Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Longitudinale in vivo beeldvorming van retinale cellen met op maat gemaakte adeno-geassocieerde virusserotypen via confocale scanning laseroftalmoscopie

993 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67106

⸱

11 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van adeno-geassocieerde virus (AAV)-vectoren voor celspecifieke labeling en in vivo beeldvorming met behulp van een confocale scanning laseroftalmoscoop (CSLO). Deze methode maakt het mogelijk om verschillende soorten retinale cellen en hun bijdragen aan de retinale functie en ziekte te onderzoeken.

Samenvatting

De dynamische aard van retinale cellulaire processen vereist vooruitgang in genafgifte en live monitoringtechnieken om het begrip en de behandeling van oogziekten te verbeteren. Deze studie introduceert een geoptimaliseerde adeno-geassocieerde virus (AAV) -benadering, waarbij gebruik wordt gemaakt van specifieke serotypen en promotors om een optimale transfectie-efficiëntie te bereiken in gerichte retinale cellen, waaronder retinale ganglioncellen (RGC's) en Müller glia. Door gebruik te maken van de precisie van confocale scanning laser oftalmoscopie (CSLO), presenteert dit werk een niet-invasieve methode voor in vivo beeldvorming die de longitudinale expressie van AAV-gemedieerd groen fluorescerend eiwit (GFP) vastlegt. Deze aanpak elimineert de noodzaak van terminale procedures, waardoor de continuïteit van de observatie en het welzijn van de proefpersoon behouden blijft. Bovendien kan het GFP-signaal worden getraceerd in met AAV geïnfecteerde RGC's langs het visuele pad naar de superieure colliculus (SC) en de laterale geniculaire kern (LGN), waardoor het potentieel voor directe visuele routekartering mogelijk wordt. Deze bevindingen bieden een gedetailleerd protocol en demonstreren de toepassing van dit krachtige hulpmiddel voor real-time studies van het gedrag van retinale cellen, pathogenese van ziekten en de werkzaamheid van gentherapie-interventies, en bieden waardevolle inzichten in het levende netvlies en zijn verbindingen.

Inleiding

Als het enige optisch toegankelijke deel van het centrale zenuwstelsel dient het netvlies als een waardevol model voor neurowetenschappelijk onderzoek1. Retinale ganglioncellen (RGC's), de outputneuronen van het netvlies die visuele informatie naar de hersenen sturen, spelen een cruciale rol in de visuele functie. Hun verlies of disfunctie leidt tot slechtziendheid en onomkeerbare blindheid, zoals gezien bij glaucoom en andere optische neuropathieën2. Müller glia, de belangrijkste gliacellen in het netvlies, zijn essentieel voor het behoud van de homeostase van het netvlies, het bieden van structurele en metabolische ondersteuning aan neuronen, het reguleren van neurotransmitterniveaus en het bijdragen aan herstel en regeneratie van het netvlies3. Hun disfunctie is betrokken bij verschillende aandoeningen van het netvlies, waaronder diabetische retinopathie4, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie5 en oculair ischemisch syndroom6. RGC's en Müller glia vertonen nauwe interacties en onderlinge afhankelijkheid; Müller glia bieden essentiële ondersteuning aan RGC's, terwijl RGC-activiteit de Müller glia-functie kan beïnvloeden 3,7. Het bestuderen van zowel RGC's als Müller glia is cruciaal voor het begrijpen van de netvliesfunctie en het ontwikkelen van effectieve behandelingen voor meerdere netvliesaandoeningen.

Huidige beoordelingen in netvliesonderzoek maken voornamelijk gebruik van technieken zoals optische coherentietomografie (OCT) om de dikte van de retinale zenuwvezellaag of de trajecten van axonbundels te meten 8,9. Hoewel deze methoden van onschatbare waarde zijn voor het detecteren van RGC-verlies, bieden ze geen gedetailleerd beeld van de RGC-morfologie en gliacellen vanwege de beperkte resolutie. Evenzo, hoewel geavanceerde technieken zoals adaptieve optische scanning laser oftalmoscopie (AO-SLO) beeldvorming op cellulair niveau van RGC's, fotoreceptoren en gliacellen in het levende menselijke netvlies mogelijk maken10, beperken hun technische complexiteit en beperkte toegankelijkheid het gebruik ervan voornamelijk tot gespecialiseerde onderzoeksomgevingen. Gezien deze beperkingen is er een voortdurende behoefte aan het ontwikkelen van meer toegankelijke en betrouwbare methoden voor de diepgaande studie van specifieke retinale celpopulaties in vivo.

