudostratificeerd epitheelbronchiale epitheelcellenhogesnelheidsmicroscopieSAVA-systeem
Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.