Methodenartikel

Operationele en biocontainmentprocedures van een faciliteit voor laboratoriummuizen met een natuurlijk microbioom: immunofenotyperingsprocedure

DOI:

10.3791/67100

⸱

13 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIH QUEST Center for Responsible Research, Berlin Institute of Health (BIH) at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), 3Institute of Microbiology, Infectious Diseases and Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Experimental and Clinical Research Center (ECRC) & Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), 5Department of Experimental Neurology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Klinik und Hochschulambulanz für Neurologie, 6Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 7Einstein Center for Neuroscience, 8German Center for Cardiovascular Research (DZHK), partner site Berlin, 9Department of Neuropathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10Cluster of Excellence, NeuroCure, 11German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Berlin, 12Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 13Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Freie Universität Berlin, 14Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin/FEM, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 15Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 16German Center for Lung Research (DZL), associated partner site, Berlin, 17Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 18Division of Toxicology, Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 19Institute of Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 20German Cancer Research Center, 21German Cancer Consortium, partner site Berlin, 22Department of Radiology (including Pediatric Radiology), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 23Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 24Department of Medicine II, Faculty of Medicine, Medical Center - University of Freiburg

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de structuur en operationele procedures, inclusief microbiële inperkingsmaatregelen van een faciliteit voor "Wilding-muizen" met behulp van bloedafname voor immunofenotypering als voorbeeld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van laboratoriummuizen met een natuurlijk microbioom, zoals "Wildling-muizen", biedt een veelbelovend onderzoeksinstrument voor zowel de fundamentele als de toegepaste wetenschap vanwege hun sterke gelijkenis met het menselijke superorganisme. Het fokken en onderhouden van deze muizen, die een divers microbioom herbergen, waaronder bacteriën, virussen en parasieten, vormen echter aanzienlijke uitdagingen voor de veehouderijfaciliteiten van onderzoeksinstellingen. Om deze uitdagingen aan te gaan, werd een gespecialiseerd faciliteitsconcept ontwikkeld voor het huisvesten van "Wildling-muizen" bij Charité - Universitätsmedizin Berlin. Deze aanpak omvatte het ontwerpen van een faciliteit met specifieke structurele kenmerken en operationele protocollen om het natuurlijke microbioom effectief in te dammen en zo gebieden met hogere hygiënenormen te beschermen.

Er wordt een methodologie gedemonstreerd voor bloedafname van zowel gespecificeerde pathogeenvrije (SPF) als "Wildling-muizen" voor immunofenotypering, waarbij de nadruk wordt gelegd op de workflow en biocontainmentmaatregelen die in de faciliteit zijn geïmplementeerd. Opmerkelijke resultaten tonen aan dat "Wildling-muizen" die worden blootgesteld aan een natuurlijk microbioom verschillende immuuncelpopulaties ontwikkelen, die aanzienlijk worden verminderd bij muizen die onder strikte hygiënische omstandigheden worden gefokt en gehouden.

Het belang van deze studie ligt in het potentieel om onderzoekers toegang te geven tot muizen die een natuurlijk microbioom en een volwassen immuunsysteem bezitten dat vergelijkbaar is met dat van menselijke volwassenen. Deze aanpak zou de vertaalbaarheid van preklinische bevindingen naar de klinische praktijk kunnen verbeteren, waardoor het gebied van biomedisch onderzoek wordt bevorderd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimenteren bij muizen is nog steeds onmisbaar in de basis- en toegepaste wetenschap, zoals preklinisch en toxicologisch onderzoek. De standaardisatie van hygiëne in laboratoriumomgevingen, gericht op het verminderen van biologische ruis en het minimaliseren van variabiliteit in experimentele resultaten, heeft echter geleid tot de uitsluiting van natuurlijke microbiota voor een groot deel. De omstandigheden waaronder hygiënisch gestandaardiseerde, gespecificeerde pathogeenvrije (SPF) laboratoriummuizen worden geboren en gehouden, verschillen dus van de werkelijke omstandigheden waaraan mensen en dieren normaal gesproken worden blootgesteld. Deze mismatch tussen laboratoriumomstandigheden en de natuurlijke omgeving waarin menselijke ziekten voorkomen, geeft aanleiding tot de "standaardisatiedrogreden": ervan uitgaan dat het minimaliseren van variatie in experimentele omstandigheden de translationele resultaten verbetert. In werkelijkheid beperkt het echter de biologische relevantie van de bevindingen 1,2. Onderzoek heeft bijvoorbeeld aangetoond dat de afwezigheid van microbiële en omgevingsdiversiteit bij SPF-muizen kan resulteren in een onderontwikkeld immuunsysteem, waardoor de validiteit van immunologische en preklinische studies wordt ondermijnd3.