Dienovereenkomstig heeft dit protocol tot doel een alternatieve beeldvormingsbenadering te introduceren die geschikt is voor onderzoekstoepassingen in retinale cellen. Het combineert de kracht van AAV-gemedieerde celtype-specifieke labeling met de niet-invasieve aard van CSLO-beeldvorming. Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) zijn veelzijdige genafgiftevectoren die bekend staan om hun lage immunogeniciteit en het vermogen om een breed scala aan celtypen te transduceren, waaronder zowel delende als niet-delende cellen11. Dit maakt ze ideale hulpmiddelen om zich te richten op specifieke celpopulaties binnen de complexe retinale omgeving. Door gebruik te maken van AAV-vectoren met zorgvuldig geselecteerde serotypen en promotors, kan selectieve expressie van fluorescerende eiwitten worden bereikt in meerdere interessante celtypen, zoals RGC's en Müller-glia. AAV2 staat bijvoorbeeld bekend om zijn hogere transductie-efficiëntie in RGC's12,13, terwijl AAV8 duidelijk effectief is in het richten op fotoreceptoren14, en AAV9 sterke transfectiemogelijkheden vertoont in Müller glia15, met een brede efficiëntie in verschillende retinale cellagen. Het is belangrijk op te merken dat de effectiviteit van AAV niet alleen afhangt van de keuze van het serotype, maar ook van de promotors, die de intensiteit en celspecificiteit van transgenexpressie dicteren, wat het belang onderstreept van zorgvuldige selectie om optimale transductie te bereiken.

Voor RGC-etikettering maakt dit protocol gebruik van AAV2 met de humane synapsine (hSyn) promotor. AAV2 vertoont efficiënte transductie van RGC's na intravitreale injectie13, en de hSyn-promotor, een alomtegenwoordige neuronale promotor, zorgt voor sterke en specifieke transgenexpressie in deze cellen16. Voor Müller glia maakt het protocol gebruik van AAV9-vectoren die worden aangestuurd door de GfaABC1D-promotor17, die een sterke transgenexpressie in deze cellen vertoont15. Deze gerichte labelbenadering stelt onderzoekers in staat om deze cellen te onderscheiden van het omringende netvliesweefsel en ze in de loop van de tijd te volgen, wat een basis vormt voor in vivo surveillance van netvliescellen en hun reacties op bio-omgevingsveranderingen.

Confocale scanning laser oftalmoscopie (CSLO) is een niet-invasieve beeldvormingstechniek die beelden met een hoge resolutie van het levende netvlies oplevert, waardoor real-time visualisatie van fluorescerend gelabelde retinale celpopulaties mogelijk is 18,19,20. Een gefocusseerde laserstraal scant het netvlies en vangt uitgezonden licht op dat door een gaatje gaat om onscherpe signalen te elimineren, wat resulteert in scherpere beelden met verbeterd contrast. Dit protocol maakt gebruik van een Heidelberg Spectralis CSLO-systeem, dat veel wordt gebruikt voor beeldvorming van retinale cellen bij levende dieren, waaronder studies die transgene gelabelde RGC's21,22 en microglia23 visualiseren. Door gebruik te maken van de HRA CSLO-eenheid met een laser van 488 nm en geschikte filters, kunnen onderzoekers fluorescerend gelabelde RGC's of Müller-glia in levende dieren afbeelden na intravitreale injectie van AAV-vectoren die fluorescerende reportergenen dragen. Het longitudinale beeldvormingsprotocol, met wekelijkse sessies die zowel het centrale als het perifere netvlies bestrijken, volgt veranderingen in de loop van de tijd. Om dierenwelzijn voorop te stellen, maakt het protocol gebruik van het automatische eye-tracking-systeem (ART) van de HRA CSLO-eenheid, waardoor nauwkeurige beeldacquisitie mogelijk is zonder dat er algemene anesthesie of contactlenzen nodig zijn.

Dit protocol maakt gebruik van de gecombineerde kracht van AAV en CSLO om de longitudinale monitoring van specifieke retinale celtypen in vivo mogelijk te maken. Door de celtypespecificiteit van AAV-gemedieerde labeling te koppelen aan de niet-invasieve beeldvormingsmogelijkheden met hoge resolutie van CSLO, stelt deze methode onderzoekers in staat om de dynamische veranderingen in RGC's en Müller-glia te bestuderen als reactie op verschillende stimuli of interventies. Deze inzichten hebben een aanzienlijk potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën voor netvliesaandoeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Capital Medical University, Beijing. Vier weken oude volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen (met een gewicht tussen 15-20 g) werden gebruikt voor alle experimenten en gehuisvest in temperatuurgecontroleerde kamers met een licht/donkercyclus van 12/12 uur. Standaard knaagdiervoer en water waren ad libitum beschikbaar. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. AAV-gemedieerde retinale celtransfectie

OPMERKING: Voor gerichte transductie van RGC's maakt dit protocol gebruik van AAV2-hSyn-eGFP, dat de hSyn-promotor bevat om een robuuste expressie van verbeterde GFP te stimuleren. Müller glia is gericht met behulp van AAV9-GfaABC1D-eGFP. Om een optimale transductie-efficiëntie en robuuste transgenexpressie te bereiken, wordt een minimale AAV-titer van 1 x 1012 virale genomen (vg)/ml aanbevolen voor intravitreale injecties bij muizen13.

