Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel

Summary

Lucht-vloeistof interfacecultuur wordt vaak gebruikt om pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen door primaire normale menselijke bronchiale epitheelcellen te differentiëren die de apicale zijde van de longluchtweg nabootsen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bepalen van de kwaliteit door de biofysische eigenschappen te monitoren, zoals ciliaire functie en membraanintegriteit.

Abstract

Het differentiëren van primaire longluchtwegepitheelcellen in de lucht-vloeistofinterface (ALI) is een populaire techniek om een meercellig pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen dat de apicale zijde van de longluchtweg nabootst. Hoewel de differentiatie van primaire longluchtwegcellen wordt verwacht, biedt de beoordeling van biofysische eigenschappen zoals ciliaire functie en membraanondoordringbaarheid een kwaliteitsbeoordeling van het luchtwegepitheel en garandeert het de betrouwbaarheid van het experiment. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van meercellig pseudogestratificeerd luchtwegepitheel in ALI-cultuur en beoordelen we twee belangrijke biofysische eigenschappen: ciliaire functie en membraanondoordringbaarheid. Om de ciliaire functie te bepalen, hebben we de ciliaire beweging van een 4 weken durend gedifferentieerd luchtwegepitheel vastgelegd met behulp van een hogesnelheidscamera die is bevestigd aan een omgekeerde microscoop, gevolgd door het kwantificeren van de ciliaire slagfrequentie (CBF) met behulp van het Simon Amon Video Analysis (SAVA) -systeem. We hebben ook de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) gemeten met behulp van een volt-ohmmeter om de integriteit van de epitheliale barrière van het luchtwegepitheel te bepalen.

Introduction

Chronische aandoeningen van de luchtwegen zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD) en cystische fibrose zijn wereldwijd enkele van de belangrijkste gezondheidsproblemen¹. De prevalentie van luchtwegaandoeningen veroorzaakt door virussen zoals het menselijke influenza A-virus, het respiratoir syncytieel virus (RSV) en het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) veroorzaken ook een economische en volksgezondheidslast². Daarom is er een enorme behoefte aan het ontwikkelen van behandelingsregimes voor aandoeningen van de luchtwegen die leiden tot onomkee....

Protocol

Het protocol moet worden uitgevoerd in een steriele toestand onder een bioveiligheidsniveau 2 laminaire stromingskap (bioveiligheidskast). Al het medium en de oplossingen moeten vóór gebruik worden ontdooid bij 37 °C. Centrifugeren moet worden uitgevoerd bij 4 °C. Alle materialen die in het experiment worden gebruikt, moeten steriel zijn. De primaire cellen (geanonimiseerde donor) werden verkregen in samenwerking met Dr. Kristina Bailey van het University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE. De primaire cellen zijn afkomstig van geanonimiseerde donoren en de cellen vallen niet onder de NIH Human Subject. De cellen werden ver....

Results

We evalueerden zowel de ciliaire functie als de membraanondoordringbaarheid van het luchtwegepitheel verkregen door het differentiëren van primaire NHBE-cellen van twee onafhankelijke geanonimiseerde donoren (twee niet-rokende, gezonde volwassenen of volwassenen met COPD, vrouwen boven de 50 jaar). Voor het bepalen van de ciliaire functie bepaalden we de CBF van het 28-daagse gedifferentieerde luchtwegepitheel. We zagen dat CBF ten minste 3 Hz bereikte voor beide luchtwegepitheel, wat ve.......

Discussion

Humaan primair luchtwegepitheel (ALI-cultuur) wordt steeds vaker gebruikt als in-vitrolongmodel voor biologische beoordelingen om functies en mechanismen te onderzoeken en het gebruik van dieren te verminderen¹⁴. ALI heeft verschillende voordelen ten opzichte van elke monolaagse ondergedompelde cultuur. Het biedt bijvoorbeeld een weefselachtig pseudogestratificeerd luchtwegepitheel dat de apicale zijde van de longluchtweg nabootst

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, USA	14190-144
Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell, Germany	C-21060
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific, USA	15290-026
EVOM2 volt Ohmmeter	World Precision Instruments, USA	Not applicable
Heparin Solution	STEMCELL technologies, USA	07980
Hydrocortisone stock	STEMCELL technologies, USA	07926
Microscope: Leica DMI8 (Leica Microscope) with 120f/sec high-speed camera (Basler) associated with the microscope. Microsope also fixed with stage chamber incubator i8.	Leica, USA	Not applicable
Penicillin-Streptomycin	Corning, USA	30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL technologies, USA	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, USA	5005
Sisson-Ammons video analysis (SAVA) system. Software V.2.1.15	Amson Engineering, USA	Not applicable