Er zijn verschillende benaderingen voorgesteld om de biologische variatie in muismodellen aan te pakken, elk met zijn eigen voordelen en beperkingen, waaronder co-housing met wilde muizen en dierenwinkelmuizen 3,4,5,6,7,8, sequentiële blootstelling aan commensalen 9, het houden van de dieren in buitenverblijven10 of op beddengoed van grote dieren11, en fecale transplantaties van wilde muizen12. Een veelbelovend nieuw muismodel voor preklinisch en toxicologisch onderzoek is het "Wildling-muizen"-model, dat bestaat uit standaard laboratoriummuizenstammen die een natuurlijk microbioom herbergen13. Deze "Wildling-muizen" worden gegenereerd door embryo's van laboratoriummuizenstammen te transplanteren in in het wild gevangen muizen. Tijdens de geboorte verwerven de laboratoriummuizenstammen het natuurlijke microbioom van hun draagmoeders, waardoor de natuurlijke inoculatie wordt nagebootst die plaatsvindt tijdens de bevalling bij de mens13. "Wildling-muizen" kunnen worden gefokt zoals elke andere laboratoriummuizenstam, waarbij hun natuurlijke microbioom van generatie op generatie behouden blijft.

"Wildling-muizen" herbergen een diverse microbiota - waaronder bacteriën, virussen en parasieten - die doorgaans worden uitgesloten van SPF-muizenfaciliteiten. Het behoud van een natuurlijk microbioom in onderzoeksfaciliteiten brengt dan ook uitdagingen met zich mee, aangezien deze microben moeten worden ingeperkt zonder de algemene hygiënenormen van SPF in gevaar te brengen.

Bij Charité - Universitätsmedizin Berlin werd een speciale faciliteit voor "Wildling-muizen" opgericht, gescheiden van de SPF-gebieden door strikte biocontainmentmaatregelen. De faciliteit omvat kweek- en experimenteerruimtes, die ervoor zorgen dat het natuurlijke microbioom van "Wildling-muizen" in stand wordt gehouden terwijl SPF-gebieden worden beschermd (Figuur 1).

De stichtende paren van Charité's kolonie werden geïmporteerd uit de kolonie "Wilding muizen" die was opgericht bij het Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Duitsland. Ze worden voorzien van een gezondheidscertificaat en worden gecontroleerd met een uitgebreid panel voor zoönotische pathogenen vóór de invoer van de koloniestichters. Sentinels zullen worden gebruikt om het microbioom in de loop van de tijd te monitoren. Zowel SPF- als "Wildling-muizen" worden onder dezelfde omstandigheden gehuisvest. De muizen worden gekweekt en bij voorkeur gehouden in individueel geventileerde kooien (IVC) type II lang in groepen van vijf muizen. De temperatuur in de faciliteit is 22 °C en de licht/donker-cyclus is 12 uur. De muizen krijgen standaard voer op basis van graan en kraanwater. Sterilisatie van strooisel en verrijkingsartikelen is niet nodig voor "Wildling-muizen". Door deze items in autoclaaf te laten staan, wordt echter voorkomen dat materialen worden verwisseld in gebieden waar SPF-muizen zijn gehuisvest.