  1. Houd u aan strikte veiligheidsprotocollen bij het uitvoeren van AAV-gemedieerde retinale celtransfectieprocedures om onbedoelde blootstelling te voorkomen en een veilige werkomgeving te garanderen.
  2. Voer alle procedures met virale vectoren uit in een gecertificeerde bioveiligheidskast (BSC). Rust het personeel uit met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder laboratoriumjassen, handschoenen en oogbescherming, tijdens de duur van de procedure.
  3. Gooi alle scherpe voorwerpen en biologisch gevaarlijke materialen op de juiste manier weg in overeenstemming met de veiligheidsprotocollen van de instelling om de naleving te handhaven en al het laboratoriumpersoneel te beschermen.

2. Bereiding van virale vectoren en dieren

  1. Verkrijg AAV2-hSyn-eGFP of de AAV9-GfaABC1D-eGFP-vectoren die zijn opgeslagen bij -80 °C. Ontdooi vectoren onmiddellijk voor gebruik op ijs om de virale integriteit te behouden.
  2. Verdoof de muizen met een intraperitoneale injectie van pentobarbital-natrium in een dosering van 50 mg/kg. Bevestig de diepte van de anesthesie door de reflexen van de achterste voet te testen voordat u verdere acties onderneemt.
  3. Knip de snorharen bij om interferentie met het operatiegebied tijdens de procedure te voorkomen. Desinfecteer de oogkas gedurende 2 s met een 20% Povidon-jodiumoplossing en spoel vervolgens grondig af met steriele normale zoutoplossing.
  4. Breng plaatselijk een druppel van 0,5% proparacaïne aan om ongemak te minimaliseren en onwillekeurige oogbewegingen te voorkomen.

3. Behandeling en intravitreale injectie van virale vectoren

  1. Breng 1 μL geselecteerde AAV-oplossing (AAV2-hSyn-eGFP of AAV9-GfaABC1D-eGFP) over op een stuk schone, voorgekoelde paraffinefilm om temperatuurschommelingen te voorkomen die de virale activiteit kunnen beïnvloeden.
  2. Zuig de AAV-oplossing op met behulp van een glazen spuit van Hamilton met een afgeschuinde naald van 33 G onder de oogheelkundige chirurgische microscoop.
  3. Plaats de muis in buikligging onder de microscoop. Kantel het hoofd iets om de oogzijde die bedoeld is voor injectie omhoog te brengen. Pas de vergroting van de microscoop aan en optimaliseer deze om het superieure gebied van de baan van de muis duidelijk te identificeren.
  4. Steek de naald 1-2 mm achter de limbus aan de bovenste sclerale rand van het oog in de glasvochtholte. Injecteer de AAV-oplossingen langzaam om terugstroming of door druk veroorzaakte schade te voorkomen.
    OPMERKING: Plaats van de injectieplaats: Voer de injectie uit in het kwadrant bovenste temporale van het oog, ongeveer 1 mm achter de limbus. Kies deze locatie om grote bloedvaten te vermijden en het risico op lensbeschadiging te minimaliseren. Vermijd injectieplaatsen die te dicht bij de limbus liggen om irritatie of slijtage van de lens te voorkomen. Vasculatuur vermijden: Gebruik een operatiemicroscoop om de geplande injectieplaats zorgvuldig te onderzoeken op zichtbare bloedvaten voordat u de injectie krijgt. Als er schepen aanwezig zijn, pas dan het invoerpunt enigszins aan om ze te vermijden. Steek de naald in een ondiepe hoek, evenwijdig aan de iris, om het risico op vaatbeschadiging verder te verminderen. Vermijd herhaalde injecties in hetzelfde gebied om het risico op subretinale bloeding te verminderen.
  5. Houd de naald 30 s op zijn plaats zodat de vectoren zich in de glaskamer kunnen verspreiden en zich op het netvliesoppervlak kunnen nestelen, waardoor de kans op succesvolle transductie wordt gemaximaliseerd.
  6. Trek de naald langzaam terug om het risico op terugstroming van glasvocht te minimaliseren.
  7. Breng onmiddellijk na de injectie een actuele antibiotische zalf aan op de injectieplaats. Zorg ervoor dat de zalf gelijkmatig wordt aangebracht om het oogoppervlak volledig te bedekken, waardoor ooginfectie en ontsteking worden voorkomen.
    OPMERKING: De antibiotische zalf bevat 1 mg/g dexamethason, 3500 IE/g neomycinesulfaat en 6000 IE/g polymyxine B-sulfaat.
  8. Plaats de muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden tijdens het herstel van de anesthesie en houd de muis nauwlettend in de gaten op tekenen van angst of afwijkingen. Zodra ze volledig hersteld zijn en geen complicaties vertonen, breng je ze terug naar hun kooien met toegang tot normaal voedsel en water.