In dit protocol worden de immunofenotyperingsprocedures voor zowel SPF- als "Wildling-muizen" gedemonstreerd, waarbij de strikte microbiële inperkingsprotocollen in de "Wildling-muis"-faciliteit worden benadrukt. Deze maatregelen garanderen de integriteit van SPF-omgevingen en bieden tegelijkertijd de voordelen van het werken met muizen die een natuurlijk microbioom dragen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Indeling van de faciliteit voor Wildling-muizen. E1 = toegang tot de faciliteit. Pijlen geven de toegangsweg tot de faciliteit aan. E2 = toegang tot de laminaire luchtstroomcabine van buiten de faciliteit. PA = watersluis voor het personeel met luchtdouche. AS = luchtdouche. R1, R2 = kamers voor het fokken van Wildling-muizen. R3 = ruimte voor het houden van Wilding muizen. R4 = ruimte voor het houden van SPF-muizen. PR1 = procedurekamer voor SPF-muizen. PR2 = procedurekamer voor Wildling-muizen. SB = steriele werkbank. EE = nooduitgangen. CR = kleedkamer voor de LAF-cabine. LAF = laminaire luchtstroomcabine voor interventies onder beschermende luchtstroom. A = autoclaaf. ER = technische ruimte. Groene pijlen geven routes aan die toegankelijk zijn bij het werken met SPF-dieren, en gele pijlen geven paden aan die beschikbaar zijn voor het werken met Wildling-muizen na het douchen. Blauwe pijlen geven de toegang alleen aan voor het personeel van de veehouderij. De rode lijn markeert de glazen wand in de LAF-cabine, die de ruimte verdeelt in twee secties die toegankelijk zijn vanaf de E1 via PR2 of vanaf de E2 via CR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De faciliteit voor het "Wilden van muizen" en procedures met levende dieren werden goedgekeurd door het verantwoordelijke staatsbureau voor dierproeven, "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). De belangrijkste stappen van het protocol zijn samengevat in Figuur 2.

1. Toegang krijgen tot de Wilding-faciliteit

  1. Krijg een persoonlijke introductie tot de operationele en biocontainmentprocedures van de faciliteit van de verantwoordelijke dierenwelzijnsfunctionaris.
  2. Verkrijg de transpondersleutel om de faciliteit voor "Wildling-muizen" te betreden en boek de procedurekamers via het online boekingssysteem.

2. Het betreden van de faciliteit voor "Wildling-muizen"

  1. Deponeer de kleding in de kleedkamer.
  2. Verander in gebiedskleding: broek, kasak en wegwerpschoenovertrekken (Figuur 3).

3. Bloed afnemen van SPF-muizen in het SPF-gebied

  1. Breng de SPF-muizen (mannetje en vrouwtje, 8-20 weken) over van de ruimte waar ze worden gehouden (R4) naar de behandelkamer voor SPF-dieren (PR1) in een gesloten IVC-kooi.
  2. Schakel de laminaire stromingsbank in en desinfecteer het werkoppervlak met 70% Vol. ethanol. Werk in de bank.
  3. Inspecteer capillaire buizen op gebroken of afgebroken delen om een verhoogd risico op breuk of schade te voorkomen.
  4. Onder korte algehele narcose met isofluraan (inductie bij 5% isofluraan in met zuurstof verrijkte medische lucht, gevolgd door 1,5%-2,0% voor onderhoud), na verlies van de pedaalterugtrekkingsreflex (zoals aangegeven via teenknijpen), de nekaders van de muizen samendrukken door het nekvel vast te pakken.
  5. Zet met één hand de kop van het dier vast met duim en wijsvinger. Breng een vers capillair in een hoek van 45° in de mediale canthus van het oog onder het knipvlies. Zorg ervoor dat het capillair zich tussen de oogbol en de benige oogkas bevindt.
    OPMERKING: Om trauma te voorkomen, mag u de punt van de capillaire buis het oppervlak van het oog niet laten raken.
  6. Breng het capillair door het sinusmembraan met een zachte axiale draaiende beweging. Blijf de buis aan de achterkant van de baan draaien totdat er bloed stroomt. Verzamel minimaal 15 μl bloed in een bloedafnamebuisje met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (ongeveer 1 druppel).
  7. Voordat u het capillair verwijdert, maakt u de greep op het nekvel los om het bloeden in het weefsel tot een minimum te beperken. Om een goede hemostase te garanderen, gebruikt u een schoon gaasje of wattenstaafje om het bloeden te stoppen.
  8. Draai de buis lichtjes om bloed en EDTA te mengen. Schud de tube niet. Bewaar het bloedmonster op ijs.
  9. Desinfecteer het werkoppervlak en schakel de laminaire stromingsbank uit. Breng SPF-muizen in een gesloten IVC terug naar de SPF-behuizingsruimte (R4).

4. Het betreden van het gebied voor "Wildling-muizen"

  1. Trek schoenen en sokken uit in de voorruimte van de luchtdouche (PA). Trek sokken en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) voor het hele lichaam aan, bestaande uit Tyvek-overall, haarnetje, indien nodig, katoenen handschoenen, nitrilhandschoenen en gezichtsmaskers (Figuur 3).
  2. Betreed de luchtdouche in sokken via de zelfklevende vloerbedekking. Hef tijdens het douchen de armen op en maak een draai van 360°.
  3. Verlaat de luchtdouche en trek aan de andere kant schoenen aan.

5. Bloed afnemen van "Wilding muizen"

  1. Breng "Wildling-muizen" (mannetje en vrouwtje, 8 - 20 weken) over van de ruimte waar ze in een gesloten IVC-kooi worden gehouden (R3) naar de behandelkamer (PR2).
  2. Schakel de laminaire stromingsbank in en desinfecteer het oppervlak van de werkruimte.
  3. Volg de procedures die worden beschreven voor het bemonsteren van SPF-muizen in sectie 3, stappen 2-8.
  4. Verwissel na het voltooien van de bloedafname van handschoenen. Desinfecteer alle materialen en oppervlakken. Schakel de laminaire stromingsbank uit.

6. Exporteren van bloedmonsters uit het gebied "Wildling-muizen" via de laminaire luchtstroom (LAF) kast

LET OP: De procedurekamer (PR2) bevat een LAF-kast, die dienst doet als materiaalsluis en steriele interventieruimte. Monsters worden overgebracht via de LAF-cabine. Het interieur is zowel van binnenuit (via E1 en PR2) als van buiten (via E2 en CR) toegankelijk via het Wildlinggebied en wordt in het midden gescheiden door een glazen wand met een schuifdeur (Figuur 1). Er zijn twee personen nodig om materialen te exporteren: Persoon 1 (in het Wildling-gebied [via PR2]) voert stap 6.1 en 6.2 uit. Persoon 2 (buiten het Wildling-gebied [via E2]) voert de stappen 6.3-6.5 uit.

  1. Desinfecteer monstercontainers. Verwijder sample containers via de schuifdeur in de glaswand van de LAF cabine.
  2. Nadat de overdracht van de monstercontainers aan persoon 2 is voltooid, ontvangt u beschermende kleding van persoon 2 (draagt beschermende kleding in het kielslot van de cabine) aan de andere kant van de LAF-cabine en gooit u deze weg. Desinfecteer alle oppervlakken.
  3. Trek beschermende kleding aan bij de LAF-toegang voor de LAF-cabine (CR, Figuur 1).
  4. Ontvang gedesinfecteerde monstercontainers uit het Wildling-gebied zonder contact via de schuifdeur in de glazen wand van de LAF-cabine.
  5. Verwijder beschermende kleding en leid deze door de schuifdeur naar het binnengedeelte van de LAF-cabine voor verwijdering.

7. Het verlaten van de faciliteit voor "Wildling-muizen"

  1. Laat wegwerpoveralls en sportschoenen in de ruimte achter. Gooi het haarnetje, de rubberen handschoenen en het gezichtsmasker weg.
    LET OP: Schoenen en overalls kunnen worden hergebruikt.
  2. Ga direct in de gebiedssokken de luchtdouche in. Hef de armen op en maak een draai van 360° tijdens het douchen.
  3. Verlaat de luchtdouche en plaats de sokken in de wasopvangbak. Trek de sokken en schoenen en wegwerpschoenovertrekken aan. Afzetruimte kleding in de kleedkamer in de wasverzamelaar. Trek de kleding aan in de kleedkamer