4. In-vivobeeldvorming met CSLO

  1. Voorbereiding van dieren
    1. Selecteer de muis die is geïnfecteerd met AAV2-hSyn-eGFP of AAV9-GfaABC1D-eGFP na 4 weken intravitreale injectie. Breng een druppel van een oogoplossing met 0,5% tropicamide en 0,5% fenylefrine aan op het oogoppervlak om de pupil te verwijden tot ongeveer 2 mm in diameter22.
      OPMERKING: Een tijdsinterval van minimaal 4 weken AAV-transductie wordt aanbevolen voor de optimale fluorescerende etikettering van retinale cellen na intravitreale injectie13. Bovendien werden in onze experimenten met oogzenuwverbrijzeling (ONC) het netvlies 4 weken na infectie in beeld gebracht, evenals op dag 7 en 14 na het verbrijzelingsletsel. Deze tijdstippen werden gekozen om zowel de initiële AAV-expressie als de progressie van retinale veranderingen na ONC vast te leggen.
    2. Bedek het beeldvormingsplatform met een stuk van de schone pad om mogelijke besmetting van dierlijke uitwerpselen tijdens het operatieproces te voorkomen.
      OPMERKING: Het op maat gemaakte beeldvormingsplatform biedt voldoende ruimte voor het dier om op zijn buik te liggen, zorgt voor stabiliteit en minimaliseert beweging tijdens handmatige fixatie voor optimale beeldacquisitie.
    3. Breng de muis voorzichtig over op het beeldvormingsplatform en wacht een acclimatisatieperiode van 2-5 minuten voorafgaand aan de beeldvorming om stress te minimaliseren en aanpassing aan de beeldomgeving te vergemakkelijken.
    4. Met de hulp van een tweede technicus kunt u het dier voorzichtig in bedwang houden terwijl u tijdens de procedure bij bewustzijn blijft. Zorg voor een rustinterval van 10 s na 15 s beeldvorming om het oog te laten knipperen en het vocht van het hoornvlies op peil te houden.
      OPMERKING: Schrob de hoofdhuid voorzichtig om het ooglid spontaan op te tillen, vermijd het gebruik van geforceerde ooglidfixatie of extra hulpmiddelen zoals clips, waardoor het risico op oogletsel wordt verkleind. Algemene anesthesie wordt niet gebruikt om de optische helderheid te behouden tijdens langdurige beeldvormingssessies, omdat het de opaciteit van de voorbijgaande lens kan verergeren. Breng hoogwaardige beeldacquisitie in evenwicht met diercomfort en veiligheid tijdens de procedure. Voltooi de hele procedure binnen 5 minuten om het welzijn van de dieren te garanderen en de beeldkwaliteit te behouden.
    5. Pas de hoofdhouding aan en lijn de cameralens uit door de scherpstelknop (Afbeelding 1B) en micromanipulator (Afbeelding 1C) nauwkeurig af te stellen om het interessegebied (ROI) te richten op daaropvolgende in vivo beeldvorming.
  2. Systeem configuratie
    1. Bevestig een contactloze groothoeklens van 55° op de camera om het gezichtsveld van het fundusgebied te vergroten.
    2. Zet het filterwiel op stand A (angiografie) om de beeldvormingsmodus voor infrarood (IR) en fluorescentieangiografie (FA) mogelijk te maken (Figuur 1A). Schakel de laser en voeding in om het CSLO-beeldvormingssysteem te activeren.
    3. Open de software Heidelberg Eye Explorer en maak een nieuw onderzoek aan door op het pictogram Nieuwe patiënt bovenaan de menubalk te klikken. Voer de relevante diergegevens in en accepteer de standaard hoornvlieskromming van 7,7 mm in het pop-upvenster.
    4. Selecteer de gele Start-knop (Figuur 1E) op het scherm van het bedieningspaneel om de live imaging-modus te starten.
  3. In vivo CSLO-beeldvorming
    1. Selecteer de IR-modus (Figuur 1G) met autofluorescentie bij een excitatiegolflengte van 820 nm op het bedieningspaneel. Om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken, moet de High Res. De (HR)-modus wordt geactiveerd via de vensterinterface of het handmatige bedieningspaneel (Afbeelding 1F).
      OPMERKING: Infraroodreflectie (IR) beeldvorming is doorgaans de eerste stap in CLSO-oogheelkundige beeldvorming, verkregen vóór fluoresceïne-angiografie (FA), om een basisbeeld te bieden. Zelfs verlichting, minimale artefacten en scherpe focus op de belangrijkste retinale vaten zijn cruciaal voor de betrouwbaarheid van de z-vlak-focussering en het bereiken van IR-beelden van hoge kwaliteit.
    2. Beweeg de lens naar het oog van de muis met behulp van de joystick met de XYZ-micromanipulator voor fijnafstelling. Onderzoek de optische transparantie en draai de gevoeligheidsknop (Figuur 1D) tegen de klok in om de helderheid van het fundusbeeld te verlagen tot 40%-60%, waardoor overbelichting van de fundus wordt voorkomen en de visualisatie van retinale details wordt verbeterd.
    3. Pas de focusknop en micromanipulator aan totdat de optische schijf en de netvliesvaten ondubbelzinnig worden geïdentificeerd op de fundus.
      OPMERKING: Criteria voor het optimale brandpuntsvlak: (1) Gelijkmatig verlichte fundusweergave zonder donkere hoeken. (2) Uniforme verlichting rond de optische schijf zonder focale donkere vlekken of vervorming. (3) Duidelijke lumenvorm van de grote netvliesvaten met de zichtbare beweging van de bloedstroom.
    4. Schakel over naar de FA-modus (Figuur 1H) met een solid-state blauwe laser op een excitatiegolflengte van 488 nm en een barrièrefilter op 500 nm. Draai de gevoeligheidsknop (Figuur 1D) met de klok mee om de helderheid van het fundusbeeld te verhogen tot 50%-107% om het beoogde netvliesgebied te verlichten.
    5. Stel de ART-gemiddelde waarde (een blauwe balk linksonder in de software-interface) in op ten minste 15 om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Deze functie neemt het gemiddelde van een reeks B-scans die op dezelfde locatie zijn gemaakt, waardoor de beeldkwaliteit wordt verbeterd.
      OPMERKING: Hoewel een hogere ART-middelingswaarde over het algemeen de beeldkwaliteit verbetert door middel van middeling, verlengt het ook de scanduur. Deze langere duur kan mogelijk het risico op uitdroging van het hoornvlies en vermoeidheid bij dieren verhogen, factoren die zorgvuldig moeten worden overwogen, vooral bij wakkere beeldvorming van dieren.
    6. Lijn opnieuw uit met het binnenste vlak van het netvlies, specifiek gericht op de GFP die RGC's tot expressie brengt of de Müller-gliacellen. Er worden fijne aanpassingen gemaakt om te zorgen voor een scherpe verlichting van de gewenste celpopulatie, zoals RGC soma en axonen, of het Müller-cellichaam. De beeldgevoeligheid is uitgebalanceerd om een optimale visualisatie te bereiken en oververzadiging van de GFP-positieve cellen te voorkomen.
      OPMERKING: Om de beelden met vergelijkbare helderheid en helderheid van het GFP-signaal te verkrijgen, moet de gevoeligheidsacquisitie constant zijn voor alle muizen in het experiment.
    7. Druk op de gevoeligheidsknop (Figuur 1D) om de ART-modus te starten, die online een live gemiddeld beeld genereert. Wacht tot de blauwe balk (die de ART-gemiddelde waarde weergeeft) linksonder in de software-interface de ingestelde ART-waarde heeft bereikt (≥ 20 frames) en tik op de knop Verkrijgen op de bedieningsinterface om de fundusbeelden vast te leggen.
      OPMERKING: Voor de ART-modus is eye-tracking ingebouwd om automatisch te compenseren voor kleine oogbewegingen tijdens in vivo beeldvorming, waardoor een consistente focus op het geselecteerde retinale brandpuntsvlak mogelijk is.
    8. Zodra u de gewenste beelden hebt verkregen, verlaat u de ART-modus door op de gevoeligheidsknop op het aanraakscherm te drukken.
      OPMERKING: Om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en spontaan met de ogen te knipperen, werden tijdens het beeldvormingsproces elke 15 s pauzes van 10 s geïmplementeerd.
    9. Om door de nasale en temporale retinale gebieden te navigeren, beweegt u de camerakop horizontaal terwijl u het livebeeld op het scherm observeert. Zodra het doelgebied is bereikt, stelt u de scherpstelling nauwkeurig af en start u het beeldvormingsproces zoals beschreven in de stappen 2.3.1-2.3.8.
      OPMERKING: Zorg voor langzame en gecontroleerde camerabewegingen en zorg tegelijkertijd voor een consistente en heldere verlichting van de fundus. Als er donkere gebieden verschijnen, gebruikt u de micromanipulator om de camerapositie verticaal aan te passen en het netvlies opnieuw te centreren.
    10. Om het superieure netvlies in beeld te brengen, stelt u de houding van het muishoofd voorzichtig in op een positie met de voorkant naar boven. Kantel de camerakop matig omhoog om deze uit te lijnen met het superieure netvliesgebied. Pas de scherpstelling indien nodig aan en ga verder met beeldvorming.
    11. Na voltooiing van de beeldvorming verlaten alle gewenste retinale gebieden het acquisitievenster en worden de beelden automatisch opgeslagen. Breng topisch glijmiddel aan op het afgebeelde oog om de hydratatie van het hoornvlies te behouden.
    12. Om het onderzoek van het contralaterale oog te starten, plaatst u het dier terug naar de andere kant van het platform en herhaalt u de stappen 2.3.1-2.3.11.