8. Verwerken en analyseren van bloedmonsters

  1. Breng bloedmonsters naar het laboratorium.
    1. Bereid een cocktail voor het kleuren van fluoroforen antilichamen: Voeg voor elk monster 0,25 μL Alexa Fluor 700 anti-muis CD45, 0,25 μL Brilliant Violet 605 anti-muis TCR-β keten, 0,25 μL APC anti-muis CD4, 0,25 μL Brilliant Violet 785 anti-muis CD8, 0,25 μL FITC anti-muis CD44 en 0,25 μL PerCP/Cyanine5.5 anti-muis CD62L toe aan 50 μL flowcytometriebuffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing, 2 mM EDTA, 0,1% runderserumalbumine, 4 °C). Blijf in het donker op ijs tot stap 8.8.
      OPMERKING: De gebruikte fluoroforen kunnen worden aangepast aan de configuratie van de flowcytometer die zal worden gebruikt voor het nemen van monsters.
  2. Desinfecteer bloedafnamebuisjes. Voeg 2 ml ijskoude flowcytometriebuffer toe aan een polystyreenbuis van 5 ml met ronde bodem. Plaats de tube op ijs.
  3. Open de bloedafnamebuis. Voeg 10 μL bloed toe aan het buisje met de flowcytometriebuffer en pulsvortex.
  4. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten op 4 °C.
  5. Aspiratie van het bovenlevende. Voeg 1 ml lysisbuffer van rode bloedcellen (RBC) toe, pulsvortex en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  6. Voeg 100 μL 10x PBS toe. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten op 4 °C.
  7. Herhaal stap 8.5-8.6.
  8. Aspiratie van het bovenlevende. Voeg 50 μL antilichaamkleuringscocktail, vortex toe en incubeer gedurende 20 minuten op ijs in het donker.
  9. Voeg 1 ml flowcytometriebuffer toe. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten op 4 °C.
  10. Aspiratie van het bovenlevende. Voeg 180 μL flowcytometriebuffer toe.
  11. Voeg 20 μL SYTOX Blue Dead Cell Stain toe (eindconcentratie 1:1000) voor het onderscheid tussen levend en dood.
  12. Verkrijg monsters op een flowcytometer en analyseer de gegevens met behulp van de flowcytometeracquisitiesoftware of het data-analyseprogramma voor flowcytometrie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Wilde muizen" herbergen mogelijk micro-organismen die doorgaans worden uitgesloten van SPF-faciliteiten, wat een uitdaging vormt voor de veehouderijpraktijken binnen onderzoeksinstellingen die strenge hygiënenormen handhaven. In de afgelopen 4 jaar hebben wetenschappers en dierenartsen van Charité - Universitätsmedizin Berlin en het Duitse Centrum voor de Bescherming van Proefdieren (Bf3R) een faciliteit ontwikkeld voor muizen met een natuurlijk microbioom, met strenge biocontainmentmaatregelen door middel van een gezamenlijke inspanning (Figuur 1). Om dit ontwerp te realiseren, onderging een bestaande muizenfaciliteit een uitgebreide reconstructie, waaronder de installatie van een luchtdouche en een laminaire luchtstroomcabine. De gebieden waar "Wildling-muizen" en SPF-muizen worden gefokt en gehouden, worden gescheiden door de luchtdouche en beide gebieden hebben aangewezen behandelkamers. Thermostabiel materiaal verlaat het gebied voor "Wildling-muizen" alleen via de autoclaaf, terwijl thermolabiele materialen, zoals monsters, via de LAF-kast kunnen worden geëxporteerd voor verdere verwerking in laboratoriumruimtes (Figuur 2). Strikte naleving van alle biocontainmentmaatregelen is essentieel om besmetting te voorkomen van gebieden waar de hygiënische voorwaarden van SPF worden gehandhaafd (Figuur 3). Gezamenlijk bieden het ontwerp en de biocontainmentmaatregelen van de faciliteit voor "Wilding mice" in Charité - Universitätsmedizin Berlin wetenschappers de mogelijkheid om onderzoek te doen met muizen die een natuurlijk microbioom herbergen, terwijl de verspreiding van micro-organismen naar delen van de dierfaciliteit met hogere hygiëneniveaus effectief wordt voorkomen.

Flowcytometrie is de gouden standaardmethode in cellulaire immunologie en wordt gebruikt om immuuncelpopulaties in bloed en weefsels te ondervragen als reactie op veranderde omgevingsomstandigheden. Volwassen mensen hebben bijvoorbeeld een aanzienlijk aantal geheugen-T-cellen die in het bloed circuleren, die zich ontwikkelen bij blootstelling aan micro-organismen uit de omgeving3. Hier werd flowcytometrie gebruikt om te zoeken naar geheugen-T-cellen in het bloed van muizen die werden gefokt en gehouden onder SPF-omstandigheden en in het bloed van "Wildling-muizen" (Figuur 4). "Wildling-muizen" gekoloniseerd met een natuurlijk microbioom, presenteren een aparte populatie van geheugen-T-cellen. Muizen die onder SPF-omstandigheden zijn gefokt en gehouden, hebben daarentegen sterk verminderde geheugen-T-cellen in de bloedcirculatie. Daarom kan flowcytometrie de impact van verschillende microbiële omgevingen op het immuuncompartiment karakteriseren. De gegevensgranulatie kan worden verhoogd door extra immuuncelmarkers op te nemen. Recent ontwikkelde benaderingen in flowcytometrie, zoals cytometrie door Time-of-Flight (CyTOF) en spectrale flowcytometrie, maken het mogelijk om informatie te verkrijgen over een groot aantal parameters en daardoor het aantal immuuncel(sub)populaties uit te breiden dat kan worden gekwantificeerd in hetzelfde bloed- en weefselmonster. Bovendien kan de productie van cellulaire cytokines ook worden beoordeeld door middel van flowcytometrie, wat inzicht geeft in de functie van cellen als reactie op een natuurlijk microbioom.