5. Beeldverwerking en -analyse

  1. Export en voorbereiding van afbeeldingen
    1. Open de Heidelberg Eye Explorer-software en selecteer de gewenste CSLO-beeldvormingssessie met goede kwaliteit. Kies enkele of opeenvolgende afbeeldingen van dezelfde netvlieslocatie met consistente gevoeligheidsinstellingen in de loop van de tijd.
    2. Sluit wazige beelden met een slechte focus of helderheid van het hoornvlies uit en zorg ervoor dat alleen beelden met een duidelijke visualisatie van netvliesstructuren worden gebruikt voor analyse. Exporteer deze afbeeldingen in TIFF-formaat voor verdere verwerking.
  2. Afbeeldingen uitlijnen en bijsnijden
    1. Groepeer afbeeldingen per muizenoog op basis van hetzelfde netvliesgebied.
      OPMERKING: De originele afbeeldingen die van het CSLO-systeem zijn verkregen, worden opgeslagen in het volgende formaat: TIFF, met een afmeting van 1536 x 1536 pixels, een resolutie van 5,69 um/pixel en een ART-waarde van ≥15.
    2. Importeer voor vervolgonderzoeken afbeeldingen in geschikte beeldverwerkingssoftware. Roteer en lijn de afbeeldingen zo nodig uit om overeen te komen met de oriëntatie van de basislijnafbeelding. Gebruik bij het opslaan of exporteren van de verwerkte afbeeldingen instellingen die de hoogst mogelijke beeldkwaliteit behouden om mogelijke compressieartefacten te minimaliseren.
    3. Lijn de CSLO-beelden uit een tijdreeks van hetzelfde oog uit door ze te roteren zodat ze overeenkomen met het respectieve basislijnbeeld met behulp van het vaatstelsel en de optische schijf als oriëntatiepunten.
      OPMERKING: Onderzoek elk uitgelijnd beeld zorgvuldig en zorg ervoor dat ze aan de volgende criteria voldoen voordat u overgaat tot bijsnijden: (1) Volledige opname van het netvliesgebied: Het beeld moet het beoogde netvliesgebied volledig omvatten, inclusief belangrijke oriëntatiepunten zoals de optische schijf en de belangrijkste bloedvaten; (2) Afwezigheid van bewegingsartefacten: Het beeld moet vrij zijn van vervaging, strepen of duplicatie van structuren veroorzaakt door oogbewegingen tijdens beeldvorming; (3) Minimale vervorming: Het beeld moet de netvliesstructuur nauwkeurig weergeven zonder kromtrekken, uitrekken of compressieartefacten die kunnen ontstaan door beeldhoeken of lenseffecten. (4) Balans van beeldkwaliteitsstatistieken: beoordelingen van achtergrondruisniveaus (standaarddeviatie van pixelintensiteiten in structuurvrije gebieden < 5 (schaal 0-255)); signaal-ruisverhouding (SNR >20), verlichtingsconsistentie (variatiecoëfficiënt tussen zes beeldkwadranten <10%) en beelduniformiteit (variatiecoëfficiënt in homogene gebieden <15%).
    4. Selecteer de geroteerde afbeelding en exporteer deze in TIFF-indeling. Gebruik voor elk tijdstip het bijsnijdgereedschap om willekeurig 5-10 gebieden (elk 300 x 300 pixels) met GFP-positieve cellen te selecteren en bij te snijden uit de afbeeldingen die op kwaliteit zijn goedgekeurd. Exporteer elke bijgesneden afbeelding afzonderlijk in TIFF-indeling voor verdere analyse.
  3. Meting van de fluorescentie-intensiteit
    1. Open de bijgesneden CSLO-afbeeldingen (8-bits grijstinten, 300 x 300 pixels) in ImageJ/Fiji.
    2. Om algemene veranderingen in fluorescerende signalen te onderzoeken, meet u de totale fluorescentie-intensiteit per bijgesneden afbeelding met behulp van Analyseren > Meten (of Ctrl + M). Noteer de "Gemiddelde"-waarde, die de gemiddelde GFP-fluorescentie-intensiteit van het hele bijgesneden beeld weergeeft.
  4. Kwantificering van RGC
    1. Pas in ImageJ/Fiji de intensiteitsdrempel van de bijgesneden CSLO-afbeeldingen aan met behulp van Image > Adjust > TBrightness/Contrast om een optimale visualisatie van individuele witte soma-lichamen tegen de zwarte achtergrond te bereiken.
      OPMERKING: Bepaal een geïndividualiseerde drempel na het bekijken van de batch bijgesneden afbeeldingen, of pas een consistent drempelalgoritme toe (bijv. Huang's methode5 in ImageJ/Fiji). Voor de methode van Huang: (1) Converteer afbeeldingen naar 8-bits grijstinten (afbeelding > Type > 8-bit). (2) Open de drempeltool (Afbeelding > Pas > drempel aan). (3) Selecteer Huang als drempelmethode. (4) Bekijk een voorbeeld van de segmentatie en klik op Toepassen. De drempel wordt automatisch berekend en weergegeven in het histogram van de afbeelding.