figure-results-1
Figuur 2: Workflow in de Wildling-faciliteit. Bloedafname en monsterverwerking zijn voorbeelden, maar kunnen worden vervangen door andere procedures, zoals chirurgische ingrepen met weefselafname en histologie. Voor afkortingen, zie Figuur 1 legenda. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Vergelijking van de vereisten voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor SPF- en Wildling-gebieden. In het SPF-gebied (links) bestaan standaard PBM's uit een enkele laag beschermende kleding. Het Wildling-gebied (rechts) daarentegen vereist een PBM-proces in drie stappen voordat het de luchtdouche betreedt: een kasac (beschermende onderkleding = stap 1) wordt onder de overall gedragen (stap 2). Deze extra laag helpt de hygiëne te behouden en kruisbesmetting tussen ruimtes te voorkomen. Na de luchtdouche moeten de daarvoor bestemde schoenen voor het Wildling-gebied worden gedragen (stap 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Immunofenotype van "Wildling-muizen". Bloedmonsters van mannelijke SPF-muizen (n = 5 muizen en "Wilding-muizen" (n = 5 muizen), leeftijd 14 weken, werden gekleurd met een cocktail van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen CD45, TCR-β-keten, CD4, CD8, CD44 en CD62L. Getallen zijn het aandeel van de ouderlijke poort ± standaarddeviatie. De gating-strategie wordt getoond voor SPF-muizen, met uitzondering van de laatste twee vlekken van SPF- en "Wildling-muizen". Bij "Wildling-muizen" zijn centrale en effectorgeheugen-T-cellen verhoogd in vergelijking met muizen die worden gekweekt en onderhouden onder SPF-omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen met een natuurlijk microbioom zijn een veelbelovend onderzoeksinstrument voor de basis- en toegepaste wetenschap vanwege hun grotere gelijkenis met het menselijke superorganisme 3,9,10,11,12. Pogingen om biologische complexiteit in muismodellen op te nemen, hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende benaderingen, elk met zijn eigen voordelen en beperkingen 3,7,8,9,10,11,12. "Wildling-muizen" combineren de voordelen van een gecontroleerde laboratoriumomgeving met een natuurlijk microbioom. Deze benadering handhaaft de stabiliteit in experimentele omstandigheden met behoud van de natuurlijke microbiële diversiteit die nodig is voor het bestuderen van complexe biologische interacties. Bijgevolg hebben biomedische therapieën die zijn ontwikkeld en getest in "Wildling-muizen" een groot potentieel voor succesvolle vertaling naar klinische toepassingen.

Er moet echter nog worden bepaald in welke preklinische ziektemodellen "Wildling-muizen" superieur zijn aan SPF-muizen. Bovendien herbergen muizen met een natuurlijk microbioom micro-organismen zoals zeer overdraagbare wormen die doorgaans worden uitgesloten van institutionele faciliteiten. Daarom vormen het fokken en werken met deze muizen een uitdaging voor de veehouderijpraktijken binnen onderzoeksinstellingen.

De oprichting van een faciliteit voor "Wildling-muizen" was een gezamenlijke inspanning van wetenschappers, dierenartsen en institutionele functionarissen van Charité - Universitätsmedizin, het Duitse Centrum voor de Bescherming van Proefdieren (Bf3R) en de Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU). Na de ontwikkeling van het faciliteitsconcept onderging een bestaande muizenfaciliteit een uitgebreide reconstructie om strenge biocontainmentmaatregelen op te nemen. De faciliteit is gecertificeerd voor activiteiten op bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) met betrekking tot onderzoek met menselijke pathogenen.

Hier worden operationele en biocontainmentprocedures in de faciliteit voor "Wildling-muizen" beschreven met behulp van bloedafname voor immunofenotypering door flowcytometrie als voorbeeld. Strikte naleving van biocontainmentmaatregelen tijdens het werken in de faciliteit voor "Wildling-muizen" is verplicht om de verspreiding van micro-organismen naar andere delen van de dierenfaciliteit te voorkomen. Dit omvat de beperking van de toegang tot de faciliteit tot zo min mogelijk mensen per onderzoeksgroep. Bovendien is een verplichte introductiesessie door de institutionele dierenwelzijnsfunctionaris vereist voordat u voor het eerst toegang krijgt tot de faciliteit. Algemene informatie en Standard Operating Procedures (SOP) voor het werken binnen de Wildling-faciliteit zijn ook beschikbaar op een interne website ("Wildling-wiki")14,15.

Tijdens het werken in de faciliteit moeten persoonlijke beschermingsmiddelen op de juiste manier worden gedragen. Het is bijvoorbeeld essentieel om ervoor te zorgen dat er geen haar buiten het haarnetje wordt blootgesteld, omdat de eieren van parasieten zich eraan kunnen hechten. Als het experiment zowel "Wildling-muizen" als SPF-muizen omvat, moeten SPF-muizen eerst worden behandeld. De gebieden voor "Wildling-muizen" en SPF-muizen in de faciliteit zijn gescheiden door een luchtdouche en elke ruimte is uitgerust met aangewezen procedurekamers. Deze kamers kunnen worden geboekt via een online boekingssysteem, wat zorgt voor soepele werkprocessen en een beperkt aantal mensen in de faciliteit. Per behandelkamer mogen maximaal twee personen per ruimte (PR1, PR2, LAF) tegelijkertijd in elke barrière werken. Uitzonderingen zijn van toepassing op experimenten waarvoor extra personeel nodig is om een ethische en bekwame uitvoering van de procedures te waarborgen. Muizen worden overgebracht tussen kamers binnen hun respectievelijke gebieden in gesloten IVC-kooien, die alleen kunnen worden geopend onder een laminaire stromingsbank om microbiële insluiting en werkveiligheid te garanderen. De behandelkamer in de "Wilding mice"-ruimte bevat ook een laminaire luchtstroom (LAF) -cabine. Deze LAF-cabine moet worden gebruikt voor de dissectie en chirurgie van "Wildling-muizen", inclusief embryotransfer. Embryotransfer is een kritieke procedure in de context van "Wilding-muizen", omdat het wordt gebruikt om nieuwe "Wildling-muis"-modellen te genereren. Het overbrengen van embryo's van genetisch gemodificeerde (GGO) muizenstammen naar wildtype "Wilding-muizen" wordt bijvoorbeeld gebruikt om Wildling GGO-stammen te maken. De LAF-cabine wordt ook gebruikt voor de export van monsters, wat coördinatie vereist met een persoon buiten het gebied "Wildling-muizen". Verdere monsterverwerking kan worden uitgevoerd in een aangrenzende laboratoriumruimte, waardoor onderzoekers ter plaatse tijdgevoelige materialen kunnen hanteren, terwijl de locaties waar monsters van "Wildling-muizen" worden verwerkt, worden beperkt.

Alle andere materialen moeten in de Wildling-faciliteit blijven of moeten worden geautoclaveerd voordat ze de faciliteit verlaten. Na het werk worden alle materialen en oppervlakken gedesinfecteerd met ontsmettingsmiddelen die geschikt zijn voor BSL2-omstandigheden. Mensen die de faciliteit zijn binnengegaan voor "Wildling-muizen" mogen op dezelfde dag geen andere dierenfaciliteit betreden.

Het onderzoek in de faciliteit wordt uitgevoerd in het kader van het wetenschappelijke consortium "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)", dat de communicatie tussen wetenschappers die met "Wildling-muizen" werken, faciliteert, evenals de uitwisseling van methoden en expertise. Het consortium wordt ondersteund door Responsible PrecliniX van het QUEST Center for Responsible Research van het Berlin Institute of Health (BIH), dat helpt bij preregistratieprocedures voor dierstudies, een robuust experimenteel ontwerp en kwaliteitsbeheer (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