    2. Activeer de Cell Counter-plug-in en klik op elke GFP-positieve RGC-soma om te tellen. Noteer het totale aantal cellen dat in het geanalyseerde gebied is gemarkeerd. Herhaal dit proces voor alle bijgesneden afbeeldingen van elk vervolgtijdstip.
  5. Gegevensanalyse
    1. Exporteer de gegevens over het aantal cellen en de fluorescentie-intensiteit naar een spreadsheet of statistische software (bijv. GraphPad Prism).
    2. Voer de juiste statistische tests uit op basis van de bijbehorende experimentele opzet en hypothesen. Interpreteer de resultaten en concludeer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens het gepresenteerde protocol werden verschillende retinale cellen met succes gevisualiseerd en in vivo gevolgd met behulp van een combinatie van AAV-gemedieerde genafgifte en CSLO. AAV2-hSyn-eGFP transduceerde effectief RGC's, wat resulteerde in robuuste eGFP-expressie door het hele netvlies, zoals bevestigd door CSLO en colokalisatie met de RGC-specifieke marker, RNA-bindend eiwit met meervoudige splitsing (RBPMS), specifiek gevonden in de ganglioncellaag (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gepresenteerde protocol beschrijft een robuuste en toegankelijke methode voor in vivo surveillance van specifieke retinale celpopulaties, waarbij gebruik wordt gemaakt van de kracht van zowel AAV-gemedieerde genafgifte als CSLO-beeldvorming. Deze benadering biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden, waardoor longitudinale studies van de dynamiek van retinale cellen en hun reacties op letsel of ziekte onder fysiologische of pathologische omstandighe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (82130029). Figuur 2A en Figuur 4A zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
33 Gauge NeedleHamilton Corp., Reno, NV, USA7803-05Voor intravitreale injectie
0.5% proparacaine Santen Pharmaceutical Co., Ltd.Topical Anesthetica
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinaVirus titer: 2,7 x 1012 virale genomen (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinaVirus titer: 4,5 x 1012 virale genomen (vg)/mL 
BetadineHealthy medical company001651Topical Antiseptica
Corneal scelar forceps (getand)Mingren Eye Instruments, ChinaMR-F301AVoor het vastzetten van het ooglid tijdens intravitreale injectie
Dumont 05# forcepsFST51-AGT5385Voor het verpletteren van de oogzenuw
Graphpad prismGraphPad Prism, USAGrafiek tekenen en statistische analyse
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Duitsland'IR' en 'FA' modus voor CSLO beeldvorming
Image J/FijiNational Institutes of Health, USABeeldverwerking
Maxitrol antibioticumzalfAlcon Laboratories, INC. USA0065-0631Topical antibiotica
MicroliterspuitenHamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01Voor intravitreale injectie
Mydrin-P OogheelmiddelSanten Pharmaceutical Co., Ltd, JapanPupilverwijding
Oogheelkundige operatiemicroscoop Leica AG, Heerbrugg, ZwitserlandM220Voor chirurgische ingrepen
Pentobarbital natriumSigma Aldrich, USA57-33-0Algemeen Anesthetica
PowerpointMicrosoft Corporation, USABeelduitlijning en bijsnijden
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, DuitslandTopical smeermiddel 
```

Referenties

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Prog Retin Eye Res. 57, 89-107 (2017).
  2. Ju, W. K., et al. Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells. Prog Retin Eye Res. 95, 101136(2023).
  3. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  4. Llorián-Salvador, M., Cabeza-Fernández, S., Gomez-Sanchez, J. A., De La Fuente, A. G. Glial cell alterations in diabetes-induced neurodegeneration. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 47(2024).
  5. Zhao, N., Hao, X. N., Huang, J. M., Song, Z. M., Tao, Y. Crosstalk between microglia and müller glia in the age-related macular degeneration: Role and therapeutic value of neuroinflammation. Aging Dis. 15 (3), 1132-1154 (2023).
  6. Minhas, G., Sharma, J., Khan, N. Cellular stress response and immune signaling in retinal ischemia-reperfusion injury. Front Immunol. 7, 444(2016).
  7. Miao, Y., Zhao, G. L., Cheng, S., Wang, Z., Yang, X. L. Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma. Prog Retin Eye Res. 93, 101169(2023).