Samenvattend is er een state-of-the-art faciliteit gecreëerd, uitgerust met strenge biocontainmentmaatregelen, om veilig en ethisch preklinisch onderzoek te ondersteunen. Deze faciliteit faciliteert de studie van "Wildling-muizen", die een natuurlijk microbioom herbergen, waardoor de kloof tussen gecontroleerde laboratoriumomstandigheden en echte microbiële omgevingen effectief wordt overbrugd. Voor het bouwen van een faciliteit zoals beschreven, is het essentieel om prioriteit te geven aan teamwetenschap en interdisciplinaire samenwerking, waarbij de expertise van wetenschappers, dierenartsen en institutionele functionarissen wordt opgenomen om een effectief ontwerp en werking van omgevingen met een hoge biocontainment te garanderen. Daarnaast zijn het implementeren van strenge biocontainmentmaatregelen, het bieden van uitgebreide training en het ontwikkelen van duidelijke Standard Operating Procedures (SOP's) cruciaal. Het opzetten van een efficiënte communicatiestructuur, zoals een interne wiki, en het continu monitoren en valideren van experimentele omstandigheden zal de werkzaamheid en veiligheid van de faciliteit bij het beheren van complexe modellen zoals "Wildling-muizen" verder verbeteren.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Charité 3R| Vervangen - verminderen - verfijnen. S.P.R. werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksstichting) Emmy Noether-Programm RO 6247/1-1 (project-ID 446316360), de DFG SFB1160 IMPATH (project-ID 256073931) en de TRR 359 PILOT (project-ID 491676693). S.J. werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksstichting) JO 1216/2-1 en de Duitse Multiple Sclerose Vereniging (DMSG e.V.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45-antilichaamBioLegend103127Clone 30F-11
Animal ChowAltromin1324
APC anti-mouse CD4-antilichaamBioLegend100515Clone RM4-5
BloedopnamebuisGreiner450475MiniCollect K3E, K3EDTA
Rundereiwit AlbumineSigma-AldrichA9647-100G
Brilliant Violet 605 anti-mouse TCR-beta keten-antilichaamBioLegend109241Clone H57-597
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD8-antilichaamBioLegend100749Clone 53-6.7
KapillairHirschmann9000210Hirschmann minicaps, Na-hep
EDTACorning46-034-CI
FITC anti-mouse CD44-antilichaamBioLegend103021Clone IM7
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD62L-antilichaamBioLegend104431Clone MEL-14
Fosfaat-gebufferd zout (10x)Gibco12579099
Fosfaat-gebufferd zout (1x)Gibco14190094
RBC-lysebufferBioLegend420302
Polystyreenbuis met ronde bodemSarstedt55.476.005
SYTOX Blue Dead Cell StainInvitrogenS34852
Tyvek overall (DuPont)Fisher Scientific11371633

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
  2. Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
  3. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  4. Caruso, R., Ono, M., Bunker, M. E., Nunez, G., Inohara, N. Dynamic and asymmetric changes of the microbial communities after cohousing in laboratory mice. Cell Rep. 27 (11), 3401-3412.e3 (2019).
  5. Labuda, J. C., Fong, K. D., Mcsorley, S. J. Cohousing with dirty mice increases the frequency of memory T cells and has variable effects on intracellular bacterial infection. Immunohorizons. 6 (2), 184-190 (2022).
  6. Martin, M. D., et al. Cd115(+) monocytes protect microbially experienced mice against e. Coli-induced sepsis. Cell Rep. 42 (11), 113345(2023).
  7. Burger, S., et al. Natural microbial exposure from the earliest natural time point enhances immune development by expanding immune cell progenitors and mature immune cells. J Immunol. 210 (11), 1740-1751 (2023).
  8. Tabilas, C., et al. Early microbial exposure shapes adult immunity by altering cd8+ t cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (49), e2212548119(2022).
  9. Reese, T. A., et al. Sequential infection with common pathogens promotes human-like immune gene expression and altered vaccine response. Cell Host Microbe. 19 (5), 713-719 (2016).
  10. Leung, J. M., et al. Rapid environmental effects on gut nematode susceptibility in rewilded mice. PLoS Biol. 16 (3), e2004108(2018).
  11. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct housing conditions reveal a major impact of adaptive immunity on the course of obesity-induced type 2 diabetes. Front Immunol. 9, 1069(2018).
  12. Rosshart, S. P., et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance. Cell. 171 (5), 1015-1028.e13 (2017).
  13. Rosshart, S. P., et al. Laboratory mice born to wild mice have natural microbiota and model human immune responses. Science. 365 (6452), eaaw4361(2019).
  14. Dirnagl, U., Kurreck, C., Castanos-Velez, E., Bernard, R. Quality management for academic laboratories: Burden or boon? Professional quality management could be very beneficial for academic research but needs to overcome specific caveats. EMBO Rep. 19 (11), e47143(2018).
  15. Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Wilde muizenBloedafnameLaboratoriummuizenfaciliteitDierhouderijImmuuncelpopulatiesPersoonlijke beschermingsmiddelenLuchtsluis

Gerelateerde artikelen