  8. Leung, C. K. S., et al. Diagnostic assessment of glaucoma and non-glaucomatous optic neuropathies via optical texture analysis of the retinal nerve fibre layer. Nat Biomed Eng. 6 (5), 593-604 (2022).
  9. Hood, D. C., et al. Detecting glaucoma with only OCT: Implications for the clinic, research, screening, and AI development. Prog Retin Eye Res. 90, 101052(2022).
  10. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Prog Retin Eye Res. 68, 1-30 (2019).
  11. Dinculescu, A., Glushakova, L., Min, S. H., Hauswirth, W. W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease. Hum Gene Ther. 16 (6), 649-663 (2005).
  12. Nickells, R. W., Schmitt, H. M., Maes, M. E., Schlamp, C. L. AAV2-mediated transduction of the mouse retina after optic nerve injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (14), 6091-6104 (2017).
  13. Cao, X., Yung, J., Mak, H., Leung, C. K. S. Factors governing the transduction efficiency of adeno-associated virus in the retinal ganglion cells following intravitreal injection. Gene Ther. 26 (3-4), 109-120 (2019).
  14. Vandenberghe, L. H., et al. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med. 3 (88), 88ra54(2011).
  15. Gao, Y., et al. Develop an efficient and specific AAV-based labeling system for Muller glia in mice. Sci Rep. 12 (1), 22410(2022).
  16. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: Comparison of five promoters. Gene Ther. 30 (6), 503-519 (2023).
  17. Kawabata, H., et al. Improving cell-specific recombination using AAV vectors in the murine CNS by capsid and expression cassette optimization. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (1), 101185(2024).
  18. Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Sci Rep. 8 (1), 1490(2018).
  19. Smith, C. A., Chauhan, B. C. Imaging retinal ganglion cells: Enabling experimental technology for clinical application. Prog Retin Eye Res. 44, 1-14 (2015).
  20. Leung, C. K. S., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (11), 4898(2008).
  21. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. J Neurosci Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  22. Mak, H. K., Ng, S. H., Ren, T., Ye, C., Leung, C. K. S. Impact of PTEN/SOCS3 deletion on amelioration of dendritic shrinkage of retinal ganglion cells after optic nerve injury. Exp Eye Res. 192, 107938(2020).
  23. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo imaging of Cx3CR1GFP/GFP reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. J Vis Exp. (129), e55984(2017).
  24. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  25. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: Oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  26. LaRocca, F., et al. Optimization of confocal scanning laser ophthalmoscope design. J Biomed Opt. 18 (7), 076015(2013).
  27. Vienola, K. V., et al. Real-time eye motion compensation for OCT imaging with tracking SLO. Biomed Opt Express. 3 (11), 2950-2963 (2012).
  28. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  29. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: Confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731(2015).
  30. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157-6170 (2021).
  31. Chaffiol, A., et al. A new promoter allows optogenetic vision restoration with enhanced sensitivity in macaque retina. Mol Ther. 25 (11), 2546-2560 (2017).
  32. Li, L., et al. Longitudinal in vivo Ca2+ imaging reveals dynamic activity changes of diseased retinal ganglion cells at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (48), e2206829119(2022).
  33. Bille, J. F. Optical Coherence Tomography (OCT): Principle and technical realization. High-resolution imaging in microscopy and ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Springer International Publishing. 59-85 (2019).
  34. Spaide, R. F., et al. Lateral resolution of a commercial optical coherence tomography instrument. Transl Vis Sci Technol. 11 (1), 28(2022).
  35. Franze, K., et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8287-8292 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Beeldvorming van netvliesscellenAAV-serotypesconfocale scannende oftalmoscopieretinale ganglioncellenMüller-gliacellengenoverdrachtGFP-expressiemapping van de visuele baan

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.